CN107771079A - 用于制备富集的生物流体的方法和装置 - Google Patents

用于制备富集的生物流体的方法和装置 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用于产生富血小板的血浆、骨髓单核细胞、来自脂肪组织的基质血管级分及其它浓缩或富集的生物流体的方法和装置。

Description

用于制备富集的生物流体的方法和装置
优先权
本申请要求2015年7月2日提交的美国系列号62/188,118的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
背景技术
本公开涉及用于产生富血小板血浆、骨髓单核细胞(BMMC)、来自脂肪组织的基质血管级分(SVF)及其它富集或浓缩的生物流体的方法和装置。本公开还公开了用富血小板血浆、骨髓单核细胞、脂肪组织的基质血管级分、或其它富集或浓缩的生物流体治疗受损组织的方法；及用于受损组织的治疗中的富血小板血浆、骨髓单核细胞、脂肪组织的基质血管级分、或其它富集或浓缩的生物流体。
发明内容
本文公开了富血小板血浆(PRP)、骨髓单核细胞(BMMC)、脂肪组织的基质血管级分(SVF)及其它富集或浓缩的生物流体以及产生这些流体的方法。一个实施方案提供了全血分级分离的方法。在一个实施方案中，全血可分级分离为红细胞层、血沉棕黄层、及贫血小板血浆(PPP)层。在一个实施方案中，全血的分级分离可通过离心实现。可移除PPP层的至少一部分，并且将剩余流体转移到不同的容器中。在一个实施方案中，将剩余流体转移到第二容器如双注射器中。剩余流体可随后分级分离为两个层，即红细胞层和血浆层(即富血小板血浆)。在一个实施方案中，将富血小板血浆从第二注射器或容器中移走并向受试者施用。
在一个实施方案中，通过本文所述的方法产生的PRP包含约8x106至约1x 107个血小板/μL。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约0.1x 105至约2x 105个红细胞/μL。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约500至约4000个白细胞/μL。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约10至约300个嗜中性白细胞/μL。根据本发明的这些实施方案中的任一个的PRP可用于本文所述的医疗用途中。
用于产生PRP的其它系统是已知的，但它们不提供高浓度的血小板并且可常常产生被不可接受的高浓度的红细胞、嗜中性白细胞或白细胞污染的PRP。本文提出的方法、医疗用途及组合物提供具有高浓度的血小板和低浓度的红细胞、白细胞及嗜中性白细胞的PRP。本文所公开的装置和方法还可用于产生骨髓单核细胞、脂肪组织的基质血管级分及其它富集或浓缩的生物流体。
一个实施方案提供了骨髓分级分离的方法。所述方法可包括将骨髓添加到具有顶部接合元件和底部接合元件的第一注射器中并且离心所述第一注射器，其中骨髓在第一注射器内分级分离为贫血小板血浆层、血沉棕黄层及红细胞/粒细胞层。任选地，贫血小板血浆层的至少一部分可从第一注射器的顶部接合元件处移走。第二注射器或第二容器的底部接合元件可连接到第一注射器的顶部接合元件。贫血小板血浆层和血沉棕黄层中的任一种可被抽入第二注射器或第二容器中。第二注射器或第二容器可被离心，其中贫血小板血浆层和血沉棕黄层分级分离为骨髓单核细胞层和红细胞/粒细胞层。根据本发明的这些实施方案中的任一个的BMMC可用于本文所述的医疗用途中。
一个实施方案提供了脂肪组织分级分离的方法。所述方法可包括在具有顶部接合元件和底部接合元件的第一注射器中离心脂肪组织，其中脂肪组织在第一注射器内分级分离(顶部至底部)为脂质层、压缩的脂肪层及额外流体层。脂质层和额外流体层中的至少一部分可分别从第一注射器的顶部接合元件和底部接合元件处移走。第二注射器的底部接合元件可连接到第一注射器的顶部接合元件。压缩的脂肪层可被抽入第二注射器或第二容器中。第二注射器可被离心，其中压缩的脂肪层分级分离为顶部脂肪细胞层和底部基质血管级分。根据本发明的这些实施方案中的任一个的SVF可用于本文所述的医疗用途中。
附图说明
图1为描绘当与来自同一供体的全血样品相比时，通过实施例1的方法、Arthrex双注射器系统、在2％血细胞比容下的PRP系统、在7％血细胞比容下的PRP系统及在15％血细胞比容下的PRP系统产生的PRP的血小板比率(□)、白细胞比率(◆)及嗜中性白细胞比率(■)的图。
图2A-C示出了产生PPP、血沉棕黄层及红细胞层的第一注射器的使用。
图3A-B示出了产生PRP的第一注射器和第二注射器的使用。
具体实施方式
本文公开了浓缩的富血小板血浆(PRP)、骨髓单核细胞(BMMC)、脂肪组织的基质血管级分(SVF)及其它富集或浓缩的生物流体以及产生这些流体的方法。对于富血小板血浆，全血可通过离心分级分离为作为顶层的澄清的贫血小板血浆(PPP)级分、作为底层的红色红细胞级分以及介于顶层与底层之间的白色级分。中间级分为“血沉棕黄层”，其含有大部分的白细胞、血小板及间充质和/或造血干细胞。图2C。
