CN110664755B - 一种蛋白质多肽自微乳及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白质多肽自微乳及其制备方法与应用，属于药物制备技术领域。本发明所述蛋白质多肽自微乳包括以下重量份的原料：蛋白质多肽药物0.01～5份、助溶剂0.5～10份、HLB值小于8的甘油脂肪酸酯20～70份和HLB值大于10小于16的聚乙二醇脂肪酸酯50份。本发明所述蛋白质多肽自微乳不仅能够降低蛋白质多肽药物与剂型辅料的吸附，而且能极大的提高蛋白质多肽药物的口服生物利用度。

Description

一种蛋白质多肽自微乳及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及一种蛋白质多肽自微乳及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，随着生物工程技术的迅速发展，生物技术活性药物不断面世，已有不少生物技术药物应用于临床治疗，在医药领域生物药物已经完全抢了化学药物的风头，因其高效性和高选择性而备受青睐。目前所述的生物药主要是指蛋白质多肽类药物，与小分子化药相比，蛋白质多肽生物药物在胃肠道内稳定性低而吸收差，导致生物利用度很低，几乎无法口服给药，因此，绝大部分蛋白质多肽均是注射给药。对需要经常用药的患者来说，注射给药相当痛苦，患者渴求非侵入性给药。为解决长期用药的问题，发展非侵入式传输系统是蛋白质多肽生物药药剂学领域面对的挑战。

在筛选给药途径时，必须考虑到大部分生物药物分子较大、易聚集和降解的特点。生物大分子的渗透性差，难以穿过人体内天然屏障，如皮肤、胃肠上皮等。口服给药是使用最方便、最易接受的一种方式，但蛋白质多肽的口服后面临以下两大方面的难点：一、在胃肠道中蛋白酶对蛋白质多肽药物降解成小分子氨基酸后吸收，使其生物活性也随之消失；二、致密的肠上皮细胞膜吸收屏障阻止这些蛋白质多肽药物的吸收。为了提高蛋白质多肽口服生物利用度，目前研究主要有以下几方面技术手段：1、抑制蛋白酶活性，研究通过蛋白酶抑制剂抑制蛋白质多肽水解提高生物利用度，但这不会从根本上增加蛋白质多肽药物的生物利用度。另外也有通过将蛋白质多肽药物是与聚合物缀合，屏蔽蛋白酶的降解作用，如Nobex/Biocon开发的口服胰岛素HIM2，但不幸的是它的人体生物利用度很低(低于1％，与皮下注射胰岛素相比)，很难临床转化。2、促进吸收，常用的方法是使用促渗剂，如表面活性剂、脂肪酸或胆盐，增加粘液层和上皮细胞层的通透性，扩大细胞间隙。最常用的口服吸收促进剂是胆盐和脂肪酸，也有人使用水杨酸钠。该类物质的最大缺点是无选择性地作用于脂质表面而可能使所有小肠内容物成分包括各种毒素和生物病原体进入血液，也有潜在的细胞膜溶解和局部炎症等毒性。3、利用载体输运技术，通过将药物负载与载体中，达到保护药物与增加药物生物利用率的双重目的，例如脂质体、高分子微球及自微乳系统等。自微乳口服制剂因制备方法相对简单且易工业化生产，在生理条件下自发形成微乳，能有效显著提高药物的生物利用度，而受到科研与工业界的广泛研究。Sandoz公司开发的环抱素A自微乳浓缩液软胶囊(商品名为新山地明)利用自微乳技术将环孢素A经口服进入胃肠道，遇胃肠液后形成微乳。与原软胶囊相比，不仅显著提高了环孢素A的生物利用度，减少了用药剂量，而且减少了个体吸收差异。环孢素A自微乳浓缩液软胶囊的成功上市极大的推动了自微乳技术在口服蛋白质多肽药物应用，不仅能有效避免体内酶对蛋白质多肽药物的降解，而且有效的提高蛋白质多肽药物的生物利用度。

自微乳主要由乳化剂、油相、助溶剂及水等组成，乳化剂是自微乳能够肠道自乳化的核心主料，是提高口服蛋白质多肽药物自微乳的生物利用度的关键，同时也是影响自微乳制剂的物理稳定的重要影响因素，因此乳化剂的设计与选择是高生物利用度自微乳的核心，本发明人考察了现有口服自乳化乳化剂(例如吐温系列、Brij系列、聚氧乙烯蓖麻油类及泊洛沙姆类乳化剂)对蛋白质多肽自微乳的生物利用率的影响，发现它们对蛋白质多肽药物的生物利用度的局域提升作用，但相对有限，不具有临床转化意义。同时，口服蛋白质多肽药物自微乳在临床应用转化中，需要将自微乳制备成肠溶软胶囊，但软胶囊因胶皮初期的高含水量及明胶胶皮蛋白质特性，导致了自微乳制备成软胶囊过程中，蛋白药物向含水量高的胶皮发生迁移，被胶皮吸附(该吸附量达到药物添加量的20～40％)，造成蛋白药物相对药量降低，从而使本就生物利用度有限的口服蛋白质多肽药物自微乳的生物利用度更加低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白质多肽自微乳及其制备方法与应用。本发明所述蛋白质多肽自微乳不仅能够降低蛋白质多肽药物与剂型辅料的吸附，而且能极大的提高蛋白质多肽药物的口服生物利用率。

本发明提供了一种蛋白质多肽自微乳，所述自微乳包括以下重量份的原料：蛋白质多肽药物0.01～5份、助溶剂0.5～10份、甘油脂肪酸酯20～70份和聚乙二醇脂肪酸酯50份；

所述聚乙二醇脂肪酸酯如式I所示，HLB值大于10小于16；

R选自CH₃或H；聚乙二醇聚合度n为6～50的聚合度；脂肪酸碳原子数m为8～12；

所述甘油脂肪酸酯HLB值小于8，包括甘油三脂肪酸酯、甘油二脂肪酸酯、甘油单脂肪酸酯、聚甘油单脂肪酸酸酯和聚甘油二脂肪酸酯中的一种或一种以上组合；

所述助溶剂包括水、丙二醇、聚乙二醇300～800、二乙二醇甲乙基醚和脂肪酸盐中的一种或一种以上的组合；所述脂肪酸盐包括辛酸钠、癸酸钠、月桂酸钠、月桂酸硫酸钠、多库酯钠、棕榈酸钠、油酸钠和亚油酸钠中的一种或一种以上的组合。

优选的是，所述蛋白质多肽药物包括胰岛素、胰岛素类似物、胰高血糖素样肽-1、降钙素、甲状旁腺激素及其类似物或活性片段、生长激素、GLP-1类似物、干扰素、尿激酶或蚓激酶。

