BR112012009560A2 - método de produção de composição para induzir a regeneração de tecidos através da ativação de plasma rico em plaquetas (prp) - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÃO PARA INDUZIR A REGENERAÇÃO DE TECIDOS ATRAVÉS DA ATIVAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) trata-se a presente invenção de uma composição para induzir a regeneração de tecidos através da ativação de plasma rico em plaquetas (PRP) com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I, e do método de produção da mesma. O método revelado inclui as etapas de: separar o PRP do sangue total; misturar o PRP com uma solução de cloreto de cálcio; e misturar a mistura do PRP e a solução de cloreto de cálcio com colágeno do tipo I. A composição revelada pode apresentar uma formação semelhante a um gel contendo PRP, e pode ser transplantada em qualquer lesão que necessite de regeneração de tecidos em casos tais como tratamento de defeitos ósseos e cura de ferimentos e, correspondentemente, o PRP pode ser ativado para induzir um fator de crescimento que é útil para a regeneração de tecidos a partir do gel PRP, para a obtenção de uma rápida e efetiva regeneração de tecidos. Consequentemente, o método é muito útil para aumentar significativamente a credibilidade da aplicação do PRP em lesões e para apresentar uma boa imagem aos consumidores.

Description

“MÉTODO DE PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÃO PARA INDUZIR A

REGENERAÇÃO DE TECIDOS ATRAVÉS DA ATIVAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP)” Campo Técnico 5 A presente invenção se refere a uma composição para induzir a regeneração de tecidos através da ativação de plasma rico em plaquetas (PRP) com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I, e ao método de produção da mesma. Mais especificamente, na presente invenção, a composição pode apresentar uma formação do tipo gel contendo PRP, e pode ser 10 transplantada para qualquer lesão que necessite de regeneração de tecidos em casos tais como tratamento de defeitos ósseos e cicatrização de ferimentos e, consequentemente, o PRP pode ser ativado para induzir um fator de crescimento que é útil para a regeneração dos tecidos a partir do gel de PRP para a obtenção de uma rápida e efetiva regeneração dos tecidos. Consequentemente, o método é 15 muito útil para aumentar significativamente a credibilidade da aplicação do PRP em lesões e para apresentar uma boa imagem aos consumidores. Fundamentos da Invenção Como é de conhecimento comum, o plasma rico em plaquetas (PRP) é um material autólogo separado do sangue total através de 20 centrifugação em gradiente de densidade, e consiste de uma substância inativa que inclui uma grande quantidade de plaquetas concentradas em relação a uma pequena quantidade de plasma, e contém leucócitos em alta concentração. As plaquetas inativadas no interior de um vaso sanguíneo mantém um formato redondo enquanto circulam no interior do vaso sanguíneo. É 25 conhecido que as plaquetas possuem vida aproximada de 10 dias, e se encontram presentes em uma quantidade aproximada de 2~4x10 8 em relação a 1 mL de sangue. As plaquetas dentro do PRP são ativadas através de substâncias incluídas no interior de um vaso sanguíneo, e então liberam fatores 30 de crescimento e várias substâncias ativas. As substâncias de ativação incluem colágeno, trombina, difosfato de adenosina (ADP) e epinefrina. Especificamente, o colágeno e a trombina são conhecidos como fortes agonistas. É conhecido que o colágeno induz a ativação das plaquetas através da adesão de suas sequências específicas nas plaquetas como mostrado na Figura 1.

Quando os fatores de ativação ativam as plaquetas, as plaquetas liberam fatores de crescimento em função da degranulação de seus grânulos alfa.

Os fatores executam um papel importante na cura inicial de ferimentos.

Aqui, os fatores de crescimento liberados incluem o fator de 5 crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AB), o fator-b1 transformador de crescimento (TGF-b1), o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), o fator de crescimento epidérmico (EGF), o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) e similares.

O PRP também libera citocinas, etc., sob condições in vitro, com isto sintetizando o DNA dos fibroblastos.

