CN110193024A - 具有高活化细胞因子的血清的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有高活化细胞因子的血清的制备方法，其特征在于包含：自体血液、抗凝血剂置入至少一试管中；将该至少一试管置入一离心机中，进行离心程序；取出该至少一试管中的血小板浓厚血浆；将该血小板浓厚血浆置入含有血小板刺破珠粒的第二试管中，并将该第二试管置于一试管震荡器中，进行震荡；将该第二试管置入该离心机中，进行第二离心程序；取出该第二试管中的血浆，透过一过滤器以过滤该血浆。
Description
技术领域
本发明关于一种血清的制备方法，特别涉及一种具有高活化细胞因子的血清的制备方法。
背景技术
血液是由红血球、白血球、血浆及血小板这四大组成单元所组成，每个组成单元都有特定的功效。长久以来，血小板在血液中一直被认为只有凝血、止血的功能，但是最近几年的医学研究，发现血小板可调节人体内的代谢、帮助组织修复与愈合的功能。
在人体的组织修复生长因子注射方法中，使用血小板浓厚血浆(Platelet-richplasma,PRP)在受损或退化的组织部位进行注射，以试图达到修复组织损伤、及恢复功能的目的。注射前会使用贴布式皮肤麻醉剂及局部麻醉细针进行皮肤麻醉，使注射时的疼痛减至最少。组织修复生长因子注射方法的并发症极少，是相对安全的治疗方式。
血小板浓厚血浆是根据自体血液中各组成成份的沉降系数不同，透过梯度离心法将血小板浓厚血浆从血液中分离出来的血小板浓缩物。然而，目前尚无统一的制备方法；因不同离心次数、离心力、离心时间以及血小板不同的启动方式所制备的血小板浓厚血浆中，其血小板数量、各种生长因子浓度、白细胞的数量各不相同，且各种手术方式应用血小板浓厚血浆的时间亦产生不同的生物效应，因此产生了对血小板浓厚血浆生物效应的分歧。随着医学技术的不断发展，目前已有多种技术能够快速产生安全的血小板浓厚血浆，并且于临床研究、检验、外科手术、医学美容、骨科手术、毛发再生、运动伤害治疗、加速烧烫伤口的愈合等领域都有很大的应用。
就目前已知的血液成份分离技术而言，主要以梯度离心技术最为普遍，其作业上是利用血液成份的沉降系数差异的特性，将血液分离为血浆层、血小板浓厚血浆、血球等三层不同成份。
但是，血小板浓厚血浆的制备方法在目前并无统一标准，不同方法所制备的血小板浓厚血浆生长因子浓度差异大、所含生长因子数量、生长因子的相互作用机制等仍不明确的因素。并且传统制作的血小板浓厚血浆不能同时治疗发炎和退化，因此，有进一步改善的空间。
本发明所提出的具有高活化细胞因子的血清的制备方法，可以改善传统制作的血小板浓厚血浆所无法达到的治疗功效。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于制备高活化细胞因子的血清，其优点为血清中可同时包含生长因子与IL-Ra，优化传统相关技术。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种具有高活化细胞因子的血清的制备方法，包含：自体血液、抗凝血剂置入至少一试管中；然后，将该至少一试管置入一离心机中，进行离心程序；之后，取出该至少一试管中的血小板相对浓厚血浆；接下来，将该血小板相对浓厚血浆置入含有血小板刺破珠粒的第二试管中，并将该第二试管置于一试管震荡器中，进行震荡；然后，将该第二试管置入该离心机中，进行第二离心程序；最后，取出该第二试管中的血浆，透过一过滤器以过滤该第二离心程序后血浆。
其中该抗凝血剂为柠檬酸盐。更进一步来说，上述方法更包含于该至少一试管中加入活化剂。活化剂为钙离子。其中该血小板刺破珠粒为聚丙烯酰胺珠粒。
根据本发明的一观点，一种具有高活化细胞因子的血清的制备方法，包含：自体血液、抗凝血剂置入至少一试管中；然后，将该至少一试管置入一离心机中，进行离心程序；之后，取出该至少一试管中的血小板相对浓厚血浆；接下来，将该血小板相对浓厚血浆置入含有血小板刺破珠粒的第二试管中，并将该第二试管置于一试管震荡器中，进行震荡；然后，将该第二试管置入该离心机中，进行第二离心程序；最后，取出该第二试管中的血浆，透过一过滤器以过滤该第二离心程序后血浆。
这些优点及其它优点从以下较佳实施例的叙述及权利要求将使读者得以清楚了解本发明。
附图说明
图1显示具有高活化细胞因子(cytokine)的血清的制作方法流程图。
主要部件附图标记：
步骤100、步骤102、步骤104、步骤106、步骤108、步骤110、步骤112。
具体实施方式
此处本发明将针对发明具体实施例及其观点加以详细描述，此类描述为解释本发明的结构或步骤流程，其供以说明之用而非用以限制本发明的权利要求。因此，除说明书中的具体实施例与较佳实施例外，本发明亦可广泛施行于其它不同的实施例中。以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可通过本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的功效性与其优点。且本发明亦可通过其它具体实施例加以运用及实施，本说明书所阐述的各项细节亦可基于不同需求而应用，且在不悖离本发明的精神下进行各种不同的修饰或变更。
说明书中所述一实施例指的是一特定被叙述与此实施例有关的特征、方法或者特性被包含在至少一些实施例中。因此，一实施例或多个实施例的各方式的实施不一定为相同实施例。此外，本发明有关的特征、方法或者特性可以适当地结合于一或多个实施例中。
