CN102573943A - 通过活化富血小板血浆（prp)诱导组织再生的组合物及其制备方法 - Google Patents

通过活化富血小板血浆（prp)诱导组织再生的组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过用氯化钙溶液和Ⅰ型胶原的活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物及其制备方法。该方法包括以下步骤：从全血中分离富血小板血浆(PRP：Platelet rich plasma)(下文称作为“PRP”)；将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液混合；并将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液的混合物与Ⅰ型胶原混合。本发明公开的组合物可以具有含富血小板血浆(PRP)的凝胶型结构，并且可被移植到任何需要组织再生的病区，例如骨缺损的治疗和伤口愈合(wound healing)，因此，富血小板血浆(PRP)可被活化以诱导来自富血小板血浆(PRP)凝胶中的对组织再生有益的生长因子(growth factor)，从而方便快捷的实现有效的组织再生。所以，本发明公开的方法在大大提高将富血小板血浆(PRP)应用到病区的可靠性并使消费者呈现良好形象方面是极其有用的。

Description

通过活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及通过用氯化钙溶液和Ⅰ型胶原活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物，以及制备该组合物的方法。更具体地，在本发明中，所述组合物可以具有含富血小板血浆(PRP)的凝胶型结构(gel-type offormation)，并且可被移植到任何需要组织再生的病区(lesion)，例如骨缺损治疗和伤口愈合(wound healing)，因此，富血小板血浆(PRP)可被活化以诱导来自富血小板血浆(PRP)凝胶的对组织再生有益的生长因子(growthfactor)，从而方便快捷的实现有效的组织再生。所以，所述方法在大大提高将富血小板血浆(PRP)应用到病区的可靠性并使消费者呈现良好形象方面是极其有用的。
背景技术
众所周知，富血小板血浆(PRP)是通过密度梯度离心法从全血中分离出来的自体材料(autologous material)，是相对于少量的血浆浓缩含有大量血小板的无活性物质，并且含有高浓度的白细胞。
血管中无活性的血小板循环通过血管时保持圆形。已知血小板的生命周期大约为10天，且相对于1mL的血液，含量大约是2-4×108。
通过血管中含有的物质活化富血小板血浆(PRP)中的血小板，然后释放生长因子(growth factor)和各种活性物质(active substance)。所述活性物质包括胶原、凝血酶、腺苷二磷酸(ADP)以及肾上腺素。特别地，胶原和凝血酶被认为是强力激动剂(strong agonist)。如图1所示，已知胶原通过将其特定序列粘合至血小板上来诱导血小板的活化。
当活化因子活化血小板时，所述血小板由于其α颗粒(alpha granules)的脱颗粒作用(degranulation)而释放生长因子(growth factor)。所述因子在伤口愈合(wound healing)初期扮演着重要角色。在此，释放的生长因子(growth factor)包括血小板衍生生长因子(PDGF-AB)、转化生长因子-b1(TGF-b1)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子(IGF)等。而且，在体外条件下，富血小板血浆(PRP)释放细胞因子等，由此合成成纤维细胞的DNA。这增加了胶原的产量，从而促使形成胶原结构。
但是，在应用时富血小板血浆(PRP)呈液态，因此很难将所述富血小板血浆(PRP)注射到伤口中，并且会存在周围组织流失(loss of surroundingtissues)的问题。因此，需要开发伴随有物理性能的凝块凝胶化(clottinggelation)。至于凝胶化，近期主要进行了关于使用凝血酶的研究。然而，有报道，在使用凝血酶(主要取自牛(bovine-derived))，也就是取自动物的蛋白时，观察到了免疫反应如狼疮(lupus)。换言之，凝血酶被认为是具有与抗体有关的临床问题的因子。凝血酶是血小板活化剂中最有效的成分。然而，在使用凝血酶时，还需要凝血酶的抗体、凝血酶原、凝血因子V(factor V)以及心磷脂。同时，通过动物研究，发现存在一些临床问题，如术后出血和自身免疫综合征。虽然这些问题很少发生，但在研发过程中不能忽略。凝血酶的使用可能导致受损伤口的扩散、异常的凝胶强度等问题。
