CN106916319A - 葡聚糖接枝改性的白果蛋白制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡聚糖接枝改性的白果蛋白制备方法及其应用。本发明利用葡聚糖对白果蛋白进行接枝改性,从而使改性蛋白的抗氧化、抗衰老作用得到显著提高,同时,经葡聚糖接枝改性后白果蛋白的细胞毒性显著降低,可以有效减缓白果蛋白的致敏性。本发明蛋白接枝改性技术方法简单,经济环保,条件可控,接枝产物得率高,可用于工业化大规模生产,本发明制备得到的葡聚糖‑蛋白接枝产物具有很好的抗氧化、抗衰老活性,具有开发成安全、有效的抗衰老药物和保健品的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及医药、食品领域,具体涉及一种葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法及其在抗衰老产品中的应用。
背景技术
衰老又称老化,是指生物体在正常状况下发育成熟后,随着年龄的增加,机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现,是不可逆的生命过程。随着社会的发展、医学的进步和人民生活水平的不断提高,人类的平均寿命也将不断延长,但也会出现相应的社会老龄化问题以及心血管病、脑血管病、癌症、关节炎等老年性疾病发病率上升的问题。2000年的老年人口的比例为6.9%,预计到2050年老龄人口的比例将增加到19.3%,每年因老年性疾病引起的死亡率也逐年上升。
银杏(Ginkgo biloba L.)是裸子植物门银杏纲银杏属植物,素有国家“活化石”之称。白果是银杏种实去掉肉质外种皮后的种核部分。已有研究表明,银杏具有较好的抗衰老作用。白果因其多糖、蛋白质和脂肪等营养物质丰富而为日本人尊为“圣果”、“长寿果”,被当作养生延年的上品。白果因其品味甘美、药食俱佳,自古以来就被作为老幼皆宜的保健食品和款待国宾上客的特制佳肴。白果中含有8.7%~13.4%的蛋白质(不同品种有差异),其氨基酸组成丰富、合理,属优质蛋白。有研究显示,白果药食兼备的特性及其保健功能与其蛋白质成分有着密切联系。
蛋白质-糖的接枝反应(美拉德反应)主要是基于蛋白质分子中氨基酸侧链的自由氨基α-或ε-氨基和糖分子还原末端的羰基之间的羰氨反应。蛋白质与糖的接枝反应,不需要任何化学试剂作为催化剂,仅加热就可使该反应自发地进行。研究表明,蛋白质-糖接枝物是一种性质优良的多功能复合物。它们是由蛋白质和糖两种天然生物分子在无任何化学催化剂参与下经由接枝反应制得,符合现代绿色环保的概念,有着广泛的应用前景。蛋白质一般对热,水解作用很不稳定,但对碳水化合物或生物多聚物的交联能变得稳定,也被赋予一些新的特性。蛋白和糖共价复合的糖基化产物具有较良好的功能特性。与蛋白质和糖非共价结合的糖基化产物相比较,其对外部条件具有较高的稳定性,而且不受热或pH值的变化而被破坏。由于接枝产物中的糖链存在,多羟基的亲水特性可以使整个蛋白分子的溶解性明显提高。而且蛋白质和糖的接枝物还具有良好的乳化特性、气泡性等功能性质。近年来,还有资料显示蛋白质-糖接枝物与未糖基化接枝的蛋白质相比,在抗氧化、抗衰老、抑菌性、自由基清除能力和抗原性等方面有相应的改善。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,该方法接枝产物得率高、简便且接枝产物具有较好的抗氧化、抗衰老作用。
为了实现本发明目的,本发明利用葡聚糖对白果蛋白进行接枝改性,从而使改性蛋白的抗氧化活性得到显著改善,具体方法如下:
(1)取白果粉碎,得白果粉,加6~12倍量的pH为7.0-9.0的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)搅拌,4℃冰箱放置一夜,离心(优选8000g×10min,4℃)收集上清液,沉淀再用6~12倍量的pH为7.0-9.0的PBS搅拌均匀,放置一夜,离心(优选8000g×10min,4℃),合并两次的上清液,缓慢加入硫酸铵体积浓度至50%-80%为止,4℃放置过夜,离心(优选8000g×10min,4℃),收集沉淀,将沉淀用适量的水溶解,装入分子截留量为1000Da的透析袋中于冰浴上透析,待除去盐后,透析液冷冻干燥得白果蛋白,-20℃冷冻保存,待用。
(2)将步骤(1)白果蛋白与葡聚糖混合,然后加磷酸缓冲盐溶解,得混合液a;
(3)调混合液a的pH值,然后加水至蛋白终浓度为1-5mg/mL,得混合液b;
(4)将混合液b加热反应,得白果蛋白-葡聚糖接枝反应液;
(5)待上述反应液冷却至室温,调节pH值(优选为7.0),然后离心,收集上清液经浓缩、干燥后即得葡聚糖接枝改性的白果蛋白产品。
前述的方法,步骤(1)所述白果蛋白为白果分离蛋白,蛋白含量>60%,所述葡聚糖为葡聚糖,葡聚糖为分析纯。
前述的方法,步骤(2)中所述葡聚糖为分子量为2-10万,白果蛋白与葡聚糖的重量比为2:1、1:1、1:2或1:10。特别优选白果蛋白与葡聚糖的重量比为1:1。
前述的方法,步骤(3)中调混合液a的pH值为6、7、8、9或10,加水后蛋白终浓度为1、2、3、4或5mg/mL;特别优选蛋白终浓度为4mg/mL。
前述的方法,步骤(4)中加热反应的温度为60、70、80、90、100、110、120℃,反应时间为为1、2、3、4或5h;特别优选反应温度为110℃,反应时间为4~5小时。
前述的方法,步骤(5)中离心条件为:3000-8000rpm/min离心15-30min。
前述的方法,步骤(4)中上清液经浓缩后蛋白浓度为10-15%,优选浓度为10%、12%或15%。
前述的方法,步骤(5)中干燥方法可选用常规干燥方法,如冷冻干燥或喷雾干燥,可根据实际情况选取。
本发明制备得到的葡聚糖接枝改性的白果蛋白在制备抗氧化、抗衰老的保健品或药物中的应用。
本发明和现有技术相比具有以下优点:
本发明利用葡聚糖对白果蛋白进行接枝改性,从而使改性蛋白的溶解性和抗氧化活性得到显著改善,经过测定,2mg/mL的白果蛋白-葡聚糖接枝产物的清除DPPH自由基的清除率和还原三价铁离子能力分别为42.67%和22.48×10-3;0.5mg/mL的白果蛋白-葡聚糖接枝产物ABTS自由基清除达到95.41%;抗氧化活性的各项指标均优于未进行改性的白果蛋白,累啊本发明经实验研究表明,葡聚糖接枝改性后白果蛋白的细胞毒性显著降低,因此本发明可以有效减缓白果蛋白的致敏性。
本发明采用葡聚糖接枝改性技术方法简便易行,原料丰富易得,绿色安全,不需要任何有毒化学试剂,利用湿法接枝,可以提高接枝产物的生成速度,从而节约接枝时间;该方法操作简便,所需设备简单,可实现工业化大规模化生产。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品或原料。
以下实施例中白果蛋白-葡聚糖接枝产物分子量的分布采用SDS-PAGE法测定;接枝度的测定采用邻苯二甲醛(OPA)法;褐变度用样品在420nm的吸光度值表示。
实施例1:制备不同温度条件下的葡聚糖接枝改性的白果蛋白
(1)取白果粉碎,得白果粉,加6~12倍量的pH为7.0-9.0的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)搅拌,4℃冰箱放置一夜,离心(8000g×10min,4℃)收集上清液,沉淀再用6~12倍量的pH为7.0-9.0的PBS搅拌均匀,放置一夜,离心(8000g×10min,4℃),合并两次的上清液,缓慢加入硫酸铵体积浓度至50%-80%为止,4℃放置过夜,离心(8000g×10min,4℃),收集沉淀,将沉淀用适量的水溶解,装入分子截留量为1000Da的透析袋中于冰浴上透析,待除去盐后,透析液冷冻干燥得白果蛋白,-20℃冷冻保存,待用;
