CN113440611B - 一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统及其制备方法。所述药物传递系统包括主体材料，所述主体材料为表面修饰有氨基的HMSNs；所述主体材料内通过物理包埋有化疗药和光敏剂，含二醛的氧化透明质酸与所述氨基通过席夫碱反应包裹在主体材料外表面。本发明将化疗药和光敏剂共载进了具有靶向功能的响应型药物载体中，能够将化学治疗和光动力治疗两种模式相结合，大大的提高了治疗效果。

Description

一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统及其制 备方法
技术领域
本发明属于药物传递系统领域，具体涉及一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统及其制备方法。
背景技术
癌症是目前对人类生命健康最大的威胁之一，尽管在癌症的临床治疗中，化疗被认为是当前相对有效的治疗方式，但是许多感染癌症的病人在接受化疗后会产生很多不良反应导致难以康复，这是因为化疗药缺乏选择性，会对人体正常的细胞造成损伤，毒副作用大。其次，许多的化疗药物因为在体内的溶解度太低，导致有效的药物浓度太低最终治疗率低下，除此之外化疗药物的长期滥用会使癌细胞对化疗药产生耐药性，这也严重导致最终的治疗效果不理想。
在扫除化疗所面临的障碍方面，研究者们为了增加药物的溶解性、选择性、提高药物的有效浓度，减少毒副作用，设计了一系列的药物传递系统，通过将化疗药物装载进载体中，然后在其表面包裹上透明质酸、壳聚糖等天然高分子材料，或者多肽、仿生材料来提高载体的稳定性以及生物相容性，最后修饰上靶向基团，如：乳糖、叶酸、RGD等，精准的靶向肿瘤细胞并定点释放出化疗药，从而避免对正常细胞带来损伤，并大大提高了化疗药的有效浓度，从而更好地杀死肿瘤细胞。透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种天然线性多糖，因为能够与肿瘤细胞表面过度表达的CD44，RHAMM等受体相互识别常被作为靶向分子应用于药物载体系统。专利CN201410673636.2公开了介孔纳米硅球复合物靶向给药系统及其制备方法和应用，其制得荧光标记物修饰的介孔微球-透明质酸-巯基多肽-阿霉素-紫杉醇复合物(MSNs-HA-RGD-DOX—PTX)，尽管该系统可以实现多靶向协同给药，但是依旧是两种化疗药的结合，依旧会导致癌细胞的多药耐药性；其次，该系统虽然在外部连接上了阿霉素，但是阿霉素不能有效地突释也会导致治疗效果不佳。
介孔硅(MSNs)因其稳定性好、表面易修饰分散性良好等特点一度成为研究的热点，其高密度的空腔和比表面积，可以用来封装传统的化疗药，解决传统药物所面临的稳定性差和水溶性差的问题，华南理工大学Lijuan Zhang等人构建了一种pH响应型药物传递系统(Polymer@MSN-DOX)，共聚物PEGMA-co-MAEBA作为堵孔剂通过酸敏感的席夫碱键包覆在载有阿霉素的介孔硅表面防止药物泄露，当Polymer@MSN-DOX通过EPR效应进入肿瘤细胞后，在肿瘤酸性条件下席夫碱键水解，共聚物脱落，装载的DOX释放抑制肿瘤细胞，但是该体系缺少靶向性，并且只能实现单一化疗。更为突出的是，MSNs过低的载药量(10％以下)满足不了临床需求的剂量大大限制了MNSs的发展。例如武汉大学Xian-Zheng Zhang团队研发的以MSNs作为载体的系统总载药量仅为8％。这远满足不了临床要求的药物剂量，为了克服这一短板，研究者们对MSNs进行了改造，合成了继承MSNs所有优点的，并具有更高载药能力的中空介孔硅(HMSNs)。与传统的MSNs密集排布的微孔结构相比，HMSNs仅在表层含有大量的介孔，而内层则是一个巨大的空腔，因而可以装载更多的药物。HMSNs也被认为是第二代理想的药物载体，逐渐成为研究的热点。中空介孔硅自从被报道以来，就因其特殊的物理性质、良好的生物相容性、稳定性以及分散性而受到广泛的关注。其中应用最为广泛的就是药物传递系统，由于HMSNs拥有大体积的空心内核使得其拥有很高的比表面积，并且表面含有许多硅醇使得在其表面进行化学修饰更为简单。因此，以HMSNs作为载体材料的药物传递系统较传统的系统拥有更高的载药量和易修饰性，目前已经有很多的研究将多种药物共载进HMSNs实现联合治疗以提高治疗效果。专利CN201611094868.8公开了双功能介孔硅球复合靶向给药系统的制备方法，其制得的Fe3O4/PS@HMSNs-FA-HA-CLB/DOX，能够实现FA/HA双受体介导的多重靶向给药，然而该载体系统忽略了装载的药物在血液循环过程中泄露的问题，因为在HMSNs的表面并没有封堵剂将孔道堵住，装载的DOX会泄露，这会导致对正常细胞造成损伤。
除了通过设计药物传递系统增加药物的溶解性、选择性、提高药物的有效浓度，减少毒副作用等方面来提高化疗的治疗效果，研究者们发现仅靠单一治疗手段并不能完全的杀死肿瘤细胞，为此，科学家们探索多种治疗模式联合治疗来提高治疗效果。当前，以化疗/光动力治疗、化疗/光热治疗、化疗/化疗等为代表的多种治疗模式联合的协同治疗成为科学家们研究的热点。
光动力治疗(PDT)是一种新兴的非侵入式的癌症治疗模式，它的治疗机制是：光敏剂(PS)在特定波长的激光照射下产生具有很强细胞毒性的活性氧(ROS)从而不可逆转的杀死肿瘤细胞，常见的活性氧包括：单线态氧(1O2)、过氧化氢(R-O-O·)、羟基自由基(·OH)。由于出色的治疗效果，光动力治疗很快受到研究者们的青睐，而以化疗联合光动力治疗的药物传递系统更是被广泛地研究。中山大学Zong-Wan Mao等人基于介孔硅构建了一种化疗联合光动力治疗的药物载体系统(Dox@MSNs-Ce6)，MSNs作为宿主材料，DOX通过疏水作用被固定在MSNs孔道中，光敏剂chlorin e6(Ce6)通过共价键接枝在MSNs表面。尽管该体系能够实现化疗光动力联合治疗，但是整个体系没有封堵剂仅靠疏水作用将DOX固定在MSNs孔道中，而疏水作用力不强，会导致DOX泄露，造成毒副作用。