一个实施方案提供了全血分级分离的方法。来自受试者的全血可通过放血针、中央静脉导管(例如PICC管)或任何其它全血采集装置获得。其它生物流体可使用任何可接受的方法获得。在一个实施方案中，全血可任选地与抗凝剂例如像柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐葡萄糖(ACD)、柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖(CPD)或乙二胺四乙酸(EDTA)混合。在加工步骤期间，还可以足以防止或抑制凝血酶活性的量添加肝素。可添加蛋白水解酶抑制剂如抑肽酶、ε-氨基己酸或凝血酸以防止自体生长因子的蛋白水解降解。
离心条件(例如，相对离心力(RCF)、时间等)决定血液或其它生物流体分级分离的范围和程度。在一个实施方案中，分级分离全血或其它生物流体的方法包括离心全血两次，其中第一离心为硬旋转(hard spin)，第二离心为软旋转(soft spin)。在一个实施方案中，分级分离全血或其它体液的方法包括离心全血两次，其中第一离心为软旋转，第二离心为硬旋转。在一个实施方案中，硬旋转大于2000x g或从约1500x g至约2000x g。在一个实施方案中，软旋转是从约30x g至约200x g。
在一个实施方案中，分级分离全血的方法包括离心全血两次，其中第一离心将血液分离成三种级分—贫血小板血浆层、血沉棕黄层及红细胞层；而第二离心将血液分离成两个层—富血小板血浆层和红细胞层。第一离心可持续约5分钟至约20分钟。第二离心可持续约5分钟至约20分钟。
在一个实施方案中，全血可在小于2000x g但仍可将血液分级分离为贫血小板血浆层、血沉棕黄层及红细胞层的相对离心力下离心(例如硬旋转)。在一个实施方案中，全血样品可在约1500x g、约1550x g、约1600x g、约1650x g、约1675x g、约1700x g、约1725xg、约1750x g、约1775x g、约1800x g、约1825x g、约1850x g、约1875x g、约1900x g、约1925x g、约1950x g、或约1975x g下离心。在一个说明性实施方案中，全血样品可在以下RCF下离心：约1500x g至2000x g、约1550x g至2000x g、约1600x g至2000x g、约1650x g至2000x g、约1675x g至2000x g、约1700x g至2000x g、约1725x g至2000x g、约1750x g至2000x g、约1775x g至2000x g、约1800x g至2000x g、约1825x g至2000x g、约1850x g至2000x g、约1875x g至2000x g、约1900x g至2000x g、约1925x g至2000x g、约1950x g至2000x g、或约1975x g至2000x g。
在一个说明性实施方案中，全血样品可在以下RCF下离心(例如硬旋转)：约1500xg至约1900x g、约1550x g至约1900x g、约1600x g至约1900x g、约1650x g至约1900x g、约1675x g至约1900x g、约1700x g至约1900x g、约1725x g至约1900x g、约1750x g至约1900x g、约1775x g至约1900x g、约1800x g至约1900x g、约1825x g至约1900x g、约1850x g至约1900x g、或约1875x g至约1900x g。
在一个说明性实施方案中，全血样品可在以下RCF下离心(例如硬旋转)：约1500xg至约1800x g、约1550x g至约1800x g、约1600x g至约1800x g、约1650x g至约1800x g、约1675x g至约1800x g、约1700x g至约1800x g、约1725x g至约1800x g、约1750x g至约1800x g、约1775x g至约1800x g、约1650x g至约1750x g、约1675x g至约1750x g、约1700x g至约1750x g、约1675x g至约1725x g、或约1700x g至约1725x g。
在一个实施方案中，血液样品(如已经受硬旋转的血液样品)可在小于200x g并且将血液分级分级为血浆层和红细胞层的RCF下离心(例如软旋转)。在一个说明性实施方案中，血浆层为富血小板血浆层。在一个实施方案中，血液样品可在约30x g、约35x g、约40xg、约45x g、约50x g、约55x g、约60x g、约70x g、约75x g、约80x g、约90x g、约100x g、约110x g、约120x g、约125x g、约150x g、约175x g、或约200x g下离心。
在一个说明性实施方案中，血液可在以下RCF下离心(例如软旋转)：约30x g至约200x g、约30x g至约175x g、约30x g至约150x g、约30x g至约125x g、约30x g至约120xg、约30x g至约110x g、约30x g至约100x g、约30x g至约90x g、约30x g至约80x g、约30xg至约75x g、约30x g至约70x g、约30x g至约60x g、约30x g至约50x g、约30x g至约45xg、约40x g至约200x g、约40x g至约175x g、约40x g至约150x g、约40x g至约125x g、约40x g至约120x g、约40x g至约110x g、约40x g至约100x g、约40x g至约90x g、约40x g至约80x g、约40x g至约75x g、约40x g至约70x g、约40x g至约60x g、约40x g至约50xg、或约40x g至约45x g。