优选的是，所述聚乙二醇脂肪酸酯包括聚乙二醇-8-辛酸酯、聚乙二醇-8-癸酸酯和聚乙二醇-32-月桂酸酯中的一种或一种以上的组合。

优选的是，所述自微乳还包括pH调节剂；所述的调节剂为盐酸、磷酸、枸橼酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸、醋酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或一种以上的组合。

优选的是，所述自微乳还包括抗氧化剂，所述抗氧化剂包括水溶性抗氧化剂和脂溶性抗氧化剂，所述脂溶性抗氧化剂为维生素E，所述水溶性抗氧化剂为精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽和半胱氨酸中的一种或一种以上的组合。

优选的是，所述自微乳还包括50～500重量份的粒径为10～500μm惰性多孔吸附颗粒，所述惰性多孔吸附颗粒为多孔惰性硅载体、无水磷酸氢钙或硅酸铝镁。

本发明还提供了上述技术方案所述蛋白质多肽自微乳的制备方法，包括以下步骤：

1)在0～25℃条件下，将蛋白质多肽药物加入助溶剂中，调节助溶剂的pH值远离蛋白质等电点，在200～1500rpm转速下搅拌溶解，得到透明蛋白质多肽溶液；

2)在15～80℃条件下，将聚乙二醇脂肪酸酯与甘油脂肪酸酯在200～1500rpm转速下搅拌溶解得到透明油溶液；

3)在15～37℃条件下，将步骤1)得到的透明蛋白质多肽溶液加入步骤2)得到的透明油溶液中，并在200～800rpm转速下搅拌至透明，得到蛋白质多肽自微乳。

本发明还提供了上述技术方案所述蛋白质多肽自微乳的制备方法，包括以下步骤：

1)在0～25℃条件下，将蛋白质多肽药物加入助溶剂水中，调节助溶剂水的pH值远离蛋白质等电点，在200～1500rpm转速下搅拌溶解，得到透明蛋白质多肽溶液；向所述透明蛋白质多肽溶液中加入脂肪酸盐，形成蛋白质多肽药物脂肪酸盐复合物沉淀，离心得到沉淀并冷冻干燥获得蛋白质多肽药物脂肪酸盐复合物，溶解于非水助溶剂中，得到蛋白质多肽药物溶液；

2)在15～80℃条件下，将聚乙二醇脂肪酸酯与甘油脂肪酸酯在200～1500rpm转速下搅拌溶解得到透明油溶液；

3)在15～37℃条件下，将步骤1)得到的蛋白质多肽药物溶液加入步骤2)得到的透明油溶液中，并在200～800rpm转速下搅拌至透明，得到蛋白质多肽自微乳。

优选的是，上述制备方法步骤3)搅拌至透明后，还包括：在15～37℃条件下，将搅拌至透明的物质与惰性多孔吸附颗粒混合，在50～600rpm下搅拌，通过三维混合仪混合，得到蛋白质多肽自微乳。

本发明还提供了上述技术方案所述自微乳或上述技术方案所述制备方法制备得到的自微乳在制备临床应用制剂中的应用。

优选的是，所述制剂包括自微乳肠溶软胶囊、含载有自微乳的惰性多孔吸附载体的肠溶硬胶囊或含载有自微乳的惰性多孔吸附载体的肠溶微丸。

本发明提供了一种蛋白质多肽自微乳。本发明所述蛋白质多肽自微乳为一种口服蛋白自微乳系统，其核心的主乳化剂聚乙二醇脂肪酸酯不仅具备自微乳所需要的HLB值，能够使蛋白自微乳遇肠道蠕动迅速自微乳成均匀的载有蛋白质多肽药物的颗粒，避免肠道酶的降解作用，而且该主乳化剂对蛋白质多肽药物具有显著的促进吸收的作用，利用主乳化剂的本身的促进吸收作用及自微乳颗粒本身的小尺寸效应促进蛋白质多肽药物的吸收，达到协同增效的作用。本发明所述自微乳不仅能降低蛋白质多肽药物与剂型辅料的吸附，且能极大的提高蛋白质多肽药物的口服生物利用率。同时，本发明所述自微乳后续与特定粒径的惰性多孔载体颗粒进行简单混合，即可将流动的自微乳液体迅速变成均匀的可流动的颗粒，既不改变自微乳的结构，又不吸附蛋白药物，不仅提高了蛋白质多肽药物的稳定性和活性，而且为后期临床应用提供了便捷。本发明所述自微乳还能够避免蛋白质多肽药物的迁移与剂型辅料(软胶囊所用的胶皮)吸附，间接降低蛋白药物的给药剂量。试验结果表明，通过本发明所述的聚乙二醇脂肪酸酯与甘油脂肪酸酯形成特定配方的自微乳，能有效提高蛋白质多肽药物的口服生物利用度，避免临床剂型软胶囊胶皮对蛋白质多肽药物吸附影响，同时通过造粒的大粒径球形惰性载体吸附液态的蛋白质多肽药物形成的蛋白质多肽自微乳，具备了固态自微乳的形态属性及液态自微乳的速溶特性。

具体实施方式

本发明提供了一种蛋白质多肽自微乳，所述自微乳包括以下重量份的原料：蛋白质多肽药物0.01～5份、助溶剂0.5～10份、甘油脂肪酸酯20～70份和聚乙二醇脂肪酸酯50份；

所述聚乙二醇脂肪酸酯如式I所示，HLB值大于10小于16；

R选自CH₃或H；聚乙二醇聚合度n为6～50的聚合度；脂肪酸碳原子数m为8～12；

所述甘油脂肪酸酯HLB值小于8，包括甘油三脂肪酸酯、甘油二脂肪酸酯、甘油单脂肪酸酯、聚甘油单脂肪酸酸酯和聚甘油二脂肪酸酯中的一种或一种以上组合。

所述助溶剂包括水、丙二醇、聚乙二醇300～800、二乙二醇甲乙基醚和脂肪酸盐中的一种或一种以上的组合；所述脂肪酸盐包括辛酸钠、癸酸钠、月桂酸钠、月桂酸硫酸钠、多库酯钠、棕榈酸钠、油酸钠和亚油酸钠中的一种或一种以上的组合。在本发明中，当所述助溶剂含有脂肪酸盐时，所述脂肪酸盐的使用形式优选包括脂肪酸盐水溶液。本发明所述的重量份可以是毫克、克、千克或吨。

本发明所述蛋白质多肽自微乳包括0.01～5份蛋白质多肽药物，优选为0.05～2份，更优选为0.1～1份。在本发明中，所述蛋白质多肽药物包括胰岛素、胰岛素类似物、胰高血糖素样肽-1、降钙素、甲状旁腺激素及其类似物或活性片段、生长激素、GLP-1类似物、干扰素、尿激酶或蚓激酶。在本发明中，所述胰岛素优选为猪胰岛素或重组人胰岛素；所述降钙素优选为鲑鱼降钙素、鳗鱼降钙素或重组人降钙素；所述生长激素优选为重组人生长激素、猪生长激素或牛生长激素；所述甲状旁腺激素优选为重组甲状旁腺激素1-84或重组甲状旁腺激素1-34；所述GLP-1类似物优选为艾塞那肽、利拉鲁肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽或阿必鲁肽。