孟加拉玫瑰红(Rose Bengal，RB)作为一种光敏剂，因其在532nm的光照条件下具有很高的活性氧产率而被广泛的应用于光动力治疗，然而游离的RB依旧面临着稳定性差溶解低的问题。阿霉素(Doxorubicin，DOX)是一种传统的化疗药，因为能适用于各种癌症的治疗而被广泛的用于化疗。但是，由于自身不具有选择性而常常导致严重的毒副作用。因此，亟需提高RB的稳定性以及DOX的选择性以提高其抗肿瘤的效果。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统，通过实现化疗和光动力治疗联合，能够大大提升对癌细胞的抑制作用，为用于肿瘤联合治疗的药物传递系统的研究提供了一种新的方法。
本发明的另一目的在于提供上述药物传递系统的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现。
一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统，包括主体材料，所述主体材料为表面修饰有氨基的HMSNs；所述主体材料内通过物理包埋有化疗药和光敏剂，含二醛的氧化透明质酸与所述氨基通过席夫碱反应包裹在主体材料外表面。
本发明构建了一种自封堵自靶向的pH响应型纳米药物传递系统，将HMSNs作为主体材料来封装化疗药和光敏剂，可以提高光敏剂的稳定性和溶解性；将透明质酸进行氧化并通过酸敏感的席夫碱键连接在HMSNs-NH2表面，既可以堵住HMSNs的孔道防止药物泄露又可以增加系统的靶向能力。所述药物传递系统通过氧化透明质酸的主动靶向进入肿瘤细胞后，响应肿瘤微酸内环境，席夫碱水解HA脱落释放出主体材料中的化疗药和光敏剂，在激光照射下实现化疗/光动力联合治疗，能够大大提升对癌细胞的抑制作用。同时，本发明包裹有氧化透明质酸的HMSNs载体材料对细胞无毒具有很强的生物安全性，包埋化疗后和光敏剂的所述药物传递系统在正常血液循环中保持稳定，装载的药物不会提前释放造成毒副作用。
所述化疗药选自阿霉素、紫杉醇、顺铂中的任意一种。所述光敏剂选自孟加拉玫瑰红、吲哚箐绿、Ce6中的任意一种。考虑药物的溶解性等因素，优选的，所述化疗药为阿霉素，所述光敏剂为孟加拉玫瑰红。即，可将所述药物传递系统记为RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA。将化疗药DOX和光敏剂RB共载进了具有靶向功能的响应型药物载体中，大大的提高了治疗效果。
优选的，所述表面修饰有氨基的HMSNs：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:1:1～5:3:3。更优选的，所述表面修饰有氨基的HMSNs：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:3:2。
优选的，所述表面修饰有氨基的HMSNs：含二醛的氧化透明质酸的质量比为1:1～1:2。更优选的，所述表面修饰有氨基的HMSNs：含二醛的氧化透明质酸的质量比为1:1。
本发明还提供所述的用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、HMSNs的制备；
S2、将所述HMSNs表面修饰氨基，即得到HMSNs-NH2；
S3、将HA氧化得到含二醛的氧化透明质酸，即得到oxi-HA；
S4、将化疗药与光敏剂通过物理包埋的方式共载进S2制备得到的HMSNs-NH2，利用席夫碱反应将S3得到的oxi-HA包裹在载药的HMSNs-NH2表面得到所述药物传递系统。
本发明方法以HMSNs为宿主载体，在其表面修饰上氨基，将化疗药与光敏剂通过物理包埋的方式共载进HMSNs，然后使氧化透明质酸上的两个-CHO与HMSNs表面的氨基发生席夫碱反应把HA包裹在载有药物的HMSNs的表面，一方面堵住HMSNs的孔道防止药物泄露，另一方面利用HA的靶向肿瘤细胞，构建了具有自靶向自封堵的pH响应型药物传递系统来实现对肿瘤细胞的化疗/光动力治疗。
步骤S1的中空介孔硅纳米颗粒HMSNs的制备可采取现有方法，优选的，步骤S1中HMSNs的制备包括如下步骤：
1)实心二氧化硅的制备：无水乙醇、去离子水、氨水，在30℃下充分搅拌，正硅酸四乙酯(TEOS)逐滴加入到上述混合溶液，然后持续剧烈搅拌反应，离心洗涤沉淀，真空干燥即可得到实心二氧化硅；
2)制备二氧化硅@CTAB-二氧化硅(SiO2@CTAB-SiO2)：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、去离子水、无水乙醇、氨水在30℃下充分搅拌，并加入超声分散好的SiO2悬浊液，继续搅拌，最后正硅酸四乙酯(TEOS)逐滴加入上述悬浮液在30℃下持续剧烈搅拌反应，离心洗涤沉淀，真空干燥即可得到SiO2@CTAB-SiO2；
3)制备CTAB@中空介孔硅(CTAB@HMSNs)：用去离子水超声分散2)中制备的SiO2@CTAB-SiO2，并加入NaCO3溶液在50℃下搅拌反应20h；离心洗涤沉淀，真空干燥即可得到CTAB@HMSNs；
4)制备HMSNs：将3)中制备的CTAB@HMSNs全部加入甲醇中超声分散，然后加入盐酸，在80℃下回流反应48h；离心洗涤沉淀，真空干燥即可得到HMSNs。
优选的，所述步骤1)实心二氧化硅的制备中，无水乙醇、去离子水、氨水、正硅酸四乙酯的体积比分别为214:30:5:5。
优选的，所述步骤2)制备二氧化硅@CTAB-二氧化硅中，CTAB、去离子水、无水乙醇、氨水、二氧化硅、正硅酸四乙酯的投料比为450mg:90mL：90mL：1.65mL：300mg：0.75mL。
优选的，所述步骤3)制备CTAB@中空介孔硅中SiO2@CTAB-SiO2、NaCO3的质量比为500:2.13。
优选的，所述步骤4)制备HMSNs中CTAB@HMSNs、甲醇、盐酸的投料比为2.4g:50mL:3mL。
优选的，步骤S1中HMSNs的制备也可采用如下方法制备得到：