在一个实施方案中，第一离心(例如硬旋转)可为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约20、约25或约30分钟。在一个实施方案中，第二离心(例如软旋转)可为约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约20、约25或约30分钟。
在一个说明性实施方案中，贫血小板血浆层(PPP)的至少一部分可在第一离心(例如硬旋转)之后和第二离心(例如软旋转)之前被移除。在一个实施方案中，至少一半、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的贫血小板血浆层(PPP)被移除。移除的PPP可出于其它目的而保存，如稀释最终的PRP制剂或用于生成自体凝块。
在移除至少一部分PRP之后，剩余的血液组分可被转移到第二容器(例如，离心管或注射器，例如Arthrex双注射器系统)中。在一个实施方案中，如本文所公开的PRP被送到注射器中并且准备立即使用。
在产生如本文所述的PRP的方法的实施方案中，与全血相比，PRP包含升高的血小板水平。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约8x 106至约1x 107个血小板/μL。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约8.5x 106至约1x 107个血小板/μL。在一个说明性实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约9x 106至约1x 107个血小板/μL。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约9.5x 106至约1x 107个血小板/μL。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约8x 106、约8.5x 106、约9x106、约9.5x 106、约9.75x 106、约9.8x 106、约9.9x 106、或约1x 107个血小板/μL。
在产生如本文所述的PRP的方法的实施方案中，与全血相比，PRP包含降低的红细胞(RBC)水平。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含小于约2x 105个RBC/μL、小于约1.5x 105个RBC/μL、小于约1x 105个RBC/μL、或小于约0.5x 105个RBC/μL。
在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约0.1x105至约2x 105个RBC/μL、约0.1x 105至约1.5x 105个RBC/μL、约0.1x 105至约1x 105个RBC/μL、约0.1x 105至约0.75x 105个RBC/μL、约0.1x 105至约0.6x 105个RBC/μL、约0.1x 105至约0.5x 105个RBC/μL、约0.25x 105至约1.5x 105个RBC/μL、约0.25x 105至约1x 105个RBC/μL、约0.25x 105至约0.75x 105个RBC/μL、约0.25x 105至约0.6x 105个RBC/μL、约0.25x 105至约0.5x 105个RBC/μL、约0.5x 105至约1.5x 105个RBC/μL、约0.5x 105至约1x 105个RBC/μL、约0.5x 105至约0.75x 105个RBC/μL、或约0.5x 105至约0.6x 105个RBC/μL。
在产生如本文所述的PRP的方法的实施方案中，与全血相比，PRP包含降低的白细胞(RBC)水平。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含小于约4x 103个WBC/μL、小于约3.5x103个WBC/μL、小于约3x 103个WBC/μL、小于约2.5x 103个WBC/μL、小于约2x 103个WBC/μL、小于约1.5x 103个WBC/μL、小于约1x 103个WBC/μL、或小于约0.5x 103个WBC/μL。
在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约500至约4000个WBC/μL、约500至约3500个WBC/μL、约500至约3000个WBC/μL、约500至约2500个WBC/μL、约500至约2000个WBC/μL、约500至约1500个WBC/μL、约500至约1000个WBC/μL、约500至约750个WBC/μL、或约500至约550个WBC/μL、约750至约3500个WBC/μL、约1000至约3500个WBC/μL、约750至约3000个WBC/μL、约1000至约3000个WBC/μL、约750至约2500个WBC/μL、或约1000至约2500个WBC/μL。
