TW201936627A - 具有高活化細胞因子的血清之備製方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種具有高活化細胞因子的血清之備製方法，包含：自體血液、抗凝血劑置入至少一試管之中；將該至少一試管置入一離心機之中，進行離心程序；取出該至少一試管之中的血小板濃厚血漿；將該血小板濃厚血漿置入含有血小板刺破珠粒的第二試管之中，並將該第二試管置於一試管震盪器之中，進行震盪；將該第二試管置入該離心機之中，進行第二離心程序；取出該第二試管中之血漿，透過一過濾器以過濾該血漿。

Description

具有高活化細胞因子的血清之備製方法

本發明有關於一種血清之備製，特別是關於一種具有高活化細胞因子的血清之備製方法。

血液是由紅血球、白血球、血漿及血小板這四大元素所組成，每個元素都有特定的功效。長久以來，血小板在血液中一直被認為只有凝血、止血的功能，但是最近幾年的醫學研究，發現血小板可調節人體內的代謝、幫助組織修復與癒合的功能。

在人體的組織修復生長因子注射方法之中，使用血小板濃厚血漿(Platelet-rich plasma,PRP)在受損或退化的組織部位進行注射，以試圖達到修復組織損傷、及恢復功能的目的。注射前會使用貼布式皮膚麻醉劑及局部麻醉細針進行皮膚麻醉，使注射時的疼痛減至最少。組織修復生長因子注射方法的併發症極少，是相對安全的治療方式。

血小板濃厚血漿係根據自體血液中各組成成份的沉降係數不同，透過梯度離心法將血小板濃厚血漿從血液中分離出來的血小板濃縮物。然而，目前尚無統一的製備方法；因不同離心次數、離心力、離心時間以及血小板不同的啟動方式所製備的血小板濃厚血漿中，其血小板數量、各種生長因子濃度、白細胞的數量各不相同，且各種手術方式應用血小板濃厚血漿的時間亦產生不同的生物效應，因此產生了對血小板濃厚血漿生物效應的分歧。隨著醫學技術的不斷發展，目前已有多種技術能夠快速產生安全的血小板濃厚血漿，並且於臨床研究、檢驗、外科手術、醫學美容、骨科手術、毛髮再生、運動傷害治療、 加速燒燙傷口的癒合等領域都有很大的應用。

就目前已知的血液成份分離技術而言，主要以梯度離心技術最為普遍，其作業上係利用血液成份的沉降係數差異之特性，將血液分離為血漿層、血小板濃厚血漿、血球等三層不同成份。

惟，血小板濃厚血漿的製備方法於目前並無統一標準，不同方法所製備的血小板濃厚血漿生長因子濃度差異大、所含生長因子數量、生長因子之相互作用機制等仍不明確的因素。並且傳統製作的血小板濃厚血漿不能同時治療發炎和退化，因此，有進一步改善的空間。

本發明所提出之具有高活化細胞因子的血清之備製方法，可以改善傳統製作的血小板濃厚血漿所無法達到的治療功效。

本發明之目的為備製高活化細胞因子的血清，其優點為血清中可同時包含生長因子與IL-Ra，優化傳統相關技術。

在本發明中，一種具有高活化細胞因子的血清之備製方法，包含：自體血液、抗凝血劑置入至少一試管之中；然後，將該至少一試管置入一離心機之中，進行離心程序；之後，取出該至少一試管之中的血小板相對濃厚血漿；接下來，將該血小板相對濃厚血漿置入含有血小板刺破珠粒的第二試管之中，並將該第二試管置於一試管震盪器之中，進行震盪；然後，將該第二試管置入該離心機之中，進行第二離心程序；最後，取出該第二試管中之血漿，透過一過濾器以過濾該第二離心程序後血漿。