Isto aumenta a produção do 10 colágeno, e consequentemente permite que uma estrutura de colágeno seja organizada.

No entanto, na aplicação do PRP em estado líquido, é difícil injetar o PRP em um ferimento, e existe uma perda de tecidos circundantes.

Consequentemente, é necessário o desenvolvimento de uma gelificação 15 coagulante acompanhada de propriedades físicas específicas.

Para a gelificação, pesquisas com a utilização da trombina foram recentemente conduzidas.

No entanto, existe um relatório que informa que com a utilização da trombina (derivada principalmente de bovinos), que é uma proteína animal, uma reação imune tal como lúpus foi observada.

Em outras palavras, a trombina é conhecida 20 como um fator tendo problemas clínicos relacionados a um anticorpo.

A trombina é o componente mais potente como ativador de plaquetas.

No entanto, quando a trombina é utilizada, anticorpos para a trombina, protrombina, fator V e cardiolipina são necessários.

Também, através de pesquisas em animais, foi descoberto que acontecem problemas clínicos tais como sangramentos pós- 25 operatórios e uma síndrome autoimune.

Embora estes problemas ocorram raramente, eles não podem ser negligenciados no desenvolvimento.

A utilização da trombina pode causar o espalhamento de um ferimento danificado, resistência anormal do gel ou sintomas semelhantes.

Além disso, em função da alta contração do gel de 30 ativação da trombina, existe uma dificuldade cirúrgica no preenchimento de um espaço de um ferimento.

Consequentemente, a importância de um material substituto para a trombina foi reconhecida.

O colágeno consiste de uma proteína fibrosa, e é o principal componente de proteína de um tecido mamífero de conexão.

Ele totaliza

30% ou mais do total de proteínas.

O colágeno proporciona formato, resistência e flexibilidade ao tecido, e possui várias funções tais como estruturação de tecidos, adesão celular, migração celular, produção de vasos sanguíneos, morfogênese de tecidos, reparação de tecidos e similares.

O colágeno, como forte agonista de 5 plaquetas, ativa as plaquetas e provoca a agregação das plaquetas.

O colágeno fibrilar induz mais fortemente a agregação das plaquetas e suporta uma maior adesão de plaquetas do que um colágeno solúvel.

Embora a razão desta diferença ainda não tenha sido claramente provada, assume-se que existe a possibilidade do colágeno fibrilar se ligar a uma molécula aumentando a ação das 10 plaquetas ativadas.

O colágeno do tipo I consiste da maioria dos tecidos mamíferos de conexão.

Também, como um estruturador natural, é mais ativamente pesquisado nos campos da medicina regenerativa e de engenharia de tecidos.

Em função destas vantagens do colágeno do tipo I, o colágeno do tipo I 15 executa um papel de ativação de plaquetas com a substituição da trombina, mantendo o formato.

No entanto, não existe nenhuma composição para induzir a regeneração de tecidos com a ativação do PRP com uma solução de cloreto de cálcio e o colágeno do tipo I.

Em outras palavras, não existe nenhum produto que 20 substitui a trombina.

Consequentemente, apenas a trombina (derivada principalmente de bovinos), isto é, uma proteína derivada de animais, foi utilizada apesar dos vários problemas que apresenta.

Revelação Problema Técnico 25 Por esta razão, a presente invenção foi desenvolvida tendo em vista os problemas acima mencionados, e fornece uma composição para induzir a regeneração de tecidos através da ativação de plasma rico em plaquetas (PRP), e um método de fabricação da mesma.

A presente invenção atinge os seguintes objetivos.

Em primeiro lugar, com o propósito de melhorar a 30 reação imune e evitar problemas clínicos, o colágeno do tipo I é utilizado, sendo que a reação imune e os problemas clínicos são causados quando o plasma rico em plaquetas (PRP) é utilizado em conjunto com uma proteína derivada de animais, isto é, a trombina (derivada principalmente de bovinos). Em segundo lugar, para o tratamento de defeitos ósseos ou cura de ferimentos, uma pequena quantidade do sangue total é coletada, e o PRP é separado do sangue total e injetado em mistura com o colágeno do tipo I.