本发明所述蛋白质多肽自微乳包括50份聚乙二醇脂肪酸酯。在本发明中，所述的聚乙二醇脂肪酸酯的HLB值优选大于12小于16；所述R优选为H；所述聚乙二醇聚合度n优选为8～32聚合度；所述脂肪酸碳原子数m为8～12。在本发明中，所述聚乙二醇脂肪酸酯具体优选为聚乙二醇-8-辛酸酯、聚乙二醇-8-癸酸酯和聚乙二醇-32-月桂酸酯中的一种或一种以上的组合。聚乙二醇-8-辛酸酯、聚乙二醇-8-癸酸酯、聚乙二醇-32-月桂酸酯，HLB值在11～14之间，既提供了自微乳所需足够的HLB值，达到形成均匀的乳化蛋白颗粒，迅速分布在肠道粘膜中，又具有提供肠道粘膜的通透性，促进乳化蛋白颗粒的吸收。

本发明所述蛋白质多肽自微乳包括20～70份甘油脂肪酸酯，优选为30～60份，更优选为40～50份。在本发明中，所述甘油脂肪酸酯的碳原子数优选为8～18，所述甘油脂肪酸酯优选为甘油三脂肪酸酯、甘油二脂肪酸酯、甘油单脂肪酸酯、聚甘油单脂肪酸酸酯和聚甘油二脂肪酸酯中的一种或一种以上的组合。在本发明中，所述甘油脂肪酸酯HLB值优选大于2小于8。在本发明中，所述甘油脂肪酸酯具体优选为C8辛酸、C10癸酸、C12月桂酸、C18油酸或C18亚油酸的甘油三脂肪酸酯、甘油二脂肪酸酯、甘油单脂肪酸酯、聚甘油单脂肪酸酯或聚甘油二脂肪酸酯的一种或一种以上的组合。在本发明中，所述甘油脂肪酸酯最优选为甘油三辛酸酯、甘油二辛酸酯、甘油单辛酸酯、甘油三癸酸酯、甘油单癸酸酯、甘油二癸酸酯、甘油三月桂酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油单月桂酸酯、甘油三油酸酯、甘油单油酸酯、甘油二油酸酯、甘油三亚油酸酯、甘油单亚油酸酯、甘油二亚油酸酯、聚甘油-6-单油酸酯、聚甘油-6-双油酸酯、聚甘油-3-单油酸酯、聚甘油-3-双油酸酯和或聚甘油-3-双异硬脂酸酯中的一种或一种以上的组合。

本发明所述蛋白质多肽自微乳包括0.5～10份助溶剂，优选为1～8份，更优选为4～7份。在本发明中，所述助溶剂优选为水、丙二醇、聚乙二醇400、二乙二醇甲乙基醚和脂肪酸盐中的一种或一种以上的组合；所述脂肪酸盐优选为辛酸钠、癸酸钠、月桂酸钠、月桂酸硫酸钠、多库酯钠、棕榈酸钠、油酸钠或亚油酸钠。在本发明中，当所述助溶剂为脂肪酸盐时，所述脂肪酸盐的使用形式优选包括脂肪酸盐水溶液。本发明通过脂肪酸盐自组装于蛋白药物的阳离子亲水部位，利用离子键相互作用在蛋白质多肽药物表面形成相对疏水环境，增强蛋白质多肽药物的疏水性，增加蛋白质多肽药物在自微乳中亲脂性，减少蛋白质多肽药物在自微乳体系中向水相中迁移；同时因在蛋白质多肽药物表面形成相对疏水层，更好地避免了肠道蛋白酶对蛋白质多肽药物的水解，尤其是利用中碳链的辛酸或癸酸钠，可以在水溶液环境中在蛋白质多肽表面形成相对疏水的中碳链层，同时又不像长碳链脂肪酸盐在蛋白质多肽表面形成相对疏水环境而导致蛋白质多肽药物沉淀，后期需要增加复溶步骤，增加制备的繁琐。

在本发明中，所述自微乳优选还包括pH调节剂；所述的调节剂优选为盐酸、磷酸、枸橼酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸、醋酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠中的一种或一种以上的组合。为了增加蛋白质多肽药物的溶解度及溶解速度，通过向助溶剂中添加适量的pH调节剂，调节助溶剂的pH值偏离蛋白药物的等电点，尤其是通过调节pH小于蛋白药物的等电点，便于助溶剂中脂肪酸盐通过离子键的作用在蛋白药物表面形成相对疏水环境，增加其在自微乳中的溶解性能。

在本发明中，所述自微乳还包括抗氧化剂，所述抗氧化剂包括水溶性抗氧化剂和脂溶性抗氧化剂，所述脂溶性溶性抗氧化剂为维生素E，所述水溶性抗氧化剂为精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽或半胱氨酸中的一种或一种以上的组合。

在本发明中，所述自微乳优选还包括50～500重量份的惰性多孔吸附颗粒，更优选为60～400份，更优选为80～250份，最优选为100～200份。在本发明中，所述惰性多孔吸附颗粒优选为多孔惰性硅载体、无水磷酸氢钙或硅酸铝镁。在本发明中，所述惰性多孔吸附颗粒的粒径为10～500μm，优选为20～300μm，更优选为50～180μm。在本发明中，所述的惰性多孔吸附颗粒的堆密度优选为0.1～0.8g/ml，更优选0.2～0.7g/ml。在本发明中，所述的多孔惰性硅载体优选通过溶胶凝胶法制备而成的，并经过造粒成粒径为80～140μm的多孔惰性硅载体球型颗粒；所述的无水磷酸氢钙优选为通过喷雾造粒干燥形成60～140μm的球形多孔无水磷酸氢钙颗粒；所述的硅酸铝镁优选为通过喷雾造粒干燥形成60～130μm的球形多孔硅酸铝镁颗粒。在本发明中，所述惰性多孔吸附颗粒不溶于水也不溶于油，但是可以提供丰富的孔道吸附自微乳，从而使液体自微乳不改变结构吸附到惰性多孔吸附颗粒中，变成了可流动的载有自微乳的惰性多孔吸附颗粒，且其颗粒的溶胀不超过15％，优选的不超过10％，而不出现颗粒堆积体积的减少。该流动的载有蛋白质多肽药物自微乳的惰性多孔吸附球形颗粒，既具有了通过常温下为固态的原料在高于熔点的条件下制备的常温为固态的自微乳的固态形态属性，又具有常温液态自微乳的速溶溶解属性。常温下为固态原料制备的固态自微乳因制备过程中需要高温(高于其熔点)，而蛋白质多肽药物在高温条件下易于失活，不适合用于温度敏感的蛋白质多肽药物自微乳的制备。

