CN104147595A

CN104147595A - 自体细胞生长因子制剂、制备方法及其制备用途

Info

Publication number: CN104147595A
Application number: CN201410433745.7A
Authority: CN
Inventors: 姜红江; 谭训香
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2014-11-19

Abstract

本发明公开了一种自体细胞生长因子制剂，其特征在于组成成分是由多种细胞生长因子和强力霉素组成，所述多种细胞生长因子包括血管内皮细胞生长因子、转化细胞生长因子和成纤维细胞生长因子，向多种细胞生长因子中加入强力霉素，通过过滤加入强力霉素的多种细胞生长因子，得到溶剂，即为自体细胞生长因子制剂，本发明采用自体细胞生长因子制剂治疗骨折愈合具有创伤小，恢复快，本法操作简便，只需将自体细胞生长因子注入骨不连处即可，减轻临床医护工作者的工作量；避免了免疫排斥反应，注射的由血液分离而来的细胞生长因子属同种移植，避免了患者身体的免疫排斥反应，减少感染的发生。

Description

自体细胞生长因子制剂、制备方法及其制备用途

技术领域

本发明涉及细胞生长因子技术领域，具体地说是一种用于骨折愈合过程中不同阶段及不同细胞生长因子对促进骨折愈合的自体细胞生长因子制剂、制备方法及其制备用途。

背景技术

众所周知，临床上骨折延迟愈合及不愈合是临床骨科常见的问题，通常解决的方法是切开植骨，植骨后再内外固定手术，植骨的方法有自体骨游离移植、吻合血管的骨及骨膜移植，以及异体骨等，上述方法都是通过二次手术植入固体的骨修复材料，需要切开手术，创伤大，对骨折局部血运损伤大，常常造成骨折的再次不愈合，临床效果很差。像胫腓骨骨折手术治疗的目的是使患者保持胫腓骨的稳定性，获得最大限度的恢复小腿的承重功能，手术后，有一些患者由于自身原因或骨折处骨膜剥离过多或提前活动等原因会导致胫腓骨骨不连，目前，对胫腓骨骨不连采取的方法是二次手术，不但增加了患者的经济负担，而且还增加了患者的心理负担。

发明内容

本发明的第一个目的是解决上述现有技术的不足，提供一种促进骨折愈合的自体细胞生长因子制剂。

本发明的第二个目的是提供一种促进骨折愈合的自体细胞生长因子制剂的制备方法。

本发明第三个目的是利用自体细胞生长因子制剂治疗骨折愈合的用途，特别是治疗胫腓骨骨不连的用途。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种自体细胞生长因子制剂，其特征在于组成成分是由多种细胞生长因子和强力霉素组成，所述多种细胞生长因子包括血管内皮细胞生长因子、转化细胞生长因子和成纤维细胞生长因子，向多种细胞生长因子中以1000:1的容积比例加入浓度为10 ug·ml^-1的强力霉素，通过0.22ｕｍ滤器过滤加入强力霉素的多种细胞生长因子，得到溶剂，即为自体细胞生长因子制剂。

本发明所述上述组成成分按浓度配比依次为：血管内皮细胞生长因子：转化细胞生长因子：成纤维细胞生长因子为8:5:6。

本发明所述自体细胞生长因子制剂的制备方法，其特征在于具体步骤为:

一、针管的制备：在生物安全柜（由美国Thermo公司生产）中，采用无菌技术将2500国际单位的低分子量肝素钠（由齐鲁制药厂生产）抽入50 ml到无菌针管（由威海医用高分子材料有限公生产司）中，制备成肝素化的针管做静脉血采集用，以防止血液凝固。

二、血液分离：皮肤消毒后，用肝素化的针管抽取患者大约50 ml的静脉血，在生物安全柜中分装进50 ml的离心管（由美国Fisher公司生产）中，使用冷冻离心机（由美国Thermo公司生产）在1048 r·min^-1下离心25 min（离心半径9 cm），时离心管内的血液分为3层，上层为浅黄色的血浆，中层为白色的富血小板血浆，下层为红细胞；

三、低温冻存：吸取不带红细胞的中、上层血浆，将中层血浆和上层血浆的混合血浆置于无菌离心管中，用3支15 ml的无菌离心管（由美国Fisher公司生产）平分约20 ml的血浆]，于-20 ℃冰箱（所述冰箱采用美国Fisher公司生产）内短时间保存，8-12小时，然后将冰箱内的温度调至-80 ℃后恒温下长时间保存，以通过温差变化促进血小板裂解，保存时间为12-24小时后，从-80 ℃冰箱内取出冻存的自体混合血浆；