其中該抗凝血劑為檸檬酸鹽。更進一步來說，上述方法更包含於該至少一試管之中加入活化劑。活化劑為鈣離子。其中該血小板刺破珠粒為聚丙烯醯胺珠粒。

在另一觀點之中，一種具有高活化細胞因子的血清之備製方法， 包含：自體血液、抗凝血劑置入至少一試管之中；然後，將該至少一試管置入一離心機之中，進行離心程序；之後，取出該至少一試管之中的血小板相對濃厚血漿；接下來，將該血小板相對濃厚血漿置入含有血小板刺破珠粒的第二試管之中，並將該第二試管置於一試管震盪器之中，進行震盪；然後，將該第二試管置入該離心機之中，進行第二離心程序；最後，取出該第二試管中之血漿，透過一過濾器以過濾該第二離心程序後血漿。

此些優點及其他優點從以下較佳實施例之敘述及申請專利範圍將使讀者得以清楚了解本發明。

100‧‧‧步驟

102‧‧‧步驟

104‧‧‧步驟

106‧‧‧步驟

108‧‧‧步驟

110‧‧‧步驟

112‧‧‧步驟

第一圖顯示具有高活化細胞因子(cytokine)的血清之製作方法流程圖。

此處本發明將針對發明具體實施例及其觀點加以詳細描述，此類描述為解釋本發明之結構或步驟流程，其係供以說明之用而非用以限制本發明之申請專利範圍。因此，除說明書中之具體實施例與較佳實施例外，本發明亦可廣泛施行於其他不同的實施例中。

說明書中所述一實施例指的是一特定被敘述與此實施例有關之特徵、方法或者特性被包含在至少一些實施例中。因此，一實施例或多個實施例之各態樣之實施不一定為相同實施例。此外，本發明有關之特徵、方法或者特性可以適當地結合於一或多個實施例之中。

在本發明中，具有高活化細胞因子(cytokine)的血清之備製方法包括底下幾個步驟。

步驟100：抽取自體血液，分別置入二個內含抗凝血劑之試管之中。在此步驟中，抽取病人的自體血液，例如16到24cc(毫升)，以8到12cc而分別置入一試管之中。由抽血者體內採集全血，包含紅血球濃厚液、乏血小 板液(Platelet-poor plasma,PPP)、冷凍血漿、冷凍沉澱品、血小板濃厚液、白血球濃厚液等供病患輸用。

在此步驟中，將抗凝血劑置入試管之中，以防止取出的血液於試管之中凝固，影響後續的分離。舉例而言，每一試管之中含有10cc的全血，試管中含有抗凝血劑的量約為0.35~0.65cc。在一例子中，抗凝血劑可以預先置入於試管之中，意即將前述抽取的自體血液置入內含抗凝血劑的試管之中。在另一例子中，抽取的自體血液置入二個試管之中，再將抗凝血劑分別置入二個試管之中。抗凝血劑例如為檸檬酸鹽(citrate)。

步驟102：將二個試管置入一離心機之中。在前述的階段，由抽血者體內抽取全血，分別置入二試管之中，加入抗凝血劑之後，全血之中的血液經由成分離分機進行成分分離。以適當的離心程序分離全血之各項血品，其中分離的血品包含紅血球濃厚液、乏血小板液、冷凍沉澱品、血小板濃厚液、白血球濃厚液等。舉例而言，離分機為水平離心機。離心程序之中，以每分鐘2000~2500轉的轉速，快速轉動、大約離心10~15分鐘，以進行各項血品的分離程序。

步驟104：抽取二個試管之中的血小板濃厚血漿(Platelet-rich plasma,PRP)。在離心機的離心程序之後，只分別取出二個試管之中的血小板濃厚血漿，其中不包含乏血小板血漿(Platelet-poor plasma,PRP)以及其他成分，以利於進行後續的血清之萃取。取出的血小板濃厚血漿(PRP)約為2.5~3.0cc。血小板濃厚血漿(PRP)含有豐富的生長因子(Growth factors)，可活化細胞，促進細胞修補受損組織，並抑制疼痛。

