CN1218960C - 白果蛋白GAPIIa及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物蛋白分离纯化技术领域，涉及从白果中(银杏)分离出一种具有延缓衰老和抗氧化的新蛋白质白果蛋白GAPIIa，它的制备方法及用途。其特征是：采用盐析和盐溶及两步离子交换层析等方法从白果果仁中分离纯化出一种未知的新蛋白GAP Ⅱ a，其精确分子量为29248 Da。对其一级结构和空间结构检测表明，GAPⅡa是由分子量接近、氨基酸序列相似的GAPⅡa-1和GAPⅡa-2两条肽链，通过二硫键连接组成的蛋白质，并以0-糖苷键方式连接少量的糖基；在GAPⅡa-1和GAPⅡa-2中共同存在肽质量数为911、1911和2470的肽段。生物实验证实被分离的白果蛋白具有抗氧化和延缓衰老的功能，可用于抗氧化和延缓衰老等保健食品的制造和药学方面。
Description
技术领域
本发明属于植物蛋白分离纯化技术领域，具体地说涉及从白果(银杏)中分离出一种具有延缓衰老和抗氧化的新蛋白质白果蛋白GAPIIa，它的制备方法及用途。
背景技术
银杏为裸子植物门银杏纲银杏植物(GinKgo bilba L.)，为一科一属一种的特殊植物，又称白果、公孙树，是我国特有的古老珍贵树种之一。银杏种实的核俗称白果，其核仁为可食用部分，由于其营养丰富，自古以来被当作养生延年的上品，而现代已成为传统的出口产品。主要药用功效为敛肺气、定喘嗽、止带浊、缩小便，有治疗哮喘、痰嗽、白带、白浊、遗精、淋病、便频等作用。此外，还作治疗鼻面黑斑、酒糟鼻及头面疮癣等皮肤病及外科感染。
现代医学研究证明(周郁文.白果的抗菌作用。中华医学杂志，1980，36(12)：549-550)，白果对多种类型的葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌等均有不同程度的抑制作用。十几年来开展对白果的药理研究及生理活性研究，目前取得的主要成果有：1、白果具有明显的抑制结核杆菌生长的作用(李蔚普，油浸白果之抗菌作用与中毒，江西中医药，1981，2(2)：145-146)；2、从白果中分离的羟基酚类具有抗癌和抗菌作用(徐丽华，赵利昌，白果的药用价值探讨，山东医药工业，1997，16(4)：47-48)；3、抗衰老、抗疲劳、耐缺氧的作用(张卫明，赵伯涛，王红，银杏种仁对小白鼠SOD活力的影响，中国野生植物资源，1995(1)：24-26)；戴建国，陈景衡，白果提取液对小白鼠心脑脂褐质水平的影响，南京医科大学学报，1994，14(3)：411-416；赵伯涛，秦长卿.银杏汁饮料的营养与功能研究，中国野生植物资源，1995(1)：19-23；4、平喘、祛痰的作用(徐长化，俞良栋，李波.定喘汤中白果用量的实验研究，浙江中医杂志，1989，24(3)：123-124)5、防治皮肤病，促进人体表皮细胞生长，延长表皮细胞寿命(马世宏，银杏在化妆品中的应用，中国野生植物资源，1995(1)：35-38)。
虽然，白果具有很好的保健和预防疾病的功能，被称之为“无价之宝”。但对白果的有效成分研究还不很深入，至于白果药理活性是由哪个成分起主要作用，白果蛋白是否具有重要的药用保健功能，尚不清楚。国内、国外关于银杏的研究主要集中在银杏叶上，而对白果蛋白的研究少之又少，仅在2000年Hexiang Wang，Tzi Bun Ng报道从白果中分离得到分子量为13kDa的抗真菌蛋白(Hexiang Wang，Tzi Bun Ng，Ginkbilobin，a Novel AntifungalProtein from Ginkgo biloba Seeds with Sequence Similarity to Embryo-Abundant Protein.Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，279(2).-407-411)。
分离纯化蛋白质的方法针对性很强，不同目的蛋白需采用不同的、专用的方法。目前，离子交换色谱是蛋白质类药物分离纯化过程中使用最广泛的色谱技术，许多具有活性的蛋白质是由离子交换层析色谱分离纯化的。王文忠等(王文忠，潘克桢等.凤凰木种子蛋白的分离提纯和生化性质。生物化学杂志，1995，11(3)；270-275)利用DEAE-Sephadex A-25、SephacrylS-200和DEAE-52纤维素等层析柱分离提纯了凤凰木种子蛋白，根据生化性质的分析认为其可能是蛋白水解酶。李明等(李明，陈正炎等.白眉蝮蛇毒神经生长因子的研究。蛇志，1997，9(4)：20-23)采用硫酸铵、DEAE纤维素和CM纤维素离子交换层析从白眉蝮蛇中分离纯化出毒神经生长因子，可促使神经细胞突起密集生长；王小晖等(王小晖，王化丽等，尖吻蝮蛇蛇毒中镇痛成分的研究。中国生化药物杂志，2001，22(4)：198-199)从尖吻蝮蛇蛇毒中提纯一种具有镇痛作用的蛋白质，可代替阿片类药物，也是采用的DEAE-Sepharose离子交换色谱法。
凝胶过滤法在提纯活性蛋白时，一般不单独使用，而是与其他层析方法同时使用。王润华等(王润华，郑硕等.蛞蝼素的纯化及其免疫毒素的制备。生物化学杂志，1998，9(5)：581-590)先采用凝胶过滤色谱再采用离子交换层析从蛞蝼中纯化出核糖体失活蛋白。文才艺等(文才艺，张艳红等.凝胶过滤及离子交换层析法纯化玉米CuZn-SOD的研究。2001，22(2)：88-92)也是先采用Sephadex G-75再采用DEAE-32从玉米中纯化出CuZn-SOD的。现有的方法大多工艺复杂，提取率低，操作过程中蛋白质容易失活。
关于白果活性蛋白的分离纯化还未见报道，而且，现有的方法并不适合白果蛋白的分离纯化。
发明内容
