CN107312809A

CN107312809A - 无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法

Info

Publication number: CN107312809A
Application number: CN201610270692.0A
Authority: CN
Inventors: 王继红; 时春风; 张欣; 张素杰; 郑媛媛; 李庆伟
Original assignee: Liaoning Normal University
Current assignee: Liaoning Normal University
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2017-11-03

Abstract

本发明公开一种无内毒素的rLj‑RGD3蛋白制备方法，按如下步骤进行：将转化有pET23b‑RGD3重组质粒的大肠杆菌BL21高密度发酵及IPTG诱导表达，收集菌体，采用高压均质机进行菌体细胞破碎，得破菌液；过滤破菌液得澄清液；将澄清液通过镍离子亲和层析进行目的蛋白的捕获；利用Superdex 75分子筛进行蛋白的第二步精细纯化；利用Q FF阴离子交换进行蛋白的第三步纯化；蛋白纯度达99%。

Description

无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法

技术领域

本发明涉及一种rLj-RGD3蛋白的制备方法，尤其是一种高纯度无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法。

背景技术

Lj-RGD3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由117个氨基酸残基组成，Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD 模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，17个精氨酸，是一类HRG的碱性蛋白，已公开于专利号为200510083437.7、名称为“具抗肿瘤作用的日本七鳃鳗口腔腺RGD模体蛋白的基因克隆与表达”的中国发明专利文献中，即命名为Lampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗肿瘤增殖、抗血栓等功效。rLj-RGD3是Lj-RGD3的基因重组蛋白，该重组蛋白没有任何纯化标签。

内毒素是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，也叫做脂多糖，对宿主具有毒性。内毒素的主要毒性成分为类脂质A，其位于细胞壁的最外层，覆盖于细胞壁的黏肽上，当细菌死亡溶解或者用人工方法破坏细菌细胞后，内毒素会从细菌中释放出来。内毒素可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等症状，因此对生物制品的内毒素含量有严格的限定，在生物制品的制备过程中内毒素的去除是必不可少的一个环节。由于rLj-RGD3来自于大肠杆菌的表达上清，因此所收集的菌体破碎液中会含有大量内毒素，而内毒素不是蛋白质，因此非常耐热，只有在160℃的温度下加热2~4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性，但是在破坏内毒素活性的同时，也破坏了rLj-RGD3的活性。

目前，对于rLj-RGD3的制备过程中大多需要采用高压均质机进行菌体细胞破碎，之后再采用离心方法进行菌体收获及澄清，存在明显弊端：由于菌液粘度大，限制的离心机的离心速度，需要多台离心机连续工作，不仅导致极高的设备投资和日常维护成本，而且操作繁琐、劳动强度大、参数不可控、易受人为因素干扰，不利于大规模的生产和工艺放大，影响生产工艺的重复性。虽然，后续也有对澄清液进行纯化的步骤，但是并不能将所含有的内毒素彻底去除。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种高纯度无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 将转化有pET23b-RGD3重组质粒的大肠杆菌BL21高密度发酵及IPTG诱导表达，收集菌体，采用高压均质机进行菌体细胞破碎，得破菌液；

b. 过滤破菌液得澄清液；

c．将澄清液通过镍离子亲和层析进行目的蛋白的捕获；

d. 利用Superdex 75分子筛进行蛋白的第二步精细纯化；

e. 利用Q FF阴离子交换进行蛋白的第三步纯化。

所述a步骤是将转化有pET23b-RGD3重组质粒的大肠杆菌BL21在LB培养基中高密度培养，OD₆₀₀达90，终浓度1 mM IPTG诱导表达后，30 ℃过夜培养，收获菌体并采用高压均质机进行菌体细胞破碎。

所述b步骤是先以体积比为1：1向破菌液中加入缓冲液稀释，再将稀释的破菌液用缓冲液稀释5倍，采用750K中空纤维微滤膜进行切向流过滤，得澄清液。

所述步骤c是采用镍离子亲和层析Ni 6 Fast Flow柱，所用的1×Binding buffer成分由5 mM imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Washingbuffe成分由 60 mM imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Eluting buffe成分由 1 M imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9。

所述d步骤所用的PH 7.4的20 mM PBS缓冲液是由1M Na₂HPO₄贮液15.48 ml与1 MNaH₂PO₄贮液4.52 ml混合后，用H₂O定容至1000 ml配制而成。

所述e步骤所用的pH8.0的20 mM PBS缓冲液是由1M Na₂HPO₄贮液18.64 ml与1 MNaH₂PO₄贮液1.36 ml混合后，用H₂O定容至1000 ml配制而成。

本发明是将菌体高密度发酵并通过切向流过滤、镍离子亲和层析、分子筛层析、阴离子离子交换层析等系列方法制备无内毒素的高纯度rLj-RGD3蛋白，蛋白纯度达99%。

附图说明

图1是本发明实施例所得澄清液过滤透过端目标蛋白的SDS-PAGE示意图。

图2是本发明实施例分子筛层析纯化结果SDS-PAGE示意图。

图3是本发明实施例分子筛层析纯化结果SEC HPLC示意图。

图4是本发明实施例Q FF阴离子交换后纯化结果SDS-PAGE示意图。

具体实施方式

按如下步骤进行：

a. 将转化有pET23b-RGD3重组质粒的大肠杆菌BL21在LB培养基中高密度培养，OD₆₀₀达90，终浓度1 mM IPTG诱导表达后，30 ℃过夜培养，收获菌体并采用高压均质机进行菌体细胞破碎，得破菌液；

b. 过滤破菌液得澄清液：

先以体积比为1：1向破菌液中加入缓冲液稀释，再将稀释的破菌液用缓冲液稀释5倍，采用GE公司的AKTA FLUX系统，用750K中空纤维微滤膜进行切向流过滤，获得澄清液；

采用SDS-PAGE鉴定回流端残留，以有效完成目标蛋白的透过澄清目的。SDS-PAGE的鉴定结果示意图，见图1。

图1中：M: marker；1: 200 ml缓冲液过滤透过端； 2：1 Ll缓冲液过滤透过端；3：1.5 Ll缓冲液过滤透过端；4：1.94 Ll缓冲液过滤透过端；5：2 Ll缓冲液过滤透过端：6：3Ll缓冲液过滤透过端；7：3.5 Ll缓冲液过滤透过端； 8：4 Ll缓冲液过滤透过端；9：4.5 Ll缓冲液过滤透过端；10：5 Ll缓冲液过滤透过端；11：终止；12：回流端残留。

从图1可以看出，目的蛋白随着透过端体积的增大而浓度越来越低。当连续洗滤体积达到4倍后浓度显著下降，即4~4.5倍的连续洗滤体积即可完成样品澄清。本步骤平均透过流速为20 L/H，TMP过膜压力均小于6 psi（远小于20 psi的安全压力上限）。

c．将澄清液通过镍离子亲和层析进行目的蛋白的捕获：

具体实施按如下步骤：

打开AKAT蛋白纯化系统、电脑显示器等电源开关，待仪器自检完毕，双击桌面上UNICORN6图标，进入操作界面；首先将A1管路放入去离子水中，将A2管路放入1×Bindingbuffer缓冲液进行管路清洗及准备，在system control 窗口点击工具栏内的manual选择Pumps and pressures →Pump wash，点击execute，泵清洗将自动结束；将GE公司空柱安放到柱夹上，并将其下口连接头接在柱位阀的4B位置；选择manual→Alarms→Alarm precolumn pressure，设置high pressure为0.3 MPa；选择Flow path→Column position→4号，up flow；选择Pumps and pressures→system flow，速设置为5 ml/min，执行execute。排除管路中的气泡，将下口连接柱子上，拧紧密封圈；下面柱头处保留1~2cm水，按操作板上“pause”键使机器暂停；将混匀好的Ni 6 Fast Flow 缓缓倒入空柱中，沉淀；待胶面稳定后，吸出胶面上方多余水，将柱子上面连接头接在机器柱位阀的4A处，程序设Flow path→Column position→ down flow，执行execute；排出柱头上面管路中气泡，按“pause”键暂停，下柱头至胶面2~3 cm，拧紧密封圈；点击操作板上“continue”键，使机器运行；用5倍柱体积去离子水去除胶中所含的20%乙醇，以机器上电导值为0为准对柱子进行平衡；再设置程序Flow path →inlet A→A2，点击execute，用1×Bind buffer缓冲液平衡Ni柱，平衡体积为5个CV以上，此时紫外线达到平行，进行紫外调零，选择Monitors→Auto zero UV，execute；将A泵的A1口放入过滤好的澄清液中，程序设置A1口进行上样；此时紫外检测的是蛋白穿透液，可进行收集，以检测蛋白结合情况；待上完样后，设将A2口放入1×Bindingbuffer缓冲液，使蛋白与柱子紧密结合，直到电导线平行，按操作板上“pause”键使机器暂停；将A2放入配制好的1×Wash buffer中，Flow path →inlet A→A2，点击execute，待一个CV后紫外又重新降为0为准；程序设置Flow path →inlet A→A2，系统泵入1×Elutebuffer进行洗脱目的蛋白；在manual里选择Fraction collection →Fraction，点击execute进行目的蛋白洗脱，将所得蛋白浓度电泳检测后进行下一步的纯化。

所用的1×Binding buffer成分由5 mM imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Washing buffe成分由 60 mM imidazole，0.5 M NaCl，20 mMTris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Eluting buffe成分由 1 M imidazole，0.5 M NaCl，20mM Tris-HCl组成，PH 7.9。

d. 利用Superdex 75分子筛进行蛋白的第二步精细纯化：

准备20 mM PBS（PH 7.4）缓冲液，使用前要进行低频超声脱气处理10 min；将新胶加脱气后的去离子水进行充分沉淀，多次更换去离子水，以保证去除胶中所带20%乙醇；打开AKAT蛋白纯化系统、电脑显示器等电源开关，待仪器自检完毕，双击桌面上UNICORN6图标，进入操作界面；将A1管路放入去离子水中，在system control 窗口点击工具栏内的manual选择Pumps and pressures →Pump wash，点击execute进行管路清洗及准备，泵清洗将自动结束；将GE公司XK 50×100空柱安放到柱夹上，并将其下口连接头接在柱位阀的3B位置；选择manual→Alarms→Alarm pre column pressure，设置high pressure为0.3 MPa；选择Flow path→Column position→3号，up flow；选择Pumps and pressures→system flow，流速设置为8.5 ml/min，执行execute；排除管路中的气泡，将下口连接柱子上，拧紧密封圈；下面柱头处保留1~2cm水，柱子上方接上装柱器；按操作板上“pause”键使机器暂停；将装柱器盖子管路连接在3A柱位阀上，程序设Flow path→Column position→ down flow，执行execute灌胶；点击操作板上“continue”键，使机器运行；排出中气泡，待液体稳定流出时，用玻璃棒引流，将充分混匀好的3400 ml superdex 75胶、水混合物（其体积是空柱加装柱器的体积之和）以适当的速度倒入空柱中；盖上装柱器的盖子，保证液液相接，拧紧装柱器盖；流速8.5 ml/min，大约3 h；待胶面稳定后，停止程序，采用恒压进行压柱；待胶面稳定后，取下装柱器及其管路，吸出胶面上方多余水，将柱子上面连接头接在机器柱位阀的3A处，程序设Flow path→Column position→ down flow，执行execute；排出柱头上面管路中气泡，按“pause”键暂停，下柱头至胶面2~3 cm，拧紧密封圈；用去离子水平衡5个CV，上样2ml 2%的丙酮，运行1个CV进行柱效测定；用20 mM PBS 缓冲液平衡柱子至少5个体积，以紫外检测为0为准；上样Ni柱蛋白；再用20 mM PBS 缓冲液进行走柱，收集分子筛样品，进行电泳、SEC HPLC检测。

所用的PH 7.4的20 mM PBS缓冲液是由1M Na₂HPO₄贮液15.48 ml与1 M NaH₂PO₄贮液4.52 ml混合后，用H₂O定容至1000 ml配制而成。

电泳检测结果如图2所示。

图2中（A）AKTA Avant-25蛋白洗脱收集曲线；（B）15%胶浓度非还原SDS-PAGE，示峰1各收集管样品。

SEC HPLC检测结果如图3所示，结果表明经Superdex75分子筛层析纯化的蛋白纯度达98%。

e. 利用Q FF阴离子交换进行蛋白的第三步纯化：

准备20 mM PBS（pH=8.0）缓冲液、0.6M NaOH溶液，所有缓冲液使用前要进行低频超声脱气处理10 min；空柱下端连接好，保证有1~2cm水且无气泡；将Q FF胶混匀后缓缓灌入空柱中，待胶面稳定后，缓缓下柱头；0.6M NaOH溶液走4个CV，最后以NaOH溶液保存在柱中过夜；用去内毒素水冲洗柱子中的NaOH溶液，走8个体积水，检测pH，以此来确定出口水pH为中性；确定Q柱中无碱后，用20 mM PBS（pH=8.0）缓冲液平衡Q柱，收集出口缓冲液，检测电导，以此来确定Q柱是否平衡；Q柱平衡后，对分子筛样品进行上样；上样走柱一半体积后，开始对流穿蛋白进行收集，并对其进行浓度、电泳、内毒素检测。

所用的pH8.0的20 mM PBS缓冲液是由1M Na₂HPO₄贮液18.64 ml与1 M NaH₂PO₄贮液1.36 ml混合后，用H₂O定容至1000 ml配制而成。

采用凝胶法利用鲎试剂对纯化蛋白进行内毒素检测。

蛋白纯度检测：纯化蛋白检测方法为SEC HPLC法或非还原SDS-PAGE法，其中SECHPLC法所用层析柱为TSKgel G3000swXL层析色谱柱，流动相为3.2 mM磷酸氢二钠、1.5 mM磷酸二氢钾、400 mM NaCl， PH7.3；流动相配制方法：称取1.15 g Na₂HPO₄, 0.204 gKH₂PO₄, 16 g NaCl 溶于水，调节PH至7.3后，以水定容至1000 ml。非还原SDS-PAGE法采用15%的丙烯酰胺分离胶浓度。

e步骤所得产品的SDS-PAGE结果示意图如图4所示，图4中M：marker；1-4：各收集管样品。结果表明：产品蛋白纯度达99%以上。

Claims

1.一种无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

b. 过滤破菌液得澄清液；

c．将澄清液通过镍离子亲和层析进行目的蛋白的捕获；

d. 利用Superdex 75分子筛进行蛋白的第二步精细纯化；

e. 利用Q FF阴离子交换进行蛋白的第三步纯化。

2.根据权利要求1所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述a步骤是将转化有pET23b-RGD3重组质粒的大肠杆菌BL21在LB培养基中高密度培养，OD₆₀₀达90，终浓度1 mM IPTG诱导表达后，30 ℃过夜培养，收获菌体并采用高压均质机进行菌体细胞破碎。

3.根据权利要求2所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述b步骤是先以体积比为1：1向破菌液中加入缓冲液稀释，再将稀释的破菌液用缓冲液稀释5倍，采用750K中空纤维微滤膜进行切向流过滤，得澄清液。

4.根据权利要求3所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述步骤c是采用镍离子亲和层析Ni 6 Fast Flow柱，所用的1×Binding buffer成分由5 mMimidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Washing buffe成分由60 mM imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Eluting buffe成分由 1 M imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9。

5.根据权利要求4所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述d步骤所用的PH 7.4的20 mM PBS缓冲液是由1M Na₂HPO₄贮液15.48 ml与1 M NaH₂PO₄贮液4.52ml混合后，用H₂O定容至1000 ml配制而成。

6.根据权利要求5所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述e步骤所用的pH8.0的20 mM PBS缓冲液是由1M Na₂HPO₄贮液18.64 ml与1 M NaH₂PO₄贮液1.36 ml混合后，用H₂O定容至1000 ml配制而成。