(2)将步骤(1)制备得到的白果蛋白和分子量为2万的葡聚糖按比重为1:1置于具螺口玻璃管中,边搅拌边加入磷酸缓冲盐溶液,搅拌均匀得白果蛋白-葡聚糖混合液a;
(3)调节白果蛋白-葡聚糖混合液a的pH值至7.8,然后加水定容,得蛋白浓度为2mg/mL的白果蛋白-葡聚糖混合液b;
(4)将白果蛋白-葡聚糖混合液b于不同温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃)下加热2h,得不同温度条件下的白果蛋白接枝葡聚糖反应液;
(5)将反应液冷却至室温并调节pH值至7.0后,于8000rpm/min下离心15min,将上清液浓缩至蛋白浓度为15%,经冷冻干燥后得葡聚糖接枝改性的白果蛋白产品。
表1不同反应温度下白果蛋白接枝产物性能对比
实施例2:不同反应时间的白果蛋白接枝产物性能对比
(l)将实施例1方法制备得到的白果蛋白和分子量为2万的葡萄糖按重量1:1的比例溶解于pH7.8的磷酸盐缓冲液中,得到混合溶液;所述白果分离蛋白和葡萄糖的浓度均为2mg/mL;
(2)将步骤(l)所得混合液置于螺口玻璃管中,设定温度为110℃,分别反应1h、2h、3h、4h、5h后,得到反应液;
(3)将步骤(2)所得反应液冷冻干燥,得糖基化的白果蛋白成品,结果如表2所示。
表2不同反应时间的白果蛋白接枝产物性能对比
实施例3:不同浓度白果蛋白接枝产物性能对比
(l)称取实施例1方法制备得到的白果蛋白,用pH7.8的磷酸盐缓冲液配成不同浓度的白果蛋白溶液(1、2、3、4、5mg/mL),按重量1:1的比例加入分子量为2万葡聚糖充分溶解,得到不同浓度的混合溶液;
(2)将步骤(l)所得混合液置于螺口玻璃管中,设定温度为110℃,反应4h后,得到反应液;
(3)将步骤(2)所得反应液冷冻干燥,得糖基化的白果蛋白成品,结果如表3所示。
表3不同浓度白果蛋白接枝产物性能对比
实施例4:不同底物配比白果蛋白接枝产物性能对比
(l)称取实施例1方法制备得到的白果蛋白用pH7.8的磷酸盐缓冲液配成终浓度为4mg/mL的白果蛋白溶液,按不同的底物配比(白果蛋白:葡聚糖)加入葡聚糖,得到不同浓度的混合溶液;
(2)将步骤(l)所得混合液置于螺口玻璃管中,设定温度为110℃,反应4h后,得到反应液;
(3)将步骤((2)所得反应液冷冻干燥,得糖基化的白果蛋白成品,结果如表4所示。
表4不同底物配比白果蛋白接枝产物性能对比
实施例5
葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其包括以下步骤:
(1)取白果粉碎,得白果粉,加10倍量的pH为7.0-9.0的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)搅拌,4℃冰箱放置一夜,离心(8000g×10min,4℃)收集上清液,沉淀再用10倍量的pH为7.0-9.0的PBS搅拌均匀,放置一夜,离心(8000g×10min,4℃),合并两次的上清液,缓慢加入硫酸铵体积浓度至50%-80%为止,4℃放置过夜,离心(8000g×10min,4℃),收集沉淀,将沉淀用适量的水溶解,装入分子截留量为1000Da的透析袋中于冰浴上透析,待除去盐后,透析液冷冻干燥得白果蛋白,-20℃冷冻保存,待用。
(2)将步骤(1)白果蛋白与分子量为2-10万的葡聚糖按重量比为1:1混合,然后加磷酸缓冲盐溶解,得混合液a;
(3)调混合液a的pH值为7.8,然后加水至蛋白终浓度为4mg/mL,得混合液b;
(4)将混合液b加热110℃,反应4h,得白果蛋白-葡聚糖接枝反应液;
