IT201700003805A1 - Tecnica di purificazione del tessuto adiposo per ottenere alta concentrazione di cellule staminali adipose - Google Patents
Tecnica di purificazione del tessuto adiposo per ottenere alta concentrazione di cellule staminali adiposeInfo
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Description
TECNICA DI PURIFICAZIONE DEL TESSUTO ADIPOSO PER OTTENERE
ALTA CONCENTRAZIONE DI CELLULE STAMINALI ADIPOSE
DESCRIZIONE
Campo tecnico dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la preparazione di una matrice rigenerativa biologica purificata, autoioga ed istocompatibile, costituita prevalentemente da cellule staminali adipose (ADSC) ed al prodotto ottenibile mediante tale procedimento. La presente invenzione si riferisce anche all’uso terapeutico e cosmetico di tale prodotto, ad esempio per il trattamento di ulcere croniche, ringiovanimento cutaneo, riempimento di rughe superficiali, alopecia, smagliature, radiodermiti croniche, patologie degenerative acute e croniche, rigenerazione tissutale, patologie immuno-degenerative come ad esempio lichen scleroatrofico, lupus, sclerodermia.
Stato della tecnica
Le prime, isolate, esperienze con l'innesto di tessuto adiposo risalgono al secolo scorso. Dalla fine degli anni '90, successivamente alla standardizzazione della tecnica, l’innesto è diventato il gold standard nella correzione dei deficit volumetrici secondari a patologie congenite, degenerative, traumatiche o all'invecchiamento. Le cellule staminali adipose (ADSC) (CD31-, CD34+, CD45-, CD90+, CD105-, CD146-) sono state scoperte nel 2001. Da allora, numerosi studi hanno valutato tali cellule progenitrici mesenchimali, estendendone gli ambiti d’applicazione ben oltre la chirurgia plastica. Le proprietà rigenerative dell’innesto di tessuto adiposo sono state solidamente dimostrate in vitro ed in vivo e sono dovute alla componente di cellule staminali contenute nella frazione vascolo-stromale del lipoaspirato. Le cellule ADSC presentano un’elevata resistenza all'ischemia, un’estesa capacità proliferativa e l'abilità di differenziare nelle linee mesodermiche, ectodermiche o endodermiche. Sebbene non vi siano attualmente linee guida al riguardo, le differenti tecniche di prelievo, il processamento ed infiltrazione possono influenzare il numero, la vitalità e la capacità di differenziarsi delle ADSC. Tali cellule sono massimamente presenti nello strato adiposo del lipoaspirato trattato mediante decantazione e nel “pellet’ caudale del lipoaspirato trattato mediante centrifugazione secondo Coleman. Sono state descritte alcune tecniche per isolare la frazione staminale, concentrarla in vitro ed aggiungerla al lipoaspirato prima dell’innesto (Cell-assisted lipotransfer, CAL). Tali tecniche richiedono però attrezzature apposite che consentano il deposito del tessuto adiposo, il suo trattamento mediante agenti chimici e l’espansione in vitro delle ADSC prima del reimpianto. Tali manipolazioni non sono consentite da alcuni sistemi legislativi, tra cui quello italiano. Inoltre, il CAL risulta costoso e spesso non applicabile nella pratica clinica routinaria. Il nano-innesto adiposo è una tecnica, descritta nel 2013 (Tonnard P. et al., Nanofat grafting : basic research and clinical applications. Piasi Reconstr Surg. 2013 Oct; 132(4): 1017) secondo la quale il lipoaspirato viene emulsionato meccanicamente mediante ripetuti passaggi tra 2 siringhe. Tale procedura determina il danneggiamento degli adipociti maturi, mantenendo vitali e funzionalmente inalterate le ADSC. Con tale metodica, è quindi possibile isolare ed iniettare a livello intradermico superficiale un’emulsione contenente la frazione vascolo-stromale del lipoaspirato, ADSC, frammenti adipocitari ed olio. La capacità riempitiva del nano-innesto di tessuto adiposo è minima a seguito della frammentazione adipocitaria, di conseguenza tale tecnica è indicata nella rigenerazione tissutale piuttosto che nell’incremento volumetrico.
Nell’articolo di Takanobu Mashiko et al. Plastic & Reconstructive Surgery: January 2017 è descritto un procedimento per la condensazione di cellule staminali adipose comprendente un passaggio di emulsificazione descritto nel video 2 fornito come materiale supplementare dell’articolo. In tale passaggio sono usate due siringhe da 2,5 mi disposte a 180° gradi tra loro unite da un connettore con tre piccoli buchi (Transfer Emulsifier; Tulip Medicai, San Diego, Calif.)
Scopo della presente invenzione è quindi quello di fornire nuovi procedimenti per la preparazione di un concentrato di cellule staminali adipose e il preparato ottenibile mediante tale procedimento che non presentino gli svantaggi della tecnica nota, in particolare consentano di ottenere un preparato con una concentrazione media di cellule staminali adipose più elevata rispetto al procedimento descritto da Takanobu Mashiko et al, preservandone riniettabilità mediante ago sottile.