Em outras palavras, o plasma rico em plaquetas (PRP) consistindo de um material autólogo e a atelocollagem que provoca poucas reações imunes são utilizados para eliminar rejeições clinicas. 5 Em terceiro lugar, o PRP é convenientemente e rapidamente separado no local do procedimento cirúrgico, e é injetado em mistura com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I, de tal maneira que uma efetiva regeneração de tecidos possa ser obtida para pacientes com lesões graves ou pacientes submetidos a cirurgias repetitivas.

Em quarto lugar, quando o PRP coletado de acordo com a 10 presente invenção é aplicado em uma região requerendo regeneração de tecidos, em mistura com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I, o colágeno do tipo I ativa o PRP, induzindo fatores de crescimento úteis para a regeneração de tecidos a partir do gel de PRP.

Este método é eficaz e provoca convenientemente e rapidamente a regeneração dos tecidos.

Especificamente, 15 em quinto lugar, a coagulação do colágeno do tipo I, como um agonista com PRP, pode liberar uma quantidade similar ou maior de agentes de crescimento de acordo com os tipos de fatores de crescimento, do que a coagulação da trombina como um agonista com PRP.

Isto induz a uma regeneração mais efetiva dos tecidos.

Além disso, em sexto lugar, o PRP coletado de acordo com a presente 20 invenção é injetado em mistura com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I em todas as regiões requerendo tratamento de defeitos ósseos ou cura de ferimentos, com isto obtendo uma efetiva regeneração de tecidos.

Finalmente, em sétimo lugar, como resultado, a invenção aumenta significativamente a credibilidade da aplicação do PRP em lesões e apresenta uma boa imagem aos 25 consumidores.

Solução Técnica De acordo com um aspecto da presente invenção, é revelado um método de manufatura de uma composição para induzir a regeneração de tecidos através da ativação de plasma rico em plaquetas (PRP), o 30 método incluindo as etapas de: separar o PRP do sangue total; misturar o PRP com uma solução de cloreto de cálcio; e misturar a mistura do PRP e a solução de cloreto de cálcio com colágeno do tipo I.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é revelada uma composição para induzir a regeneração de tecidos através da ativação do PRP, que é produzido através do mencionado método.

Efeitos Vantajosos Como descrito com detalhes acima, na presente invenção, com o propósito de melhorar a reação imune e evitar problemas 5 clínicos, o colágeno do tipo I é utilizado, sendo que a reação imune e os problemas clínicos são causados quando o plasma rico em plaquetas (PRP) é utilizado em conjunto com uma proteína derivada de animais, isto é, a trombina (derivada principalmente de bovinos). Na configuração técnica da presente invenção descrita 10 acima, para o tratamento de defeitos ósseos ou cura de ferimentos, uma pequena quantidade do sangue total é coletada, e o plasma rico em plaquetas (PRP) é separado do sangue total e injetado em mistura com o colágeno do tipo I.

Em outras palavras, o PRP como material autólogo e a atelocollagem provocam poucas reações imunes e são utilizados para eliminar rejeições clinicas. 15 Também, na presente invenção, o PRP é convenientemente e rapidamente separado no local do procedimento cirúrgico, e é injetado em mistura com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I, de tal maneira que uma efetiva regeneração de tecidos possa ser obtida para pacientes com lesões graves ou pacientes submetidos a cirurgias repetitivas. 20 Também, quando o PRP coletado de acordo com a presente invenção é aplicado em uma região requerendo regeneração de tecidos, em mistura com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I, o colágeno do tipo I ativa o PRP induzindo fatores de crescimento úteis para a regeneração de tecidos a partir do gel de PRP.

Este método é eficaz e provoca 25 convenientemente e rapidamente a regeneração dos tecidos.

