CN108310379B

CN108310379B - 一种兼具分子靶向及可控光动力治疗的纳米诊疗剂及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN108310379B
Application number: CN201810232161.1A
Authority: CN
Inventors: 高瑜; 张英英; 柯玲洁; 林晓文; 张露; 李冬梅; 方胤瑾; 雷桂财; 陈海军
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2018-03-21
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2038-03-21
Also published as: CN108310379A

Abstract

本发明公开了一种厄洛替尼‑壳聚糖‑介孔二氧化硅纳米粒‑吲哚菁绿（ECMI）新型纳米诊疗剂及其制备方法和用途。该纳米诊疗剂以内部负载着吲哚菁绿的介孔二氧化硅纳米粒为载体，采用ZnO QDs封闭介孔二氧化硅纳米粒表面的孔隙，并在其表面包覆厄洛替尼修饰的壳聚糖二硫键交联聚合物。本发明的纳米诊疗剂可以识别不同分子分型的肺癌细胞，并用于可控近红外荧光成像；且其可发挥分子靶向药物和光动力治疗协同作用，提高肺癌的治疗效果。

Description

一种兼具分子靶向及可控光动力治疗的纳米诊疗剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种厄洛替尼-壳聚糖-介孔二氧化硅-吲哚菁绿新型纳米诊疗剂（ECMI）及其制备方法和用途。

背景技术

肺癌是世界上发病率和死亡率较高的癌症，其5年生存率仅为15％。肺癌分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。NSCLC是最常见的类型，占肺癌总数的85％。表皮生长因子受体（EGFR）是一种跨膜蛋白，属于表皮生长因子受体家族。研究发现，在NSCLC患者中，EGFR与配体结合后可导致酪氨酸激酶磷酸化，诱导肿瘤生长因子分泌，促进肿瘤细胞增殖和血管生成等过程。人的EGFR基因位于7号染色体7 p13-q22区域，总长度为200kb，由28个外显子组成。EGFR突变多发生在负责编码EGFR酪氨酸激酶区域的18-21这四个外显子上，而此四个外显子主要突变类型为：21外显子858位点突变；20外显子插入突变；19外显子缺失和18外显子突变（G719S）。突变的EGFR具有致癌性，主要通过不断自磷酸化激活下游信号通路，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，最终导致细胞癌变。针对EGFR基因突变而开发的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）是目前NSCLC治疗的热点。厄洛替尼（Er）是一种口服有效的小分子EGFR-TKI，其可通过与三磷酸腺苷（ATP）竞争EGFR上酪氨酸激酶（TK）催化区的结合位点，阻断EGFR下游酪氨酸激酶的信号通路，从而抑制肿瘤的生长和转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，是临床上常用的治疗NSCLC的化疗药（Nguyen, K.-S.H. and J.W. Neal, First-line treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer: the role oferlotinib and other tyrosine kinase inhibitors. Biologics : targets & therapy, 2012. 6: p. 337-45.）。然而，分子靶向药物使用后不可避免均发生耐药。

肿瘤细胞耐药性可分为两种：一种是天然耐药性，即固有耐药性，这种耐药性是由自身固有染色体所决定的；另一种是获得耐药性，这种耐药性是细胞在某种条件下发生基因突变或获得外源性耐药基因所产生的。获得性耐药是肿瘤化疗失败的一个重要原因。

光动力疗法（Photodynamic Therapy，PDT）是利用光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种新技术，其采用特定波长的激光照射使组织吸收的光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡（Shafirstein, G., et al.,Photodynamic Therapy of Non-Small Cell Lung Cancer Narrative Review andFuture Directions. Annals Of the American Thoracic Society, 2016. 13(2): p.265-275.）。近红外（NIR）荧光染料由于具有了良好的组织渗透性，吸收的近红外光在生物组织中的穿透深度较大，而激发的荧光受生物组织本身的影响较小，所以可检测到深层组织的荧光信号。吲哚菁绿（ICG）是一种在近红外光谱范围内有较强吸收、毒性小、不参与体内生物转化、排泄迅速的荧光染料，是目前唯一被美国FDA批准的临床使用的近红外光学成像对比增强剂。同时ICG也可用于光动力治疗，在近红外光照射下，利用其高荧光效率，在较低剂量时可选择性的杀死肿瘤组织。