将450mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，然后依次加入90mL的去离子水、90mL的无水乙醇和1.65mL的氨水在30℃下充分搅拌溶解30min，得混合溶液；同时将300mg实心的SiO2放入60ml的去离子水中超声分散30min，然后快速加入上述混合溶液中继续剧烈搅拌30min；最后将0.75mL正硅酸四乙酯(TEOS)逐滴加入并在30℃下持续剧烈搅拌反应6h；11000rpm离心13min，所得的沉淀用去离子水和无水乙醇反复交替洗涤3次，将最终的白色沉淀在50℃下真空干燥过夜即可得到SiO2@CTAB-SiO2；
将500mg制备的SiO2@CTAB-SiO2加入到60mL的去离子水中充分超声分散30min，同时将2.13g NaCO3溶解在20mL的去离子水中，将分散好的SiO2@CTAB-SiO2悬浊液快速加入到NaCO3溶液中在50℃下搅拌反应20h；11000rpm离心13min，所得的沉淀用去离子水和无水乙醇反复交替洗涤3次，将最终的白色沉淀在50℃下真空干燥过夜即可得到CTAB@HMSNs；
将上述制备的CTAB@HMSNs全部加入50mL甲醇超声分散30min，然后加入3mL盐酸，在80℃下回流反应48h；11000rpm离心13min，所得的沉淀用去离子水和甲醇反复交替洗涤3次，将最终的白色沉淀在50℃下真空干燥过夜即可得到HMSNs。
上述制备的HMSNs是按照自模板法，即以实心的SiO2作为模板然后以CTAB作为表面活性剂，再在外层在形成一层SiO2，最后通过选择性刻蚀的方法用碳酸钠将内层的SiO2刻蚀掉，用盐酸将CTAB去除掉，最后得到空心的内核，表面具有规则的孔道的HMSNs。按照上述步骤制备得到的HMSNs纳米粒尺寸合适，比表面积大、表面易修饰、载药能力高且粒径均一分散性良好，是理想的药物载体。
优选的，步骤S2包括：将HMSNs加入到甲苯中超声均匀分散，然后逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应，将反应液离心，所得的沉淀用去离子水和无水乙醇反复交替洗涤，将最终的白色沉淀真空干燥过夜即可得到HMSNs-NH2；其中，所述HMSNs:甲苯：3-氨丙基三乙氧基硅烷的投料比为200mg：80mL:0.1mL～200mg：80mL:0.6mL。
更优选的，所述HMSNs:甲苯：3-氨丙基三乙氧基硅烷的投料比为200mg：80mL：0.5mL。
更优选的，步骤S2中，所述回流反应条件：在60℃下回流反应20h；所述离心条件：11000rpm离心13min；真空干燥过夜的温度为50℃。
优选的，步骤S4包括：将制备得到的HMSNs-NH2超声分散于MES buffer中，将化疗药和光敏剂分别溶于MES buffer中，将溶解好的化疗药阿霉素和光敏剂孟加拉玫瑰红加入分散好的HMSNs-NH2中，避光搅拌，加入用MES buffer溶解好的oxi-HA，继续在室温条件下避光搅拌；待反应结束后，离心，洗涤沉淀，真空干燥过夜即可得到所述药物传递系统；
其中，所述MES buffer的pH 6.0，浓度0.01M；所述HMSNs-NH2：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:1:1～5:3:3。
更优选的，所述HMSNs-NH2：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:3:2。
更优选的，所述HMSNs-NH2：阿霉素：孟加拉玫瑰红：oxi-HA的质量比为5:3:2:5。
更优选的，步骤S4包括：将50mg制备得到的HMSNs-NH2超声分散于30mL的MESbuffer(pH 6.0,0.01M)中，然后将30mg阿霉素和20mg孟加拉玫瑰红分别溶于10mL MESbuffer中，将溶解好的阿霉素和孟加拉玫瑰红加入分散好的HMSNs-NH2中，在25℃下避光搅拌24h；将50mg oxi-HA溶于10mL MES buffer中，然后将溶解好的oxi-HA加入到上述的反应液中，继续在室温条件下避光搅拌24h；待反应结束后，将反应液离心(11000rpm，13min)，洗涤沉淀，并在50℃下真空干燥过夜即可得到所述药物传递系统RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA。
优选的，步骤S3包括：将透明质酸、高碘酸钠分别溶于水中，然后将高碘酸钠溶液加入到透明质酸溶液中在室温下避光反应；用乙二醇反应掉过量的高碘酸钠；然后转移进行透析，将最终透析的反应液进行冷冻干燥即可得到oxi-HA；其中，所述透明质酸与高碘酸钠的质量比为5:4。
更优选的，步骤S3包括：将400mg透明质酸溶于40mL的去离子水中，将320mg高碘酸钠溶于12mL去离子水中，分别制备所述透明质酸溶液和高碘酸钠溶液。
更优选的，步骤S3还包括：将所述高碘酸钠溶液加入到透明质酸溶液中在室温下避光反应24h后，加入5mL乙二醇反应0.5h反应掉过量的高碘酸钠，然后转移进行透析，MWCO＝10K Da，去离子水作为透析液透析三天，其中透析液每天更换4次，将最终透析后的反应液进行冷冻干燥即可得到oxi-HA。
优选的，所述离心的条件均为11000rpm离心13min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的药物传递系统包封率高，化疗药达76.67％，光敏剂达95.85％；所述药物传递系统载药量高，可达到28.08％，其中化疗药为15.30％，光敏剂为12.78％。在pH为5.0的条件下，化疗药和光敏剂的累计释药率分别达到58.60％和46.86％。
(2)本发明将具有靶向能力的天然高分子材料HA进行氧化，得到含二醛的氧化透明质酸，并利用酸敏感的席夫碱键将氧化透明质酸包裹在HMSNs的表面，从而避免药物泄露，形成了自封堵自靶向的pH响应型纳米药物传递系统，这也是有文献和相关发明报道以来首次将氧化透明质酸(oxi-HA)作为靶向分子和封堵剂接枝在HMSNs。