此外，由于凝血酶-活化凝胶的高收缩性，使在填充伤口空间的外科手术过程中存在困难。因此，认识到了凝血酶替代材料的重要性。
胶原是刚性纤维状蛋白(rigid fibrous protein)，是哺乳动物结缔组织中的主要蛋白成分。它构成了蛋白总量的30％以上。胶原赋予组织外形、强度和弹性(shape，strength and flexibility)，并具有各种功能如组织支架(tissuescaffolding)、细胞粘合、细胞迁移、血管生成(blood vessel production)、组织形态生成、组织修复等。作为血小板强力激动剂(strong agonist)的胶原活化血小板，并引起血小板聚集(platelet aggregation)。纤维状的胶原(fibrillarcollagen)比可溶性的胶原(soluble collagen)更强烈的诱导血小板聚集(platelet aggregation)并支持(supporting)更强烈的血小板粘附(plateletadhesion)。虽然产生这种差异的原因还没有被证实，据设想，存在纤维状的胶原(fibrillar collagen)与促进活化血小板作用的分子结合的可能性。
Ⅰ型胶原构成哺乳动物结缔组织的大部分。同时，作为天然支架(scaffold)，对Ⅰ型胶原在再生医学和组织工程学领域的研究最为活跃。由于具有这些优点，Ⅰ型胶原通过替代凝血酶扮演着活化血小板的角色，并能保持外形。
然而，目前还没有通过用氯化钙溶液和Ⅰ型胶原活化富血小板血浆(PRP：Platelet rich plasma)诱导组织再生的组合物。换言之，目前还没有很好的凝血酶的替代品。因此，尽管存在很多问题，也只采用凝血酶(主要取自牛)，也就是取自动物的蛋白。
发明内容
因此，鉴于上述问题进行本发明，并提供通过活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物及其制备方法。本发明达到下列目的。第一，当富血小板血浆(PRP)与取自动物的蛋白，也就是凝血酶(主要取自牛)一起使用时，会引起免疫反应和临床问题，为了改善所述免疫反应和临床问题，采用Ⅰ型胶原。第二，为了骨缺损治疗或伤口愈合(wound healing)，收集少量的全血，然后从全血中分离富血小板血浆(PRP)并与Ⅰ型胶原混合注射。换言之，采用作为自体材料和很少引起免疫反应的去端肽胶原(atelocollagen)的富血小板血浆(PRP)，以消除临床排异(clinical rejection)。第三，能够方便快捷地从外科手术部位分离富血小板血浆(PRP)，并将其与氯化钙溶液和Ⅰ型胶原混合注射，这样能够使严重受伤的病人或遭受反复手术的病人获得有效的组织再生。第四，当根据本发明收集的富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液和Ⅰ型胶原混合应用于需要组织再生的部位时，Ⅰ型胶原活化富血小板血浆(PRP)，诱导来自富血小板血浆(PRP)凝胶(gel)对组织再生有益的生长因子(growth factor)。这样能够方便快捷的获得有效的组织再生。特别地，第五，与以凝血酶作为激动剂和富血小板血浆(PRP)的凝块(clotting)相比，以Ⅰ型胶原作为激动剂和富血小板血浆(PRP)的凝块(clotting)能够释放相似或更大量的生长因子(growth factor)(根据生长因子(growth factor)的种类)。这诱导了更有效的组织再生。此外，第六，根据本发明收集的富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液和Ⅰ型胶原混合注射到需要骨缺损治疗或伤口愈合(wound healing)的所有部位，从而获得有效的组织再生。最后，第七，因此，本发明大大提高了将富血小板血浆(PRP)应用到病区的可靠性并使消费者呈现良好的形象。