Especificamente, na presente invenção, a coagulação do colágeno do tipo I como um agonista com PRP pode liberar uma quantidade similar ou maior de agentes de crescimento de acordo com os tipos de fatores de crescimento, do que a coagulação da trombina como um agonista com PRP.

Isto 30 induz a uma regeneração mais efetiva dos tecidos.

Além disso, o PRP coletado de acordo com a presente invenção é injetado em mistura com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I em todas as regiões requerendo tratamento de defeitos ósseos ou cura de ferimentos, com isto obtendo uma efetiva regeneração de tecidos.

Finalmente, como resultado, a invenção aumenta significativamente a credibilidade da aplicação do PRP em lesões e apresenta uma boa imagem aos consumidores.

Breve Descrição dos Desenhos 5 Os objetivos anteriores e outros, recursos e vantagens da presente invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir, quando observada em conjunto com os desenhos anexos nos quais: a Figura 1 mostra uma vista ilustrando um modelo no qual a absorção e a ativação ocorrem sequencialmente e a agregação acontece 10 através de uma interação entre plaquetas e proteínas subendoteliais; a Figura 2 mostra fotografias de 1 mL de plasma rico em plaquetas (PRP) separado do sangue total em mistura com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I, sendo que na Figura 2(a) a solução de cloreto de cálcio é incluída em uma quantidade de 0,25 mg/mL, na Figura 2(b) a 15 solução de cloreto de cálcio é incluída em uma quantidade de 0,3 mg/mL, e na Figura 2(c) a solução de cloreto de cálcio é incluída em uma quantidade de 0,5 mg/mL; e a Figura 3 mostra fotografias de uma cultura de uma mistura convencional de trombina (A) e a mistura de colágeno do tipo I (B) da 20 invenção.

Descrição Detalhada da Invenção Aqui e a seguir, uma modalidade preferida de execução de acordo com a presente invenção, para a exibição destes efeitos, será descrita com detalhes com referência aos desenhos anexos. 25 De acordo com a presente invenção, uma composição para induzir a regeneração de tecidos com a ativação de plasma rico em plaquetas (PRP), e um método de manufatura da mesma são configurados como ilustrado nas Figuras 2 e 3. Nas descrições seguintes da presente invenção, uma 30 descrição detalhada das funções conhecidas e das configurações aqui incorporadas será omitida quando for determinado que a descrição detalhada das funções conhecidas e das configurações pode obscurecer desnecessariamente o assunto principal da presente invenção.

Também, os termos descritos abaixo são definidos em consideração às suas funções na invenção, que podem ser variados de acordo com o propósito do fabricante ou do seu uso convencional.

Consequentemente, suas definições podem ser baseadas na descrição desta especificação.

Em primeiro lugar, na presente invenção, uma 5 composição para induzir a regeneração de tecidos através da ativação de plasma rico em plaquetas (PRP) é manufaturada nas seguintes etapas: separar o PRP do sangue total; misturar o PRP com uma solução de cloreto de cálcio; e misturar a mistura do PRP e da solução de cloreto de cálcio com colágeno do tipo I.

Enquanto isso, na presente invenção, a composição pode 10 ser aplicada de várias maneiras, e pode ser produzida de várias formas.

Também deve ser entendido que a presente invenção não é limitada às modalidades preferidas de execução mencionadas na descrição detalhada, e inclui modificações, equivalências e alternativas situadas no espírito e escopo das reivindicações anexas da presente invenção. 15 Aqui e a seguir, os efeitos operacionais do método inventivo de manufatura da composição para induzir a regeneração de tecidos através da ativação do PRP, como configurado acima, serão descritos.

Em primeiro lugar, o método inventivo inclui a etapa de separação do PRP do sangue total.

Aqui, a etapa de separação do PRP do 20 sangue total inclui a etapa de coletar 10 mL do sangue total de um animal ou de um paciente em um tubo de ensaio a vácuo contendo 3,2% de citrato de sódio, e de centrifugar primeiramente o sangue total (1.750~1.900 g) durante 3 a 5 minutos.