在产生如本文所述的PRP的方法的实施方案中，与全血相比，PRP包含降低的嗜中性白细胞(N)水平。在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含小于约300N/μL、约250N/μL、约230N/μL、约225N/μL、约200N/μL、约175N/μL、约150N/μL、约125N/μL、约120N/μL、约110N/μL、约100N/μL、约75N/μL、约50N/μL、约25N/μL、约20N/μL、约15N/μL、或约10N/μL。
在一个实施方案中，通过本文的方法产生的PRP包含约10至约300N/μL、约10至约250N/μL、约10至约230N/μL、约10至约225N/μL、约10至约200N/μL、约10至约175N/μL、约10至约150N/μL、约10至约125N/μL、约10至约120N/μL、约10至约100N/μL、约10至约75N/μL、约10至约50N/μL、或约10至约25N/μL。
装置
在一个实施方案中，用于制备PRP的装置可包括具有底部接合元件110的第一注射器100，所述底部接合元件110用于例如直接连接输注套件以将血液直接抽入第一注射器中。图2A.接合元件可为鲁尔锁连接器或任何其它类型的小型流体配件以用于在锥形阳配件与其配合的阴部件之间制造防漏连接。第一注射器还可包括顶部接合元件120。顶部接合元件可连接到例如可擦拭的无针注射鲁尔连接器150或活塞140上。第一注射器可包括具有适合用于生物流体的腔室130的筒体190。可用连接到顶部接合元件120(或其它合适的工具)的活塞140将生物流体向上抽入第一注射器的腔室130中。
生物流体(例如全血)可直接从患者处或从含有先前收集的生物流体样品的容器处抽入第一注射器中。可使用任何量的生物流体，例如约10、20、50、75、100、125、150、200、300或更多mL。可将活塞140从顶部接合元件120处移走并将可擦拭的无针注射器鲁尔连接器150(或其它鲁尔锁口或注射口)置于顶部接合元件中(图2B)。将第一注射器置于离心机中并且在例如硬旋转条件下旋转。生物流体的三个层可在离心之后呈现：PPP层160、血沉棕黄层170及红细胞或红血球层180(图2C)。
任选地，PPP层的量(例如约1、2、5、10、20、30、40、50mL或更多)可经由可擦拭的无针注射器鲁尔连接器150或顶部接合元件120被移除，留下所需体积的PPP(例如约50、40、30、20、10、5、2、1或更少mL)。任选移除的PPP可用于例如PRP最终注射的稀释或产生自体凝块。或者，所有PPP可保留在第一注射器中。第二注射器200或其它第二容器可连接到顶部接合元件120或可擦拭的无针注射器鲁尔连接器150。第二注射器可为Arthrex双注射器。双注射器包括例如远端(外部)注射器，其具有拥有第一直径的第一主体；和近端(内部)注射器，其具有拥有小于第一直径的第二直径的第二主体，远端(外部)注射器与近端(内部)注射器呈直接流体连通，且近端(内部)注射器位于远端(外部)注射器内。第二注射器或其它第二容器可具有底部接合元件210和活塞240。第二注射器或第二容器的筒体220可包括腔室230，所述腔室230可以容纳生物流体。第二注射器或第二容器的筒体可具有小于第一注射器的直径以便第二注射器可配合在第一注射器的筒体内。参见图3A。
存在于第一注射器中的所有或一部分生物流体(例如PPP、血沉棕黄层、红细胞层)可经由第一注射器的顶部接合元件120被抽入第二注射器200或其它第二容器中。图3A.在一个实施例中，PPP层、血沉棕黄层及任选一部分红细胞层(例如约小于1、2、5、10、15或30mL)的红细胞层可向上抽入第二注射器或其它第二容器中。第二注射器或第二容器可从第一注射器处移走并置于离心机中。第二注射器或第二容器可在例如软旋转条件下离心。第二离心之后可呈现两个层：PRP层235和红血球层240。图3B.PRP层可通过例如将红血球层从第二注射器或第二容器的底部接合元件210中排出而分离。PPP可随后用于经由连接到第二注射器或第二容器的底部接合元件210上的注射套件直接向患者注射或者可保存在第二注射器或第二容器中以备后用，或从第二注射器或第二容器的腔室中移走并保存在另一容器中以备后用。
当第二容器为双注射器如Arthrex双注射器时，内部注射器的活塞可用于第二离心之后的PRP的简便分离。在第二离心之后，(双注射器的)内部注射器可被拔起以分离PRP。因此，第二双注射器的内部注射器可用于抽起PRP，而不会干扰RBC层。随后可移除第二注射器的内部注射器，可将针连接到底部接合元件上，并且第二双注射器的内部注射器可用于直接向患者或容器注射PRP。
装置的其它用途
本文所述的装置和方法可与其它生物流体(包括例如骨髓或脂肪组织)一起使用。