根据本发明的一方面，提供一种通过活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物的制备方法，该方法包括下列步骤：从全血中分离富血小板血浆(PRP)；将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液混合；并将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液的混合物与Ⅰ型胶原混合。
根据本发明的另一方面，提供一种通过活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物，该组合物通过上述方法制备。
如上所详述，当富血小板血浆(PRP)与取自动物的蛋白，也就是凝血酶(主要取自牛)一起使用时，会引起免疫反应和临床问题，在本发明中，为了改善所述免疫反应和临床问题，采用Ⅰ型胶原。
根据上述本发明的技术方案，为了骨缺损治疗或伤口愈合(woundhealing)，收集少量的全血，然后从所述全血中分离富血小板血浆(PRP)并与Ⅰ型胶原混合注射。换言之，采用作为自体材料和很少引起免疫反应的去端肽胶原的富血小板血浆(PRP)，以消除临床排异。
而且，在本发明中，能够方便快捷地从外科手术部位分离富血小板血浆(PRP)，并将其与氯化钙溶液和Ⅰ型胶原混合注射，这样能够使严重受伤的病人或遭受反复手术的病人获得有效的组织再生。
而且，当根据本发明收集的富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液和Ⅰ型胶原混合应用于需要组织再生的部位时，Ⅰ型胶原活化富血小板血浆(PRP)，诱导来自于富血小板血浆(PRP)凝胶对组织再生有益的生长因子(growthfactor)。这样能够方便快捷的获得有效的组织再生。
特别地，在本发明中，与以凝血酶作为激动剂和富血小板血浆(PRP)的凝块(clotting)相比，以Ⅰ型胶原作为激动剂和富血小板血浆(PRP)的凝块(clotting)能够释放相似或更大量的生长因子(growth factor)(根据生长因子(growth factor)的种类)。这诱导了更有效的组织再生。
此外，将根据本发明收集的富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液和Ⅰ型胶原混合注射到需要骨缺损治疗或伤口愈合(wound healing)的所有部位，从而获得有效的组织再生。
最后，因此，本发明大大提高了将富血小板血浆(PRP)应用到病区的可靠性并使消费者呈现良好的形象。
附图说明
以下结合附图的详细说明，将使本发明的上述和其他目的、特征、优点变得更加明显。
图1是通过血小板和内皮下蛋白(Subendothelial proteins)间的相互作用(interaction)连续发生吸附和活化并进行聚集(aggregation)的模示图；
图2是1mL从全血中分离的富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液和Ⅰ型胶原的混合物的照片，在图2(a)中，所述氯化钙溶液的含量为0.25mg/mL，在图2(b)中，所述氯化钙溶液的含量为0.3mg/mL，在图2(c)中，所述氯化钙溶液的含量为0.5mg/mL；以及
图3是常规凝血酶混合物(A)和本发明Ⅰ型胶原混合物(B)培养物的照片。
具体实施方式
下文中，将参照附图更具体地描述用于实现上述效果的根据本发明的优选实施方式。
根据本发明，如图2和3所示的，获得(configured)通过活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物及其制备方法。
以下对本发明的描述中，当确定详细描述已知功能或结构会使本发明的主题不清楚时，那么将省略引入本文的已知功能或结构的详细描述。
另外，本发明中，下文描述的术语是鉴于其功能而设置的，是可以根据操作者的意图或常规用途而变化的。因此，应根据本说明书的描述确定其定义。
首先，在本发明中，通过活化富血小板血浆(PRP：Platelet rich plasma)诱导组织再生的组合物通过下列步骤制备：从全血中分离富血小板血浆(PRP)；将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液混合；并将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液的混合物与Ⅰ型胶原混合。
同时，在本发明中，所述组合物可有多种应用，并可以多种形式制得。