Então, através da configuração, um líquido sobrenadante 25 (camada de plasma) incluindo uma capa leucocitária é coletado.

O líquido sobrenadante (camada de plasma) incluindo a capa leucocitária é transferido a um novo tubo de ensaio a vácuo com o auxílio de uma agulha cega, e é centrifugado uma segunda vez (4.500~5.000 g) durante 4 a 6 minutos. 30 Então, o PRP concentrado em uma camada do fundo (do fundo até a uma altura aproximada de 1 mL do tubo de ensaio) é coletado com uma agulha cega.

O método inventivo também inclui a etapa de misturar o PRP com uma solução de cloreto de cálcio.

Aqui, na etapa de mistura do PRP com a solução de cloreto de cálcio, aproximadamente 1 mL do PRP coletado na etapa de separação do PRP do sangue total é misturado uma vez com uma solução de cloreto de cálcio com uma concentração de 0,30~0,55 mg/mL através de um conector de 5 três vias.

O método inventivo também inclui a etapa de misturar o PRP e a solução de cloreto de cálcio com colágeno do tipo I, para a produção da composição para induzir a regeneração de tecidos com a ativação do PRP.

Aqui, a etapa de misturar a mistura do PRP e a solução 10 de cloreto de cálcio com colágeno do tipo I inclui a etapa de manter o colágeno do tipo I em temperatura ambiente.

A seguir, a mistura do PRP e a mistura do colágeno do tipo I, carregada em uma seringa, é injetada em todas as regiões que necessitam de regeneração de tecidos, nos casos de tratamento de defeitos ósseos e cura de 15 ferimentos.

O colágeno do tipo I apresenta preferencialmente uma concentração de 20~50 mg/mL.

Além disso, o colágeno do tipo I é preferencialmente mantido em temperatura ambiente por 15 a 30 minutos. 20 Aqui e a seguir, Exemplos da presente invenção serão descritos.

Exemplo 1 Primeiramente, um kit para a separação do PRP é preparado como descrito abaixo. 25 1) Um tubo de ensaio a vácuo contendo 3,2% de citrato de sódio 2) Um suporte para o tubo de ensaio a vácuo 3) Uma agulha para o tubo de ensaio a vácuo 4) Um tubo de ensaio a vácuo (do tipo liso) 30 6) Uma agulha cega A partir dos componentes acima mencionados, um método de separação de PRP pode ser realizado.

Primeiramente, 1) De um paciente, 10 mL de sangue total são coletados em um tubo de ensaio a vácuo contendo 3,2% de citrato de sódio.

2) O sangue total carregado no tubo de ensaio a vácuo é centrifugado (1.750~1.900 g) durante 3 a 5 minutos. Nesta etapa, a aceleração e o tempo de operação do separador centrífugo são definidos em níveis otimizados para a separação do sangue total em hemócitos, na capa leucocitária e no 5 plasma. 3) Depois que a tampa do tubo de ensaio é aberta, um líquido sobrenadante (camada de plasma) incluindo a capa leucocitária é coletado e transferido a um novo tubo de ensaio (do tipo liso) com a utilização de uma seringa equipada com uma agulha cega. 10 4) O plasma incluindo a capa leucocitária, transferido ao novo tubo de ensaio, é centrifugado (4.500~5.000 g) durante 4 a 6 minutos. Nesta etapa a aceleração da gravidade e o tempo de operação do separador centrífugo são ajustados para níveis otimizados para realizar a concentração do PRP no plasma. 15 5) Depois que a tampa do tubo de ensaio é aberta, o PRP concentrado na camada do fundo do tubo de ensaio (do fundo até a uma altura aproximada de 1 mL do tubo de ensaio) é coletado com a utilização de uma seringa equipada com uma agulha cega. 6) Com o propósito de determinar a eficiência de 20 separação de 1 mL de plaquetas separadas de 10 mL de sangue total, um marcador específico de superfícies de plaquetas, isto é, CD41, e um marcador específico de superfícies de leucócitos, isto é, CD45, são levados a reagir. Em seguida, uma citometria de fluxo é realizada para medir o número de células expressivas. Como resultado, o número de plaquetas do PRP separado é de 5,8 a 25 7,6 vezes mais elevado do que na linha de base. Nas necessidades clínicas recomendadas, o número necessita ser de 4,0 a 6,0 vezes (aproximadamente