介孔二氧化硅纳米粒（MSN）因其特有的介孔结构，能保证药物分子以扩散的形式进入到孔径；且其具有载药量高、表面易修饰等特点。但是无法避免纳米药物在到达肿瘤部位前药物的过早释放，从而导致疗效变差以及毒性增加。因此，具有高效pH敏感性和无毒的“门卫”以防止药物的过早释放成为了急需解决的问题。

ZnO纳米粒易制备，价格低廉，可生物降解，且在pH=7.4时稳定存在，在pH<5.5时迅速溶解。更重要的是，ZnO溶解后对正常细胞无毒。

壳聚糖（Cs）是一种天然高分子多糖，因其具有良好的药物缓释性、生物相容性、生物可降解性且无毒廉价等特性而备受研究者的青睐。

发明内容

基于以上研究背景，本发明提供了一种可靶向不同分子分型肺癌、实现可控近红外成像、并可联合分子靶向/光动力治疗的纳米诊疗及制备方法和用途。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种兼具分子靶向及可控光动力治疗的纳米诊疗剂，其以介孔二氧化硅纳米粒（MSN）作为药物靶向输送的载体核心，将吲哚菁绿（ICG）通过物理吸附装载在MSN内部，并将氧化锌量子点（ZnO QDs）通过正负电荷相互作用嵌在MSN的孔隙处；然后将厄洛替尼（Er）通过化学合成的方法连接到壳聚糖（Cs）的骨架上，再利用含有二硫键的末端炔基化合物使其相互交联并包裹在MSN的外部，制得所述纳米诊疗剂ECMI。

其中，利用ZnO QDs的酸降解特性，使ICG能在特定肿瘤细胞内有效释放，进行近红外荧光成像；而Er可选择性识别EGFR突变型肺癌细胞，并在谷胱甘肽（GSH）和溶菌酶存在的条件下，通过使二硫键断裂，壳聚糖链断开，而使Er释放出来。ICG作为一种光敏剂，可以用于光动力治疗，克服肿瘤耐药性，增强治疗效果。

所得纳米诊疗剂ECMI的粒径为100-400 nm。

其中，厄洛替尼的接枝量为30 wt%-80 wt%；吲哚菁绿的装载量为10 wt%-20 wt%。

壳聚糖的交联度为0.1-0.5%。

所述含有二硫键的末端炔基化合物为3,3'-二硫（N-（丙-2-炔基）丙酰胺）；其是将二乙撑三胺五乙酸（DTPA）溶于CH₂Cl₂中，然后逐滴加入到二环己基碳二亚胺（DCC）的CH₂Cl₂溶液中，冰浴反应2 h，再逐滴加入炔丙胺的CH₂Cl₂溶液，反应过夜后过滤、浓缩制得。

所述纳米诊疗剂的制备方法是在制备的介孔二氧化硅纳米粒MSN中装载吲哚菁绿ICG，然后用ZnO QDs封闭其表面孔隙，再利用“点击化学”反应机理，将厄洛替尼Er修饰的壳聚糖二硫键交联聚合物偶联在其表面，得到所述纳米诊疗剂；其包括如下步骤：

（1）将十六烷基三甲基氯化铵与三乙醇胺、四乙基硅烷混合搅拌，得到羟基修饰的MSN（MSN-OH）；

（2）将MSN-OH通过3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰，得到氨基修饰的MSN（MSN-NH₂）；

（3）将MSN-NH₂与ICG通过静电相互作用，得到负载ICG的MSN纳米粒（MI）；

（4）将MI与ZnO-NH₂QDs通过静电相互作用，得到ZnO封闭的MSN纳米粒（MI-ZnO）；

（5）将Cs与Er通过click化学反应得到Er修饰的Cs（EC）；

（6）EC之间通过二硫键连接并包覆在MI-ZnO表面，得到ECMI。

本发明所得纳米诊疗剂不仅可用于肺癌细胞近红外荧光成像，还可用于肺癌的分子靶向/光动力治疗；其中，光动力治疗时的波长为700-800 nm。

本发明的显著效果在于：

（1）本发明中以MSN作为光敏剂ICG的载体，以达到运载药物的目的；ZnO QDs在酸性条件下可溶解，从而使ICG从MSN内部释放出来，用于响应性可控近红外荧光成像和光动力治疗；而厄洛替尼分子的加入可以使所得诊疗剂能有效识别EGFR突变型NSCLC，且厄洛替尼在GSH和溶菌酶的作用下可在细胞内释放，实现肺癌的靶向治疗。