而且，应当理解的是本发明并不限于详细描述中提到的具体实施方式，且包括在本发明所附权利要求的精神和范围内的修改、添加和替换。
在下文中，将对制备如上获得的通过活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物的发明方法的实施效果进行描述。
首先，本发明方法包括从全血中分离富血小板血浆(PRP：Platelet richplasma)的步骤。
此处，从全血中分离富血小板血浆(PRP)的步骤包括下列步骤：收集10mL动物或病人的全血放入含3.2％柠檬酸钠(Sodium citrate)的真空试管中，并先离心所述全(1750-1900g)3-5分钟。
然后，经过离心，收集含有血沉棕黄层(软膜：Buffy coat)的上层清液(血浆层)。
将收集的含有血沉棕黄层(软膜：Buffy coat)的上层清液(血浆层)通过钝针(blunt needle)转移到新的真空试管中，并再次进行离心(4500-5000g)4-6分钟。
然后，通过钝针(blunt needle)收集浓缩于底层(从试管底部到约为1mL的高度)的富血小板血浆(PRP)。
此外，本发明方法包括将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液混合的步骤。
此处，将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液混合的步骤中，通过三相连接器(Connecta)将大约1mL从全血分离富血小板血浆(PRP)步骤中收集的富血小板血浆(PRP)与浓度为0.30-0.55mg/mL的氯化钙溶液进行一次混合。
另外，本发明方法包括将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液的混合物与Ⅰ型胶原混合的步骤，由此来制备通过活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物。
此处，将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液的混合物与Ⅰ型胶原混合的步骤包括将所述Ⅰ型胶原放置在室温下的步骤。
然后，通过三相连接器(Connecta)连接将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液的混合物与浓度为20-50mg/mL的不透明的Ⅰ型胶原混合四次。
接下来，将用注射器收取的所述富血小板血浆(PRP)和Ⅰ型胶原的混合物注射到需要组织再生的所有部位，例如骨缺损治疗和伤口愈合(woundhealing)。
所述Ⅰ型胶原优选具有20-50mg/mL的浓度。
此外，所述Ⅰ型胶原优选在室温下放置15-30分钟。
下面将对本发明的实施例进行描述。
[实施例1]
首先，准备用于富血小板血浆(PRP)分离的试剂盒如下。
1)含有3.2％柠檬酸钠的真空试管
2)真空试管夹
3)真空试管针
4)真空试管(普通型)
5)3mL注射器
6)钝针(Blunt needle)
从上述工具可以推导出富血小板血浆(PRP)的分离方法。首先，
1)收集10mL病人的全血放入含有3.2％柠檬酸钠的真空试管中。
2)将真空试管中收取的全血离心(1750-1900g)3-5分钟。此处，将离心机的重力加速度和时间设置成将全血分离为血细胞、血沉棕黄层(软膜：Buffy coat)和血浆的最适状态。
3)在打开所述真空试管的盖之后，用带有钝针(Blunt needle)的注射器收集含有血沉棕黄层(软膜：Buffy coat)的上层清液(血浆层)并转移到新的真空试管(普通型)中。
4)将转移到新真空试管的含有血沉棕黄层(软膜：Buffy coat)的血浆离心(4500-5000g)4-6分钟。此处，将离心机的重力加速度和时间设置成使血浆中的富血小板血浆(PRP)浓缩的最适状态。
5)在打开所述真空试管的盖之后，用带有钝针(Blunt needle)的注射器收集浓缩于试管底层(从试管底部到约为1mL的高度)的富血小板血浆(PRP)。