本发明的目的在于从白果((GinKgo bilba L.))果仁中分离出一种未知的蛋白质，提出一种分离、纯化、鉴定以及制备该蛋白的方法，探索该蛋白的生物活性以及在抗氧化和延缓衰老方面的可能用途。
本发明提供了一种具有新的生物活性，特别是可能存在延缓生物衰老和抗氧化的新的未知蛋白。对该蛋白的肽质量指纹谱(PMF)进行了Peptldent数据库检索，未发现与其相关参数相匹配的蛋白质。对肽序列标签(PST)进行了SWISS-PRO数据库检索，未发现与其同源的序列，证明这是首次分离得到的新蛋白质。本发明还提供了从白果中分离纯化得到该延缓衰老和抗氧化蛋白的制备方法。本发明还提供了所述蛋白质用于制备延缓衰老和抗氧化方面的可能的用途。
本发明通过以下技术方案实现：
一种来源于白果(GinKgo bilba L.)果仁的蛋白质，所述的蛋白被定义为GAPIIa白果蛋白，其准确分子量为29248 Da。
定义的蛋白质GAPIIa是由两条分子量接近、氨基酸序列相似的被定义为GAPIIa-1和GAPIIa-2的两条肽链，通过二硫键连接组成的蛋白质，并以O-糖苷键方式连接少量的糖基；在GAPIIa-1和GAPIIa-2中共同存在，其准确分子量分别2470.0044和1910.9644的肽段；其中肽质量数为1910.9644的肽段序列为Leu-Val-Gly-Asn-Thr-Ala-Asp-Leu-Gly-Asn-Trp-Gln-Ser-Met-His-Leu-Arg；肽质量数为2470.0044的肽段序列Ala-Val-Val-Val-Asp-Ser-Asn-Thr-Gly-Glu-Thr-Trp-His-Cys-Gly-Glu-Gly-Met-Pro-Asp-Pro-Asn-Arg。
所述的GAPIIa-1和GAPIIa-2，用胰蛋白水解酶水解，均可被水解成大小不等的多条肽段：肽质量数在900以上的，GAPIIa-1有8段，分别为911.92、1912.36、1075.82、1331.00、1638.09、2471.52、3098.98和3495.22；GAPIIa-2有5段，对应的肽质量数为911.87、1844.28、1912.38、2242.56、2471.56；两条肽链中均含有肽质量数为911的肽段、肽质量数为1911的肽段和肽质量数为2470的肽段相互匹配，相匹配的肽段的分子量相等，氨基酸序列相同。
所述的白果蛋白GAPIIa的制备方法，其步骤为：
1)采用盐溶和盐析的方法，从白果果仁中得到白果清蛋白、白果球蛋白和白果盐溶蛋白；
2)采用阴离子纤维素离子交换层析的方法，分离纯化步骤1)得到白果清蛋白，得到白果蛋白GAPIIa粗品；
3)采用阴离子葡聚糖凝胶离子交换层析的方法，进一步纯化步骤2)得到的GAPIIa粗品，得到精制的白果蛋白GAPIIa。
其中白果清蛋白、球蛋白及盐溶蛋白的制备方法如下：
1)将白果脱脂粉在4℃下，料液比按1∶3(w/v)加入0.14mol/L NaCl溶液，分三次提取，得到白果盐溶提取液，将白果盐溶提取液冻干，得到白果盐溶蛋白；
2)将白果盐溶提取液离心，得到上清液，弃去沉淀；
3)将步骤2)得到的上清液加入粉末硫酸铵使上清液的饱和度达35％，析出杂蛋白，并离心；得到上清液，弃去沉淀；
4)将步骤3)得到的上清液加入粉末硫酸铵使上清液的饱和度达90％，析出清蛋白和球蛋白，并离心；弃去上清液；
5)将得到的沉淀对蒸馏水进行透析，脱去硫酸铵，同时析出球蛋白；离心，得到的上清液，冻干得到白果清蛋白；对透析析出的沉淀进行冻干，得到白果球蛋白。
其中所述的阴离子纤维素离子交换层析步骤如下：
用pH值为8.0的50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液制备上样缓冲液，平衡层析柱后，将白果蛋白质溶液上样在DEAE-Cellulose层析柱上，流速0.2ml/min。先用pH 8.0的50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液配制的0.1mol/L的NaCl洗脱液洗脱至基本无峰出现，再用pH 8.0的50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液配制的0.2mol/L-0.4mol/L的NaCl洗脱液以流速为0.2ml/min进行梯度洗脱，用部分收集器收集经洗脱流出的溶液。
其中的阴离子葡聚糖凝胶离子交换层析步骤如下：
将权利要求6所述收集蛋白质溶液用pH 8.0的50mmol/L的三乙醇胺-盐酸缓冲液进行透析，除去部分盐后，缓慢加入到DEAE-Sephadex-A50层析柱中，使蛋白质被吸附到层析柱顶部，在pH 8.0条件下，再用50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液配制的0.2mol/L-0.4mol/L的NaCl洗脱液进行梯度洗脱，然后用部分收集器收集高峰部分，用透析带对蒸馏水透析除去盐分后，冷冻干燥即为GAPIIa冻干样品。
附图说明
图1：是本发明的流程图；
图2：是1911肽段的氨基酸序列；
图3：是2471肽段的氨基酸序列；
图4：是GAPIIa的MALDI-TOF-MS的分子量图谱；
图5：是GAPIIa-1胰蛋白酶酶解肽MALDI-TOF-MS；
图6：是GAPIIa-2胰蛋白酶酶解肽MALDI-TOF-MS；
图7：是GAP在DEAE-Cellulose的分离图谱；
图8：是GAPIIa在DEAE-Sephadex-A50柱层析图；
图9：是常规聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定GAPIIa的纯度；
图10：是15％浓度的聚丙烯酰胺SDS-PAGE鉴定GAPIIa的纯度；
图11：是GAPIIa中肽段(2471)的CID；
图12：是GAPIIa中肽段(1911)的CID；
图13：是GAPIIa的拉曼光谱；