（2）本发明诊疗剂粒径小于300 nm，可以通过静脉给药，输送到肿瘤部位。

（3）本发明研发了一种高效新型的纳米诊疗剂，其可以对不同的肺癌分型做出成像诊断，并可达到分子靶向与光动力联合治疗的效果。

附图说明

图1为本发明所制备ECMI的粒径分布图。

图2为不同纳米粒的表面电势图。

图3为不同纳米粒的紫外吸收图。

图4为不同纳米粒的荧光光谱图。

图5为不同pH条件下，ECMI中Er的释放曲线图（A）和ICG的释放曲线图（B）。

图6为本发明所制备ECMI的共聚焦成像图。

图7为不同纳米粒分别对肺癌细胞A549、PC-9、H1975体外细胞毒性情况的对比图。

图8为不同纳米粒分别诱导肺癌细胞A549、PC-9、H1975凋亡情况的对比图。

图9为不同纳米粒分别对肺癌细胞A549、PC-9、H1975细胞周期影响情况的对比图。

图10为不同纳米粒分别对肺癌细胞A549、PC-9、H1975细内ROS产生的影响情况对比图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

量取20 mL超纯水于50 mL圆底烧瓶中，加入2.0 g十六烷基三甲基氯化铵（CTAC），室温搅拌至完全溶解后，加入0.2 mg三乙醇胺（TEA），于95℃油浴中恒温加热冷凝搅拌1 h。随后逐滴加入1.5 mL四乙基硅烷（TEOS），继续于95℃油浴中恒温加热冷凝搅拌1 h。将样品冷却至室温，用无水乙醇高速离心洗涤3-4次以除去残留的反应试剂。然后收集样品于20mL的洗涤溶剂（0.2 g氯化钠溶于20 mL甲醇）中，室温搅拌3 h，用甲醇高速离心洗涤3-4次以除去模板剂CTAC，冷冻干燥，即得白色MSN固体粉末。

取100 mg MSN，与2.5 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）共同溶于20 mL无水乙醇中，再在常温下搅拌12 h。将样品液在15000 rpm下离心10 min，移除上清，然后分别用无水乙醇与超纯水洗涤3遍来除去反应残留，所得的固体物质冷冻干燥后即可得到MSN-NH₂。

实施例2

称取600 mg实施例1所得MSN-NH₂固体粉末，溶于50 mL甲醇中，然后加入5 mgICG，室温避光搅拌8 h，10000 rpm离心10 min，所得沉淀分别用乙醇和二次水洗涤3次，然后将所得产物冷冻干燥，即得MI。

实施例3

称取2.2 g醋酸锌和220 mg醋酸镁（Zn：Mg=10：1），溶于150 mL无水乙醇中，50 ℃加热搅拌直至其溶解。称取500 mg NaOH，溶于30 mL无水乙醇中，70 ℃加热搅拌，待其完全溶解后，在冰浴中降温，随后快速加入到装有醋酸锌和醋酸镁的烧瓶中，冰浴条件下反应8h。反应结束，加入正己烷，生成沉淀。8000 rpm离心5 min。然后将固体再次溶于无水乙醇，加入正己烷，再次离心，重复以上步骤3次，所得产物放于通风橱干燥，得ZnO QDs。

称取500 mg ZnO QDs，溶于75 mL DMF中，超声使其溶解，然后加入250 µL APTES，120 ℃反应15 min，8000 rpm离心5 min，产物用DMF洗涤3次。产物抽滤干燥，得到ZnO-NH₂QDs。

① 称取600 mg实施例1所得MSN-NH₂溶于二次水中，随后加入500 mg ZnO-NH₂QDs，室温下避光搅拌反应4小时，5000 rpm离心10 min，水洗三次，产物冷冻干燥，得到固体MSN-ZnO。