步驟106：合併二個試管之中的血小板濃厚血漿(PRP)，並加入活化劑(Activator)。在此步驟之中，合併的血小板濃厚血漿(PRP)溶合在一起，並加入活化劑於其中，以進行進一步的血小板濃厚血漿(PRP)活化作用。在血小板濃厚血漿(PRP)的例子中，活化劑作為增加物質活化作用的藥劑。活化劑例如為鈣離子。換言之，加入鈣離子可以活化血小板濃厚血漿(PRP)。在本實施例中，二個試管合幷的血小板濃厚血漿(PRP)的量約為5.0~6.0cc，加入鈣離子約為 0.35~0.65cc。

步驟108：將合併的血小板濃厚血漿(PRP)置入含有血小板刺破珠粒(beads)的試管之中，並置於一試管震盪器之中。在一例子中，合併的血小板濃厚液置於溫度20至24℃的環境，靜置1小時後，再進行試管震盪器的搖盪。在本步驟之中，試管之中內含有用於刺破血小板的珠粒。血小板刺破珠粒例如為聚丙烯醯胺珠粒(polyacrylamide beads)。因此，在含有聚丙烯醯胺珠粒的試管之中，原有的血小板濃厚血漿與鈣離子係接觸於試管中的聚丙烯醯胺珠粒。舉例而言，試管中的聚丙烯醯胺珠粒約為8~12cc。將試管置於震盪器之上，搖晃混合約4~6分鐘。在試管震盪器之中，例如超音波震盪器，經過超音波震盪處理步驟，可以快速讓血小板之胞體瓦解(細胞膜破裂)，而使其釋放高活化之細胞因子(cytokine)。

從上述可知，在本發明中，經過試管震盪器(超音波震盪)處理，可以得到最佳活化之細胞因子。細胞因子是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產生的低分子量可溶性蛋白質，具有調節固有免疫和適應性免疫、血細胞生成、細胞生長以及損傷組織修復等多種功能。細胞因子可被分為介白素(Interleukin)、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。衆多細胞因子在體內通過旁分泌、自分泌或內分泌等方式發揮作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、協同性等多種生理特性，形成了十分複雜的細胞因子調節網絡，參與人體多種重要的生理功能。

步驟110：將含有血小板刺破珠粒(beads)與合併的PRP之試管，置入一離心機之中。接下來，在試管震盪器的血小板濃厚血漿(PRP)細胞膜破裂程序之後，再進行離心機的分離程序。將試管置入離心機內，以每分鐘4000~6000轉的轉速，快速轉動、大約離心8~12分鐘，以進行分離程序，可獲得紫色桿菌素的濃度。

換言之，含有珠粒與血小板濃厚血漿之試管置放於震盪器進行均勻混合以刺破血小板，然後再置放於離心機之中進行離心程序，可以取得高活化細胞因子之血漿。

步驟112：抽出血漿，透過一過濾器以過濾血漿。最後，利用一長針頭，抽取出血漿，並透過一過濾器以過濾上述離心機所分離之血漿，以萃取具有高活化細胞因子之血清。血清(Serum)係指血液中既不含血細胞(血清不含紅血球和白血球)、也不含凝血因子的成分，也就是除去纖維蛋白原的血漿。過濾器例如為0.15~0.30微米的過濾，以過濾血漿，而得到純粹的血清；此血清即可以注入人體。

介白素1造成過度發炎反應引起關節疼痛。關節炎退化的最主要原因，是因為發炎反應時，受刺激活化的免疫細胞釋出大量激素介白素1。此發炎細胞激素介白素1會促使免疫細胞大量進入關節腔，造成關節局部區域的發炎和退化。介白素1也會造成軟骨的破壞。當患部處於長期發炎的狀態下，過多的介白素1使組織無法進行再生和修復，造成關節疼痛症狀。

舉一實例而言，人體的血清之中具有一種蛋白質，稱為介白素1受體拮抗劑(IL-1Ra)，是介白素1(IL1)的天然抑制劑。本發明之方法所製作之血清之中即含有介白素1受體拮抗劑(IL-1Ra)，其中介白素1受體拮抗劑(IL-1Ra)會取代掉介白素1(IL1)和細胞上受體的結合，抑制發炎反應，使受損的組織能進行傷口癒合和再生。實驗證實，經過1~3個小時的培育之後，本發明所製作之血清之中介白素1受體拮抗劑(IL-1Ra)量，在1小時之後增加了3倍，而在3小時之後更增加了4.5倍。