一个实施方案提供了骨髓分级分离的方法。在一个实施方案中，骨髓单核细胞(BMMC)可被分离。BMMC是包括单核细胞、淋巴细胞、及造血和/或间充质干细胞、和祖细胞的单个核细胞的混合群。骨髓、骨髓抽吸物或骨髓浓缩物(即骨髓样品)可用连接到顶部接合元件120上的活塞140被向上抽入第一注射器的腔室130中。骨髓样品可直接从患者处或从含有先前收集的骨髓样品的容器处抽入第一注射器中。密度梯度介质(例如Percoll或Ficoll，ρ为约1.070至约1.080)可任选被抽入第一注射器中，以使得在第一注射器的腔室中骨髓样品为顶层且密度梯度介质为底层。或者，密度梯度介质可经由底部接合元件110被向上抽入第一注射器中，然后经由第一注射器的顶部接合元件120添加骨髓样品。活塞140(如果使用的话)可从顶部接合元件处移走并且可擦拭的无针注射器鲁尔连接器150(或其它鲁尔锁口或注射口)可被置于顶部接合元件120中。图2A.第一注射器可置于离心机中并且在例如如上对于分离PRP所述的任何硬旋转离心条件下旋转，例如在约2000x g下持续约10分钟。生物流体的三个或四个层可以下列顺序从上到下呈现：贫血小板血浆层、血沉棕黄层、密度梯度介质层(如果使用的话)及红血球/粒细胞层。
任选地，一个量的贫血小板血浆层可经由可擦拭的无针注射器鲁尔连接器或顶部接合元件移除，留下所需体积的贫血小板血浆层。或者，所有贫血小板血浆层可保留在第一注射器中。第二注射器(例如双注射器)或其它第二容器可连接到顶部接合元件或可擦拭的无针注射器鲁尔连接器上。第二注射器(例如双注射器)或第二容器可具有底部接合元件。第二注射器或第二容器的筒体可包括能够容纳生物流体的腔室。第二注射器或第二容器的筒体可具有小于第一注射器的直径以便第二注射器或第二容器可配合在第一注射器的筒体内。
存在于第一注射器中的所有或一部分生物流体(例如贫血小板血浆层、血沉棕黄层、密度梯度介质层(如果使用的话)及红血球/粒细胞层)可经由顶部接合元件被抽入第二注射器或第二容器中。在一个实施例中，任何剩余的贫血小板血浆层和血沉棕黄层都可被向上抽入第二注射器或其它容器中。第二注射器或第二容器可被移除并置于离心机中。第二注射器或第二容器可在如上对于PRP分离所述的任何软旋转条件下离心。其它条件可包括例如在约225、250、275、300、325、350、375、400、425x g或更高下离心3、5、7、10、15分钟或更久。离心之后可呈现两个层：顶部骨髓单核细胞层和底部红血球/粒细胞层。骨髓单核细胞层可通过例如将红血球/粒细胞层从第二注射器或第二容器的底部接合元件210处排出以使得骨髓单核细胞层保留在第二注射器中而分离。骨髓单核细胞层可随后用于经由连接到第二注射器或第二容器的底部接合元件210上的注射套件直接向患者注射或者可保存在第二注射器或第二容器中以备后用，或从第二注射器或第二容器的腔室中移走并保存在另一容器中以备后用。
当第二容器为双注射器如Arthrex双注射器时，内部注射器可用于第二离心之后的骨髓单核细胞层的简便分离。在第二离心之后，(双注射器的)内部注射器的活塞被拔起以分离骨髓单核细胞层。因此，第二双注射器的内部注射器可用于抽起骨髓单核细胞层，而不会干扰红血球/粒细胞层；并且单注射器将红血球/粒细胞层挤出并将骨髓单核细胞层保留在注射器内。随后可移除第二注射器的内部注射器，针可连接到底部接合元件上，并且第二双注射器的内部注射器可用于直接向患者或容器注射骨髓单核细胞层。
骨髓单核细胞层可接着用于向患者注射或可保存以备后用。当使用全血时，骨髓单核细胞层类似于如上所述的富血小板血浆层，但另外含有干细胞。
一个实施方案提供了脂肪组织分级分离的方法。在一个实施方案中，纯化的基质血管级分或层(SVF)可从脂肪组织中分离而来。脂肪组织可用连接到顶部接合元件上的活塞140被向上抽入第一注射器的腔室130中。脂肪组织可直接从患者处或从含有先前收集的脂肪组织样品的容器处抽入第一注射器中。脂肪组织可在抽入第一注射器中之前被乳化或可在第一注射器内以机械方式被乳化。活塞(如果使用的话)可从顶部接合元件处移走并且可擦拭的无针注射器鲁尔连接器(或其它鲁尔锁口或注射口)可被置于顶部接合元件中。图2A.第一注射器可置于离心机中并且在例如如上对于分离PRP所述的任何硬旋转离心条件下旋转。其它离心条件包括在例如约400、500、600、666、700、800x g或更高下持续约3、4、5、7、10或更多分钟。生物流体的三个层可以下列顺序从上到下呈现：脂肪酸/脂质/油层(“脂质层”)；压缩的脂肪层；以及额外流体层(包括例如浆液、红血球和局部麻醉剂)。
脂质层可经由可擦拭的无针注射器鲁尔连接器或顶部接合元件被移除。额外流体层可从底部接合元件110处排出，以使得压缩的脂肪层留在第一注射器中。约75、80、85、90、95、97、98、99或100％的脂质层和额外流体层被移除。第二注射器(例如双注射器)或第二容器可连接到顶部接合元件或可擦拭的无针注射器鲁尔连接器上。第二注射器或第二容器可具有底部接合元件。第二注射器或第二容器的筒体可包括能够容纳生物流体的腔室。第二注射器或第二容器的筒体可具有小于第一注射器的直径以便第二注射器可配合在第一注射器的筒体内。
存在于第一注射器中的所有或一部分生物流体可经由顶部接合元件被抽入第二注射器或第二容器中。在一个实施例中，压缩的脂肪层可向上抽入第二注射器或第二容器中，第二注射器或第二容器可从第一注射器处移走并将第二注射器或第二容器置于离心机中。第二注射器或第二容器可在如上对于PRP分离所述的软旋转条件下离心。其它条件包括在例如约200、250、300、350、375、400、450x g或更高下持续约3、4、5、7、10或更多分钟。离心之后可呈现两个层：顶部脂肪细胞层和底部基质血管层或级分。脂肪组织的基质血管级分为前脂肪细胞、间充质干细胞(MSC)、内皮祖细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞及脂肪组织巨噬细胞的丰富来源。SVF可通过例如将其从第二注射器或第二容器的底部鲁尔锁连接器中排出而分离。分离的SVF可接着用于向患者注射或可保存以备后用。