(3)本发明优化选择化疗药DOX和光敏剂RB，并将其共载进了具有靶向功能的响应型药物载体中，在532nm光照下能够实现化疗/光动力联合治疗并有效的抑制肿瘤细胞的存活，存活率仅为10.9％。
(4)本发明采用自模板法制备了HMSNs，优化制备方法，使制得的产品孔径合适、比表面积大、表面易修饰、分散性良好，粒径低至120nm。
附图说明
图1为本发明实施例中所述药物传递系统的制备路线及其释药和治疗机制。
图2(a)为实施例1制备的HMSNs的透射电镜图，图2(b)(c)为实施例1制备的HMSNs-N＝C-HA的透射电镜图，且(c)为局部放大；(a)、(b)、(c)的标尺分别为：100nm、150nm、50nm。
图3为实施例1中HA和oxi-HA的红外光谱图。
图4为实施例1中HMSNs、HMSNs-NH2、HMSNs-N＝C-HA的红外光谱图。
图5为实施例1制备的药物传递系统中DOX在不同pH条件下药物释放曲线。
图6为实施例1制备的药物传递系统中RB在不同pH条件下药物释放曲线。
图7为应用例3中4T1细胞与不同浓度梯度的Free RB、RB@HMSNs-N＝C-HA、FreeDOX、DOX@HMSNs-N＝C-HA和RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA(实施例1)培养24h后的细胞存活率图，其中(a)为黑暗条件下培养，(b)为在培养过程中进行532nm光照5min。其中*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，误差棒均表示mean±SD(n＝4)。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
材料与试剂：正硅酸四乙酯、乙醇、甲醇、盐酸、氨水、碳酸钠均购于上海国药试剂；盐酸阿霉素、孟加拉玫瑰红、3-氨丙基三乙氧基硅烷、2-(N-吗啉)乙磺酸、透明质酸均购于上海麦克林生化科技有限公司。
具体实施方式中提供一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统，包括主体材料，所述主体材料为表面修饰有氨基的HMSNs；所述主体材料内通过物理包埋有化疗药和光敏剂，含二醛的氧化透明质酸与所述氨基通过席夫碱反应包裹在主体材料外表面。
所述化疗药选自阿霉素、紫杉醇、顺铂中的任意一种/多种。所述光敏剂选自孟加拉玫瑰红、吲哚箐绿、Ce6中的任意一种/多种。
为实施例和对比例描述方便，将以下实施例中化疗药限定为阿霉素，光敏剂限定为孟加拉玫瑰红。
所述表面修饰有氨基的HMSNs：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:1:1～5:3:3。
所述表面修饰有氨基的HMSNs：含二醛的氧化透明质酸的质量比为1:1～1:2。
经过前期试验研究，具体实施方式提供上述药物传递系统的优选制备方法，具体包括如下步骤：
S1、HMSNs的制备或购买；
S2、将所述HMSNs表面修饰氨基，即得到HMSNs-NH2：
将HMSNs加入到甲苯中超声均匀分散，然后逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应，将反应液离心，所得的沉淀用去离子水和无水乙醇反复交替洗涤，将最终的白色沉淀真空干燥过夜即可得到HMSNs-NH2；其中，所述HMSNs:甲苯：3-氨丙基三乙氧基硅烷的投料比为200mg：80mL:0.1mL～200mg：80mL:0.6mL；
S3、将HA氧化得到含有二醛的氧化透明质酸，即得到oxi-HA：
将透明质酸、高碘酸钠分别溶于水中，然后将高碘酸钠溶液加入到透明质酸溶液中在室温下避光反应；用乙二醇反应掉过量的高碘酸钠；然后转移进行透析，将最终透析的反应液进行冷冻干燥即可得到oxi-HA；
S4、将化疗药与光敏剂通过物理包埋的方式共载进S2制备得到的HMSNs-NH2，利用席夫碱将S3得到的oxi-HA包裹在载药的HMSNs-NH2表面得到所述药物传递系统：
将制备得到的HMSNs-NH2超声分散于MES buffer中，将化疗药和光敏剂分别溶于MES buffer中，将溶解好的化疗药阿霉素和光敏剂孟加拉玫瑰红加入分散好的HMSNs-NH2中，避光搅拌，加入用MES buffer溶解好的oxi-HA，继续在室温条件下避光搅拌；待反应结束后，离心，洗涤沉淀，真空干燥过夜即可得到所述药物传递系统；
其中，所述MES buffer的pH 6.0，浓度0.01M；所述HMSNs-NH2：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:1:1～5:3:3。
本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，除下述实施例外不一一列举所有实施例。
实施例1
本实施例提供一种药物传递系统RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA，所述主体材料为表面修饰有氨基的HMSNs；所述主体材料内通过物理包埋有化疗药和光敏剂，含二醛的氧化透明质酸与所述氨基通过席夫碱反应包裹在主体材料外表面。
所述表面修饰有氨基的HMSNs：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:3:2。
所述表面修饰有氨基的HMSNs：含二醛的氧化透明质酸的质量比为1:1。
上述药物传递系统的优选制备方法，具体包括如下步骤：
S1、HMSNs的制备：
1)实心二氧化硅的制备：500mL的三口烧瓶中依次加入214mL无水乙醇、30mL去离子水、5mL氨水，在30℃下充分搅拌。5mL正硅酸四乙酯(TEOS)逐滴加入到上述混合溶液，然后持续剧烈搅拌反应2h。用转速为11000rpm的离心机将反应液离心13min,所得的沉淀用去离子水和无水乙醇反复交替洗涤3次，将最终的白色沉淀在50℃下真空干燥过夜即可得到实心二氧化硅(SiO2)；