图14：是GAPIIa的FTIR图谱；
图15：是GAPIIa的CD；
图16：是GAPIIa扫描电镜照片；
图17：是GAPIIa透射电镜照片；
图18：是GAPIIa在不同溶剂中的荧光光谱；
图19：是GAPIIa(乙二醇)紫外差光谱。
详细的技术方案如下所述：
经检测，本发明的GAPIIa白果蛋白，分子总共由271个氨基酸残基组成，他们分别是37个Asp、28个Thr、33个Ser、25个Glu、25个Gly、19个Ala、8个Cys、28个Val、7个Ile、12个Leu、8个Tyr、8个Phe、8个Lys、3个His、5个Arg、6个Pro、5个Met和4个Trp。
GAPIIa是含有少量糖的糖蛋白，其与糖之间是以O-糖苷键方式连接在Ser或Thr残基上的。
GAPIIa-1和GAPIIa-2胰蛋白水解酶酶解的肽质量酶谱分别见附图5和6所示。
所述的GAPIIa存在2种以上结构形式，主要为β-折叠或卷曲结构，α-螺旋结构含量较少。
所述的GAPIIa中的Trp残基两种类型都存在，即有暴露于分子外部的Trp残基，也有处于疏水内部的Trp残基。在溶液中的构象，受酸碱度影响较小，但酸度相对影响较大，而对有机溶剂其构象变化敏感。
制备所述的GAPIIa的方法，按照以下方式：
一种从白果中提取、分离、纯化白果蛋白(GAPIIa)的工艺，选择品质优良的白果作为分离纯化白果蛋白GAPIIa的材料，用氯化钠盐溶法和硫酸铵盐析法抽提蛋白质；两步离子交换结合分子筛层析柱分离纯化，得到新的具有延缓衰老和抗氧化活性的蛋白。
为了保持蛋白质的活性，所有的操作均宜在0-4℃进行。
为了保持蛋白质的活性，避免不可逆变性，采用硫酸铵盐析法进行蛋白质抽提。为了富集目标蛋白，同时尽可能减少杂蛋白或杂肽，弃去饱和度为35％的硫酸铵盐析沉淀物，保留饱和度为35％至90％的硫酸铵盐析沉淀物。
为了有效分离清蛋白和球蛋白，根据清蛋白和球蛋白的溶解特点，将硫酸铵盐析沉淀物对蒸馏水进行透析，透析液再经10000r/min离心，并收集上清液。
本发明采用两步离子交换结合分子筛层析柱分离纯化从清蛋白中分离目标蛋白。为了提高分离效率，同时保持蛋白质的活性，离子强度和pH是其中的重要参数。所以，第一步采用DEAE-Cellulose离子交换层析，pH 8.0、50mmol/L的三乙醇胺-盐酸缓冲液平衡层析柱，经上样吸附后，以步进式和梯度式结合的方法进行洗脱，即先用0.1mol/L离子浓度的NaCl洗脱液洗脱至基本无峰出现，再用0.2mol/L-0.4mol/L离子浓度的NaCl洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液。第二步采用具有离子交换和分子筛两重性能的阴离子交换柱-DEAE-Sephadex-A50层析柱，进一步纯化目标蛋白。为了减少了脱盐干燥的步骤，同时避免蛋白质变性，将第一步分离得到的蛋白洗脱液先对pH 8.0、50mmol/L的三乙醇胺-盐酸缓冲液进行透析，除去部分盐后，缓慢加入到DEAE-Sephadex-A50层析柱中，使GAPII被吸附到层析柱顶部，再用0.2mol/L-0.4mol/L的NaCl洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液。
为了更好地保存目标蛋白，并保持蛋白质的活性，所采用的干燥方法均为真空冷冻干燥法。
采用上述工艺制备的GAPIIa样品，纯度达到了色谱纯和电泳纯。
将上述工艺制备的白果清蛋白和GAPIIa冻干粉，采用2-脱氧-D-核糖(DR)法(Halliwell B，Gutteridge J MC，Aruoma O I.The deoxyribose method：a simple“test-tube”assay for determination of rate contents for reactions of hydroxylradicals.Anal Biochem.，1987，165：215-219)和氮蓝四唑(NBT)光化还原法(贾之慎，杨贤强.茶多酚清除活性氧自由基的分光光度法研究.茶叶，1993，19(1)：25-27)测定他们的抗氧化能力，研究结果表明白果蛋白具有良好的清除或抑制羟基自由基和超氧阴离子自由基能力，并以抑制超氧阴离子自由基活性为佳。
通过体外、体内给药动物实验和果蝇生存寿命实验等观察采用上述工艺制备的白果蛋白延缓衰老的能力。实验结果显示白果蛋白具有抗生物氧化和延缓机体衰老的作用，并提示白果蛋白具有较好的抗衰老作用的作用机理是与其具有抗氧化活性有关。
具体实施方式
实施例1：白果蛋白GAPIIa的分离与纯化
1.清蛋白的提纯
在4℃温度下，料液比按1∶3(w/v)加入0.14mol/L NaCl溶液，分三次将500g白果脱脂粉充分匀浆，匀浆液在10000r/min转速下离心15min。取上清液，加入固体硫酸铵达35(w/w)％饱和度。搅拌放置1h以上，10000r/min转速下离心15min，取上清液。再加入固体硫酸铵达90(w/w)％饱和度，搅拌放置1h以上，10000r/min转速下离心15min，收集粗蛋白。将粗蛋白沉淀重溶于蒸馏水中，用1.0kDa的透析膜对蒸馏水透析。随着盐浓度的降低，球蛋白会慢慢析出，将透析过的蛋白质溶液在10000r/min转速下离心15min。取上清液，冷冻干燥得18.6g白果清蛋白。
2.阴离子纤维素离子交换层析
称取DEAE-Cellulose树脂50g，先以0.5mol/LNaOH处理30min，抽滤，水洗至pH9，然后以0.5mol/L HCl处理30min，蒸馏水洗至pH6-7。随后再用0.5mol/L NaOH处理30min使之转为OH-型。然后再用5％的NaCl溶液洗脱，使之转为Cl-型。50g处理好的DEAE-Cellulose可装填400×30mm柱，柱上端留20-30mm空间，以水覆盖。