四、快速解冻：将装有冻存的自体混合血浆的离心管放在37 ℃水浴锅中快速解冻，时间不超过5 min；

五、反复冻存和融化：反复重复步骤三和步骤四两次以上，以利于最大程度的提高血小板裂解率。

六、自体细胞生长因子的获取：将融化后的装有混合血浆的离心管放置到离心机内再以3054 r·min^-1的速度离心6 min（离心半径9 cm），可见离心管内的混合血浆分为两层，上层液为多种细胞生长因子，下层液为血小板破碎后的碎片，所述多种细胞生长因子包括血管内皮细胞生长因子、转化细胞生长因子和成纤维细胞生长因子，

七、自体细胞生长因子制剂：取多种细胞生长因子，向多种细胞生长因子中按照1000:1的容积比例加入浓度为10 ug·ml^-1的强力霉素（由美国APP Pharm公司生产），以达到防止感染的作用，过滤加入强力霉素的自体多种细胞生长因子溶剂，即得到自体细胞生长因子制剂。

一种由自体细胞生长因子的制备方法制得的制剂的治疗用途用于促进骨折部位的生长。

本发明所述治疗用途特别是促进对胫腓骨骨不连的生长。

本发明中的细胞因子促进骨折愈合的机理分析：

本发明由于血管的重建贯穿骨修复的全过程，多种细胞生长因子参与新血管的形成，其中血管内皮细胞生长因子VEGF 作为一种重要的具有特异性促血管内皮细胞生长和血管生成诱导作用的因子，在骨愈合过程中具有重要作用，转化细胞生长因子TGF-β 属于 TGF 超家族，成熟的 TGF-β 有 5 种异构体-TGF-β1-5，研究表明骨组织中含有高浓度的TGF-β，是其他组织的 100 倍，TGF-β1的表达在人体骨折愈合、诱导成骨细胞分化和重新构建骨组织过程中发挥着及其重要的作用，这些细胞生长因子能刺激细胞的分裂和增值、增加胶原蛋白的合成、诱导细胞分化，同时还可以促进内再生血管作用，从而为骨折处提供良好的血液供应保证，促进骨折的愈合。

本发明采用自体细胞生长因子制剂治疗骨折愈合具有以下优点：①创伤小，不需要重新切开皮肤和肌肉做二次手术，可以减轻患者的经济和心理负担；②恢复快，只需要抽取患者少量的血液，这些血液在很短的时间内便可恢复；③本法操作简便，只需将自体细胞生长因子注入骨不连处即可，减轻临床医护工作者的工作量；④避免了免疫排斥反应，注射的由血液分离而来的细胞生长因子属同种移植，避免了患者身体的免疫排斥反应，减少感染的发生。

综上所述，自体细胞生长因子对于治疗胫腓骨骨不连具有创伤小、出血少、恢复快、疗效好等优点，值得临床上推广应用。

附图说明

图1是实行手术后患者7个月X线片，显现骨折断端硬化，未连接。

图2是患者注射后本发明后3个月的X线片，显示大量骨痂。

图3是注射后6个月的X线片，显示骨性愈合。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明：

自体细胞生长因子治疗胫腓骨骨不连228例临床疗效总结：

1 临床资料

本组228例，男185例，女43例。年龄18～55岁，中位数42.5岁。其中术前闭合性骨折216例，开放性骨折12例。致伤原因：摔伤38例，车祸伤132例，重物砸伤48例。术后时间为6个月至1年，中位数7.5个月。

2 手术方法 患者采取仰卧姿势，消毒胫腓骨骨不连部位的皮肤，在X光机下使用一次性麻醉用针（由上海埃斯埃医械塑料制品有限公司生产）找到胫腓骨骨不连部位，将自体细胞生长因子分多部位每次每部位按照0.5-0.75ml的办法注入。

3 术后处理 术后常规使用抗生素24～48 h；以后每4天注射一次细胞生长因子，三次注射完成后未发生感染可出院。

4 结果

所有患者均获得随访，随访时间2～5个月，中位数2个月。骨折均获得愈合，愈合时间为1.5～5.5个月，中位数2.3个月。注射自体骨髓和细胞生长因子后未发生断钢板和神经损伤等合并症，按照上述评价标准，本组优213例，良12例，可3例，优良率98.68%。