1.000.000 de plaquetas/mL) mais elevado do que uma linha de base por unidade de volume de 6 mL de sangue total. Portanto, o método de separação do PRP satisfaz as recomendações. Além disso, o número de leucócitos é de 2,8 a 4,2 30 vezes maior do que uma linha de base. Consequentemente, na aplicação do PRP, espera-se atingir um efeito antiviral. Também, como pode ser observado na Tabela abaixo, o sangue total é centrifugado duas vezes (1º a 1.750~1.900 g durante 3 a 5 minutos, e 2º a 4.500~5.000 g durante 4 a 6 minutos), de maneira a separar 1 mL de PRP.

Em seguida, um marcador específico de superfícies de plaquetas, isto é, CD41, e um marcador específico de superfícies de leucócitos, isto é, CD45, são levados a reagir.

A seguir uma citometria de fluxo é realizada para medir o número de células expressivas.

Como resultado, o número de plaquetas do PRP 5 separado é de 5,8~7,6 vezes maior do que uma linha de base, e o número de leucócitos é de 2,8~4,2 vezes maior do que uma linha de base.

Tabela 1 Amostra Contagem de Plaquetas (x 108/mL) Leucócitos (x 106/mL) Linha de Base PRP (vezes a Linha de Base do PRP (vezes a do Sangue Total linha de base) Sangue Total linha de base) Amostra 2,46 14,81 (6,02) 8,7 29,7(3,41) 1 Amostra 1,18 11,27 (620) 4,3 14,9(3,50) 2 Amostra 2,11 15,24 (7,22) 5,0 20,9(4,18) 3 Amostra 2,62 16,15 (6,16) 12,1 39,3(3,27) 4 Amostra 1,94 11,58 (6,00) 4,6 12,9(2,80) 5 Amostra 2,36 20,09 (5,81) 6,2 25,2(4,06) 6 Amostra 2,55 17,48 (6,85) 6,4 30,7(4,80) 7 Amostra 1,77 13,52 (7,64) 4,8 17,9(3,73) 8 Amostra 2,13 15,6 (7,32) 5,0 17,9(3,58) 9 Média 2,19 15,08 (6,88) 6,3 23,3(3,7) Exemplo 2 Um kit para o transplante de uma mistura de PRP com 10 uma solução de cloreto de cálcio e um colágeno do tipo I é preparado como descrito abaixo. 1) Seringas de 1 mL e 3 mL 2) Conector de três vias 3) Uma solução de cloreto de cálcio 15 4) 20~50 mL de colágeno do tipo I A partir dos componentes acima mencionados, um método de transplante da mistura do PRP com a solução de cloreto de cálcio e o colágeno do tipo I pode ser realizado.

Primeiramente, 1) Uma seringa carregada com 1 mL de PRP é conectada a uma seringa carregada com uma solução de cloreto de sódio com uma concentração de 0,30~0,55 mg/mL através do conector de três vias, e os materiais são misturados uma vez.

Em outras palavras, a Figura 2 mostra fotografias de 1 mL 5 de PRP separado do sangue total em mistura com uma solução de cloreto de cálcio e colágeno do tipo I, sendo que na Figura 2(a) a solução de cloreto de cálcio é incluída em uma quantidade de 0,25 mg/mL, na Figura 2(b) a solução de cloreto de cálcio é incluída em uma quantidade de 0,3 mg/mL, e na Figura 2(c) a solução de cloreto de cálcio é incluída em uma quantidade de 0,5 mg/mL.

Na 10 presente invenção, para a agregação das plaquetas da mistura da solução de cloreto de cálcio e do colágeno do tipo I, a concentração otimizada de cloreto de cálcio se situa preferencialmente na faixa de 0,30 a 0,55 mg/mL.