(5)待上述反应液冷却至室温,调节pH值为7.0,于8000rpm/min下离心15min,收集上清液经浓缩、干燥后即得葡聚糖接枝改性的白果蛋白产品。
实施例6:白果蛋白及其接枝产物对DPPH自由基清除的能力
向96孔板中精密移取不同浓度的白果蛋白:糖=1:1的未接枝溶液和实施例5制备得到的葡聚糖接枝改性的白果蛋白产物75μL,再加入0.25mmol/L DPPH甲醇溶液75μL,混匀,室温避光反应30min后每个样品平行测定1个复孔,再517nm波长下测定其吸光度A1;以蒸馏水代替DPPH甲醇溶液,测定吸光度A2;蒸馏水加DPPH甲醇溶液作为对照,测定吸光度(A0)。
清除率(%)=[A0-(A1-A2]/A0×100%
式中:A0为不加样品溶液的空白吸光度;A1为加有样品的DPPH甲醇溶液的吸光度:A2为加有样品和水的吸光度,用于校正空白。实验重复三次,取平均值。
对比相同浓度的白果蛋白和白果蛋白-糖接枝产物对DPPH自由基清除的能力见表5。试验结果表明白果蛋白经接枝后清除DPPH自由基的活性更强。
表5白果蛋白不接枝与接枝产物对DPPH自由基清除的能力对比
注:**表示与白果未接枝蛋白比较p<0.01;*表示与白果未接枝蛋白比较p<0.05
实施例7:白果蛋白及其接枝产物对ABTS自由基清除的能力
称1mgABTS溶于0.735mL水,1mgK2S2O8溶于1.43mL水,然后以1:1的体积混合,避光12~14h,在12~14h时间段内用完。用之前先稀释,测出稀释液的吸光度在0.7±0.02,然后才能用次此稀释液测样品。向96孔板中精密移取不同浓度的白果蛋白:糖=1:1的未接枝溶液和实施例5制备得到的白果蛋白:糖=1:1的葡聚糖接枝改性的白果蛋白产物75μL接枝4h的产物50μL,再加入ABTS稀释液150μL。每个样品平行测一个复孔在734nm波长下测定其吸光度(A1);以蒸馏水代替ABTS稀释液,测定吸光度(A2);水加ABTS稀释液作为对照,测定吸光度(A0)。
清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%
式中:A0为不加样品溶液的空白吸光度;A1为加有样品的ABTS甲醇溶液的吸光度:A2为加有样品和水的吸光度,用于校正空白。
对比相同浓度的白果蛋白和白果蛋白-糖接枝产物对ABTS自由基清除的能力见表6。试验结果表明白果蛋白经接枝后清除ABTS自由基的活性更强。
表6白果蛋白不接枝与接枝产物对ABTS自由基清除的能力对比
注:**表示与白果未接枝蛋白比较p<0.01;*表示与白果未接枝蛋白比较p<0.05
实施例8:白果蛋白及其接枝产物对三价铁离子的还原能力
FRAP工作液现配现用:25mL300mmol/L pH=3.6的醋酸盐缓冲液2.5mL10mmol/LTPTZ溶液,2.5mL20mmol/L Fecl3溶液混合而成。900μLFRAP工作液中加入100μL不同浓度白果蛋白:糖=1:1的未接枝溶液和施例5制备得到的白果蛋白:糖=1:1的葡聚糖接枝改性的白果蛋白样品溶液,混旋均匀,在室温下静置30min。取200μL于96孔板中,在593nm处测吸光度。OD值越大,表明还原Fe3+能力越强,样品抗氧化活性用达到同样吸光度值所需的FeSO4的物质的量(mmol)表示,其标准方程为y=11.52x-0.043,R2=0.9995。
对比相同浓度的白果蛋白和白果蛋白-糖接枝产物对Fe3+的还原能力见表7。试验结果表明白果蛋白经接枝后还原能力增强。
表7白果蛋白不接枝与接枝产物对Fe3+还原能力对比
注:**表示与白果未接枝蛋白比较p<0.01;*表示与白果未接枝蛋白比较p<0.05
实施例9:白果蛋白及其接枝产物对细胞致衰模型保护作用