用上样缓冲液(即pH值为8.0的50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液)平衡层析柱后，将白果蛋白质溶液上样在DEAE-Cellulose层析柱上，流速0.2ml/min。先用50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液(pH 8.0)配制的0.1mol/L的NaCl洗脱液洗脱至基本无峰出现，再用50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液(pH 8.0)配制的0.2mol/L-0.4mol/L的NaCl洗脱液以流速为0.2ml/min进行梯度洗脱，用部分收集器分部收集经洗脱流出的溶液，收集的体积为4ml/管。纤维素阴离子交换层析图见附图(7)。
3.阴离子葡聚糖凝胶离子交换层析
称取10g DEAE-Sephadex-A50干树脂，用50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液(pH值为8.0)在沸水浴中溶胀1h。用1.0mol/LNaOH将树脂悬浆的pH调至8.0，静置，让树脂沉下，去上清液。用三乙醇胺缓冲溶液洗涤三次左右，直至pH为8.0并保持不变。10g处理好DEAE-Sephadex-A50可装填400×30mm柱。
将收集的蛋白质溶液对pH 8.0、50mmol/L的三乙醇胺-盐酸缓冲液进行透析，除去部分盐，缓慢加入到DEAE-Sephadex-A50层析柱中，使蛋白质被吸附到层析柱顶部，再用50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液(pH 8.0)配制的0.2mol/L-0.4mol/L的NaCl洗脱液进行梯度洗脱，然后用部分收集器收集高峰部分，命名为GAPIIa。葡聚糖凝胶离子交换层析图见附图(8)。收集的GAPIIa盐溶液，用透析带对蒸馏水透析除去盐分后，冷冻干燥即为GAPIIa冻干样品。
从500g脱脂白果粉中约可制得15mg纯化GAPIIa。
实施例2：白果蛋白GAPIIa的鉴定
1.DEAE-Sephadex-A50 GAPIIa的纯度鉴定
将实施方式(1)中纯化得到的GAPIIa样品再进行一次DEAE-Sephadex-A50柱层析(如附图(8))。从附图可以看出，只有一个单一对称峰。因此，可以认为GAPIIa在层析性质上是均一的，其纯度达到色谱纯。
2.常规-聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-PAGE GAPIIa的纯度鉴定
采用最常用并具有较高分辨率的常规聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定GAPIIa的纯度。将GAPIIa配成浓度为2mg/mL的溶液，按进样量为20uL进行点样，在100V稳压条件下电泳6h。电泳后的凝胶先用固定液(异丙醇∶乙酸∶水＝25∶10∶65)固定1h，再用考马式亮蓝R-250染色4h，最后用7％的乙酸溶液脱色至基本无背景。从附图(9)可以看到为一条蛋白带，因此可鉴定GAPIIa样品为电泳纯。
采用SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度，可以反映蛋白质所含有亚基的情况。蛋白质处理液配制：称取Tris 0.665g，甘油5.5mL，巯基乙醇2.5mL，5gSDS溶于水，用HCl调pH为8.0，加溴酚蓝20mg完全溶解后用水定容至50mL。
分离胶缓冲液pH 8.8，浓缩胶缓冲液pH 6.8；电极缓冲液pH8.3；分离胶浓度15％；浓缩胶浓度4％；样品和标样均用蛋白质处理液配成浓度为2mg/mL的溶液，并在沸水中加热3-5min，冷却至室温作点样用；进样量20uL；100V稳压电泳6h。用样品缓冲液配制样品后需经100℃加热处理。分离缓冲液、浓缩缓冲液、电极缓冲液和样品溶液均含有SDS。电泳后的凝胶先用固定液(异丙醇∶乙酸∶水＝25∶10∶65)固定1h，再用考马式亮蓝R-250染色4h，最后用7％的乙酸溶液脱色至基本无背景。附图10是用15％浓度的聚丙烯酰胺鉴定GAPIIa的纯度，图中在14.4KDa处出现两条蛋白带，表明GAPIIa是由两条分子量为14.4KDa左右的肽链以二硫键结合的蛋白质。
3.MALDI-TOF-MS测定蛋白的分子量和肽质量指纹图谱
3.1 GAPIIa分子量测定
采用岛津Kratos公司Kompact SEQ型的MALDI-TOF-MS测定GAPIIa分子量为29247Da。测定时的仪器条件为氮激光器，波长337nm，线性飞行距离1.2m，加速电压20kV，检测器电压25kV。基质为α-Cyano，取适量α-Cyano于塑料离心管中，加入0.1％TFA/50％乙腈溶液40～100uL，充分振荡后离心，使离心管底部有少许固体α-Cyano为宜，取上清饱和液使用。内外标均用水配制。将GAPIIa溶于去离子水中，配成40pmol·μL-1的溶液，然后取1μL与等体积饱和基质溶液混合后点靶测定，用CytoC(10pmol)进行内标校正。质谱图如附图(4)。
3.2 GAPIIa肽质量指纹图谱的测定
采用SDS-PAGE电泳法将GAPIIa的两条肽链分离纯化。配制12.5％分离胶，3.3％浓缩胶(20cm×20cm×0.1cm)的SDS-PAGE胶，在垂直板电泳仪上制胶。待胶液凝固后，上样进行电泳，恒流48mA，直至溴酚蓝前沿到达玻璃板底部。考马斯亮蓝G250染色2h，脱色过夜。
