CN102492681A - 一种利用凝胶分子筛去除猪凝血酶中内毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用凝胶分子筛去除猪凝血酶中内毒素的方法方法，属于农副产品深加工领域。方法包括离心分离、柱层析、酶的激活和分子筛分离去除内毒素。优点是分离效果好，凝血酶的活性高，凝血酶中热源物质和内毒素少，临床使用安全性高。

Description

一种利用凝胶分子筛去除猪凝血酶中内毒素的方法

技术领域

本发明属农副产品深加工领域，是生物技术在农副产品深加工方面的探索性应用研究。

背景技术

凝血酶(thrombin)是机体凝血系统中的天然成份，来源于动物血浆，凝血酶在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细管血液渗出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙出血等，有时也可以口服，用于胃和十二指肠出血。凝血酶局部止血效果好，且无副作用。

2008年世界血友病联盟的全球性调查显示，按照人均最低收入国家人均凝血因子的消费量为0.08单位计算，我国每年至少需要1亿单位的凝血因子才能满足最低需求。而市场调查显示，我国在2006年、2007年的年凝血因子产量仅为4000万单位左右。因此，血液制品短缺，特别是凝血因子类制品。中东两伊及阿富汗战争期间，曾大量从我国进口凝血酶。目前随着凝血酶应用的不断推广，用量迅速扩大，加之世界一些地区战乱，伤病人员增加，对高效局部止血药的需求量更难以估计，有些国家甚至作为战略储备物资进行购买，使凝血酶在国际市场前景十分广阔。

目前临床上使用的凝血酶多因纯度低、含热原、凝血酶的稳定性差等问题限制了其正常使用，而上述问题也是迫切需要解决的科学问题，另外研究和完善猪血提取高活性高稳定性高纯度的凝血酶技术不但可以保护环境、变废为宝创造效益，还可以提高猪血附加值、促进就业，拉动地方经济的发展。

发明内容

本发明目的是提供利用凝胶分子筛去除猪凝血酶中内毒素的方法。该方法简单，制备的凝血酶纯度和活性高。所述方法包括：柱层析和分子筛分离。

(1)猪血液的收集、血浆的分离及纤维蛋白原的去除

以新鲜猪血液为原料，加入柠檬酸钠抗凝，搅拌均匀，然后离心分离获得血浆，血浆冷冻后再解冻，除去纤维蛋白原。

(2)凝血酶原的制备及凝血酶的激活

采用柠檬酸钡吸附血浆中的凝血酶原，然后用CaCl₂和MgCl₂复合体系溶液中Ca²⁺和Mg²⁺激活凝血酶原，得到的粗凝血酶。

(3)凝血酶的纯化及其内毒素的去除

先用柱层析对凝血酶粗品进行初步纯化，除去大部分杂蛋白，收集凝血酶，然后采用凝胶分子筛法，先用Sephadex G-25过滤再用Sepharose过滤去除凝血酶中残存的血浆蛋白和杂蛋白，得到电泳高纯高活性的凝血酶。

具体实施方式

实施例

1血浆的分离

检疫合格的新鲜的猪血加入3.0％的柠檬酸三钠抗凝，缓慢搅拌减少血细胞的破碎。使用高速冷冻离心机分离血液，在4℃条件下4500r/min离心10min，收集血浆，储存在4℃条件下备用。

2纤维蛋白原的去除

将收集到的血浆置于-20℃冷冻24h，取出在4℃环境中解冻，此时纤维蛋白原析出为絮状沉淀，除去沉淀，收集液体。所得到的凝血酶的总活性比未冷冻的提高了3.7％。

3凝血酶的制备和激活

在第二步中收集的液体中加入1mol/L的氯化钡溶液，添加量为8％，均搅拌20min，抽滤收集柠檬酸钡沉淀，将沉淀溶于pH8.00.2mol/L EDTA溶液中，搅拌60min，再用0.05mol/LpH7.2的Tris-HCl缓冲液透析，不断更换透析液，至体系中无Ba²⁺为止。然后加入CaCl₂和MgCl₂复合溶液，使Ca²⁺终浓度为0.1mol/L，Mg²⁺终浓度为0.05mol/L，在20℃条件下激活2h。

4凝血酶的纯化

加入50g DEAE-纤维素(DE52)于1000ml烧杯中，先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸化处理，用0.02mol/L，pH8.0的磷酸缓冲液平衡，抽干水分，收集湿DE52纤维素。按照5g/ml的量加入到上述溶液中，置于4℃吸附70min，收集上清液再如上处理一次，即可获得较纯的凝血酶，凝血酶比活为778U/mg。

5去除凝血酶中的内毒素

取10g Sephadex G-25，用去离子水溶胀3h后，煮沸1h，冷却后装柱，300床体积毫升/g干分子筛。再用直径在45-165um的Sepharose凝胶过滤，最大线性流速150cm/h；25℃，HR16/10柱，5cm床高度)，过滤去除凝血酶中残存的血浆蛋白和杂蛋白，收集滤液，即为得到电泳高纯高活性的凝血酶。

Claims (7)

1.本发明涉及一种利用凝胶分子筛去除猪凝血酶中内毒素的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤：

a以猪血为原料，先加入抗凝剂，然后离心分离出血浆，血浆中应无残留血细胞；

b血浆低温冷冻，析出去除纤维蛋白原；

c添加1～2mol/L柠檬酸钡溶液吸附分离凝血酶原；

d使用CaCl₂和MgCl₂复合体系激活凝血酶原；

e使用DEAE-纤维素DE-52对凝血酶粗品进行初步纯化，除去大部分杂蛋白，收集具有凝血酶活性的峰；

f采用凝胶分子筛法过滤去除凝血酶中残存的血浆蛋白和杂蛋白，纯化凝血酶。

2.根据权利要求1a所述的猪血液的分离，其特征在于在猪血中加入2.0％～3.0％的柠檬酸钠(W/V)作为抗凝剂，缓慢搅拌均匀，4000～5000r/min离心7～10分钟，获得血浆。

3.根据权利要求1b所述的纤维蛋白原的去除，其特征在先低温冷冻24～48h，然后在4～10℃解冻，利用纤维蛋白原低温凝结析出的原理去除纤维蛋白原。

4.根据权利要求1c所述的凝血酶原的吸附，其特征在于利用1～2mol/L柠檬酸钡吸附分离凝血酶原，4℃搅拌30～50min，静置20分钟。

5.根据权利要求1d所述的凝血酶原的激活，其特征在于使用CaCl₂和MgCl₂复合体系激活，激活的条件为，加入CaCl₂和MgCl₂溶液，使Ca²⁺终浓度为0.1～0.15mol/L，Mg²⁺终浓度为0.05～0.08mol/L，在20～25℃下激活2h。

6.根据权利要求1e所述的凝血酶的纯化：其特征在于使用称取DEAE-纤维素(DE52)50g，置于1000ml烧杯中，先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸盐缓冲液(PB)平衡。将水分抽干，或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤，收集湿纤维素，以降低其离子强度。按1ml血清加湿重5g DE52，经过充分搅拌，置4℃吸附1h。上清液可再如此处理一次，即获得较纯的凝血酶。

7.根据权利要求1f所述的凝血酶内毒素的去除，其特征在于所运用Sephadex G-25(溶胀3小时后，还要煮沸1小时，冷却后装柱，100～5000床体积毫升/g干分子筛)和Sepharose(颗粒尺寸范围：45-165um；最大线性流速150cm/h；25℃，HR16/10柱，5cm床高度)。