Um íon de cálcio (Ca2+) como componente de uma solução de cloreto de cálcio desempenha o papel de converter a solubilidade em 15 não-solubilidade na coagulação do sangue.

Esta característica do íon de cálcio (Ca2+) induz a agregação de plaquetas da mistura de 1 mL do PRP separado e do colágeno do tipo I.

Então, se a concentração da solução de cloreto de cálcio para a agregação das plaquetas for de 0,25 mg/mL ou menor, a agregação de plaquetas não acontece.

Por outro lado, se a concentração for de 0,55 mg/mL ou 20 maior, danos celulares acontecem em função da pressão osmótica. 2) O colágeno do tipo I com uma concentração de 20~50 mg/mL é mantido em temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos para transformar o colágeno solúvel em colágeno fibrilar.

A razão para que o colágeno I seja mantido em temperatura ambiente é a seguinte: em primeiro lugar, o 25 colágeno do tipo I é aquecido para que o colágeno do tipo I em um estado de colágeno solúvel possa ser fibrilar-colagenado; em segundo lugar, dificilmente existe qualquer diferença na quantidade de fatores de crescimento liberados entre a mistura do colágeno fibrilar-colagenado do tipo I com o PRP e a mistura do colágeno do tipo I em estado de colágeno solúvel com o PRP; e em terceiro lugar, 30 de modo geral, o colágeno fibrilar-colagenado do tipo I pode induzir mais eficientemente a agregação das plaquetas e suportar a adesão das plaquetas do que o colágeno solúvel. 3) Uma seringa carregada com 1 mL de PRP com a solução de cloreto de cálcio é conectada à mesma quantidade do colágeno fibrilar do tipo I com uma concentração de 20~50 mg/mL através do conector de três vias, e os materiais são misturados uns com os outros por quatro vezes. 4) A mistura do PRP, da solução de cloreto de cálcio e do colágeno do tipo I, carregada em uma seringa, é injetada em todas as regiões que 5 necessitam de regeneração de tecidos em casos tais como tratamento de defeitos ósseos e cura de ferimentos.

Exemplo 3 1) A mistura do PRP, da solução de cloreto de cálcio e do colágeno do tipo I, carregada em uma seringa, é carregada em um tubo de vidro 10 de fundo redondo. 2) A mistura é colocada em cultura a 37°C em uma incubadora durante 15 minutos, e coagulada.

Nesta etapa, durante a cultura da mistura a 37°C em uma incubadora, é possível obter a mesma condição da mistura transplantada e coagulada em uma região de tecidos. 15 3) A mistura coagulada é colocada em um vaso de cultura esterilizado com 24 recipientes em conjunto com 1 mL de DMEM, e colocada em cultura a 37°C em uma incubadora.

Através do método acima descrito, 10 mL do sangue total são coletados de um paciente e sujeitados a duas etapas de centrifugação para a 20 obtenção de 1 mL de PRP concentrado.

O PRP é primeiramente misturado com uma solução de cloreto de cálcio e depois misturado com o colágeno do tipo I.

Então, a mistura é transplantada para todas as regiões que necessitam de regeneração de tecidos nos casos tais como tratamento de defeitos ósseos e cura de ferimentos.

Neste método, não existe rejeição clínica.

Também é possível 25 separar o PRP, misturar o PRP com o colágeno do tipo I, e transplantar a mistura em um curto período de tempo.

Consequentemente, é possível induzir efetivamente uma rápida regeneração de tecidos no tratamento de defeitos ósseos e cura de ferimentos.

A Figura 3 mostra, especificamente, culturas nas quais o 30 PRP separado foi ativado com a trombina e o colágeno do tipo I, e um meio de cultura foi colocado em cultura em uma incubadora a 5% de CO2 (37°C). Após 15 dias, a maior parte da mistura convencional da trombina (A) foi degradada.