将从电泳上分离后，经考马斯亮蓝染色的两条蛋白带，用刀片沿蛋白带染色边缘切下，切成1mm2的胶块，分别置于Eppendorf管中，用100μl 50％乙腈/100mM碳酸氢铵洗2-3次，每次20分钟至脱色干净。脱色后的胶片置于真空干燥器SpeedVac(Savant Instruments，Holbrook，NY，USA)中干燥20分钟，然后加入10ng/μL的胰蛋白酶液(25mM碳酸氢铵溶液，pH 8.0)5-10μl，置于4℃冰箱放置40min使胶片完全吸收酶液，再补加10μL 25mM碳酸氢铵缓冲液，于37℃温育过夜。用5％TFA 50-100μL于40℃提取酶切肽段1h一次，再用相同体积的50％ACN/2.5％TFA溶液于30℃提取1h一次，最后用50μL ACN超声提取一次，合并3次提取液，用真空干燥器SpeedVac进行干燥。干燥后的样品用3-5μL 0.5％的TFA溶液溶解供质谱测定。内标：胰岛素，外标：胰岛素氧化B链。以上溶液0.6μl用于MALDI-TOF-MS分析。对于手动测序的样品，需要用C18Ziptip(Millipore，Bedford，MA，USA)脱盐。脱盐步骤按照说明书操作。脱盐后的样品置于镀金属钯的needle中进行测定，得到GAPIIa两条肽链的肽质量指纹图谱分别见附图(5)和(6)。
4.ESI-MS/MS测定GAPIIa部分序列
取0.6μl以上制备的溶液用于ESI-MS/MS分析测定GAPIIa部分序列。分析的图谱见附图(11)和(12)，结果见表(1)。
表1 肽质量数为2470.0044和1910.9644的肽段的氨基酸序列
| 实验测得的质量数 | 理论质量数 | 误差(Da) | 理论误差(％) | 肽段的氨基酸序列 |
| 2470.00441910.9644 | 2472.6811913.171 | -2.6766-2.2066 | 0.08930.1155 | AVVVDSNTGETHWCGEGMPDPNRLVGNTADLGNWQSMHLR |
ESI-Q-TOF-MS/MS为英国Micromass公司的正交加速电喷雾串联质谱仪Q-TOF2。配备毛细管液相色谱和纳升喷雾源。所有测定均在正离子方式下进行。质谱仪的校正是用Glu-fib的串联质谱碎片校正的，质量准确度小于0.1Da。雾化气为氮气，碰撞气体为氩气。源温80℃，锥孔电压50V左右。TOF加速电压为9.1Kv。MCP检测器电压为2.2Kv。当进行nano-ESI-MS/MS分析时，毛细管电压为800-1000V，调节碰撞能量和碰撞气体的大小使得到一个好的串联质谱图。该质谱图经Micromass的专用软件MaxEnt3处理后，借助Micromass的专用软件MasSeq直接推导出肽段序列。镀金属钯的硼硅酸盐电喷雾针(palladium-coated borosilicateelectrospray needle)(Protana，Odense，Denmark)是一次性的专用needle。
5.蛋白质序列数据库检索
使用互联网上的蛋白质数据库检索程序：Ex PASy Molecular Biology Server网站提供的Peptldent(
http：//www.expasy.ch/tools/peptident.html)和UCSFMass Spectrometry Facility网站提供的MS Fit(
http：//prospector.ucsf.edu/ht mlucsf3.0/msfit.ht，对肽质量指纹图谱和肽序列标签进行蛋白质数据库搜索，证明GAPIIa为一未知蛋白质。
6.β-消除反应确定GAPIIa糖肽链的连接方式
采用张惟杰的O-糖苷键的稀碱水解(β-消除反应)方法，(张惟杰，糖复合物生化研究技术。浙江，浙江大学出版社，1999，第二版：129)确定GAPIIa糖肽链的连接方式。在氮气保护下，30mg GAPIIa溶于3mL 0.2mol/L NaOH-1.0 mol/L NaBH4溶液，于40℃反应24h，在冰浴中用1mol/L乙酸中和至pH7.0。在氮气保护下，用6mol/L HCl水解，用氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量。表(2)为反应前后氨基酸组成的变化，由测定结果可知，苏氨酸和丝氨酸分别减少了1.01％和1.24％，而丙氨酸增加了0.64％。根据这些氨基酸残基的变化，可以确定GAPIIa与糖基之间是以O-糖苷键方式相联的。
表2.β-消除反应前后氨基酸组成的变化
| 氨基酸 | 反应前 | 反应后 | 氨基酸 | 反应前 | 反应后 |
| AspThrSerGluGlyAlaCysValIle | 14.829.769.8811.284.964.712.979.472.68 | 13.998.758.6410.385.965.352.0211.282.10 | LeuTyrPheLysHisArgProMetTrp | 5.274.414.324.041.632.792.132.362.51 | 4.994.704.954.231.633.003.952.091.95 |
7.GAPIIa拉曼光谱分析
将少量(约0.1mg)天然GAPIIa冻干粉在MKI-1000激光拉曼光谱仪上进行拉曼光谱测试，由微机联动控制。双单色仪狭缝宽400um，扫描速度为1cm-1/S。激光光源为Coherent公司的INNOVA 70型氨离子激光器，激发波长514.5nm，功率250mW。实验为90°方向散射几何装置。对天然GAPIIa冻干粉的拉曼散射信号扫描2次，由计算机作信号累加平均和绘图输出，得到天然GAPIIa冻干粉的拉曼光谱图，见附图(13)。
8.GAPIIa红外光谱分析
将少量(约0.5mg)天然GAPIIa冻干粉样品和溴化钾混合研磨后压片，用Nicoler-SX-170傅立叶变换红外光谱仪测定，红外光谱图见附图(14)。
9.GAPIIa分子园二色谱分析