6)为了确定从10mL全血中分离1mL血小板的分离效率，使血小板(Platelet)特异性表面标识(Surface maker)(即CD41)和白细胞(Leukocyte)特异性表面标识(Surface maker)(即CD45)进行反应。然后，用流式细胞计数仪(Flow cytometry)测量特定细胞(expressing cells)的数量。结果，分离的富血小板血浆(PRP)中血小板(Platelet)的数量比基准(Baselines)高5.8-7.6倍。在临床所需建议中，每6mL体积的全血中需要的数量比基准高4.0-6.0倍(约1000000个血小板/mL)。因此，所述富血小板血浆(PRP)的分离方法满足了所述建议。另外，白细胞的数量比基准高2.8-4.2倍。因此，在应用所述富血小板血浆(PRP)时，预期能获得抗病毒(antiviral effect)的效果。
另外，如下表所示，将全血离心(第1次：1750-1900g，3-5分钟；第2次：4500-5000g，4-6分钟)两次以分离出1mL的富血小板血浆(PRP)。然后，使血小板(Platelet)特异性表面标识(Surface maker)(即CD41)和白细胞(Leukocyte)特异性表面标识(Surface maker)(即CD45)进行反应。然后，用流式细胞计数仪(Flow cytometry)测量特定细胞的数量。结果，分离的富血小板血浆(PRP)中血小板(Platelet)的数量比基准(Baselines)高5.8-7.6倍，且白细胞的数量比基准高2.8-4.2倍。
表1
Figure BDA0000156167000000101
[实施例2]
首先，准备用于移植富血小板血浆(PRP)、氯化钙溶液和Ⅰ型胶原混合物的试剂盒如下。
1)1mL、3mL的注射器
2)三相连接器(Connecta)
3)氯化钙溶液
4)20-50mg/mL的Ⅰ型胶原
从上述工具可推导出移植富血小板血浆(PRP)、氯化钙溶液和Ⅰ型胶原混合物的方法。首先，
1)通过三相连接器(connecta)将收取了1mL富血小板血浆(PRP)的注射器与收取了浓度为0.30-0.55mg/mL的氯化钙溶液的注射器相连，并将材料混合一次。
换言之，图2是1mL从全血中分离的富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液和Ⅰ型胶原的混合物的照片，在图2(a)中，所述氯化钙溶液的含量为0.25mg/mL，在图2(b)中，所述氯化钙溶液的含量为0.3mg/mL，在图2(c)中，所述氯化钙溶液的含量为0.5mg/mL。在本发明中，为使所述氯化钙溶液和Ⅰ型胶原的混合物的血小板聚集(Platelet aggregation)，所述氯化钙的最适浓度优选在0.30-0.55mg/mL范围内。
作为氯化钙溶液成分的钙离子(Ca2+)在血液凝固(Blood coagulation)过程中起到将可溶性(soluble)转化成不溶性(insoluble)的作用。钙离子(Ca2+)的这种特性诱导1mL分离的富血小板血浆(PRP)与Ⅰ型胶原的混合物中的血小板聚集(platelet aggregation)。然后，如果使血小板聚集(plateletaggregation)的所述氯化钙溶液的浓度为0.25mg/mL以下，就不会形成血小板聚集(platelet aggregation)。另一方面，如果所述浓度为0.55mg/mL以上，渗透压会导致细胞损伤。
2)将浓度为20-50mg/mL的Ⅰ型胶原在室温下放置15-30分钟，以使可溶性胶原(soluble collagen)变为纤维状的胶原(fibrillar collagen)。此处，将Ⅰ型胶原放置在室温下的原因如下：第一，使所述Ⅰ型胶原变温能够使可溶性胶原状态的Ⅰ型胶原纤维状胶原化(fibrillar-collagenated)；第二，纤维状胶原化的Ⅰ型胶原与富血小板血浆(PRP)的混合物和可溶性的Ⅰ型胶原与富血小板血浆(PRP)的混合物间释放生长因子(growth factor)的量的区别几乎不存在；且第三，通常，纤维状胶原化的Ⅰ型胶原比可溶性的胶原(soluble collagen)能更有效地诱导血小板聚集(platelet aggregation)和支持(supporting)血小板粘附(platelet adhesion)。
3)通过三相连接器(connecta)将收取了1mL富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液混合物的注射器与等量的浓度为20-50mg/mL的纤维状的Ⅰ型胶原相连，并将材料互相混合四次。
4)将注射器中收取的富血小板血浆(PRP)、氯化钙溶液和Ⅰ型胶原的混合物注射到需要组织再生的所有部位，例如骨缺损治疗和伤口愈合(woundhealing)。
[实施例3]
1)将注射器中收取的富血小板血浆(PRP)、氯化钙溶液和Ⅰ型胶原的混合物注入圆底玻璃管中。