本发明还提供了上述技术方案所述蛋白多肽自微乳的制备方法，所述制备方法针对于所述助溶剂不含有脂肪酸盐的情况，包括以下步骤：

1)在0～25℃条件下，将蛋白质多肽药物加入助溶剂中，调节助溶剂的pH值远离蛋白质等电点，在200～1500rpm转速下搅拌溶解，得到透明蛋白质多肽溶液；

2)在15～80℃条件下，将聚乙二醇脂肪酸酯与甘油脂肪酸酯在200～1500rpm转速下搅拌溶解得到透明油溶液；

3)在15～37℃条件下，将步骤1)得到的透明蛋白质多肽溶液加入步骤2)得到的透明油溶液中，并在200～800rpm转速下搅拌至透明，得到蛋白质多肽自微乳。

在本发明中，步骤1)所述pH值优选采用pH调节剂进行调节，pH调节剂优选添加到助溶剂中，调节助溶剂的pH值低于所述蛋白质多肽的等电点，但不超过3，以加快蛋白质多肽的溶解速度，提高生产效率。

在本发明中，所述步骤1)中优选加入水溶性抗氧化剂，用于提高蛋白药物的化学稳定性。在本发明中，所述步骤2)中加入脂溶性抗氧化剂，提高脂质成分的化学稳定性。在本发明中，步骤3)搅拌至透明后，优选还包括：在15～37℃条件下，将搅拌至透明的物质与惰性多孔吸附颗粒混合，在50～600rpm下搅拌，通过三维混合仪混合，得到蛋白质多肽自微乳。

本发明还提供了上述技术方案所述蛋白多肽自微乳的制备方法，所述制备方法针对于所述助溶剂含有脂肪酸盐的情况，包括以下步骤：

1)在0～25℃条件下，将蛋白质多肽药物加入助溶剂水中，调节助溶剂水的pH值远离蛋白质等电点，在200～1500rpm转速下搅拌溶解，得到透明蛋白质多肽溶液；向所述透明蛋白质多肽溶液中加入脂肪酸盐，形成蛋白质多肽药物脂肪酸盐复合物沉淀，离心得到沉淀并冷冻干燥获得蛋白质多肽药物脂肪酸盐复合物，溶解于非水助溶剂中，得到蛋白质多肽药物溶液；

2)在15～80℃条件下，将聚乙二醇脂肪酸酯与甘油脂肪酸酯在200～1500rpm转速下搅拌溶解得到透明油溶液；

3)在15～37℃条件下，将步骤1)得到的蛋白质多肽药物溶液加入步骤2)得到的透明油溶液中，并在200～800rpm转速下搅拌至透明，得到蛋白质多肽自微乳。

在本发明中，所述步骤1)中优选加入水溶性抗氧化剂，用于提高蛋白药物的化学稳定性。在本发明中，所述步骤2)中加入脂溶性抗氧化剂，提高脂质成分的化学稳定性。在本发明中，步骤3)搅拌至透明后，优选还包括：在15～37℃条件下，将搅拌至透明的物质与惰性多孔吸附颗粒混合，在50～600rpm下搅拌，通过三维混合仪混合，得到蛋白质多肽自微乳。

本发明还提供了上述技术方案所述自微乳或上述技术方案所述制备方法制备得到的自微乳在制备临床应用制剂中的应用。

在本发明中，所述制剂包括自微乳肠溶软胶囊、含载有自微乳的惰性多孔吸附载体的肠溶硬胶囊或含载有自微乳的惰性多孔吸附载体的肠溶微丸。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种蛋白质多肽自微乳及其制备方法与应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

胰岛素自微乳的制备

1、称取15g去离子水(1N的盐酸调节pH为2.5)，再向去离子水中加入0.5g猪胰岛素，溶解形成猪胰岛素水溶液，向猪胰岛素水溶液中加入含有0.08g辛酸钠的水溶液，在25℃、300rpm转速下搅拌逐渐形成猪胰岛素辛酸复合物沉淀，离心得到沉淀并冷冻干燥获得猪胰岛素辛酸复合物沉淀，并将该沉淀分散于5g丙二醇中，在15℃、300rpm转速下搅拌形成猪胰岛素辛酸复合物丙二醇溶液。

2、称取50g聚乙二醇-8-辛酸酯、40g聚甘油-3-二油酸酯及0.01g维生素E，在40℃、500rpm转速下搅拌溶解均匀。

3、将步骤1得到的猪胰岛素辛酸复合物丙二醇溶液缓慢加入步骤2得到的产物中，在25℃、300rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态胰岛素自微乳Ⅰ。

4、称取75g硅酸铝镁(80～120μm)加入步骤3得到液态胰岛素自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态胰岛素自微乳Ⅱ。

临床应用将液态胰岛素自微乳Ⅰ罐装到肠溶明胶软胶囊中，将固态胰岛素自微乳Ⅱ造粒成500～900μm的肠溶微丸或直接将固态胰岛素自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例2

胰岛素自微乳的制备

1、称取30g去离子水(1N的盐酸调节pH为3)，再向去离子水中加入1g重组人胰岛素，形成重组人胰岛素水溶液，向该水溶液中加入含有0.16g癸酸钠的水溶液，在15℃、200rpm转速下搅拌逐渐形成重组人胰岛素癸酸复合物沉淀，离心得到沉淀并冷冻干燥获得重组人胰岛素癸酸复合物，将该重组人胰岛素癸酸复合物加入10g聚乙二醇400中，在15℃、500rpm转速下搅拌形成重组人胰岛素癸酸复合物聚乙二醇溶液。

2、称取50g聚乙二醇-8-癸酸酯、50g聚甘油-6-双油酸酯及0.01g维生素E，在70℃、800rpm转速下搅拌溶解均匀，冷却至25℃。

3、将步骤1得到的胰岛素癸酸复合物聚乙二醇溶液缓慢加入步骤2得到的产物中，在25℃、400rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态胰岛素自微乳Ⅰ。

4、称取150g无水磷酸氢钙(120μm)加入步骤3得到液态胰岛素自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态胰岛素自微乳Ⅱ。

临床应用将液态胰岛素自微乳Ⅰ罐装到肠溶明胶软胶囊中，将固态胰岛素自微乳Ⅱ造粒成500～900μm的肠溶微丸或直接将固态胰岛素自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例3