将GAPIIa配制成0.1-0.3mg/mL浓度的溶液在JASCO-500型园二色谱仪上进行测试。测试条件为：灵敏度2毫度；池厚0.1cm；温度20℃；扫描范围180-350nm；扫描速度100nm/min。园二色谱图见附图(15)。
10.GAPIIa聚集状态的扫描电镜和透射电镜观察
将少量(约0.1mg)天然GAPIIa冻干粉样品放入真空喷镀仪中镀上一层金属薄膜后，在日立X-650型扫描电镜上进行观察。电镜条件为：高压20kV、束流5×10-9mA，工作距离15mm。扫描电镜照片见附图(16)。
将少量(约0.1mg)天然GAPIIa冻干粉样品放入无水乙醇溶液中，用铜网载上后，送入JEM-100CX-II型透射电镜的镜筒中进行观察。电镜条件为：加速电压80kV。透射电镜照片见附图(17)。
11.GAPIIa的内源荧光特征
所有荧光实验均在Hitachi-850荧光分光光度仪上进行，样品测定温度25℃，激发和发射光谱谱宽分别为4nm和2nm。除特殊说明外，GAPIIa浓度0.05mg/mL测定荧光光谱，溶液体系为0.01mol/L Tris-HCl缓冲体系(pH7.6)。
除注明外，激发波长均为282nm，一般蛋白质在此激发波长下的荧光光谱约97％为Trp残基所提供，且Trp对溶剂的极性较为敏感，因此可用282nm为激发波长研究GAPIIa中Trp残基的微环境。
用盐酸和氢氧化钠改变GAPIIa溶液的pH值(对照组用水溶液)测定当激发波长为282nm时的GAPIIa发射λmax和荧光强度。在一组盐酸和氢氧化钠溶液中，使它们pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，研究酸碱度对GAPIIa内源荧光光谱的影响，荧光光谱变化结果见表(3)。
表3 不同酸碱度时的GAPIIa荧光强度
| pH | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 | 8.0 | 9.0 | 10.0 |
| 相对荧光强度 | 79 | 80 | 80.6 | 78.6 | 81.4 | 84 | 81.8 | 82.4 | 82.8 |
GAPIIa在一些含有机试剂的溶液中如30％的二甲亚砜、30％乙二醇、30％的乙醇及30％甘油，观察其发射光谱波长的变化，研究有机溶剂对GAPIIa内源荧光光谱的影响，荧光光谱变化结果见附图(18)。
12.GAPIIa紫外差光谱分析
紫外差光谱测定用日立556型双波长双光束分光光度计进行，在25℃恒温下测定230-310nm波段的紫外差光谱。GAPIIa浓度为1mg/mL的水溶液；微扰剂为乙二醇；乙二醇浓度为20％的水溶液。GAPIIa紫外差光谱见附图(19)。
实施例3：白果蛋白生物活性的测定
1.白果蛋白对自由基(·OH)的清除作用
采用2-脱氧-D-核糖(DR)法(Halliwell B，Gutteridge J MC，Aruoma O I.Thedeoxyribose method：a simple“test-tube”assay for determination of rate contents for reactions ofhydroxyl radicals.Anal Biochem.，1987，165：215-219)：在干净磨口试管中依次加入0.4mL50mmol/L pH 7.5的KH2PO4-KOH缓冲液，一定浓度样品，0.1mL 1.04mmol/L EDTA溶液，0.1mL10mmol/L H2O2，0.1mL 60mmol/L DR(对照不加)，0.1mL 2mmol/L维生素C，以及0.1mLlmmol/L FeCl3，各管终体积为1.0mL。37℃保温1小时后取出，加入1mL 25％HCl终止反应，再加1.0 ml1％TBA溶液，将每个试管中溶液混匀，沸水浴中煮15min，立即冷却后离心(3000rpm)。在532nm波长处测吸光度，并按下列公式计算抑制率：
其中A0、A1、A2分别代表对照 品及样品空白的吸光度。实验结果为133μg/ml的白果蛋白GAPIIa对·OH的抑制率高达69.1％。
2.白果蛋白对超氧阴离子自由基的清除作用
采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法(贾之慎，杨贤强.茶多酚清除活性氧自由基的分光光度法研究.茶叶，1993，19(1)：25-27)，加以改进。反应在装有2支20W日光灯，四周衬有铝箔的盒子中进行，调节反应物离灯的距离，用照度计测定使其受光强度为4000lx。3ml反应液中，使核黄素的浓度为3×10-6mol·L-1，甲硫氨酸的浓度为1×10-2mol·L-1。试液均用5×10-2mol·L-1，pH为7.5的磷酸缓冲液配制，在25℃下，光照20min，核黄素即因光化反应而产生O2 -·。
在以上体系中加入氯化硝基四氮唑兰(NBT)，使浓度达1×10-4mol·L-1，光照核黄素产生的O2 -·能将NBT还原为蓝色的产物，以无光照的试液作校正，在560nm处测得其吸光度A，可表示为O2 -·的含量，加清除剂后能清除O2 -·，抑制了NBT的还原，测得其吸光度为A1，A-A1表示O2 -·的减少量，则抑制率为：
实验结果为100μg/ml的白果蛋白GAPIIa对O2 -·的抑制率高达60.64％，与20μg/ml的茶多酚相当。
3.白果蛋白抗生物氧化性能
3.1白果蛋白体外抗氧化实验
每支试管加入0.20mL 10％肝匀浆，0.10mL生理盐水或FeSO4(5mmol/L)或H2O2(10mmol/L)，给药组加0.20mL不同浓度的白果蛋白溶液，对照组加等体积的生理盐水，37℃温浴1h，置冰水中冷却后，TBA比色法测MDA含量。
每支试管加入0.20mL 0.50mg/mL线粒体蛋白液，0.20mL不同浓度的白果蛋白溶液，对照组加等体积的生理盐水，37℃温浴24h，置冰水中冷却后，TBA比色法测定大鼠肝线粒体MDA含量。