從表一可以了解，本發明所製作之血清與傳統的PRP之差異。本發明所萃取之血清，由於血清之中含有生長因子和IL-Ra，因此可以提供治療發炎、疼痛和關節退化之所需。意即，含有介白素1受體拮抗劑(IL-1Ra)之血清即可以注入人體的膝蓋，與自體的血液作用，刺激免疫細胞產生更多的介白素1 受體拮抗劑(IL-1Ra),IL-1Ra競爭掉IL-1，以抑制發炎反應，使關節進行再生作用，達到治療的效果。

因此，本發明之血漿經由離心、震盪(超音波震盪處理)、血小板濃厚血漿(PRP)細胞膜破裂..等一系列的程序之後，產生的血清含有生長因子和IL-Ra，血清之細胞因子活性可以大大地提升。

一實施例為本發明之一實作或範例。說明書中所述一實施例、一個實施例、某些實施例或其他實施例指的是一特定被敘述與此實施例有關之特徵，結構，或者特質被包含在至少一些實施例中，但未必於所有實施例。而各態樣之實施例不一定為相同實施例。其中應被理解的是在本發明實施例描述中，各特徵有時會組合於一實施例之圖、文字描述中，其目的為簡化本發明技術特徵，有助於了解本發明各方面之實施方式。除描述於此之外，可藉由敘述於本發明中之實施例及實施方式所達成之不同改良方式，皆應涵蓋於本發明之範疇中。因此，揭露於此之圖式及範例皆用以說明而非用以限制本發明，本發明之保護範疇僅應以列於其後之申請專利範圍為主。

Claims (10)

1. 一種具有高活化細胞因子的血清之備置方法，包含：自體血液、抗凝血劑置入至少一試管之中；將該至少一試管置入一離心機之中，進行離心程序；取出該至少一試管之中的血小板相對濃厚血漿；將該血小板相對濃厚血漿置入含有血小板刺破珠粒的第二試管之中，並將該第二試管置於一試管震盪器之中，進行震盪；將該第二試管置入該離心機之中，進行第二離心程序；以及取出該第二試管中之血漿，透過一過濾器以過濾該第二離心程序後血漿。
2. 如請求項1所述具有高活化細胞因子的血清之製作方法，其中該抗凝血劑為檸檬酸鹽。
3. 如請求項1或2所述具有高活化細胞因子的血清之製作方法，更包含於該至少一試管之中加入活化劑。
4. 如請求項3所述之具有高活化細胞因子的血清之製作方法，其中該活化劑為鈣離子。
5. 如請求項1所述之具有高活化細胞因子的血清之製作方法，其中該血小板刺破珠粒為聚丙烯醯胺珠粒。
6. 一種具有高活化細胞因子的血清之備製方法，包含：自體血液、抗凝血劑分別置入第一試管與第二試管之中； 將該第一試管與該第二試管置入一離心機之中，進行離心程序；分別取出該第一試管與該第二試管之中的血小板相對濃厚血漿，並混合該第一試管與該第二試管之中的該血小板相對濃厚血漿；將該混合的血小板相對濃厚血漿置入含有血小板刺破珠粒的第三試管之中，並將該第三試管置於一試管震盪器之中，進行震盪；將該第三試管置入該離心機之中，進行第二離心程序；以及取出該第三試管中之血漿，透過一過濾器以過濾該第二離心程序後血漿。
7. 如請求項6所述具有高活化細胞因子的血清之製作方法，其中該抗凝血劑為檸檬酸鹽。
8. 如請求項6或7所述具有高活化細胞因子的血清之製作方法，更包含於該第一試管與該第二試管之中加入活化劑。
9. 如請求項8所述之具有高活化細胞因子的血清之製作方法，其中該活化劑為鈣離子。
10. 如請求項6所述之具有高活化細胞因子的血清之製作方法，其中該血小板刺破珠粒為聚丙烯醯胺珠粒。