取指数生长期的细胞加入1mLPBS,然后吸走放在试管中,洗2次,再加入0.5mL0.25%胰蛋白酶消化2min,,用含有10%的FBS(胎牛血清)和1%的P/S(双抗)的DMEM培养液配成细胞悬液。吹打数次之后,去10μL细胞混悬液在显微镜下计数。根据公式计算所需要种的细胞数,用DMEM培养液稀释细胞,然后吹打数次,将细胞种入96孔板。在37℃,5%CO2培养箱中孵育24h后,弃去上清,加入样品20μL。再将96孔板放在37℃,5%CO2培养箱中孵育48h后,每孔加入20μL的5mg/mL的MTT溶液,37℃孵育3h,弃去上清液,每孔加入150μLDMSO(二甲基亚砜),在摇床上(450rpm,37℃)避光振摇30分钟。待充分混匀后,用酶标仪在波长为570nm处检测其OD值。
D-半乳糖造模:半乳糖造模组满体积200μL,细胞悬液数目为3×104个/mL。样品组分为高、中、低共计3个浓度。四天为一个周期:第一天:将细胞种入96孔板,每孔200μL;第二天:弃去旧液,加160μL培养液,3小时后加入20μL半乳糖和20μL药样。第三天继续在孵箱中培养,使其饥饿一天。第四天:弃去旧液,加180μL培养液,3小时后加10μLMTT(注意避光),再过3小时弃去旧液,加入150μL二甲基亚砜(注意避光)。在摇床上避光振摇30min后在酶标仪上的570nm波长处检测其OD值。
白果蛋白:糖=1:1的未接枝溶液与实施例5方法制备得到的白果蛋白:糖接枝产物对D-半乳糖致衰模型HELF细胞生长状况的影响见表8。试验结果表明白果蛋白经接枝后抗衰老作用更明显。
表8白果蛋白未接枝与接枝产物对细胞的影响
注:##表示与模型组比较p<0.01;#表示与模型组比较p<0.05;**表示与白果未接枝蛋白比较p<0.01
实施例10:白果蛋白及其接枝产物对过氧化氢氧化损伤细胞保护作用
过氧化氢造模组满体积100μL,细胞悬液数目为1.5×104个/mL。样品组分为高、中、低3个浓度组。四天一个周期,第一天:将细胞种入96孔板,每孔100μL;第二天:弃去旧液,加90μL培养液(其中Control组、模型组和VC组加100μL培养液且不给药),3小时后加10μL药;第三天步骤同第二天;第四天:弃去旧液,加90μL培养液(其中Control组加100μL培养液),3小时后(此刻往后步骤都需避光)模型组先加入10ΜlVC,再加入10μL过氧化氢,除Control组外,其余的加10μL过氧化氢,1小时后加10μLMTT,再过3小时弃去旧液,加入150μL二甲基亚砜。接着在摇床上混匀30min后在酶标仪上的570nm波长处检测其OD值。
白果蛋白:糖=1:1的未接枝溶液与本发明实施例5方法制备得到的接枝产物对过氧化氢氧化损伤HELF细胞生长状况的影响见表9。试验结果表明白果蛋白经接枝后对过氧化氢氧化损伤的HELF细胞保护作用更好。
表9白果蛋白未接枝与接枝产物对过氧化氢损伤的细胞保护作用
注:##表示与模型组比较p<0.01;#表示与模型组比较p<0.05;*表示与白果未接枝蛋白比较p<0.05
实施例11:动物致敏实验
BALB/c小鼠按体重随机分成3组,分别为白果蛋白组,葡聚糖-白果蛋白接枝产物组和空白组,每组10只。适应性喂养周,自由摄食和饮水,所有动物在达到标准的动物房内词养。在第0、7、14、21和28分别经口服灌胃给予白果蛋白、实施例5制备得到的白果蛋白:糖=1:1的葡聚糖接枝改性的白果蛋白或PBS,每周观察动物的体重及生长情况。各组动物在试验的第7、14、21、28和35天采血,于4℃静置过夜后,在3000g条件下离心并分离血清,分装后保存于,采用ELISA法测定各组动物血液中蛋白特异性IgG1(表10)和IgE(表11)的水平。实验结果表明白果蛋白能显著提高小鼠血清中特异性抗体IgG1和IgE的含量,且经葡聚糖接枝改性产物与正常组血清中IgG1和IgE的含量无显著性差异。本部分研究结果表明葡聚糖接枝改性后白果蛋白的致敏性显著降低。