富血小板血浆、骨髓单核细胞、基质血管级分及其用途
在一个实施方案中，通过本文所公开的方法制备的PRP组合物、BMMC组合物、SVF组合物或其它体液可包含一种或多种维生素，如维生素E、维生素A或其它的类维生素A。维生素或其它的类维生素A可以约40、30、20、10、5或更少mg/L存在于PRP、BMMC或SVF中。维生素可提供伤口愈合及抗氧化性质。或者或另外，非维生素抗氧化剂可以约50、40、30、20、10、5或更少mcg/dL包括在PRP、BMMC或SVF中。这种抗氧化剂的非限制性代表性实例包括β-胡萝卜素。
一个实施方案提供了一种包含自体富血小板血浆(PRP)的组合物，其用于治疗软组织损伤，其中所述PRP包含约8x 106至约1x 107个血小板/μL。在一个实施方案中，通过本文所述的方法获得PRP，并且与通过本文方法产生的PRP有关的任何特征可应用于其医疗用途中。在一个实施方案中，包含自体富血小板血浆(PRP)的组合物可经由向韧带、肌腱、骨、软骨或关节间隙注射来施用。
一个实施方案提供了一种包含通过本文所述的方法获得的血液骨髓单核细胞(BMMC)的组合物，其用于治疗软组织损伤或损坏。
一个实施方案提供了一种包含通过本文所述的方法获得的基质血管级分(SVF)的组合物，其用于治疗软组织损伤或损坏。
在一个实施方案中，通过本文所述的方法获得的约0.1、0.5、1、5、10、15、20、25mL或更多PRP可向受试者施用。受试者可为哺乳动物。哺乳动物可为人、犬、猫、马或牛。
在一个实施方案中，通过本文所述的方法获得的PRP、BMMC或SVF可向未进行手术的受试者施用。PRP、BMMC或SVF可(如通过注射)直接施用于未进行手术的受试者的软骨、韧带、肌腱、软组织、肌肉或关节间隙。例如，可经由注射于肌腱中向患有慢性肌腱病(例如，跟腱炎、外/内上髁炎、足底筋膜炎、髌骨肌腱病)的受试者施用PRP、BMMC或SVF。在一个说明性实施方案中，可向患有软骨损伤和早期或晚期骨关节炎的受试者施用PRP、BMMC或SVF。
在一个实施方案中，通过本文所述的方法获得的PRP、BMMC或SVF可在手术期间向受试者施用。PRP、BMMC或SVF可在手术期间施用以修复软组织损坏或损伤，例如用于韧带(例如，前十字韧带、内侧副韧带等)、软骨(例如，半月板、关节盂唇等)或肌腱(例如跟腱)。PRP、BMMC或SVF还可在手术期间施用以促进骨修复(例如，髌骨、胫骨、股骨、肱骨等)。PRP、BMMC或SVF还可用于治疗局部缺血、缺血性中风、心脏损伤或损坏、肌肉损伤或损坏、骨关节炎、类风湿性关节炎及其它疾病。PRP、BMMC或SVF可直接施用于软组织或关节间隙(例如肩、膝、踝、腕、髋关节等)。
在一个实施方案中，通过本文所述的方法获得的PRP、BMMC或SVF可向患有神经病(例如周围神经病)的受试者施用。
在本文所述的方法中，向受试者施用的PRP、BMMC或SVF可为自体的PRP、BMMC或SVF。在一个实施方案中，向受试者施用的PRP、BMMC或SVF可为同种异体的PRP、BMMC或SVF。
在一个实施方案中，通过本文所述的方法获得的PRP、BMMC或SVF可与一种或多种特异性生长因子组合施用。生长因子包括但不限于血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、TGF-β(转化生长因子-β)、上皮生长因子(EGF)及血管内皮生长因子(VEGF)。约0.001、0.01、0.1、1.0、10、100或更多ng/mL的生长因子可添加到PRP、BMMC或SVF中，或同时或相继地分开施用。
在一个实施方案中，通过本文所述的方法获得的PRP、BMMC或SVF可与骨髓浓缩物(BMC)、骨髓抽吸物(BMA)或脂质吸出物组合施用。约1、2、5、10、15、20、25mL或更多的BMC、BMA或脂质吸出物可添加到PRP、BMMC或SVF中，或同时或相继地分开施用。
在一个说明性实施方案中，通过本文所述的方法得到的PRP、BMMC或SVF可与干细胞组合施用。举例来说，PRP、BMMC或SVF可与间充质干细胞或骨髓干细胞一起施用。约0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25mL或更多的间充质干细胞或骨髓干细胞可添加到PRP、BMMC或SVF中，或同时或相继地分开施用。
在一个实施方案中，通过本文方法获得的PRP、BMMC或SVF可经由连接到第二注射器或第二容器上的注射成套工具直接从第二注射器或第二容器施用于患者。例如，当双注射器被用作第二注射器时，内部注射器可被移除并连接到注射成套工具上，PRP、BMMC或SVF可直接向患者施用。
在上面的段落中给出了针对PRP、BMMC或SVF的各种考虑，并且除非文中另外需要，与施用有关的相关特征全部都适用于如本文所定义的这些细胞群的相应医疗用途中。
成套工具
在一个实施方案中，本文所述的方法包括一次性血液分离成套工具和装置以实现全血的适当分级分离及各层的收集。方法、装置、和装置组件包括监测和控制将全血和血液组分分离(例如，第二离心，其中至少一部分PPP已经移除)为各级分且随后收集所选级分。
定义