重组人甲状旁腺激素1-34(PTH1-34)自微乳的制备

1、称取5g去离子水(pH 6.5磷酸缓冲液)，向去离子水中加入0.01g PTH1-34，溶解形成PTH1-34，再向去离子水中加入含有0.0036g多库酯钠的水溶液，在25℃、200rpm转速下搅拌逐渐形成沉淀，离心得到沉淀并冷冻干燥获得PTH1-34多库酯钠复合物沉淀，将该沉淀加入1g聚乙二醇200中，在25℃、500rpm转速下搅拌形成PTH1-34多库酯钠复合物聚乙二醇溶液。

2、称取25g聚乙二醇-8-辛酸酯、25g聚乙二醇8-癸酸酯、40g甘油二辛酸酯及0.01g维生素E，在40℃、800rpm转速下搅拌溶解均匀，冷却至25℃。

3、将步骤1得到的PHT1-34多库酯钠复合物聚乙二醇溶液缓慢加入步骤2得到的产物中，在25℃、400rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态PTH1-34自微乳Ⅰ。

4、称取200g无水磷酸氢钙(120μm)加入步骤3得到液态PTH1-34自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态PTH1-34自微乳Ⅱ。

临床应用将液态PTH1-34自微乳Ⅰ罐装到肠溶明胶软胶囊中，将固态PTH1-34自微乳Ⅱ造粒成500～900μm的肠溶微丸或直接将固态PTH1-34自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例4

索马鲁肽自微乳的制备

1、称取10g二乙二醇单乙基醚，向其中加入2.5g索马鲁肽，在30℃、500rpm转速下搅拌至索马鲁肽溶解成透明溶液。

2、称取50g聚乙二醇-32-月桂酸酯、35g甘油二辛酸酯、10g甘油单辛酸酯及0.01g维生素E，在40℃、800rpm转速下搅拌溶解均匀，冷却至室温。

3、将步骤1得到的索马鲁肽溶液缓慢加入步骤2得到的产物中，在25℃、400rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态索马鲁肽自微乳Ⅰ。

4、称取100g硅酸铝镁(80-120μm)加入步骤3得到液态索马鲁肽自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态索马鲁肽自微乳Ⅱ。

临床应用将液态索马鲁肽自微乳Ⅰ罐装到肠溶明胶软胶囊中，将固态索马鲁肽自微乳Ⅱ造粒成500～900μm的肠溶微丸或直接将固态索马鲁肽自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例5

艾塞那肽自微乳的制备

1、称取5g去离子水(pH4.5醋酸缓冲液)，向去离子水中加入0.1g艾塞那肽，形成艾塞那肽水溶液，再向该水溶液中加入含有0.02g的辛酸钠水溶液，在25℃、300rpm转速下搅拌逐渐形成沉淀，离心得到沉淀并冷冻干燥获得艾塞那肽辛酸复合物，将该复合物加入4g聚乙二醇400中，在25℃、500rpm转速下搅拌形成艾塞那肽辛酸复合物聚乙二醇溶液。

2、称取30g聚乙二醇-8-辛酸酯、20g聚乙二醇8-癸酸酯、40g甘油二癸酸酯及0.01g维生素E，在40℃、800rpm转速下搅拌溶解均匀，冷却至25℃。

3、将步骤1得到的艾塞那肽辛酸复合物聚乙二醇溶液缓慢加入步骤2得到的产物中，在25℃、400rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态艾塞那肽自微乳Ⅰ。

4、称取150g无水磷酸氢钙(120μm)加入步骤3得到液态艾塞那肽自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态艾塞那肽自微乳Ⅱ。

临床应用将液态艾塞那肽自微乳Ⅰ罐装到肠溶明胶软胶囊中，将固态艾塞那肽自微乳Ⅱ造粒成500-900μm的肠溶微丸或直接将固态艾塞那肽自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例6

索马鲁肽自微乳的制备

1、称取6g去离子水(pH8.1磷酸氢二钠，采用盐酸或氢氧化钠调节pH维持在8.1左右)，向去离子水中加入1.5g索马鲁肽，在25℃、500rpm转速下搅拌至索马鲁肽溶解成透明溶液。

2、称取50g聚乙二醇-8-辛酸酯、10g甘油单辛酸酯40g聚甘油-3-二油酸酯及0.01g维生素E，在35℃、400rpm转速下搅拌溶解均匀，冷却至25℃。

3、将步骤1得到的索马鲁肽溶液缓慢加入步骤2得到的产物中，在25℃、400rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态索马鲁肽自微乳Ⅰ。

4、称取150g无水磷酸氢钙(120μm)加入步骤3得到液态索马鲁肽自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态索马鲁肽自微乳Ⅱ。

临床应用将液态索马鲁肽自微乳Ⅰ罐装到肠溶明胶软胶囊中，将固态索马鲁肽自微乳Ⅱ造粒成500～900μm的肠溶微丸或直接将固态索马鲁肽自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例7

利拉鲁肽自微乳的制备

1、称取2g丙二醇、6g去离子水(pH8.1磷酸氢二钠，采用盐酸或氢氧化钠调节pH维持在8.1左右)在25℃、300rpm转速下搅拌溶解，再向丙二醇去离子水中加入1.5g利拉鲁肽，在25℃、500rpm转速下搅拌至利拉鲁肽溶解成透明溶液。

2、称取50g聚乙二醇-8-辛酸酯、10g甘油单辛酸酯40g聚甘油-3-二油酸酯及0.01g维生素E，在35℃、400rpm转速下搅拌溶解均匀，冷却至25℃。

3、将步骤1得到的利拉鲁肽溶液缓慢加入步骤2得到的产物中，在25℃、400rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态利拉鲁肽自微乳Ⅰ。

4、称取150g无水磷酸氢钙(120μm)加入步骤3得到液态利拉鲁肽自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态利拉鲁肽自微乳Ⅱ。

临床应用将液态利拉鲁肽自微乳Ⅰ罐装到肠溶明胶软胶囊中，将固态利拉鲁肽自微乳Ⅱ造粒成500～900μm的肠溶微丸或直接将固态利拉鲁肽自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例8

胰岛素自微乳的制备

1、称取20g去离子水(1N的盐酸调节pH，4)，再向去离子水中加入0.5g重组人胰岛素，在15℃、500rpm转速下搅拌至重组人胰岛素溶解成透明溶液，再向重组人胰岛素溶液中缓慢滴加23ml10mg/ml的多库酯钠水溶液，在15℃、200rpm转速下搅拌逐渐形成重组人胰岛素多库酯钠沉淀，离心并将沉淀冷冻干燥获得重组人胰岛素多库酯钠复合物。

2、称取8g聚乙二醇400、50g聚乙二醇-8-癸酸酯、50g聚甘油-6-双油酸酯及0.01g维生素E，在70℃、800rpm转速下搅拌溶解均匀，冷却至25℃。

3、将步骤1得到的胰岛素多库酯钠复合物加入步骤2得到的产物中，在25℃、400rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态胰岛素自微乳Ⅰ。

4、称取150g无水磷酸氢钙(120μm)加入步骤3得到液态胰岛素自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态胰岛素自微乳Ⅱ。