Por outro lado, a mistura inventiva do colágeno (B) manteve seu formato inicial com poucas mudanças de tamanho durante os 15 dias.

Na composição inventiva para a indução da regeneração de tecidos com a ativação do PRP, e no método de manufatura da mesma, o espírito técnico atual pode ser obtido de modo repetitivo com os mesmos resultados.

Especificamente, a realização da invenção pode facilitar o 5 desenvolvimento técnico e contribuir para o desenvolvimento industrial.

Consequentemente, a invenção possui mérito de proteção.

Deve ser entendido que qualquer ordem específica ou hierarquia de etapas em qualquer processo revelado consiste de um exemplo de uma abordagem de amostra.

Baseado em preferências de desenho, deve ser 10 entendido que a ordem específica ou a hierarquia das etapas dos processos pode ser rearranjada enquanto permanecer situada no escopo da presente revelação.

As reivindicações anexas do método apresentam os elementos das várias etapas em uma ordem de amostra, e não devem ser limitadas à ordem específica ou à hierarquia das etapas apresentadas. 15 Embora a invenção tenha sido descrita em relação a vários aspectos, deve ser entendido que a invenção pode ser submetida a modificações adicionais.

Esta aplicação tem o propósito de cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção, seguindo, de modo geral, os princípios da invenção, e considerando as variações da presente revelação como 20 fazendo parte da prática conhecida e usual da arte à qual a invenção pertence.

Claims (7)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÃO PARA

INDUZIR A REGENERAÇÃO DE TECIDOS ATRAVÉS DA ATIVAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP), o método caracterizado pelo fato de 5 compreender as etapas de: separar o PRP do sangue total; misturar o PRP com uma solução de cloreto de cálcio; e misturar a mistura do PRP e a solução de cloreto de cálcio com colágeno do tipo I. 10

2. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de separação do PRP do sangue total compreende as etapas de: coletar 10 mL do sangue total de um animal ou de um paciente em um tubo de ensaio a vácuo contendo 3,2% de citrato de sódio, e de 15 centrifugar primeiramente o sangue total (1.750~1.900 g) durante 3 a 5 minutos; coletar o líquido sobrenadante (camada de plasma) incluindo a capa leucocitária através da mencionada centrifugação; transferir o líquido sobrenadante (camada de plasma) incluindo a capa leucocitária a um novo tubo de ensaio a vácuo com o auxílio de 20 uma agulha cega, e centrifugá-lo uma segunda vez (4.500~5.000 g) durante 4 a 6 minutos; e coletar o PRP concentrado em uma camada do fundo (do fundo até a uma altura aproximada de 1 mL do tubo de ensaio) com o auxílio de uma agulha cega. 25

3. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa de mistura do PRP com a solução de cloreto de cálcio, aproximadamente 1 mL do PRP coletado na etapa de separação do PRP do sangue total é misturado uma vez com uma solução de cloreto de cálcio com uma concentração de 0,30~0,55 mg/mL através de um conector de 30 três vias.

4. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de misturar o PRP e a solução de cloreto de cálcio com colágeno do tipo I compreende as etapas de: manter o colágeno do tipo I em temperatura ambiente;

misturar a mistura do PRP e a solução de cloreto de cálcio com colágeno do tipo I com uma concentração de 20~50 mg/mL, em uma fase opaca, quatro vezes através da conexão com o conector de três vias; e injetar a mistura do PRP e do colágeno do tipo I, 5 carregada em uma seringa, em todas as regiões que necessitam de regeneração de tecidos, nos casos de tratamento de defeitos ósseos e cura de ferimentos.

5. MÉTODO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o colágeno do tipo I apresenta uma concentração de 20~50 mg/mL. 10

6. MÉTODO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o colágeno do tipo I é mantido em temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos.

7. COMPOSIÇÃO PARA INDUZIR A REGENERAÇÃO

DE TECIDOS ATRAVÉS DA ATIVAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS 15 (PRP), produzida pelo método de acordo com a reivindicação 1.