取新配的1％大鼠红细胞悬浮液5.0mL，加入0.40mL不同浓度的白果蛋白溶液，混匀，置37℃温浴24h，置冰水中冷却后，离心取上清液，TBA比色法测定大鼠红细胞MDA含量。
实验结果表明：白果清蛋白对肝匀浆体外温育时MDA的自发产生及Fe2+、H2O2诱发MDA的生成有一定的抑制作用，其对MDA生成的抑制率最高为47.55％；白果清蛋白对大鼠肝线粒体MDA含量的生成都有显著的抑制作用，最大抑制率高达70.97％；白果清蛋白都具有显著的抑制红细胞自氧化作用，最大抑制率高达65.57％。
3.2白果蛋白的体内抗氧化实验
选用SPF级雌性昆明种小白鼠，老龄小鼠(11-12月龄)70只(45.2±4.3g)，青年小鼠(2月龄)10只(34.2±3.1g)。将老龄小鼠按体重随机分为7组，每组10只，即老龄对照组(灌生理盐水)，GAP剂量组(100mg/kg.d，50mg/kg.d，25mg/kg.d)和GSP剂量组(200mg/kg.d，100mg/kg.d，50mg/kg.d)，另设青年对照组。各组动物适应性喂养一周后，灌胃给予受试物或对照物，连续30天，然后断头处死，采血，取脏器，测定。实验期间，每周称体重一次。
分别取10％肝组织匀浆和血清各0.10mL，按试剂盒肝组织匀浆中MDA含量的测定方法(硫代巴比妥酸法)，以四氧甲基丙烷为标准，在532nm波长处测定小鼠肝组织匀浆和小鼠血清MDA含量。
分别取10％肝组织匀浆5μL和1％肝组织匀浆12μL，按试剂盒肝组织匀浆中SOD活性的测定方法(羟胺法)测定小鼠肝组织匀浆和小鼠血清中SOD活性。
分别取1％肝组织匀浆0.20mL和溶血液0.20mL，按试剂盒肝组织匀浆GSH-PX活性的测定方法(二硫对硝基苯甲酸法)测定小鼠肝组织匀浆和小鼠全血中GSH-PX活力。
实验结果分别见表(4)(5)和(6)
表4.白果蛋白对小鼠肝组织匀浆和血清中MDA含量的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg.d) | 血清 | 肝组织(nmol/mg protein) |
| (nmol/mL) | |||
| 老年对照组青年对照组白果清蛋白白果盐溶蛋白 | 00100502520010050 | 9.53±1.254.32±0.577.24±0.54**7.26±0.61**6.76±0.60**6.51 ±0.51**6.40 ±0.43**5.85±1.20** | 1.91 ±0.360.92±0.161.91±0.201.43±0.30*1.28±0.13**1.68±0.401.45±0.32*1.43±0.29* |
*：P＜0.05，**：P＜0.01
表5.白果蛋白对小鼠肝组织匀浆和血清中SOD活性的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg.d) | 血清 | 肝组织(NU/mg protein) |
| (NU/mL) | |||
| 老年对照组青年对照组白果清蛋白白果盐溶蛋白 | 00100502520010050 | 164.3±15.1291.2±24.7208.0±10.7**216.9±17.5**195.3±10.3**208.5±12.8**199.6±19.7**203.2±11.5** | 531.1±58.5968.2±84.3805.8±31.2**604.3±39.9*592.7±56.9689.1±65.4**623.0±29.6*611.2±42.9* |
*：P＜0.05，**：P＜0.01
表6.白果蛋白对小鼠肝组织匀浆和血清中GSH-PX活性的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg.d) | 全血 | 肝组织(NU/mg protein) |
| (NU/mL) | |||
| 老年对照组青年对照组白果清蛋白白果盐溶蛋白 | 00100502520010050 | 63.5±3.2110.4±10.691.2±8.7**89.6±9.6**83.4±8.0**87.7±8.4**88.4±5.8**81.4±7.4** | 32.9±3.750.6±4.839.2±1.9**37.6±3.1**38.0±2.4**42.0±3.7**41.9±3.9**39.7±3.6** |
*：P＜0.05，**：P＜0.01
实验结果表明：饲喂白果蛋白均可抑制实验动物饲肝组织匀浆和血清中MDA的生成，这些效果说明白果蛋白可以有效地抑制机体内自由基的产生，对动物细胞起到很好保护作用。饲喂白果蛋白均可提高实验动物肝匀浆和血清中SOD的活性，白果蛋白作为一种营养性的抗氧化剂，能够增强体内SOD活性，是理想的抗衰老滋补品。饲喂白果蛋白均可提高实验动物肝匀浆和血清中GSH-PX的活性，说明食用白果蛋白可以激活体内GSH-PX的活性，有效地清除体内自由基，保护机体免受自由基攻击损害。
3.3果蝇生存实验
空白培养基及药物培养基制备：用玉米粉34g，蔗糖26g，干酵母粉3g，丙酸2.0mL，琼脂3.0g，蒸馏水400mL。制成不含药物的空白培养基，药物培养基则在基础培养基中加入白果蛋白3.3mg/100g(低剂量组)、10mg/100g(中剂量组)和30/100g(高剂量组)。取1.cm×10cm的培养管，收集10h孵出的果蝇成虫，乙醚麻醉，称体重分成4组，每组100只果蝇，每只培养管内放入25只果蝇，雌雄分养，每管放2mL培养基，用双层纱布封口。各组果蝇均放入25±1℃、湿度为45％～75％的培养箱中，前四周均喂养基础培养基，29天后各试验组开始给药物培养基，每天上午10:00观察并记录死蝇数目，4天更换一次培养基，观察果蝇至完全死亡为止。记录每组果蝇的存活时间及半数存活时间。以每组最后一只死亡果蝇的寿命为该组果蝇的最高寿命。统计各组果蝇的平均寿命(组内各个果蝇生存天数的代数和除以果蝇数目)以及最高寿命天数。根据各组果蝇不同时间累积存活率绘制果蝇生存曲线。并对各组平均生存天数采用t检验。