② 称取600 mg实施例2所得MI溶于二次水中，随后加入500 mg ZnO-NH₂ QDs，室温下避光搅拌反应4小时，5000 rpm离心10 min，水洗三次，产物冷冻干燥，得到固体MI-ZnO。

实施例4

称取500 mg壳聚糖分散于约60 mL的无水DMF中，并加入1 g溴邻苯二甲酸酐，于120 ℃氮气保护下反应0.5 h。当体系由白色浑浊液变澄清后，停止反应，趁热倒入一定量的冰水中，有固体析出。抽滤，并用丙酮和乙醚洗涤固体，最后将固体放于通风处干燥，得到产物N-（4-溴邻苯二甲亚胺基）壳聚糖（Cs-Br）。

称取300 mg Cs-Br于烧杯中，加入约30 mL的N-甲基吡咯烷酮，在油浴锅中加热使其完全溶解。称取500 mg的叠氮化钠加入烧瓶中，在80℃氮气保护下搅拌反应24 h。将反应物倒入烧杯中，加入300 mL的乙醇洗出沉淀，离心收集沉淀物。将沉淀物用二次水洗涤3次，丙酮洗涤2次，最后将所得到的沉淀物在通风厨内干燥，得到产物N-（4-叠氮基邻苯二甲亚胺基）-壳聚糖（Cs-N₃）。

在10 mL烧瓶中加入50 mg Cs-N₃，溶于3 mL二甲亚砜，随后加入20 mg厄洛替尼。烧瓶用橡胶塞密封，抽真空后，氮气保护。用1 mL 注射器依次往烧瓶内滴加2.5 mg五水硫酸铜（溶于100 μL二次水中）、2 mg抗坏血酸钠（溶于100 μL二次水中）。50 ℃下避光反应72h。反应结束后反应液用规格为8000 ~ 10000的透析袋透析72 h，将产物冷冻干燥，得固体EC。

实施例5

称取247.6 mg二环己基碳二亚胺（DCC）溶于CH₂Cl₂中，N₂保护下冰浴搅拌溶解。称取210.27 mg二乙撑三胺五乙酸（DTPA）溶于5 mL CH₂Cl₂中，然后逐滴加入装有DCC的烧瓶中，冰浴反应2 h，再逐滴加入炔丙胺的CH₂Cl₂溶液，反应过夜。过滤除去白色沉淀物，浓缩，分离，得固体3,3'-二硫（N-（丙-2-炔基）丙酰胺）。

① 称取18 mg实施例3所得MSN-ZnO，溶于2 mL二次水中。然后分别称取6 mg 3,3'-二硫（N-（丙-2-炔基）丙酰胺）和18 mg实施例4所得EC，将其溶于30 mL DMSO中，用1 mL注射器往烧瓶内依次滴加4 mg五水硫酸铜（溶于300 μL二次水中）、20 mg抗坏血酸钠（溶于300 μL二次水中）。50 ℃、N₂保护下避光反应72 h。反应结束后，6000 rpm，离心15 min，DMSO洗，乙醇洗，水洗各两次。将产物冷冻干燥，得固体ECM。

② 称取18 mg实施例3所得MI-ZnO，溶于2 mL二次水中。然后分别称取6 mg 3,3'-二硫（N-（丙-2-炔基）丙酰胺）和18 mg实施例4所得Cs-N₃，将其溶于30 mL DMSO中，用1 mL注射器往烧瓶内依次滴加4 mg五水硫酸铜（溶于300 μL二次水中）、20 mg抗坏血酸钠（溶于300 μL二次水中）。50 ℃、N₂保护下避光反应72 h。反应结束后，6000 rpm，离心15 min，DMSO洗，乙醇洗，水洗各两次。将产物冷冻干燥，得固体CMI。