临床应用将液态胰岛素自微乳Ⅰ罐装到肠溶明胶软胶囊中，将固态胰岛素自微乳Ⅱ造粒成500～900μm的肠溶微丸或直接将固态胰岛素自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例9

胰岛素自微乳的制备

1、称取8.5g去离子水(1N的盐酸调节pH为2.5)，再向去离子水中加入0.7g重组人胰岛素，在15℃、500rpm转速下搅拌至重组人胰岛素溶解成透明溶液。

2、称取50g聚乙二醇-8-癸酸酯、50g聚甘油-6-双油酸酯及0.01g维生素E，在70℃、800rpm转速下搅拌溶解均匀，冷却至25℃。

3、将步骤1得到的胰岛素溶液缓慢加入步骤2得到的产物中，在25℃、400rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态胰岛素自微乳Ⅰ。

4、称取150g无水磷酸氢钙(120μm)加入步骤3得到液态胰岛素自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态胰岛素自微乳Ⅱ。

临床应用将将固态胰岛素自微乳Ⅱ造粒成500～900μm的肠溶微丸或直接将固态胰岛素自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例10

重组人甲状旁腺激素1-34(PTH1-34)自微乳的制备

1、称取0.5g去离子水(pH 6.5磷酸缓冲液)，向去离子水中加入0.01g PTH1-34，在25℃、500rpm转速下搅拌至PTH1-34溶解成透明溶液。

2、称取25g聚乙二醇-8-辛酸酯、25g聚乙二醇8-癸酸酯、40g甘油二辛酸酯及0.01g维生素E，在40℃、800rpm转速下搅拌溶解均匀，冷却至25℃。

3、将步骤1得到的PHT1-34溶液缓慢加入步骤2得到的产物中，在25℃、400rpm速度下搅拌，形成均匀透明的液态PTH1-34自微乳Ⅰ。

4、称取200g无水磷酸氢钙(120μm)加入步骤3得到液态PTH1-34自微乳Ⅰ中，25℃、50rpm速度下搅拌均匀形成均匀可流动的固态PTH1-34自微乳Ⅱ。

临床应用将将固态PTH1-34自微乳Ⅱ造粒成500～900μm的肠溶微丸或直接将固态PTH1-34自微乳Ⅱ灌装到肠溶硬胶囊中。

实施例11

自微乳粒径测定及物理稳定性测试

将实施例1-10制备所得自微乳Ⅰ分别放置20℃环境中，并于第0天及第180天观察其外观及测定其遇水自乳化所得粒径。分别将各自微乳样品用生理盐水稀释100倍，带各自微乳样品乳化充分，利用MalvernZetasizer 3000激光粒度仪检测其粒径。

表1各自微乳样品乳化粒径及物理稳定性

实施例12

自微乳化学稳定性

将实施例1～10所制备得到的液态自微乳Ⅰ和固态自微乳Ⅱ分别密封置于4℃和20℃环境中，按照美国药典USP35-NF30各药物的检测方法，利用HPLC分别于第0天及第180天检测各药物的峰面积，利用第180天药物峰面积除以第0天药物峰面积计算药物保存第180天时相对保留率。由表2可以看出，在4℃保存条件下，自微乳药物化学稳定，含量保持稳定，但在20℃保存条件下，通过惰性多孔吸附材料固态化后有利于提高药物保存的化学稳定性。

表2自微乳中药物相对保留百分比

实施例13

胶皮对自微乳中胰岛素的吸附

将实施例2重组人胰岛素自微乳通过软胶囊工艺制备成重组人胰岛素自微乳软胶囊(实验组1)，采用实施例2的方法将癸酸钠替换成辛酸钠、多库酯钠或油酸钠，分别获得重组人胰岛素自微乳软胶囊(实验组2、实验组3及实验组4)；并采用实施例2去除癸酸钠，其余组分及含量保持不变，按照同样的制备方法制备成不含癸酸钠的重组人胰岛素自微乳软胶囊(对照组)。分别取适量软胶囊，将软胶囊用剪刀剪碎连同内容物一起采用pH 2的盐酸溶液溶解稀释，按照美国药典HLPC检测胰岛素含量；再分别取适量软胶囊，破开软胶囊，取内容物，并用pbs冲洗，合并物与冲洗液，采用pH 2的盐酸溶液溶解稀释，按照美国药典HLPC检测胰岛素含量；最后计算内容物胰岛素占整个软胶囊胰岛素量的百分比。实验组1、2、3及4的软胶囊内容物中重组人胰岛素占总软胶囊中胰岛素含量分别为93.4％、92.1％、96.5％及93.6％，而对照组软胶囊内容物中重组人胰岛素占总软胶囊中胰岛素含量的69.1％，说明通过癸酸钠、辛酸钠、多库酯钠及油酸钠有利于增加胰岛素的脂溶性，降低胰岛素向高水含量胶皮中迁移吸附。

实施例14

自微乳抗酶解试验

称取适量胰蛋白酶加入Tris缓冲液(1mmol/LCaCl₂，pH8.0)制成1mg/ml的胰蛋白酶溶液。称取适量胰岛素(胰岛素预先溶解于0.1mol/l的HCl)加入Tris缓冲液(1mmol/LCaCl₂，pH8.0)，配制成胰岛素终浓度为20IU/ml，作为胰岛素溶液酶解对照品。另外取实施例1中所制备的自微乳Ⅰ适量加入到Tris缓冲液中配制成胰岛素终浓度为20IU/ml，作为胰岛素自微乳试验品。为了比较其他脂肪酸甘油酯得到的自微乳抗酶解作用，将按照实施例1的方法，将聚甘油-3-单油酸酯分别替换为甘油三辛酸酯、甘油二辛酸酯、甘油单辛酸酯、甘油三亚油酸酯、甘油单亚油酸酯、甘油二亚油酸酯、聚甘油-6-单油酸酯、聚甘油-6-双油酸酯、聚甘油-3-单油酸酯制备相应的自微乳，同样利用Tris缓冲液配制成20IU/ml的稀释液。另外，按照实施例1的方法，将聚甘油-3-单油酸酯替换成聚乙二醇-8-辛酸酯，形成不含脂肪酸甘油酯的胰岛素聚乙二醇脂肪酸酯溶液，同样利用Tris缓冲液配制成20IU/ml。37℃条件下分别取胰岛素溶液、各种胰岛素自微乳及胰岛素聚乙二醇脂肪酸酯溶液0.8ml，各样品分别加入150ulTris缓冲液和50ul的胰蛋白酶溶液，漩涡2s，于120min取样100ul，并加入150ul冷的酶终止液(pH1.8 TFA溶液)，终止酶反应。利用美国药典HPLC方法检测胰岛素含量，计算胰岛素剩余量。