术语“血沉棕黄层”或“血沉棕黄面”是指在密度梯度离心之后或在血液的硬旋转离心条件下介于血浆层与红血球层之间的白细胞、血小板、和间充质细胞和/或造血细胞的白色中间层。
术语“贫血小板血浆(PPP)是指在血液的密度梯度离心之后或在血液的硬旋转离心条件下血浆的上层。当离心在足够的力下时出现PPP层，此时白细胞和血小板分级分离为血沉棕黄层。
术语“红血球”与“红细胞(RBC)”可互换并且指的是成熟红细胞。
术语“嗜中性白细胞(N)”指的是一类成熟的、粒细胞性白细胞。其它粒细胞包括嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
术语“硬旋转”是指引起红血球沉淀且引起血小板沉淀在紧邻红血球层之上且在紧邻贫血小板血浆层之下的层中的离心条件。通常，硬旋转被定义为具有约1500x g至约2000x g的相对离心力(RCF)。术语“软旋转”是指引起红血球沉淀而血小板保留在悬液中的离心条件。通常，软旋转被定义为具有约20x g至约200x g的RCF。
除非文中另外清楚陈述，如本文所用，单数形式“a”、“an”及“所述”包括多个指示物。术语“约”与数值结合时意指所述数值可在±5％或更小的所述数值间变化。
本文中任何地方提及的所有专利、专利申请及其它科学或技术著作以引用的方式整体并入本文。在本文中举例描述的本发明可适宜地在省去本文没有特别公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制下实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一者可用其它两个术语的任一个来代替，而保留其通常含义。已采用的术语和表述被用作说明而非限制的术语，并且并不意味着在使用这种术语和表述时排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但认识到可能在如权利要求所述的本发明范围内进行各种修改。因此，应理解虽然本发明已由实施方案具体地公开，但本文所公开构思的任选特征、修改和变化可诉诸于本领域技术人员，而且这种修改和变化被认为在如由说明和所附权利要求书所限定的本发明的范围内。
此外，在本发明的各特征或各方面按照马库什组或其它可选分组来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此按照该马库什组或其它组的任意单个成员或成员亚组被描述。
如本文所用的术语‘实施方案’不意图将本发明局限于特征的任何特定的组合。如上所述的任何实施方案及在任何实施方案中存在提及“能够”或“可以”的任何特征旨在可与本文所述的任何其它或另外的实施方案或特征以任何可操作的组合形式组合。
以下内容仅是为了举例说明，而不是对上文中以上位概念描述的本发明范围的限制。
实施例
实施例1：浓缩的富血小板血浆的制备
开发了一种产生具有更高的血小板比率的浓缩的富血小板血浆(即，自体条件化血浆)的方法。
方法
将全血抽入注射器(三个不同供体中的每一个)中。将活塞从注射器中移走，并且在室温下，在1705x g下在注射器中离心全血(1390桶，Hettich LabTechnology,Beverly,MA))10分钟。可辨别出三个级分-顶部浅黄色澄清级分(贫血小板血浆)、白色界面级分(“血沉棕黄层”)和在注射器底部的红色级分。移除大约20mL贫血小板血浆级分。将剩余的血浆和血沉棕黄层转移到Arthrex双注射器系统(Arthrex Inc.,Naples,FL)中。双注射器经由可擦拭的无针连接器连接到更大的注射器。将双注射器置于1390桶中并在室温下在41.65x g下离心5分钟。离心之后，可辨别出两个级分-顶部的浅黄色澄清级分(富血小板血浆)和底部红色红血球级分。使用Arthrex双注射器的内部注射器分离上部级分。为测量细胞含量而加工的PRP的总体积为6mL。
结果
分析全血(WB)和最终PRP级分的细胞含量。
表1：来自3个供体的WB和PRP的组分。
a103/μL；b106/μL；c103/μL；dfL；e103/μL
在表2中比较了PRP中的组分，与全血相比，以组分(白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)及嗜中性白细胞(N))的量的比率的形式。
表2：PRP与全血的细胞比率
比率 供体1 供体2 供体3 平均值
WBC比率 0.53 0.18 0.53 0.42
RBC比率 0.03 0.01 0.01 0.02
PLT比率 4.47 6.99 2.80 4.84
N比率 <0.01 0.13 0.08 0.07
本文所述的方法产生具有升高的血小板比率及降低的白细胞比率、红细胞比率和嗜中性白细胞比率的PRP。
实施例2：浓缩的PRP的比较
通过不同的方法产生浓缩的PRP以与实施例1中产生的浓缩PRP相比较。
方法
根据制造商说明书，通过Arthrex双注射器系统和PRP系统(Arthrex Inc.,Naples,FL)来制备浓缩的PRP。制备三个单独的PRP，唯一的差异是2％、7％和15％血细胞比容设定。
结果
通过各种不同方法制备的PRP的组分在表3中进行比较(PRP对比全血)(也参见图1)。类似于实施例1，为测量细胞含量而加工的每个PRP样品为6mL。然而，为测量细胞含量而加工的Arthrex双注射器系统样品为4.6mL。数据从4.6mL被外推至6.0mL以提供与相同体积的比较。