本发明中，具有高活化细胞因子(cytokine)的血清的制备方法包括底下几个步骤。
步骤100：抽取自体血液，分别置入二个内含抗凝血剂的试管中。在此步骤中，抽取病人的自体血液，例如16到24cc(毫升)，以8到12cc而分别置入一试管中。由抽血者体内采集全血，包含红血球浓厚液、乏血小板液(Platelet-poor plasma,PPP)、冷冻血浆、冷冻沉淀品、血小板浓厚液、白血球浓厚液等供病患输用。
在此步骤中，将抗凝血剂置入试管中，以防止取出的血液于试管中凝固，影响后续的分离。举例而言，每一试管中含有10cc的全血，试管中含有抗凝血剂的量约为0.35～0.65cc。在一例子中，抗凝血剂可以预先置入于试管中，意即将前述抽取的自体血液置入内含抗凝血剂的试管中。在另一例子中，抽取的自体血液置入二个试管中，再将抗凝血剂分别置入二个试管中。抗凝血剂例如为柠檬酸盐(citrate)。
步骤102：将二个试管置入一离心机中。在前述的阶段，由抽血者体内抽取全血，分别置入二试管中，加入抗凝血剂后，全血中的血液经由成分分离机进行成分分离。以适当的离心程序分离全血的各项血品，其中分离的血品包含红血球浓厚液、乏血小板液、冷冻沉淀品、血小板浓厚液、白血球浓厚液等。举例而言，分离机为水平离心机。离心程序中，以每分钟2000～2500转的转速，快速转动、大约离心10～15分钟，以进行各项血品的分离程序。
步骤104：抽取二个试管中的血小板浓厚血浆(Platelet-rich plasma,PRP)。在离心机的离心程序之后，只分别取出二个试管中的血小板浓厚血浆，其中不包含乏血小板血浆(Platelet-poor plasma,PRP)以及其它成分，以利于进行后续的血清的萃取。取出的血小板浓厚血浆(PRP)约为2.5～3.0cc。血小板浓厚血浆(PRP)含有丰富的生长因子(Growthfactors)，可活化细胞，促进细胞修补受损组织，并抑制疼痛。
步骤106：合并二个试管中的血小板浓厚血浆(PRP)，并加入活化剂(Activator)。在此步骤中，合并的血小板浓厚血浆(PRP)溶合在一起，并加入活化剂于其中，以进行进一步的血小板浓厚血浆(PRP)活化作用。在血小板浓厚血浆(PRP)的例子中，活化剂作为增加物质活化作用的药剂。活化剂例如为钙离子。换言之，加入钙离子可以活化血小板浓厚血浆(PRP)。在本实施例中，二个试管合并的血小板浓厚血浆(PRP)的量约为5.0～6.0cc，加入钙离子约为0.35～0.65cc。
步骤108：将合并的血小板浓厚血浆(PRP)置入含有血小板刺破珠粒(beads)的试管中，并置于一试管震荡器中。在一例子中，合并的血小板浓厚液置于温度20至24℃的环境，静置1小时后，再进行试管震荡器的摇荡。在本步骤中，试管中内含有用于刺破血小板的珠粒。血小板刺破珠粒例如为聚丙烯酰胺珠粒(polyacrylamide beads)。因此，在含有聚丙烯酰胺珠粒的试管中，原有的血小板浓厚血浆与钙离子接触于试管中的聚丙烯酰胺珠粒。举例而言，试管中的聚丙烯酰胺珠粒约为8～12cc。将试管置于震荡器上，摇晃混合约4～6分钟。在试管震荡器中，例如超音波震荡器，经过超音波震荡处理步骤，可以快速让血小板的胞体瓦解(细胞膜破裂)，而使其释放高活化的细胞因子(cytokine)。
从上述可知，在本发明中，经过试管震荡器(超音波震荡)处理，可以得到最佳活化的细胞因子。细胞因子是免疫原、丝裂原或其它刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白介素(Interleukin)、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。众多细胞因子在体内通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性，形成了十分复杂的细胞因子调节网络，参与人体多种重要的生理功能。
步骤110：将含有血小板刺破珠粒(beads)与合并的PRP的试管，置入一离心机中。接下来，在试管震荡器的血小板浓厚血浆(PRP)细胞膜破裂程序之后，再进行离心机的分离程序。将试管置入离心机内，以每分钟4000～6000转的转速，快速转动、大约离心8～12分钟，以进行分离程序，可获得紫色杆菌素的浓度。
换言之，含有珠粒与血小板浓厚血浆的试管置放于震荡器进行均匀混合以刺破血小板，然后再置放于离心机中进行离心程序，可以取得高活化细胞因子的血浆。
步骤112：抽出血浆，透过一过滤器以过滤血浆。最后，利用一长针头，抽取出血浆，并透过一过滤器以过滤上述离心机所分离的血浆，以萃取具有高活化细胞因子的血清。血清(Serum)是指血液中既不含血细胞(血清不含红血球和白血球)、也不含凝血因子的成分，也就是除去纤维蛋白原的血浆。过滤器例如为0.15～0.30微米的过滤，以过滤血浆，而得到纯粹的血清；此血清即可以注入人体。
白介素1是造成过度发炎反应引起关节疼痛。关节炎退化的最主要原因，是因为发炎反应时，受刺激活化的免疫细胞释出大量激素白介素1。此发炎细胞激素白介素1会促使免疫细胞大量进入关节腔，造成关节局部区域的发炎和退化。白介素1也会造成软骨的破坏。当患部处于长期发炎的状态下，过多的白介素1使组织无法进行再生和修复，造成关节疼痛症状。