表3胰蛋白酶对胰岛素降解120min的剩余百分比

由表3可知，胰岛素水溶液不能抵抗酶降解，胰岛素聚乙二醇脂肪酸酯溶液具有较强的抵抗酶降解，而通过甘油脂肪酸酯与聚乙二醇脂肪酸酯形成的胰岛素自微乳具有非常强的抵抗酶降解能力，有利于保护胰岛素不被酶降解，同时，甘油二脂肪酸酯、甘油单脂肪酸酯、比甘油三脂肪酸酯更能有效的避免胰岛素被蛋白酶降解，甘油二脂肪酸酯比甘油单脂肪酸酯有效避免胰岛素被蛋白酶降解。

实施例15

聚乙二醇脂肪酸酯吸收促进作用

采用高糖DMEM培养Caco-2细胞，向DMEM中加入10％的胎牛血清，1％L-谷氨酰胺，1％非必须氨基酸，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。将细胞置于95％相对湿度，5％CO₂培养箱，37℃培养5～7天，当细胞达到80％融合度时，用Trypsin-EDTA消化后以1*10⁵/ml密度接种于12孔Transwell的AP端(apical side)。通过测量跨膜电阻(TEER)，检测Caco-2细胞单层膜的完整性。当细胞培养经过21后，跨膜电阻达到800Ω/cm²以上，在AP端分别加入各含有1％以下物质的HBSS缓冲液，这些物质包括聚乙二醇-8-辛酸酯、聚乙二醇-8-癸酸酯、聚乙二醇-32-月桂酸酯、吐温80、聚氧乙烯-40-氢化蓖麻油、泊洛沙姆188、甘油三辛酸酯、甘油二辛酸酯、甘油单辛酸酯、甘油三癸酸酯、甘油二癸酸酯、甘油单癸酸、甘油三月桂酸酯、甘油二月桂酸酯、聚甘油-3-油酸酯或聚甘油-3-二油酸酯。于120min检测细胞跨膜电阻，计算加入上述物质后跨膜电阻下降电阻百分比。跨膜电阻越大代表着细胞膜越致密，当加入不同的物质后，跨膜电阻下降百分比越大，说明该物质具有降低膜通透性能力越大，说明该物质的促渗透作用越明显。

表4 Caco-2细胞单层细胞跨膜电阻下降百分比

物质名称	跨膜电阻百分比
		聚乙二醇-8-辛酸酯	46.7％
聚乙二醇-8-癸酸酯	54.3％
		聚乙二醇-32-月桂酸酯	52.4％
吐温80	15.4％
		聚氧乙烯-40-氢化蓖麻油	24.6％
泊洛沙姆188	12.7％
		聚甘油-3-二油酸酯	5.7％
聚甘油-3-油酸酯	8.9％
		甘油三辛酸酯	2.5％
甘油二辛酸酯	15.3％
		甘油单辛酸酯	26.9％
甘油三癸酸酯	6.4％
		甘油二癸酸酯	17.5％
甘油单癸酸酯	24.3％
		甘油单油酸酯	12.4％
聚甘油-6-单油酸酯	7.4％
		聚甘油-6-双油酸酯	6.6％
聚甘油3-单油酸酯	8.9％

由表4结果可以看出，各物质促吸收作用为聚乙二醇-8-癸酸酯、聚乙二醇-8-辛酸酯及聚乙二醇-32-月桂酸酯大于甘油单辛酸酯、甘油单癸酸酯及聚氧乙烯-40-氢化蓖麻油大于泊洛沙姆188、甘油二辛酸酯及甘油二癸酸酯。聚乙二醇-8-癸酸酯、聚乙二醇-8-辛酸酯及聚乙二醇-32-月桂酸酯作为蛋白质多肽药物自微乳主乳化剂，既能充分发挥自微乳保护蛋白质多肽药物被酶解，又具有有效促进蛋白质多肽药物吸收的作用。

实施例16

惰性吸附剂对自微乳的影响

分别取2ml的惰性载体无水磷酸氢钙颗粒(120μm)、硅酸铝镁颗粒(80～120μm)、硅酸铝镁粉末(2～8μm)、多孔惰性硅载体(5～20μm)，加入600ul的实施例1液体自微乳，经过轻微震荡，形成吸附油自微乳的惰性载体。发现无水磷酸氢钙颗粒与硅酸铝镁颗粒保持原有的流动状的颗粒，并且在显微镜下观察颗粒间没有聚集，颗粒外貌保持不变，而硅酸铝镁粉末及多孔惰性硅载体颗粒的流动性下降，并且显微镜观察颗粒间发生了聚集。通过量筒去称量其体积，吸附自微乳的无水磷酸氢钙颗粒、硅酸铝镁颗粒、硅酸铝镁粉末、多孔惰性硅载体的体积分别为2.1、2.1、1.1、1.2ml，说明无水磷酸氢钙与硅酸铝镁颗粒吸附自微乳后颗粒形态没有发生明显变化，并且保持原有颗粒的表面状态及流动性。通过重新造粒形成的100μm左右的球形颗粒无水磷酸氢钙及硅酸铝镁能够为自微乳提供刚性的孔道，有利于不改变蛋白质多肽药物自微乳的原有的自微乳结构及各组分的分配，更有利于保持蛋白质多肽药物自微乳的生物利用度。

实施例17

重组人胰岛素自微乳生物利用度测定

将18只体重为180～220g范围的雄性Ⅱ型糖尿病大鼠禁食12h，分为试验组Ⅰ(口服给药组，样品为实施例2的自微乳Ⅰ，剂量为胰岛素计0.4mg/kg)，试验组Ⅱ(口服给药组，样品为实施例2的自微乳Ⅱ，剂量为胰岛素计0.4mg/kg)，对照组(皮下注射胰岛素注射液，剂量为胰岛素计0.04mg/kg)，试验组在给药前，用50mg剂量戊巴比妥钠麻醉老鼠，并侧方位固定大鼠，在腹部切一口，通过给药器进行回肠给药，给药后缝合切口。试验组与对照组分别与给药前与给药后0.5、1、2、3、4h时间点，尾静脉取血，采用罗氏血糖测定仪测定血糖，通过计算药时曲线下面积，计算试验组Ⅰ和Ⅱ相对于注射对照组的药效生物利用度分别为16.1％和17.4％。通过本实施例自微乳配方的胰岛素相对注射的药效生物利用度高于15％，具有显著的临床应用价值，同时通过120μm的无水磷酸氢钙固化后的自微乳并没有降低胰岛素的药效生物利用率。