2)制备二氧化硅@CTAB-二氧化硅(SiO2@CTAB-SiO2)：将450mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)于500mL的三口烧瓶中，然后依次加入90mL的去离子水、90mL的无水乙醇和1.65mL的氨水在30℃下充分搅拌溶解30min，得混合溶液；同时将300mg制备的SiO2放入60ml的去离子水中超声分散30min，然后快速加入上述混合溶液中继续剧烈搅拌30min；最后将0.75mL正硅酸四乙酯(TEOS)逐滴加入并在30℃下持续剧烈搅拌反应6h；11000rpm离心13min，所得的沉淀用去离子水和无水乙醇反复交替洗涤3次，将最终的白色沉淀在50℃下真空干燥过夜即可得到SiO2@CTAB-SiO2；
3)制备CTAB@中空介孔硅(CTAB@HMSNs)：将500mg制备的SiO2@CTAB-SiO2加入到60mL的去离子水中充分超声分散30min，同时将2.13g NaCO3溶解在20mL的去离子水中，将分散好的SiO2@CTAB-SiO2悬浊液快速加入到NaCO3溶液中在50℃下搅拌反应20h；11000rpm离心13min，所得的沉淀用去离子水和无水乙醇反复交替洗涤3次，将最终的白色沉淀在50℃下真空干燥过夜即可得到CTAB@HMSNs；
4)制备HMSNs：将上述制备的2.4g CTAB@HMSNs全部加入50mL甲醇超声分散30min，然后加入3mL盐酸，在80℃下回流反应48h；11000rpm离心13min，所得的沉淀用去离子水和甲醇反复交替洗涤3次，将最终的白色沉淀在50℃下真空干燥过夜即可得到HMSNs。
分别用透射电镜(TEM)和马尔文激光粒度仪检测制备的HMNSs，结果显示HMSNs粒径为120nm，具有良好的分散性。
S2、将所述HMSNs表面修饰氨基，即得到HMSNs-NH2：
将200mg制备的HMSNs加入到80mL甲苯中超声均匀分散，然后逐滴加入0.5mL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，60℃下回流反应20h，将反应液在11000rpm离心13min，所得的沉淀用去离子水和无水乙醇反复交替洗涤3次，将最终的白色沉淀50℃真空干燥过夜即可得到HMSNs-NH2；
即，所述HMSNs:甲苯：3-氨丙基三乙氧基硅烷的投料比为200mg：80mL：0.5mL。
S3、将HA氧化得到含有二醛的氧化透明质酸，即得到oxi-HA：
称取400mg透明质酸溶于40mL的去离子水中，称取320mg高碘酸钠溶于12mL去离子水中，然后将高碘酸钠溶液加入到透明质酸溶液中在室温下避光反应24h；为了反应掉过量的高碘酸钠，加入5mL乙二醇反应0.5h；然后将所得到的反应液转移至透析袋中(MWCO＝10KDa)，去离子水作为透析液透析三天，其中透析液每天更换4次；将最终透析的反应液进行冷冻干燥即可得到oxi-HA；
即，所述透明质酸与高碘酸钠的质量比为5:4。
S4、将化疗药与光敏剂通过物理包埋的方式共载进S2制备得到的HMSNs-NH2，利用席夫碱将S3得到的oxi-HA包裹在载药的HMSNs-NH2表面得到所述药物传递系统：
将50mg制备得到的HMSNs-NH2超声分散于30mL的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)buffer(pH 6.0,0.01M)中，然后将30mg阿霉素和20mg孟加拉玫瑰红分别溶于10mL MES buffer中，将溶解好的阿霉素和孟加拉玫瑰红加入分散好的HMSNs-NH2中，在25℃下避光搅拌24h；将50mg oxi-HA溶于10mL MES buffer中，然后将溶解好的oxi-HA加入到上述的反应液中，继续在室温条件下避光搅拌24h；待反应结束后，将反应液离心(11000rpm，13min)，用去离子水反复洗涤沉淀直至上清液澄清透明，收集洗涤液待后续测定包封率和载药量。最后将所得到的固体在50℃下真空干燥过夜即可得到RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA。
即，所述HMSNs-NH2：阿霉素：孟加拉玫瑰红：oxi-HA的质量比为5:3:2:5。
所述药物传递系统的制备路线及其释药和治疗机制如图1所示，RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA通过包裹在表面的oxi-HA分子与肿瘤细胞表面过度表达的CD44受体特异性结合介导的内吞作用进入肿瘤细胞，在肿瘤细胞的微酸性环境下，连接载体与封堵剂透明质酸的席夫碱键会断裂，载体中的药物将被释放出来，一方面化疗药DOX能够通过破坏肿瘤细胞的DNA结构抑制癌细胞，另一方面光敏剂RB在532nm的激光照射下激发单线态氧进而杀死肿瘤细胞，两者联合治疗能够大大提高抑制肿瘤细胞的效果。
实施例2
本实施例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S2中，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的用量为0.6mL；即所述HMSNs:甲苯：3-氨丙基三乙氧基硅烷的投料比为200mg：80mL：0.6mL。
实施例3
本实施例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S4中，阿霉素和孟加拉玫瑰红的用量均为25mg；即，所述表面修饰有氨基的HMSNs：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:2.5:2.5。
实施例4
本实施例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S4中，阿霉素和孟加拉玫瑰红的用量均为10mg；即，所述表面修饰有氨基的HMSNs：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:1:1。