表10各组小鼠血清IgG1水平的变化
注:##表示与正常组比较p<0.01;#表示与正常组比较p<0.05;**表示与白果蛋白比较p<0.01;*表示与白果蛋白比较p<0.05
表11各组小鼠血清IgE水平的变化
注:##表示与正常组比较p<0.01;#表示与正常组比较p<0.05;**表示与白果蛋白比较p<0.01;*表示与白果蛋白比较p<0.05
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)取白果粉碎,得白果粉,加pH 7.0-9.0的PBS溶液搅拌,低温浸提,离心收集上清液,沉淀再用pH为7.0-9.0的PBS搅拌均匀,放置过夜,离心,合并两次的上清液,缓慢加入硫酸铵至体积浓度为50%-80%,冷藏过夜,离心,收集沉淀,将沉淀用适量的水溶解,装入分子截留量为1000Da的透析袋中于冰浴上透析,待除去盐后,透析液冷冻干燥得白果蛋白,冷冻保存,待用;
(2)将步骤(1)制得的白果蛋白与葡聚糖按2:1~1:10的重量比混合,然后加磷酸缓冲盐溶解,得混合液a;
(3)调混合液a的pH值6-10,然后加水至白果蛋白终浓度为1-5mg/mL,得混合液b;
(4)将混合液b加热反应,得白果蛋白-葡聚糖接枝反应液;
(5)待步骤(4)反应液冷却至室温,调节pH值,然后离心,收集的上清液,浓缩、冷冻干燥后即得葡聚糖接枝改性的白果蛋白产品。
2.根据权利要求1所述的葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述白果蛋白的蛋白含量>60%。
3.根据权利要求1所述的葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述葡聚糖为分子量为2-10万;白果蛋白与葡聚糖的重量比为2:1、1:1、1:2或1:10。
4.根据权利要求1所述的葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(3)中混合液a的pH值为6、7、8、9或10。
5.根据权利要求1所述的葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(3)中加水后蛋白终浓度为1、2、3、4或5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(4)中烘箱的温度为60、70、80、90、100、110、120℃,反应时间为1、2、3、4或5h。
7.根据权利要求1所述的葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(5)中离心条件为:3000-8000rpm/min离心15-30min。
8.根据权利要求1所述的葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(5)中调节pH值为7;上清液经浓缩后蛋白浓度为15-40%。
9.根据权利要求1所述的葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(5)中干燥方法为冷冻干燥或喷雾干燥。
10.权利要求1至9任一项制备得到的葡聚糖接枝改性的白果蛋白在制备抗氧化、抗衰老的保健品或药物中的应用。
11.权利要求1至9任一项所述的葡聚糖接枝改性的白果蛋白的制备方法在减缓白果蛋白的致敏性及相关产品加工中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170704 |
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