实施例18

PTH1-34自微乳生物利用度测定

将12只体重为180～220g范围的雄性大鼠禁食12h，分为试验组Ⅰ(口服给药组，样品为实施例3的自微乳Ⅰ，剂量为PTH1-34计100μg/kg)，试验组Ⅱ(口服给药组，样品为实施例3的自微乳Ⅱ，剂量为PTH1-34计100μg/kg)对照组(皮下注PTH1-34水溶液，剂量为PTH1-34计10μg/kg)，试验组在给药前，用50mg剂量戊巴比妥钠麻醉老鼠，并侧方位固定大鼠，在腹部切一口，通过给药器进行回肠给药，给药后缝合切口。试验组与对照组分别与给药前与给药后15/30/45/60/75/90/105min时间点，尾静脉取血，分离血清备用，采用PTH1-34高灵敏度EIA试剂盒检测血清中PTH1-34含量，通过计算血药浓度曲线下面积，计算试验组Ⅰ和Ⅱ相对于注射对照组的生物利用度为17.2％和16.1％。通过本实施例自微乳配方有效的提高了PTH1-34的生物利用度，具有显著的临床应用价值。

实施例19

艾塞那肽自微乳生物利用度测定

将12只体重为180～220g范围的雄性Ⅱ型糖尿病大鼠禁食12h，分为试验组Ⅰ(口服给药组，样品为实施例5的自微乳Ⅰ，剂量为艾塞那肽计50μg/kg)，试验组Ⅱ(口服给药组，样品为实施例5的自微乳Ⅱ，剂量为艾塞那肽计50μg/kg)对照组(皮下注射艾塞那肽注射液，剂量为艾塞那肽计5μg/kg)，试验组在给药前，用50mg剂量戊巴比妥钠麻醉老鼠，并侧方位固定大鼠，在腹部切一口，通过给药器进行回肠给药，给药后缝合切口。试验组与对照组分别与给药前与给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10h时间点，尾静脉取血0.5ml，离心去血清，采用酶联免疫法测定血清中艾塞那肽的含量，通过计算药时曲线下面积，计算试验组Ⅰ和Ⅱ相对于注射对照组的生物利用度为13.2％和15.1％。通过本实施例自微乳配方有效的提高了艾塞那肽的生物利用度，具有显著的临床应用价值。

实施例20

索马鲁肽自微乳生物利用度测定

将12只体重为180-220g范围的雄性Ⅱ型糖尿病大鼠禁食12h，分为试验组Ⅰ(口服给药组，样品为实施例6的自微乳Ⅰ，剂量为索马鲁肽计500μg/kg)，试验组Ⅱ(口服给药组，样品为实施例6的自微乳Ⅱ，剂量为索马鲁肽计500μg/kg)对照组(皮下注射索马鲁肽注射液，剂量为索马鲁肽计50μg/kg)，试验组在给药前，用50mg剂量戊巴比妥钠麻醉老鼠，并侧方位固定大鼠，在腹部切一口，通过给药器进行回肠给药，给药后缝合切口。试验组与对照组分别与给药前与给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10h时间点，尾静脉取血，采用罗氏血糖测定仪测定血糖，通过计算药时曲线下面积，计算试验组Ⅰ和Ⅱ相对于注射对照组的药效生物利用度为7.2％和6.7％。通过本实施例自微乳配方有效的提高了索马鲁肽的生物利用度，具有显著的临床应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.蛋白质多肽自微乳的制备方法，所述蛋白质多肽自微乳包括以下重量份的原料：蛋白质多肽药物0.01~5份、助溶剂0.5~10份、甘油脂肪酸酯20~70份和聚乙二醇脂肪酸酯50份；

所述聚乙二醇脂肪酸酯如式I所示，HLB值大于10小于16；

式I，

R选自CH₃或H； 聚乙二醇聚合度n为6~50的聚合度；脂肪酸碳原子数m为8~12；

所述甘油脂肪酸酯HLB值小于8，包括甘油三脂肪酸酯、甘油二脂肪酸酯、甘油单脂肪酸酯、聚甘油单脂肪酸酯和聚甘油二脂肪酸酯中的一种或一种以上的组合；

所述助溶剂包括水、丙二醇、聚乙二醇300~800、二乙二醇甲乙基醚和脂肪酸盐中的一种或一种以上的组合；所述脂肪酸盐包括辛酸钠、癸酸钠、月桂酸钠、月桂酸硫酸钠、多库酯钠、棕榈酸钠、油酸钠和亚油酸钠中的一种或一种以上的组合；

所述制备方法包括以下步骤：

1）在0~25℃条件下，将蛋白质多肽药物加入助溶剂水中，调节助溶剂水的pH值远离蛋白质等电点，在200~1500rpm转速下搅拌溶解，得到透明蛋白质多肽溶液；向所述透明蛋白质多肽溶液中加入脂肪酸盐，形成蛋白质多肽药物脂肪酸盐复合物沉淀，离心得到沉淀并冷冻干燥获得蛋白质多肽药物脂肪酸盐复合物，溶解于非水助溶剂中，得到蛋白质多肽药物溶液；

2）在15~80℃条件下，将聚乙二醇脂肪酸酯与甘油脂肪酸酯在200~1500rpm转速下搅拌溶解得到透明油溶液；

3）在15~37℃条件下，将步骤1）得到的蛋白质多肽药物溶液加入步骤2）得到的透明油溶液中，并在200~800rpm转速下搅拌至透明，得到蛋白质多肽自微乳。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白质多肽药物包括胰岛素、胰岛素类似物、胰高血糖素样肽-1、降钙素、甲状旁腺激素及其类似物或活性片段、生长激素、GLP-1类似物、干扰素、尿激酶或蚓激酶。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇脂肪酸酯包括聚乙二醇-8-辛酸酯、聚乙二醇-8-癸酸酯和聚乙二醇-32-月桂酸酯中的一种或一种以上的组合。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述自微乳还包括pH调节剂；所述的调节剂为盐酸、磷酸、枸橼酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸、醋酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或一种以上的组合。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述自微乳还包括抗氧化剂，所述抗氧化剂包括水溶性抗氧化剂和脂溶性抗氧化剂，所述脂溶性抗氧化剂为维生素E，所述水溶性抗氧化剂为精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽和半胱氨酸中的一种或一种以上的组合。

6.根据权利要求1~5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述自微乳还包括50~500重量份的粒径为10~500 μm惰性多孔吸附颗粒，所述惰性多孔吸附颗粒为多孔惰性硅载体、无水磷酸氢钙或硅酸铝镁。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3）搅拌至透明后，还包括：在15~37℃条件下，将搅拌至透明的物质与惰性多孔吸附颗粒混合，在50~600rpm下搅拌，通过三维混合仪混合，得到蛋白质多肽自微乳。

8.权利要求1~7任一项所述制备方法制备得到的自微乳。

9.权利要求8所述自微乳在制备临床应用制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述制剂包括自微乳肠溶软胶囊、含载有自微乳的惰性多孔吸附载体的肠溶硬胶囊或含载有自微乳的惰性多孔吸附载体的肠溶微丸。