实施例5
本实施例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S4中RB的用量为30mg；即，所述表面修饰有氨基的HMSNs：阿霉素：孟加拉玫瑰红的质量比为5:3:3。
实施例6
本实施例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S4中oxi-HA的用量为100mg；即，表面修饰有氨基的HMSNs：含二醛的氧化透明质酸的质量比为1:2。
对比例1
本对比例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S2中所述甲苯替换成甲醇。
对比例2
本对比例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S4中将20mg孟加拉玫瑰红替换成20mg吲哚菁绿(ICG)。
对比例3
本对比例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S2中HMSNs用量为100mg，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)用量为2mL。
对比例4
本实施例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S3中透明质酸与高碘酸钠的质量比为5:1。
对比例5
本对比例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S4中不添加20mg孟加拉玫瑰红，所述阿霉素的用量为50mg。
对比例6
本实施例与实施例1的药物传递系统和制备方法大体相同，唯一区别在于：步骤S2中，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的用量为1mL；即所述HMSNs:甲苯：3-氨丙基三乙氧基硅烷的投料比为200mg：80mL：1mL。
应用例1
本应用例将实施例1所制备的纳米粒子的表面形态通过高分辨率透射电子显微镜(TEM，JEM-2100F)观测，如图2所示，所制备的HMSNs呈现出规则的球形结构，且平均粒径为120nm，外部轮廓可见清晰的介孔结构，内部有着一个大体积的空腔，这使得更多的药物可以通过介孔进入HMSNs。TEM的结果表明，所制备的HMSNs具有分散性好，粒径大小合适，载荷量高的特性，能够满足优良纳米药物载体的要求。反应进一步制备HMSNs-N＝C-HA，相比图2(a)，在图2(b)和(c)中HMSNs的表面轮廓变厚了而且模糊，已经观察不到介孔了，这是因为表面包裹了氧化透明质酸层，HMSNs-N＝C-HA的平均粒径增大到170nm，但是纳米粒依旧具有良好的分散性。
通过对比透明质酸(HA)和氧化透明质酸(oxi-HA)的红外吸收光谱，证明实施例1中oxi-HA是否成功制备，以及通过对比不同程度修饰的HMSNs的红外光谱，来确定对实施例1中HMSNs的成功修饰。在图3中，与HA相比，oxi-HA在吸收波长为1720cm-1处，出现了-CHO的伸缩振动峰，说明了对HA的成功氧化。在图4中，与HMSNs相比，HMSNs-NH2在吸收波长为1520cm-1处，出现了-NH2的伸缩振动峰，证明HMSNs-NH2的成功制备。而在HMSNs-N＝C-HA中，-NH2的吸收峰消失，这是因为HMSNs表面的-NH2与oxi-HA分子中的-CHO发生了席夫碱反应，证实了在HMSNs的表面成功包裹上透明质酸。
应用例2
本应用例所有的数据都是3次以上重复实验的平均值，最终的结果都是由平均值±标准偏差(mean±SD)表示的。
通过以下公式计算实施例中DOX和RB的包封率(EE)和载药量(DL)：
EE＝(被载进去的DOX或RB质量/总投药量DOX或RB)×100％
DL＝(被载进去的DOX或RB质量/RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA的质量)×100％
通过绘制DOX/RB标准曲线，以及包封率和载药量的计算公式计算出，DOX的包封率(EE)为76.67％，载药量(DL)为15.30％，RB的EE为95.85％，DL为12.78％。从结果可知载体系统的总载药量为28.08％，这比传统的介孔硅的载药量(10％以下)要高得多。虽然DOX与RB的投药比为3:2，但是载药量差的并不多，这是由于RB与HMSNs内部的NH2有较弱的静电吸引作用，所以较容易载进HMSNs内。
本应用例进一步模拟肿瘤微环境以及正常组织环境的pH值，设置了pH值为7.4、6.0、5.0三种环境，探究实施例1制备的RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA在不同pH条件下的体外药物释放情况。如图5所示，可知在80h内，当在pH值为7.4的情况下，DOX的累计释药率仅为12.23％；而在pH值为6.0时，累计释药率增加到39.05％；当在pH值为5.0时，累计释药率高达58.60％。同样的在图6中，在pH值为7.4的情况下，RB的累计释药率也仅为12.23％；而在pH值为6.0时，累计释药率为27.30％；当在pH值为5.0时，累计释药率为46.86％。从上述RB和DOX的释药情况可知，在pH值为7.4时，两者几乎都不释药，这是因为在pH值为7.4时，席夫碱键会保持稳定，因而氧化透明质酸仍然包裹在HMSNs的表面，而当pH值为5.0和6.0时，都有明显的药物释放，因为此时席夫碱键断裂，氧化透明质酸会从HMSNs的表面脱落，且酸性越强，透明质酸脱落的程度越大，这也是pH值为5.0的释放率比pH为6.0高的原因。而RB的释放率在pH值为5.0和6.0时都比DOX的低，这是由于RB与HMSNs内部的NH2有着微弱的静电吸附作用，因而较DOX难以释放。体外释药实验证明，RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA能够在正常的生理条件下保持稳定，包裹的药物难以泄露，从而避免泄露对正常细胞造成毒副作用，而在酸性条件下具有很强的敏感性，这也为体系在肿瘤的酸性微环境中进行药物释放提供了支持。