③ 称取18 mg实施例3所得MI-ZnO，溶于3 mL二次水中。然后分别称取6 mg 3,3'-二硫（N-（丙-2-炔基）丙酰胺）和18 mg实施例4所得EC，将其溶于35 mL DMSO中，用1 mL注射器往烧瓶内依次滴加4 mg五水硫酸铜（溶于300 μL二次水中）、20 mg抗坏血酸钠（溶于300μL二次水中）。50 ℃、N₂保护下避光反应72 h。反应结束后，6000 rpm，离心15 min，DMSO洗，乙醇洗，水洗各两次。将产物冷冻干燥，得固体ECMI。

将所得ECMI溶于二次水中，检测其粒径，结果如图1所示。由图1可见，ECMI的平均粒径为235.2±20 nm。

将所得MSN-NH₂、MI、MI-ZnO、ECMI溶于二次水中，检测其表面电势图，结果如图2所示。由图2可见，MSN-NH₂表面带有正电荷，其电势为：17.8±0.2 mV；由于ICG表面带有负电荷，MI的电势为：-29.2±0.5 mV；由于ZnO-NH₂ QDs表面带有正电荷，MI-ZnO的电势为：19.1±0.1 mV；ECMI的电势为：-21.1±0.4 mV。

将所得EC、ECM、ECMI溶于DMSO中，检测其紫外吸收，结果如图3所示。由图3可见，在343 nm波长范围处EC及ECM、ECMI均出现有Er的紫外吸收峰，这表明Er已成功连接在Cs上，且EC成功覆盖在MSN表面。

将MI、MI-ZnO、ECMI溶于无水乙醇中，在激发波长为700 nm的条件下检测其荧光强度，，结果如图4所示。由图4表明，ICG成功通过静电相互作用负载在MSN内部形成MI；ZnO-NH₂ QDs通过静电相互作用嵌在MSN的空隙处，造成ICG荧光减弱，但无法完全使其“淬灭”；而CE覆盖在MSN表面时，可以完全使ICG荧光“淬灭”。

实施例6

称取40 mg ECMI，用4 mL含有20%乙醇和1.25 mg/mL溶菌酶的PBS将其分散，置于透析袋中，将透析袋分别置于装有20 mL pH值为5.5和7.4的PBS的烧杯中，37℃磁力搅拌。在0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、16 h、24 h和48 h时间点取样，分别采用紫外分光光度计和酶标仪测定Er和ICG在各个时间点的积累释放量，结果如图5所示。

如图5所示，在pH值为5.0的酸性条件下，Er 48 h内的累积释放量达到75%左右，这是因为溶菌酶在酸性条件下活性较强，它可以水解壳聚糖中的糖苷键，可将壳聚糖链断裂呈小分子片段，使带着Er小分子片段更容易释放出来。而由于溶菌酶在碱性条件下易失活，因此ECMI在pH值为7.4的条件下释放缓慢，48 h内Er的累积释放量只达到40%左右。同时，在pH为7.4的PBS中，ICG 48 h内的累积释放量为5%左右，而在pH为5.0的PBS中，ICG的累积释放量为50%左右。这主要是由于ZnO QDs在酸性条件下溶解，使ICG能从MSN中释放出来，而其在中性或碱性条件下不溶解。

以人肺癌细胞系A549细胞（EGFR野生型）、PC-9（EGFR敏感突变型）和H1975细胞（EGFR耐药突变型）为测试细胞系（细胞购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心）。

细胞培养方法：从液氮罐中取出A549、PC-9和 H1975三种细胞保种管，迅速投入37℃水浴锅中摇晃约1 min使其快速融化，然后用1 mL的移液枪吸取细胞悬浮液，置于1.5 mL的离心管中，1500 rpm离心5 min，吸弃上清液，取1 mL 1640培养基将离心管底部细胞沉淀吹打均匀，然后转移至培养瓶中，加入3 mL培养基，轻轻摇晃培养瓶使细胞分布均匀，然后将培养瓶置于37 ℃，5 % CO₂培养箱中继续培养，24 h后弃掉旧培养基，用4 mL 无菌PBS清洗三遍，继续加入4 mL新鲜1640培养基继续培养。