2)将所述混合物在37℃恒温箱中培养15分钟，并凝块。此处，通过在37℃恒温箱中培养所述混合物，能够获得与所述混合物移植到组织部位并凝块处相同的条件。
3)将凝块的混合物放置在加有1mL DMEM的无菌24孔培养皿中，并在37℃恒温箱中培养。
通过上述方法，收集10mL病人的全血并经过两次离心步骤得到1mL浓缩的富血小板血浆(PRP)。所述富血小板血浆(PRP)首先与氯化钙溶液混合，并其次与Ⅰ型胶原混合。然后，将所述混合物移植到需要组织再生的所有部位，例如骨缺损治疗和伤口愈合(wound healing)。在这个方法中，没有发生临床排异。而且，能够在短时间内分离富血小板血浆(PRP)，与Ⅰ型胶原混合，并移植所述混合物。因此，能够有效快捷的诱导组织再生，如骨缺损和伤口愈合(wound healing)。
特别地，图3显示的是分别用凝血酶和Ⅰ型胶原活化分离的富血小板血浆(PRP)，并将培养基在5％CO2的恒温箱(37℃)中培养时的培养物。在15天后，大多数常规凝血酶(Thrombin)混合物(A)降解(degradation)了。另一方面，15天后本发明的胶原混合物(B)仍然保持它的初始外形，尺寸仅有微小变化。
本发明的通过活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物及其制备方法，其技术精神实际上能够通过重复相同的结果来实现。特别地，本发明的实现能够促进技术的发展并为工业发展作出贡献。因此，本发明应当得到保护。

Claims (7)

1.一种通过活化富血小板血浆(PRP：Platelet rich plasma)诱导组织再生的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
从全血中分离富血小板血浆(PRP)；
将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液混合；并且
将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液的混合物与Ⅰ型胶原混合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从全血中分离富血小板血浆(PRP)的步骤包括下列步骤：
收集10mL动物或病人的全血放入含3.2％柠檬酸钠(Sodium citrate)的真空试管中，并先离心收集的全血(1750-1900g)3-5分钟；
经过所述离心，收集含有血沉棕黄层(软膜：Buffy coat)的上层清液(血浆层)；
将收集的含有血沉棕黄层(软膜：Buffy coat)的上层清液(血浆层)通过钝针(Blunt needle)转移到新的真空试管中，并再次进行离心(4500-5000g)4-6分钟；然后
通过钝针(Blunt needle)收集浓缩于底层(从试管底部到约为1mL的高度)的富血小板血浆(PRP)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液混合的步骤中，通过三相连接器(Connecta)将大约1mL从全血分离富血小板血浆(PRP)步骤中收集的富血小板血浆(PRP)与浓度为0.30-0.55mg/mL的氯化钙溶液进行一次混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液的混合物与Ⅰ型胶原混合的步骤包括下列步骤：
将所述Ⅰ型胶原放置在室温下；
通过三相连接器(Connecta)连接将所述富血小板血浆(PRP)与氯化钙溶液的混合物与浓度为20-50mg/mL不透明状态的Ⅰ型胶原混合四次；接下来
将用注射器收取的所述富血小板血浆(PRP)和Ⅰ型胶原的混合物注射到需要组织再生的所有部位，例如骨缺损治疗和伤口愈合(wound healing)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述Ⅰ型胶原具有20-50mg/mL的浓度。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述Ⅰ型胶原在室温下放置15-30分钟。
7.一种通过活化富血小板血浆(PRP)诱导组织再生的组合物，其特征在于，该组合物通过权利要求1所述的方法制备。
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