表3：PRP与全血的细胞比率
与其它方法相比，实施例1的方法产生了具有更高的血小板比率的PRP，例外的是具有15％血细胞比容的PRP样品。然而，红细胞、嗜中性白细胞和白细胞比率与具有15％血细胞比容的PRP相比要低得多。

Claims (22)

1.一种血液分级分离的方法，所述方法包括：
a)在具有顶部接合元件和底部接合元件的第一注射器中离心全血，其中所述全血在所述注射器内分级分离为贫血小板血浆层、血沉棕黄层和红血球层；
b)从所述第一注射器的所述顶部接合元件处移走至少一部分所述贫血小板血浆层；
c)将第二注射器或第二容器的底部接合元件连接到所述第一注射器的所述顶部接合元件；
d)将所述贫血小板血浆层、所述血沉棕黄层和任选一部分的所述红血球层中的任一者抽入所述第二注射器或第二容器中；以及
e)离心所述第二注射器或第二容器，其中所述贫血小板血浆层、所述血沉棕黄层和所述红血球层中的所述任一者分级分离为富血小板血浆层和红血球层。
2.权利要求1或2所述的方法，其中所述富血小板血浆层被移走并转移到容器中。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述富血小板血浆层包含约8x106至约1x107个血小板/μL。
4.先前权利要求中任一项所述的方法，其中所述富血小板血浆层包含约0.1x105至约2x105个红血球/μL。
5.先前权利要求中任一项所述的方法，其中所述富血小板血浆层包含约500至约4000个白细胞/μL。
6.先前权利要求中任一项所述的方法，其中所述富血小板血浆层包含约10至约300个嗜中性白细胞/μL。
7.先前权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的离心具有约1500xg至约2000xg的相对离心力(RCF)。
8.先前权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(e)中的离心具有约30xg至约200xg的相对离心力(RCF)。
9.先前权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二注射器为双注射器。
10.先前权利要求中任一项所述的方法，还包括将所述红血球层从所述第二注射器或第二容器处排出并在所述第二注射器或第二容器中保留所述富血小板血浆。
11.先前权利要求中任一项所述的方法，还包括将针连接到所述第二注射器或第二容器的所述底部接合元件上。
12.先前权利要求中任一项所述的方法，还包括向患者的韧带、肌腱、骨、软骨或关节间隙注射所述第二注射器的所述富血小板血浆。
13.一种治疗软组织损伤的方法，所述方法包括施用包含自体富血小板血浆(PRP)的组合物，其中所述PRP包含约8x106至约1x107个血小板/μL。
14.权利要求13所述的方法，其中所述施用包括将所述组合物注射到韧带、肌腱、骨、软骨或关节间隙中。
15.一种包含自体富血小板血浆(PRP)的组合物，其用于治疗软组织损伤，其中所述PRP包含约8x106至约1x107个血小板/μL。
16.根据权利要求15使用的组合物，其中所述组合物用于经由注射到韧带、肌腱、骨、软骨或关节间隙中施用。
17.一种骨髓分级分离的方法，所述方法包括：
a)添加骨髓到具有顶部接合元件和底部接合元件的第一注射器中；
b)离心所述第一注射器，其中所述骨髓在所述第一注射器内分级分离为贫血小板血浆层、血沉棕黄层和红血球/粒细胞层；
c)任选地从所述第一注射器的所述顶部接合元件处移走至少一部分所述贫血小板血浆层；
d)将第二注射器或第二容器的底部接合元件连接到所述第一注射器的所述顶部接合元件；
e)将所述贫血小板血浆层和所述血沉棕黄层中的任一者抽入所述第二注射器或第二容器中；以及
f)离心所述第二注射器或第二容器，其中所述贫血小板血浆层和所述血沉棕黄层分级分离为骨髓单核细胞层和红血球/粒细胞层。
18.一种治疗软组织损伤或损坏的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用通过权利要求17所述的方法产生的血液骨髓单核细胞。
19.一种包含通过权利要求17所述的方法产生的血液骨髓单核细胞的组合物，其用于治疗软组织损伤或损坏。
20.一种脂肪组织分级分离的方法，所述方法包括：
a)在具有顶部接合元件和底部接合元件的第一注射器中离心脂肪组织，其中所述脂肪组织在所述第一注射器内分级分离为脂质层、压缩的脂肪层和额外流体层；
b)从所述第一注射器处移除至少一部分所述脂质层和至少一部分所述额外流体层；
c)将第二注射器的底部接合元件连接到所述第一注射器的所述顶部接合元件上；
d)将所述压缩的脂肪细胞层抽入所述第二注射器或第二容器中；以及
e)离心所述第二注射器，其中所述压缩的脂肪细胞层分级分离为脂肪细胞层和基质血管级分。
21.一种治疗软组织损伤或损坏的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用通过权利要求20所述的方法产生的基质血管级分。
22.一种包含通过权利要求20所述的方法产生的基质血管级分的组合物，其用于治疗软组织损伤或损坏。
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