实施例7

共聚焦成像实验：将PC-9细胞消化后加入到12孔板中，过夜，待细胞完全贴壁后，用PBS洗涤2遍，加入实施例5的ECMI，分别在37 ℃下孵育0.5h、2h和4h，然后用PBS洗涤2遍，加入溶酶体染料，37 ℃下孵育1 h，PBS洗涤2遍，用4% 多聚甲醛孵育固定10min，PBS洗涤2遍，然后加入DAPI，室温避光孵育10min，然后PBS洗涤2遍。激光共聚焦成像，结果如图6所示。

从图6中可以看出，在PC-9细胞中，ECMI可以靶向进入细胞质，且4 h的荧光强度更强。表明ECMI可以靶向输送到PC-9细胞中成像，为肿瘤治疗提供有效的手段。

实施例8

选取对数生长期且状态良好的A549、PC-9和H1975细胞，经胰蛋白酶消化后配成细胞浓度为0.5-1×10⁵个/mL的细胞悬液。按每孔100 µL细胞悬液的量接种到96孔板，培养24h后，加入ICG、Er、EC、ECM和ECMI，另设溶剂对照组和空白对照组，并将ICG和ECMI两实验组用或不用近红外光照射，用于比较光动力的治疗效果。孵育48 h后，吸弃旧培养基，PBS洗3遍，并于每孔中加入90 µL无血清、无酚红的1640培养基和10 µL MTT溶液，继续孵育4 h后，小心吸弃上清液，于每孔中加入150 µL二甲基亚砜，避光振荡10 min，使蓝紫色结晶全部溶解，用多功能酶标仪于570 nm波长处测定各孔的吸收度，并按下式计算细胞的存活率。不同纳米粒的细胞毒性的结果如图7所示。

存活率（%）=（实验组吸收值-溶剂对照组吸收值）/（空白组吸收值-溶剂对照组吸收值）。

从图7中可以看出，ECMI的细胞毒性比其他纳米粒的细胞毒性强；且在ECMI的作用下，A549、PC-9和H1975的细胞活性分别为72.8%、33%和44.7%，这表明ECMI能更好的杀死PC-9细胞。同时，与比ECMI实验组，采用近红外光照射的ECMI+NIR实验组能引起更多的细胞死亡，这表明光动力治疗可明显增强ECMI的抗肿瘤效果。

实施例9

取对数生长期且状态良好的A549、H1975和PC-9细胞消化计数后，将细胞悬液接种于6孔板中，置于培养箱中培养24 h，待细胞完全贴避，吸弃旧培养基，用PBS清洗三遍，每孔分别加入1.5 mL含有ICG、Er、EC、ECM和ECMI的培养基，并将ICG和ECMI两实验组用或不用近红外光照射，用于比较光动力的治疗效果。孵育48 h后，吸弃旧培养基，用PBS清洗三遍，每孔加入1 mL不含EDTA胰酶的消化液消化5 min，待细胞完全漂浮后转入1.5 mL离心管，1500rpm离心5 min，吸弃上清，用PBS清洗两次，1500 rpm离心5 min，弃上清收集离心管底部细胞沉淀。设置两个单阳管，分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，每管再加入500 μLbinding buffer 缓冲液吹打混匀，避光孵育15 min。设定阴性对照管，无需添加染料，加入500 μL binding buffer 缓冲液吹打混匀，上流式细胞仪在488 nm激发波长下检测分析实验结果。不同纳米粒诱导细胞凋亡的结果如图8所示。

从图8中可以看出，在ECMI的作用下，A549、PC-9和H1975细胞凋亡分别为20.2%、56.2%和34.2%，这表明ECMI能更好的杀死PC-9细胞；而且ECMI+NIR实验组引起的细胞凋亡量明显高于ECMI实验组，这表明光动力治疗可明显增强ECMI的抗肿瘤效果，该结果与细胞毒性结果一致。