举一实例而言，人体的血清中具有一种蛋白质，称为白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)，是白介素1(IL1)的天然抑制剂。本发明的方法所制作的血清中即含有白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)，其中白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)会取代掉白介素1(IL1)和细胞上受体的结合，抑制发炎反应，使受损的组织能进行伤口愈合和再生。实验证实，经过1～3个小时的培育之后，本发明所制作的血清中白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)量，在1小时之后增加了3倍，而在3小时之后更增加了4.5倍。
表1
| 本发明制作的血清 | 传统的血小板浓厚血浆(PRP) |
| 血清中含有生长因子和IL-Ra | 血浆中只有生长因子，没有IL-Ra |
| 可治疗发炎、疼痛和关节退化 | 不能治疗发炎和退化 |
从表1可以了解，本发明所制作的血清与传统的PRP的差异。本发明所萃取的血清，由于血清中含有生长因子和IL-Ra，因此可以提供治疗发炎、疼痛和关节退化所需。意即，含有白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)的血清即可以注入人体的膝盖，与自体的血液作用，刺激免疫细胞产生更多的白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)，IL-1Ra竞争掉IL-1，以抑制发炎反应，使关节进行再生作用，达到治疗的效果。
因此，本发明的血浆经由离心、震荡(超音波震荡处理)、血小板浓厚血浆(PRP)细胞膜破裂……等一系列的程序之后，产生的血清含有生长因子和IL-Ra，血清的细胞因子活性可以大大地提升。
一实施例为本发明之一操作或范例。说明书中所述一实施例、一个实施例、某些实施例或其它实施例指的是一特定被叙述与此实施例有关的特征，结构，或者特质被包含在至少一些实施例中，但未必于所有实施例。而各方式的实施例不一定为相同实施例。其中应被理解的是在本发明实施例描述中，各特征有时会组合于一实施例的图、文字描述中，其目的为简化本发明技术特征，有助于了解本发明各方面的实施方式。除描述于此之外，可通过叙述于本发明中的实施例及实施方式所达成的不同改良方式，皆应涵盖于本发明的范畴中。因此，揭露于此的图式及范例皆用以说明而非用以限制本发明，本发明的保护范畴仅应包含在前述的权利要求内。
Claims (10)
1.一种具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，包含：
自体血液、抗凝血剂置入至少一试管中；
将所述至少一试管置入一离心机中，进行离心程序；
取出所述至少一试管中的血小板相对浓厚血浆；
将所述血小板相对浓厚血浆置入含有血小板刺破珠粒的第二试管中，并将所述第二试管置于一试管震荡器中，进行震荡；
将所述第二试管置入所述离心机中，进行第二离心程序；以及
取出所述第二试管中的血浆，透过一过滤器以过滤所述第二离心程序后血浆。
2.如权利要求1所述具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，所述抗凝血剂为柠檬酸盐。
3.如权利要求1或2所述具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，更包含于所述至少一试管中加入活化剂。
4.如权利要求3所述具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，所述活化剂为钙离子。
5.如权利要求1所述具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，所述血小板刺破珠粒为聚丙烯酰胺珠粒。
6.一种具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，包含：
自体血液、抗凝血剂分别置入第一试管与第二试管中；
将所述第一试管与所述第二试管置入一离心机中，进行离心程序；
分别取出所述第一试管与所述第二试管中的血小板相对浓厚血浆，并混合所述第一试管与所述第二试管中的所述血小板相对浓厚血浆；
将所述混合的血小板相对浓厚血浆置入含有血小板刺破珠粒的第三试管中，并将所述第三试管置于一试管震荡器中，进行震荡；
将所述第三试管置入所述离心机中，进行第二离心程序；以及
取出所述第三试管中的血浆，透过一过滤器以过滤所述第二离心程序后血浆。
7.如权利要求6所述具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，所述抗凝血剂为柠檬酸盐。
8.如权利要求6或7所述具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，更包含于所述第一试管与所述第二试管中加入活化剂。
9.如权利要求8所述具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，所述活化剂为钙离子。
10.如权利要求6所述具有细胞因子的血清的制作方法，其特征在于，所述血小板刺破珠粒为聚丙烯酰胺珠粒。
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