本应用例进一步使用单线态氧(1O2)检测探针DPBF评价所述药物传递系统在体外条件下产生1O2的能力，经试验证明，532nm的激光照射下，DPBF的紫外吸收曲线随着激光照射时间的增长而明显的下降，这是因为DPBF的浓度在降低，说明了随着光照时间的增长，有更多的单线态氧生成与DPBF进行1，4-环加成反应。该试验证明所述药物传递系统在激光照射下可以迅速产生单线态氧并且可以用于肿瘤的光动力治疗。
应用例3
本应用例所有的数据都是通过3次以上的重复实验计算的平均值，最终得到的结果也都是用平均值±标准偏差(mean±SD)表示。此外，还通过Student's T检验法对相关实验结果的显著性进行分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
本应用例中HMSNs、不载药的载体(HMSNs-N＝C-HA)、单载药的载体(DOX@HMSNs-N＝C-HA和RB@HMSNs-N＝C-HA)的制备也按照与实施例1相同的方法得到，具体为，HMSNs为步骤S1制得的HMSNs，HMSNs-N＝C-HA为按步骤S1-S4但不添加RB/DOX制得的不载药载体，DOX@HMSNs-N＝C-HA和RB@HMSNs-N＝C-HA为按步骤S1-S4但仅添加50mg DOX或50mgRB的单载药的载体。
细胞培养：选用正常的人肾上皮(293T)细胞和CD44受体过度表达的小鼠乳腺癌(4T1)细胞作为模型对实施例1制备的药物传递系统进行生物学评价。首先，用DMEM培养基将293T细胞以1×105个/孔的密度进行培养，DMEM培养基中添加有1％抗生素(青霉素-链霉素，10000U·mL-1)和10％胎牛血清(FBS)。对于4T1细胞的培养采用RPMI 1640培养基，培养液与293T细胞培养基中相同，两种细胞均在湿润的CO2含量为5％的37℃的细胞培养箱中培养24h以供后续实验使用。
体外细胞毒性观察：采用细胞的增殖检测(MTT)法继续观察载体系统、载体材料以及其他样品对4T1细胞的毒性。4T1细胞在培养基中培养24h后，吸出培养基并加入含有不同浓度梯度的所述HMSNs、HMSNs-N＝C-HA、free RB、free DOX、RB@HMSNs-N＝C-HA、DOX@HMSNs-N＝C-HA和实施例1的RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA的新鲜培养基继续在避光条件下培养12h。然后将培养过后的细胞均分成两组，一组继续在黑暗条件下继续培养12h，另一组用532nm的激光照射5min后继续在黑暗条件下培养12h。然后移除培养基并加入含有20μL的MTT(5mg/mL,PBS)的新鲜培养基并在37℃下继续培养4h。最终，移除培养基并添加150μL的DMSO来溶解产生的结晶甲臜，并且通过酶标仪在570nm处测量溶液的光密度(OD)值并根据下述公式计算细胞的相对存活率：
细胞相对存活率＝(OD(sample)/OD(control))×100％
其中OD(sample)表示添加样品共培养的数值，OD(control)表示未添加任何样品的数值，对于光密度(OD)值的测量每个样品均测试3次以上，然后取平均值，最终的结果均表示为mean±SD的形式。
如图7(a)和(b)中，RB只有在532nm的激光照射下才能产生有细胞毒性的单线态氧，自身是无毒的，因此用游离RB和RB@HMSNs-N＝C-HA共培养的细胞在黑暗条件下，无论在任何实验浓度下细胞存活率依旧高于90％，而相反的在光照5min的实验组中，随着RB浓度的增大，细胞的存活率依次减小，当等效浓度为16μg/mL时，细胞存活率为46.2％，这都是载体系统单一的光动力治疗产生的毒性。因为DOX为广谱化疗药，它的毒性不受光照的影响。游离DOX和DOX@HMSNs-N＝C-HA共培养的4T1细胞，无论是在光照条件下还是在黑暗条件下都表现出了相似的细胞毒性，且当DOX浓度为16μg/mL时，游离DOX组的细胞的存活率为20.53％，DOX@HMSNs-N＝C-HA组的细胞存活率为23.2％，这个结果是载体系统单一化疗抑制肿瘤细胞的效果。
为了评价我们的载体系统化疗协同光动力治疗的效果，设置了RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA共培养的细胞的组分，在黑暗条件下，RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA培养的组分的细胞的存活率与单一化疗的存活率相近，这是因为此时只能实现DOX的化疗，而对比在光照条件下，RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA组分的细胞的存活率在等效浓度为16μg/mL时仅为10.9％，这要比单一化疗的抑制率高10％，这说明我们的体系能够实现联合化疗和光动力治疗并大大提升治疗效果。为了更进一步的证明体系的联合化疗/光动力治疗的效果，我们通过计算上述不同组分的细胞的半数最大抑制浓度(IC50)来更清晰的进行分析，在表1中，黑暗条件下，RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA组的IC50值和游离DOX以及DOX@HMSNs-N＝C-HA组的IC50值相近，因为此时只是单一化疗起作用，且单一光动力治疗在黑暗条件下无法实现因此无毒。在光照条件下，RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA组的IC50值为0.23μg/mL，大约是游离DOX以及DOX@HMSNs-N＝C-HA组IC50值的1/3，是RB@HMSNs-N＝C-HA组的1/39，这个结果说明在抑制一半细胞存活的情况下，我们的体系RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA所需要的浓度最低。