实施例10

取对数生长期且状态良好的A549、H1975和PC-9细胞经胰蛋白酶消化后，配制成细胞悬液并计数。吸取细胞悬液接种于6孔板，细胞密度为4×10⁵cell/孔，之后置于培养箱中培养24 h，吸弃旧培养基，PBS清洗三遍，每孔分别加入1.5 mL含有ICG、Er、EC、ECM和ECMI的培养基，并将ICG和ECMI两实验组用或不用近红外光照射，用于比较光动力的治疗效果。孵育48 h后，吸弃含药旧培养基，用PBS清洗三遍，每孔加入1 mL不含EDTA胰酶的消化液消化5min，待细胞完全漂浮后转入1.5 mL离心管，1500 rpm离心5 min，弃上清，用预冷的PBS清洗细胞两次，1500 rpm离心5 min，弃上清，收集底部细胞沉淀。在离心管中留约0.1 mL的预冷PBS，用移液枪将轻轻吹打细胞，使细胞混匀，再向离心管中缓慢匀速的加入1 mL预冷的70%乙醇，之后将离心管置于4 ℃固定24 h。然后将固定好的细胞放入低速离心机1500 rpm离心5 min，弃上清收集离心管底部细胞沉淀，预冷PBS洗涤2遍，弃上清，离心管底部预留50 μL细胞悬液轻吹混匀，之后每管中加500 μL的碘化丙啶（PI）染料，室温下避光染色30 min。以488 nm为激发波长，用流式细胞仪检测，用软件Modfit处理分析结果。不同纳米粒对细胞周期的影响结果如图9所示。

从图9中可以看出，与ICG、Er、EC、ECM实验组相比，ECMI实验组G1/G0期增加，这表明ECMI能将细胞增殖阻滞在G1/G0期。而且ECMI+NIR实验组的G1/G0期细胞高于ECMI实验组，这表明ECMI在近红外光照射下可以进一步促使细胞增殖阻滞在G1/G0期。

实施例11

选取对数生长期且状态良好的A549、PC-9和 H1975细胞经胰蛋白酶消化后，配成细胞浓度为1-1.5×10⁶个/mL的细胞悬液。按每孔100 µL细胞悬液的量接种到6孔板，培养24h后，每孔加入1.5 mL含有ICG、MI、CMI和ECMI的培养基，另设空白对照组，并将所有实验组用近红外光照射。孵育48h后，吸弃旧培养基，每孔加入1 mL含有 DCFH-DA的无酚红培养基（10 μM），然后将6孔板置于37 ℃培养箱中继续避光孵育30min。吸弃旧培养基，PBS洗3遍，消化细胞，用流式细胞仪检测。不同纳米粒对细胞内ROS产生的影响结果如图10所示。

从图10中可以看出，在PC-9细胞中，ICG、MI、CMI和ECMI实验组产生的ROS量分别是Control组的1.59、3.62、3.62和7.7倍。这表明ECMI在近红外光的照射下能增强其抗肿瘤效果，是由于其能产生更多的ROS，ROS和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1. 一种兼具分子靶向及可控光动力治疗的纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于：所述纳米诊疗剂是以内部负载着吲哚菁绿的介孔二氧化硅纳米粒为载体，采用ZnO QDs封闭介孔二氧化硅纳米粒表面的孔隙，并在其表面包覆厄洛替尼修饰的壳聚糖二硫键交联聚合物而制得；

所述厄洛替尼修饰的壳聚糖二硫键交联聚合物是将厄洛替尼修饰的壳聚糖链之间通过含有二硫键的末端炔基化合物交联而成；所述含有二硫键的末端炔基化合物为3,3'-二硫（N-（丙-2-炔基）丙酰胺）；

其具体包括以下步骤：

（1）将十六烷基三甲基氯化铵与三乙醇胺、四乙基硅烷混合搅拌，得到MSN-OH；

（2）将MSN-OH通过3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰，得到MSN-NH₂；

（3）将MSN-NH₂与ICG通过静电相互作用，得到负载ICG的MSN纳米粒MI；

（4）将MI与ZnO-NH₂QDs通过静电相互作用，得到ZnO封闭的MSN纳米粒MI-ZnO；

（5）将Cs与Er通过click化学反应，得到EC；

（6）EC壳聚糖链之间通过含有二硫键的末端炔基化合物连接，并包覆在MI-ZnO表面，得到ECMI。

2. 根据权利要求1所述的纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于：所述纳米诊疗剂的粒径为100-400 nm。

3. 根据权利要求1所述的纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于：厄洛替尼的接枝量为30 wt%-80 wt%；吲哚菁绿的装载量为10 wt%-20 wt%。

4.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于：壳聚糖的交联度为0.1-0.5%。