5、典型病例

如附图1、2、3所示，患者于xx，男，46岁，因右胫腓骨a骨折于荣成某医院行切开复位钢板内固定术，术后7个月断端硬化，诊断为骨不连，建议行切开断端清理植骨术，患者因恐惧二次手术来我院，行自体细胞生长因子制剂注射。首先，需用消毒棉将患者要抽血的皮肤消毒，用肝素化的针管抽取患者约50ml的静脉血，在美国Fisher公司生产的生物安全柜中分装进50 ml的离心管中，使用冷冻离心机（由美国Thermo公司生产）在1 048 r·min^-1离心25 min（离心半径9 cm），可见全血分为3层，上层为浅黄色的血浆，中层为白色的富血小板血浆，下层为红细胞。吸取不带红细胞的中、上层血浆，用3支15 ml的无菌离心管（由美国Fisher公司生产）平分约20 ml的混合血浆，于-20 ℃冰箱内短时间保存8-12小时，所述冰箱采用美国Fisher公司生产，然后将温度调至-80 ℃长时间保存，保存时间为12-24小时，过夜后从-80 ℃冰箱内取出冻存的血浆，在37 ℃水浴锅中解冻时间不超过5 min。如此反复冻存融化两次以上，获得多种细胞生长因子（包含VEGF、TGF-β、β-FGF等细胞生长因子），融化后的血浆再以3 054 r·min^-1离心6 min（离心半径9 cm），可见血浆分为两层，上层液含有多种细胞生长因子，下层液为血小板破碎后的碎片，上层液为多种细胞生长因子，向多种细胞生长因子中按照1000:1的容积比例加入浓度为10 ug·ml^-1的强力霉素（由美国APP Pharm公司生产），过滤加入强力霉素的多种细胞生长因子即得到自体细胞生长因子制剂，用肝素化的针管抽入5 ml的自体细胞生长制剂备用，让患者采取仰卧姿势，消毒胫腓骨骨不连部位的皮肤，在X光机下使用一次性麻醉用针找到胫腓骨a骨不连b部位，将自体细胞生长因子分多部位每次少量注射，且每部位的注入量为0.5-0.75ml，术后常规使用抗生素24～48小时；以后每4天注射一次细胞生长因子，三次注射完成后未发生感染出院，患者的胫腓骨a骨不连部位b 6个月后经检查发现骨性愈合。

Claims

1.一种自体细胞生长因子制剂，其特征在于组成成分是由多种细胞生长因子和强力霉素组成，所述多种细胞生长因子包括血管内皮细胞生长因子、转化细胞生长因子和成纤维细胞生长因子，向多种细胞生长因子中以1000:1的容积比例加入浓度为10 ug·ml^-1的强力霉素，通过0.22ｕｍ滤器过滤加入强力霉素的多种细胞生长因子，得到溶剂，即为自体细胞生长因子制剂。

2.根据权利要求1所述的一种自体细胞生长因子制剂，其特征在于所述上述组成成分按浓度配比依次为：血管内皮细胞生长因子：转化细胞生长因子：成纤维细胞生长因子为8:5:6。

3.根据权利要求1或2所述的一种自体细胞生长因子制剂，其特征在于本发明所述自体细胞生长因子制剂的制备方法，其特征在于具体步骤为:

一、针管的制备：在生物安全柜中，采用无菌技术将2500国际单位的低分子量肝素钠抽入50 ml到无菌针管中，制备成肝素化的针管做静脉血采集用；

二、血液分离：皮肤消毒后，用肝素化的针管抽取患者大约50 ml的静脉血，在生物安全柜中分装进50 ml的离心管中，使用冷冻离心机在1048 r·min^-1下离心25 min，时离心管内的血液分为3层，上层为浅黄色的血浆，中层为白色的富血小板血浆，下层为红细胞；

三、低温冻存：吸取不带红细胞的中、上层血浆，将中层血浆和上层血浆的混合血浆置于无菌离心管中，无菌离心管平分20 ml的血浆，于-20 ℃冰箱内短时间保存，8-12小时，然后将冰箱内的温度调至-80 ℃后恒温下长时间保存，保存时间为12-24小时后，从-80 ℃冰箱内取出冻存的自体混合血浆；

五、反复冻存和融化：反复重复步骤三和步骤四两次以上；

六、自体细胞生长因子的获取：将融化后的装有混合血浆的离心管放置到离心机内再以3054 r·min^-1的速度离心6 min（离心半径9 cm），可见离心管内的混合血浆分为两层，上层液为多种细胞生长因子，下层液为血小板破碎后的碎片，所述多种细胞生长因子包括血管内皮细胞生长因子、转化细胞生长因子和成纤维细胞生长因子；

七、自体细胞生长因子制剂：取多种细胞生长因子，向多种细胞生长因子中按照1000:1的容积比例加入浓度为10 ug·ml^-1的强力霉素，过滤加入强力霉素的自体多种细胞生长因子溶剂，即得到自体细胞生长因子制剂。

4.一种由权利要求3的自体细胞生长因子的制备方法制得的制剂的治疗用途用于促进骨折部位的生长。

5.根据权利要求4所述本发明所述治疗用途是促进对胫腓骨骨不连的生长。