表1不同样品共培养4T1细胞在光照不光照后的IC50值
Figure GDA0003734981290000161
应用例4
将所有实施例、对比例制得的药物传递系统利用相同的检测方法，对其各自的氨基接枝率、粒径大小、载药量进行了测定，并且通过应用例3中的MTT法对各自的细胞毒性进行了观察，并算出了各自的半数最大抑制浓度(IC50)值。
表2各实施例和对比例的药物传递系统各参数比较
Figure GDA0003734981290000162
对于上述各项测定结果进行分析，对比例1将甲苯替换成甲醇，APTES在甲醇中极易水解，导致接枝率会低很多。对比例2将孟加拉玫瑰红替换成吲哚菁绿ICG，ICG在酸性缓冲液的溶解度过低，导致ICG无法溶解富集在HMSNs内，使得替换后的系统稳定性和分散性极差，而本发明所用的光敏剂为RB，具有很好的溶解性，实施例1所制备的载体系统稳定性和分散性都很好。对比例3由于APTES过量，自身发生缩合而团聚，导致粒径过大分散性极差。对比例4由于氧化剂量过少，导致得到的二醛过少，无法堵住HMSNs的孔道，因此载药量过低。对比例5的系统只能实现化疗，而本发明用于肿瘤化疗/光动力联合治疗的药物传递系统RB-DOX@HMSNs-N＝C-HA能实现化疗和光动力治疗联合，大大提高了治疗效果。氨基接枝率的高低决定了氧化透明质酸接枝的程度，在一定程度上影响载药量的高低。而粒径的大小，决定了系统能否通过EPR效应进入细胞，当粒径过大时，系统无法被细胞所摄取，因此对比例1、2和3没有细胞毒性。载药量的高低在一定程度上决定了进入细胞中有效药物的多少，虽然实施例5的载药量是最高的，但是其粒径略大，使得载体系统较难进入细胞，因此毒性不是最高的。而实施例6的载药量为28.08％，但是因为在步骤S4中氧化透明质酸较多，导致外层包裹层过厚，一方面导致粒径略大，另一方面导致透明质酸不易脱落，包裹的药物释放的较少，因此细胞毒性不是最高的。本发明的优选实施例例为实施例1-5，通过实施例1、2、对比例6的比较说明HMSNs、甲苯、3-氨丙基三乙氧基硅烷的投料比影响了氨基的接枝率和HMSNs-NH2的粒径大小和分散性，三者优选的投料比为200mg:80mL:0.1mL～200mg:80mL:0.6mL；通过实施例1、3、4、5的比较说明表面修饰有氨基的HMSNs、阿霉素、孟加拉玫瑰红的质量比影响了整个体系的载药量、粒径大小以及治疗效果，三者最优选的质量比为5:3:2。
综上所述，本发明所述药物传递系统的稳定性、分散性和有效性等因素由接枝率、粒径、光敏剂的选择、载药量、各原料的用量比等多种条件综合决定。实施例1的接枝率最高，粒径最小，且载药量也很高，因此细胞毒性最大，IC50最低，是本发明的最佳实施例。
尽管已经示出和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，对于本领域的普通技术人员而言，本发明不受上述实施例的限制，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统，其特征在于，包括主体材料，所述主体材料为表面直接修饰有氨基的中空介孔硅HMSNs；所述主体材料的内核中通过物理包埋有化疗药和光敏剂，含二醛的氧化透明质酸与所述氨基通过席夫碱反应包裹在主体材料外表面；所述化疗药为阿霉素，所述光敏剂为孟加拉玫瑰红；所述表面修饰有氨基的HMSNs：阿霉素：孟加拉玫瑰红：含二醛的氧化透明质酸的质量比为5:3:2:5；
所述的用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统的制备方法，包括如下步骤：
S1、HMSNs的制备；
S2、将所述HMSNs表面修饰氨基，即得到HMSNs-NH2；
S3、将HA氧化得到含二醛的氧化透明质酸，即得到oxi-HA；
S4、将化疗药与光敏剂通过物理包埋的方式共载进S2制备得到的HMSNs-NH2，利用席夫碱反应将S3得到的oxi-HA包裹在载药的HMSNs-NH2表面得到所述药物传递系统；
步骤S2包括：将HMSNs 加入到甲苯中超声均匀分散，然后逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应，将反应液离心，所得的沉淀用去离子水和无水乙醇反复交替洗涤，将最终的白色沉淀真空干燥过夜即可得到HMSNs-NH2；其中，所述HMSNs: 甲苯：3-氨丙基三乙氧基硅烷的投料比为200 mg: 80 mL: 0.1 mL ~ 200 mg:80 mL: 0.6 mL；
步骤S3包括：将透明质酸、高碘酸钠分别溶于水中，然后将高碘酸钠溶液加入到透明质酸溶液中在室温下避光反应；用乙二醇反应掉过量的高碘酸钠；然后转移进行透析，将最终透析的反应液进行冷冻干燥即可得到oxi-HA；其中，所述透明质酸与高碘酸钠的质量比为5:4。
2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统，其特征在于，所述HMSNs: 甲苯：3-氨丙基三乙氧基硅烷的投料比为200 mg：80 mL：0.5 mL。
3.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤化疗与光动力联合治疗的药物传递系统，其特征在于，步骤S4包括：将制备得到的HMSNs-NH2超声分散于MES buffer中，将化疗药阿霉素和光敏剂孟加拉玫瑰红分别溶于MES buffer中，将溶解好的阿霉素和孟加拉玫瑰红加入分散好的HMSNs-NH2中，避光搅拌，加入用MES buffer溶解好的oxi-HA，继续在室温条件下避光搅拌；待反应结束后，离心，洗涤沉淀，真空干燥过夜即可得到所述药物传递系统；
其中，所述MES buffer 的pH 6.0，浓度0.01 M。
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