实验结果表明，无论是雄性果蝇还是雌性果蝇，中剂量组(10mg/100g)均能延长果蝇的平均寿命和平均最高寿命。与对照组相比，具有极显著差异，平均延寿率雌性果蝇为10.87，雄性果蝇为10.31％。说明白果清蛋白具有延长果蝇寿命的作用。
本发明具有以下积极效果：
本发明纯化的白果蛋白GAPIIa是一种新的植物蛋白，并且具有抗氧化和延缓衰老的保健功能，本发明的蛋白可用于生产抗氧化和延缓衰老的保健食品或药学方面。
本发明中的提取、分离、纯化工艺，可专一性适合白果蛋白GAPIIa的纯化，工艺流程短，易于保持白果蛋白GAPIIa的活性，样品中GAPIIa纯度可达色谱纯和电泳纯，可进行序列测定和结构分析。
Claims (8)
1、一种来源于白果果仁的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白被定义为GAP IIa白果蛋白，其精确分子量为29248Da。
2、权利要求1定义的蛋白质，其特征在于：GAP IIa是由两条分子量接近、氨基酸序列相似的被定义为GAP IIa-1和GAP IIa-2的两条肽链，通过二硫键连接组成的蛋白质，并以O-糖苷键方式连接少量的糖基；在GAP IIa-1和GAP IIa-2中共同存在，其准确分子量分别为2470.0044和1910.9644的肽段；其中肽质量数为1910.9644的肽段序列为Leu-Val-Gly-Asn-Thr-Ala-Asp-Leu-Gly-Asn-Trp-Gln-Ser-Met-His-Leu-Arg；肽质量数为2470.0044的肽段序列Ala-Val-Val-Val-Asp-Ser-Asn-Thr-Gly-Glu-Thr-Trp-His-Cys-Gly-Glu-Gly-Met-Pro-Asp-Pro-Asn-Arg。
3、权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述的GAP IIa-1和GAP IIa-2，用胰蛋白水解酶水解，均可被水解成大小不等的多条肽段：肽质量数在900以上的，GAP IIa-1有8段，分别为911.92、1912.36、1075.82、1331.00、1638.09、2471.52、3098.98和3495.22；GAPIIa-2有5段，对应的肽质量数为911.87、1844.28、1912.38、2242.56、2471.56；两条肽链中均含有肽质量数为911的肽段、肽质量数为1911的肽段和肽质量数为2470的肽段，这3个肽段的分子量相等，氨基酸序列相同。
4、权利要求1所述的白果蛋白GAP IIa的制备方法，其步骤为：
1)采用盐溶和盐析的方法，从白果果仁中得到白果清蛋白、白果球蛋白和白果盐溶蛋白；
2)采用阴离子纤维素离子交换层析的方法，分离纯化步骤1)得到白果清蛋白，得到白果蛋白GAP IIa粗品；
3)采用阴离子葡聚糖凝胶离子交换层析的方法，进一步纯化步骤2)得到的GAP IIa粗品，得到精制的白果蛋白GAP IIa。
5、权利要求4所述的方法，其中白果清蛋白、球蛋白及盐溶蛋白的制备方法如下：
1)将白果脱脂粉在4℃下，料液比按质量体积比1∶3加入0.14mol/L NaCl溶液，分三次提取，得到白果盐溶提取液，将白果盐溶提取液冻干，得到白果盐溶蛋白；
2)将白果盐溶提取液离心，得到上清液，弃去沉淀；
3)将步骤2)得到的上清液加入粉末硫酸铵使上清液的饱和度达35％，析出杂蛋白，并离心；得到上清液，弃去沉淀；
4)将步骤3)得到的上清液加入粉末硫酸铵使上清液的饱和度达90％，析出清蛋白和球蛋白，并离心；弃去上清液；
5)将得到的沉淀对蒸馏水进行透析，脱去硫酸铵，同时析出球蛋白；离心，将得到的上清液冻干得到白果清蛋白；对透析析出的沉淀进行冻干，得到白果球蛋白。
6、权利要求4所述的方法，其中所述的阴离子纤维素离子交换层析步骤如下：
用pH值为8.0的50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液制备上样缓冲液，平衡层析柱后，将白果蛋白质溶液上样在DEAE-Cellulose层析柱上，流速0.2ml/min；先用pH8.0的50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液配制的0.1mol/L的NaCl洗脱液洗脱至基本无峰出现，再用pH8.0的50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液配制的0.2mol/L-0.4mol/L的NaCl洗脱液以流速为0.2ml/min进行梯度洗脱，用部分收集器收集经洗脱流出的溶液。
7、权利要求4所述的方法，其中的阴离子葡聚糖凝胶离子交换层析步骤如下：
将权利要求6所述的蛋白质溶液用pH8.0的50mmol/L的三乙醇胺-盐酸缓冲液进行透析，除去部分盐后，缓慢加入到DEAE-Sephadex-A50层析柱中，使蛋白质被吸附到层析柱顶部，在pH8.0条件下，再用50mmol/L三乙醇胺缓冲溶液配制的0.2mol/L-0.4mol/L的NaCl洗脱液进行梯度洗脱，然后用部分收集器收集高峰部分，用透析带对蒸馏水透析除去盐分后，冷冻干燥即为GAP IIa冻干样品。
8、权利要求1所述的白果蛋白GAP IIa在用于制备抗氧化和延缓衰老的保健食品或药物方面的用途。
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| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |