CN113244458B - 一种用于修复关节软骨损伤的复合材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于修复关节软骨损伤的复合材料，包括由动物皮肤组织制得的液态的胶原蛋白、自体血液制得的具有一定数量血小板数的PRP、质量百分比浓度为5％～10％的钙离子激活剂，胶原蛋白、PRP、钙离子激活剂以体积比为(10～15):(10～15):1的比例混合，且胶原蛋白和PRP的体积相同，同时公开了该复合材料的制备方法，即依次制得胶原蛋白、PRP并将它们混合，之后再混入钙离子激活剂。该发明制备方法简单易操作，不需要复杂的设备，原料来源广泛，选择动物皮肤组织和患者自体血液，能显著降低成本，不用添加外源性凝血酶，减少了不良反应发生的几率，也能减缓PRP中生长因子的释放。

Description

一种用于修复关节软骨损伤的复合材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗材料领域，尤其是一种用于修复关节软骨损伤的复合材料及其制备方法。
背景技术
关节软骨是由软骨细胞和软骨基质组成的一种乳白色、光滑的透明组织，覆盖于关节表面，可以保障机体关节正常运动。关节软骨损伤是较为常见的关节外科疾病，可由创伤、骨关节炎、类风湿性关节炎和剥脱性骨软骨炎等引起，未经有效治疗容易发展为膝骨性关节炎(KOA)，后期会导致疼痛、关节畸形直至残疾，严重影响患者的运动功能与生活质量，同时加重患者心理压力或精神负担。
随着再生医学与组织工程的不断发展，为软骨的修复与重建提供了新的方法及思路。软骨细胞工程就是通过利用支架材料、种子细胞以及生长因子三要素，综合形成具有良好生物学功能的替代组织，从而修复缺失或发生损伤的软骨组织。富血小板血浆(Platelet-rich Plasma，PRP)是全血经离心后得到的血小板浓缩物，含有大量生长因子及活性蛋白，如转化生长因子TGF-β，能有效促进细胞增殖、分化和细胞外基质的合成，可用于修复关节软骨损伤、加速骨愈合。
随着PRP治疗KOA在临床的普及，仍然存在一些不足：首先，PRP网状结构的密度由其原料纤维蛋白原的数量决定，其类型取决于凝血酶总量与聚合速度。在传统PRP的制备过程中，未聚合的纤维蛋白原因溶解于PPP而直接被弃掉，因此加入凝血酶来促凝血时，纤维蛋白原含量已大大降低，使聚合后的纤维蛋白网状结构的密度远低于生理血凝块，由于外源性凝血酶的作用，高凝血酶浓度使得纤维蛋白原的聚合速度远高于生理反应，形成的纤维蛋白网由四分子纤维蛋白原聚合形成，僵硬而缺乏弹性，不利于网罗生长因子及促进细胞迁移。PRP由于外源性凝血酶的参与，瞬间激活了PRP中的血小板，并且激活后释放的生长因子亦有起加速血小板激活作用的生长因子，故其生长因子的释放集中在加入外源性凝血酶的时点附近以及使用后愈合期的早期阶段，而后期的释放较少，生长因子的释放并不均衡及持久。
发明内容
针对现有的不足，本发明提供一种用于修复关节软骨损伤的复合材料及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于修复关节软骨损伤的复合材料，包括由动物皮肤组织制得的液态的胶原蛋白、自体血液制得的血小板数为(350～1250)×103/μL的PRP、质量百分比浓度为5％～10％的钙离子激活剂，所述胶原蛋白、PRP、钙离子激活剂以体积比为(10～15):(10～15):1的比例混合，且胶原蛋白和PRP的体积相同，所述胶原蛋白中混合有长度小于500nm的由纤维素包覆的单壁碳纳米管,其在胶原蛋白中的浓度小于100μg/mL。
作为优选，所述胶原蛋白、PRP、钙离子激活剂的体积比是10:10:1。
作为优选，所述钙离子激活剂是氯化钙、葡萄糖酸钙中的一种或两种，所述氯化钙的质量百分比浓度是10％或5％，所述葡萄糖酸钙的质量百分比浓度是10％。
一种用于修复关节软骨损伤的复合材料的制备方法，步骤如下：
S1，胶原蛋白的制备，选择动物的皮肤组织将其制成胶原蛋白，所述胶原蛋白中混合有长度小于500nm的由纤维素包覆的单壁碳纳米管,其在胶原蛋白中的浓度小于100μg/mL；
S2，PRP的制备，采集自体血液至预先装有枸橼酸钠或EDTA的血液采集容器中，离心去除血液中的红细胞制得血小板数为(350～1250)×103/μL的PRP；
S3，胶原蛋白和PRP的混合，将前述制备的胶原蛋白和PRP以体积比1:1的方式混合制成待注射溶液；
S4，待注射溶液和激活剂的混合，使用质量百分比浓度为5％～10％的钙离子激活剂与前述的待注射溶液混合，所述钙离子激活剂与待注射溶液的体积比为1:(20～30)。
作为优选，所述钙离子激活剂是氯化钙、葡萄糖酸钙中的一种或两种，所述氯化钙的质量百分比浓度是10％或5％，所述葡萄糖酸钙的质量百分比浓度是10％。
作为优选，所述PRP是通过一次离心制得的，其离心速度为2200r/min，离心时间15min，离心结束后保留有PRP层下0.5～1mL的红细胞。
作为优选，所述胶原蛋白的制备步骤如下：
S1a，采样动物的皮肤组织；
S1b，前处理，对皮肤组织进行清洗和去脂处理；
S1c，去除杂蛋白，将前处理后的皮肤组织加入重量浓度为2％的氯化钠溶液中，浸提7～8小时；
S1d，粉碎，将去除杂蛋白的组织放入组织捣碎机进行粉碎；
S1e，提取，将粉碎后的组织加入蛋白酶中，在给定的pH值、提取温度、提取时间下进行提取；
S1f，盐析，将提取液在7500～8000r/min的条件下离心，分离出上清液，调节pH值为7.0～7.5，加入(NH4)2SO4，缓慢搅拌后静置过夜；
S1g，溶解与纯化，将盐析后的沉淀溶于pH为2的醋酸溶液，装入透析袋中透析纯化制得胶原蛋白。
作为优选，所述纤维素包覆的单壁碳纳米管制备方法如下，
P1，将单壁碳纳米管纯化并截短至长度小于500nm；
P2，将纯化并截短的单壁碳纳米管与纤维素的溴化1-丁基-3-甲基咪唑溶液在超声下反应，之后将反应液抽滤制得纤维素包覆的单壁碳纳米管。
本发明的有益效果在于：该发明制备方法简单易操作，不需要复杂的设备，原料来源广泛，选择动物皮肤组织，来源广泛，能显著降低成本，胶原蛋白与PPR联合使用可以增加支架材料的网状结构密度，提高弹性，有利于网罗生长因子及促进细胞迁移，PRP利用患者自体血液，通过钙离子激活剂激活PRP中所含有的内源性凝血酶，不用添加外源性凝血酶，减少了不良反应发生的几率，也能减缓PRP中生长因子的释放，PRP中的血小板数量也就确保了通过钙离子能激活足够的生长因子，而激活剂浓度的限定就能最大化的激活生长因子，避免浓度过低起到稀释作用，导致生长因子的浓度降低，浓度过高起不到缓释的目的。
附图说明
图1是本发明实施例中混合材料后生长因子浓度随时间变化的示意图；
图2是本发明实施例中混合材料后凝胶体积随时间的变化示意图；
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。此外，本发明中所提到的方向用语，例如，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“内”、“外”等，仅是参考附加图示的方向，使用的方向用语是为了更好、更清楚地说明及理解本发明，而不是指示或暗指本发明必须具有的方位，因此不能理解为对本发明的限制。
本发明实施例，一种用于修复关节软骨损伤的复合材料及其制备方法，制备步骤如下：
S1，胶原蛋白的制备，选择动物的皮肤组织将其制成胶原蛋白，选择动物皮肤组织，如鱼、猪、牛、羊等的皮肤组织，来源广泛，成本低廉，能显著降低成本，胶原蛋白具有高生物相容性、低致敏性和可被生物降解的特性，且来源广泛、容易获取，是一种理想的生物支架材料，其制备过程则是：
S1a，采样动物的皮肤组织，选定好动物，对其皮肤组织进行采样；
S1b，前处理，对皮肤组织进行清洗和去脂处理，首先刮去动物皮肤组织上的脂肪层，让后将其切成长和宽约5mm的小块状，加入5％脂肪酶、丙酮和1:1乙醚:石油醚浸泡并振荡处理30min～1h，结束后取出组织块并用清水冲洗至中性；
S1c，去除杂蛋白，将前处理后的皮肤组织加入重量浓度为2％的氯化钠溶液中，浸提7～8小时；
S1d，粉碎，将去除杂蛋白的组织放入组织捣碎机进行粉碎；
S1e，提取，将粉碎后的组织加入蛋白酶中，在给定的pH值、提取温度、提取时间下进行提取，此时pH值、提取温度、提取时间就依据所加入的不同蛋白酶来进行设定，在粉碎后的组织中加入木瓜蛋白酶，调节pH在5.0～7.0范围内，温度控制在25～35℃，提取时间20～24h；若使用胃蛋白酶，调节pH在1.5～2.5范围内，在10～20℃条件下提取5～12h；若使用中性蛋白酶，调节pH在7.0～8.0范围内，在30～35℃条件下提取5～8h；若使用菠萝蛋白酶，调节pH在2.5～3.5范围内，在40～50℃条件下提取5～8h；
S1f，盐析，将提取液在7500～8000r/min的条件下离心，分离出上清液，调节pH值为7.0～7.5，加入(NH4)2SO4，缓慢搅拌后静置过夜；
S1g，溶解与纯化，将盐析后的沉淀溶于pH为2的醋酸溶液，装入透析袋中透析纯化制得胶原蛋白；
S2，PRP的制备，采集自体血液至预先装有枸橼酸钠或EDTA的血液采集容器中，离心去除血液中的红细胞制得血小板数为(350～1250)×103/μL的PRP，采集10mL自体血液至预先装有适量枸橼酸钠或EDTA的血液采集容器(离心管、注射器等)中，进行离心，采用一次离心的方式，离心速度设置为2200r/min，离心15min，离心后去除底部的红细胞，并保留白膜层(交界面)下少量的红细胞，即保留PRP层下0.5～1mL的红细胞，此时采集管内底部物质则为PRP，且PRP中血小板计数为(350～1250)×103/μL，约为全血血小板计数的3～6倍；
S3，胶原蛋白和PRP的混合，将前述制备的胶原蛋白和PRP以体积比1:1的方式混合制成待注射溶液，PRP中血小板计数为662×103/μL，混合是可以采用缓慢搅拌下的混合或者利用两个注射器进行推注混合；胶原蛋白与PPR联合使用可以增加支架材料的网状结构密度，提高弹性，有利于网罗生长因子及促进细胞迁移；
S4，待注射溶液和激活剂的混合，使用质量百分比浓度为5％～10％的钙离子激活剂与前述的带注射溶液混合，所述钙离子激活剂与待注射溶液的体积比为1:(20～30)，PRP利用患者自体血液，通过钙离子激活剂激活PRP中所含有的内源性凝血酶，不用添加外源性凝血酶，外源性凝血酶的浓度可影响细胞的增殖、组织因子和炎症因子的释放，高浓度时具有神经毒性，采用自体血液中PRP避免了外源性凝血酶可能会产生的免疫排斥、凝血功能障碍等不良反应，也能减缓PRP中生长因子的释放，PRP中的血小板数量也就确保了通过钙离子能激活足够的生长因子，而激活剂浓度的限定就能最大化的激活生长因子，避免浓度过低起到稀释作用，导致生长因子的浓度降低，浓度过高起不到缓释的目的，抑制细胞增殖等问题，钙离子激活剂是氯化钙、葡萄糖酸钙中的一种或两种，所述氯化钙的质量百分比浓度是10％或5％，所述葡萄糖酸钙的质量百分比浓度是10％，葡萄糖酸钙是一种良好的螯合剂，可以有效地降低毛细血管通透性，增加致密度，起到止血效果，并有助于骨质形成，与CaCl2联合作为激活剂使用对细胞的促迁移作用明显。在实施例中选择选择10％CaCl2作为激活剂，与前述制成的待注射溶液的体积比为1:20进行混合，此时混合后形成的复合材料中胶原蛋白:PRP:CaCl2的体积比就为10:10:1。
在实施例中采用如下四种方式来混合形成该复合材料：
(1)胶原蛋白+PRP+5％CaCl2：体积比为10:10:1；
(2)胶原蛋白+PRP+10％CaCl2：体积比为10:10:1；
(3)胶原蛋白+PRP+10％葡萄糖酸钙比为10:10:1；
(4)胶原蛋白+PRP+10％CaCl2+10％葡萄糖酸钙：体积比为10:10:1:1混合后将复合材料放置于37℃恒温培养箱中，使其释放生长因子至培养基中，然后以复合材料中血小板和生长因子TGF-β的释放量，以及特定时间段内生长因子的释放情况(动力学检测)、凝胶的形成和回缩至体积最小的时间来作为评价手段，并以此证明该方法制备出的复合材料对促进软骨修复有积极作用，此时分别在第15分钟、60分钟、1天、3天和8天检测生长因子浓度，在每个时间节点，取少量样本，按照ELISA试剂盒说明测定TGF-β的浓度，检测结果如图1和图2中所示；
方式(1)混合后生长因子TGF-β在各个检测点(第15min、60min、1天、3天、8天)的释放量为14.8,33.4,39.7,45.2,42.6ng/mL；凝胶的形成时间和回缩至体积最小的时间分别为50～60min和1.5～2h，混合材料后凝胶体积大小在各个检测点(第15min、30min、1h、2h、6h)的结果分为2.1，2.6，3.4，3.0，2.9；
方式(2)混合后生长因子TGF-β在各个检测点(第15min、60min、1天、3天、8天)的释放量为24.3,48.2,50.6,52.6,46.8ng/mL；凝胶的形成时间和回缩至体积最小的时间分别为35～40min和1～1.5h，混合材料后凝胶体积大小在各个检测点(第15min、30min、1h、2h、6h)的结果分别为3.0,3.2,3.9,3.8,3.8mL；
方式(3)混合后生长因子TGF-β在各个检测点(第15min、60min、1天、3天、8天)的释放量为44.6,40.5,37.5,26.2,11.8ng/mL；凝胶的形成时间和回缩至体积最小的时间分别为15～20min和约1h，混合材料后凝胶体积大小在各个检测点(第15min、30min、1h、2h、6h)的结果分为4.0,4.4,4.2,4.2,4.2mL；
方式(4)混合后生长因子TGF-β在各个检测点(第15min、60min、1天、3天、8天)的释放量为34.5,20.4,22.0,10.6,4.9ng/mL；凝胶的形成时间和回缩至体积最小的时间分别为约15min和约0.5h，混合材料后凝胶体积大小在各个检测点(第15min、30min、1h、2h、6h)的结果分为5.0，3.7，3.6，3.6，3.6mL。
选择方法(1)或方法(2)成软骨诱导因子TGF-β长时间内大量释放，凝胶的形成时间和降解时间较长，适于对受损软骨长期有效修复；
选择方法(3)或方法(4)，成软骨诱导因子TGF-β短时间内快速释放，凝胶支架快速生成，适于对受损软骨短期快速修复：
进一步的改进，所述胶原蛋白中混合有长度小于500nm的由纤维素包覆的单壁碳纳米管,其在胶原蛋白中的浓度小于100μg/mL，将纤维素包覆在单壁碳纳米管(SWCNTs)就获得了水分散性良好的纤维素/单壁碳纳米管复合物，也就显著提高了单壁碳纳米管的生物相容性，将它们和胶原蛋白共同作为生物支架，单壁碳纳米管的良好吸附性，吸附生长因子，加之它们的分散性和生物相容性，在这样的长度下，就能跨过细胞膜进入到细胞内部，这样的浓度也不会影响到细胞的生长，PRP分布分布更均匀，就能准确地将PRP分布到受损部位；其制备方法如下，
P1，将单壁碳纳米管纯化并截短至长度小于500nm，实施例中将1.0g干燥的碳纳米管和200ml的硝酸水溶液(2.6mol/L)加入到500mL单颈圆底烧瓶中，超声30min后，在磁棒搅拌下继续回流24h，然后将反应液冷却至室温，用φ0.22μm混纤微孔滤膜抽滤，并用去离子水洗涤至中性，然后在50℃真空干燥24h后研磨待用，之后将纯化后的单壁碳纳米管分散于500mL 98％的H2SO4和65％HNO3混合酸中(3:1，V/V)，0℃冰水浴下超声24h，然后用超纯水(18.2MΩ)洗涤至中性就得到截短的单壁碳纳米管；
P2，将纯化并截短的单壁碳纳米管与纤维素的溴化1-丁基-3-甲基咪唑溶液在超声下反应，之后将反应液抽滤制得纤维素包覆的单壁碳纳米管，将3.5mg单壁碳纳米管和20g溴化1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Br)加入到100mL单颈圆底烧瓶中，在80℃下超声20min，然后加入20g纤维素的溴化1-丁基-3-甲基咪唑溶液(5％w/w)，继续超声10min后加入20mL去离子水，用φ0.22μm混纤微孔滤膜抽滤，将黑色产物重新分散到去离子水中后在抽滤，反复5次，最后将产物分散至5mL去离子水中待用。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于修复关节软骨损伤的复合材料，其特征在于：包括由动物皮肤组织制得的液态的胶原蛋白、自体血液制得的血小板数为(350～1250)×103/μL的PRP、质量百分比浓度为5％～10％的钙离子激活剂，所述胶原蛋白、PRP、钙离子激活剂以体积比为(10～15):(10～15):1的比例混合，且胶原蛋白和PRP的体积相同，所述胶原蛋白中混合有长度小于500nm的由纤维素包覆的单壁碳纳米管,其在胶原蛋白中的浓度小于100μg/mL。
2.根据权利要求1所述用于修复关节软骨损伤的复合材料，其特征在于:所述胶原蛋白、PRP、钙离子激活剂的体积比是10:10:1。
3.根据权利要求1所述用于修复关节软骨损伤的复合材料，其特征在于:所述钙离子激活剂是氯化钙、葡萄糖酸钙中的一种或两种，所述氯化钙的质量百分比浓度是10％或5％，所述葡萄糖酸钙的质量百分比浓度是10％。
4.一种用于修复关节软骨损伤的复合材料的制备方法，其特征在于:制备步骤如下：
S1，胶原蛋白的制备，选择动物的皮肤组织将其制成胶原蛋白，所述胶原蛋白中混合有长度小于500nm的由纤维素包覆的单壁碳纳米管,其在胶原蛋白中的浓度小于100μg/mL；
S2，PRP的制备，采集自体血液至预先装有枸橼酸钠或EDTA的血液采集容器中，离心去除血液中的红细胞制得血小板数为(350～1250)×103/μL的PRP；
S3，胶原蛋白和PRP的混合，将前述制备的胶原蛋白和PRP以体积比1:1的方式混合制成待注射溶液；
S4，待注射溶液和激活剂的混合，使用质量百分比浓度为5％～10％的钙离子激活剂与前述的待注射溶液混合，所述钙离子激活剂与待注射溶液的体积比为1:(20～30)。
5.根据权利要求4所述用于修复关节软骨损伤的复合材料的制备方法，其特征在于:所述钙离子激活剂是氯化钙、葡萄糖酸钙中的一种或两种，所述氯化钙的质量百分比浓度是10％或5％，所述葡萄糖酸钙的质量百分比浓度是10％。
6.根据权利要求4所述用于修复关节软骨损伤的复合材料的制备方法，其特征在于:所述PRP是通过一次离心制得的，其离心速度为2200r/min，离心时间15min，离心结束后保留有PRP层下0.5～1mL的红细胞。
7.根据权利要求4所述用于修复关节软骨损伤的复合材料的制备方法，其特征在于:所述胶原蛋白的制备步骤如下：
S1a，采样动物的皮肤组织；
S1b，前处理，对皮肤组织进行清洗和去脂处理；
S1c，去除杂蛋白，将前处理后的皮肤组织加入重量浓度为2％的氯化钠溶液中，浸提7～8小时；
S1d，粉碎，将去除杂蛋白的组织放入组织捣碎机进行粉碎；
S1e，提取，将粉碎后的组织加入蛋白酶中，在给定的pH值、提取温度、提取时间下进行提取；
S1f，盐析，将提取液在7500～8000r/min的条件下离心，分离出上清液，调节pH值为7.0～7.5，加入(NH4)2SO4，缓慢搅拌后静置过夜；
S1g，溶解与纯化，将盐析后的沉淀溶于pH为2的醋酸溶液，装入透析袋中透析纯化制得胶原蛋白。
8.根据权利要求4所述用于修复关节软骨损伤的复合材料的制备方法，其特征在于:所述纤维素包覆的单壁碳纳米管制备方法如下，
P1，将单壁碳纳米管纯化并截短至长度小于500nm；
P2，将纯化并截短的单壁碳纳米管与纤维素的溴化1-丁基-3-甲基咪唑溶液在超声下反应，之后将反应液抽滤制得纤维素包覆的单壁碳纳米管。
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