Sommario dell’invenzione
Come descritto nel paragrafo precedente i tentativi di concentrare le cellule staminali adipose con minima manipolazione (ossia solo con strumenti meccanici), hanno sinora dato risultati contrastanti. Tali tecniche, inoltre, non permettono la separazione delle cellule staminali adipose dagli adipociti maturi, risultando quindi in un prodotto „ibrido“, contenente entrambe le componenti. Ciò è particolarmente rilevante in quanto il tessuto ricevente l’innesto di tale prodotto può riceverne una quantità limitata, oltre la quale l’aumento della pressione interstiziale generato dall’iniezione supera la pressione di perfusione micro vascolare, riducendo l’apporto ematico locale e di conseguenza l’attecchimento del materiale iniettato. In casi estremi, o in tessuti già compromessi, suddetto aumento della pressione interstiziale può determinare una vera e propria necrosi tissutale. Il nano-innesto di tessuto adiposo, invece, permette la frammentazione degli adipociti maturi con preservazione delle cellule staminali adipose. Il nano-innesto di tessuto adiposo presenta tuttavia diversi limiti rispetto alle tecniche di minima manipolazione che preservano gli adipociti maturi, tra cui il ridotto numero di cellule staminali adipose e la presenza di olio nella soluzione iniettata, derivante dalla frammentazione degli adipociti stessi (tale materiale può esercitare un effetto isto-lesivo e determinare reazioni granulomatose). L’alternativa a tali tecniche, eseguite con minima manipolazione, è l’isolamento ed espansione delle cellule staminali adipose in vitro. Questo richiede tuttavia attrezzature apposite, il trattamento del materiale prelevato (e quindi da impiantare) mediante agenti chimici e l’espansione delle cellule prima del reimpianto. Tali manipolazioni non sono consentite da alcuni sistemi legislativi al di fuori di protocolli sperimentali, tra cui quello italiano. Inoltre, risultano costose e molto lunghe, quindi non applicabili nella pratica clinica routinaria.
Tali problemi sono risolti da un procedimento secondo la rivendicazione 1 e dal preparato di cellule staminali adipose ottenibili tramite tale procedimento secondo la rivendicazione 9.
Caratteristiche preferite della presente invenzione sono oggetto delle rivendicazioni dipendenti.
Il procedimento secondo la presente invenzione permette di ottenere un prodotto con una concentrazione di cellule staminali superiore rispetto alle tecniche con minima manipolazione già descritte in letteratura ed al nano innesto di tessuto adiposo. Tale prodotto è ottenuto esclusivamente con mezzi meccanici, quindi nel rispetto della definizione di “minima manipolazione” e della legge italiana vigente.
Rispetto alle tecniche precedentemente riportate in letteratura, si ottiene un prodotto costituito prevalentemente da cellule staminali adipose.
Rispetto al procedimento descritto nell’articolo di Takanobu Mashiko et al. Plastic & Reconstructive Surgery: January 2017, gli inventori hanno sorprendentemente scoperto che modificando il passaggio di emulsificazione è possibile ottenere un preparato di cellule staminali adipose con una concentrazione più elevata, preservandone la vitalità e garantendone, al termine dell’intera processazione, l’iniettabilità con ago sottile.
Più in dettaglio gli inventori hanno trovato che se invece di usare nel passaggio di emulsificazione due siringhe disposte a 180° gradi tra loro unite da un connettore con tre piccoli buchi (Transfer Emulsifier; Tulip Medicai, San Diego, Calif.) sono usate due siringhe disposte a 90° semplicemente connesse con un tubo di plastica a T è possibile ottenere un preparato con concentrazioni più elevate di cellule staminali adipose.
L’eliminazione degli adipociti maturi e dell’olio derivante dalla frammentazione degli stessi garantisce un elevato rapporto cellule staminali/volume. Pertanto è teoricamente possibile ottenere un’elevata efficacia rigenerativa iniettando un volume ridotto. In tal modo, si previene l’aumento eccessivo della pressione interstiziale, evitando la compromissione del micro-circolo locale e permettendo un migliore attecchimento delle cellule iniettate.
L’assenza degli adipociti maturi permette:
-che i metaboliti che giungono nella sede ricevente mediante diffusione e neovascolarizzazione siano utilizzati esclusivamente dalle cellule staminali iniettate e non per l'attecchimento degli adipociti stessi;
-l'iniezione mediante aghi sottili che, rispetto alle cannule convenzionali, consentono di creare un numero maggiore di tunnel in cui depositare le cellule staminali, favorendone quindi l’integrazione e la vascolarizzazione nella sede ricevente;
-maggiore facilità di iniezione nei processi flogistici cronici, in cui la fibrosi rende difficile l'introduzione di cannule ed a livello intradermico.
-l’assenza di olio riduce l'infiammazione ossidativa della sede ricevente e permette di evitare la formazione di granulomi.
-i frammenti cellulari, le sostanze intracellulari rilasciate nel processo di frammentazione meccanica e la matrice extracellulare presenti nel prodotto fungono da matrice biologica e contribuiscono alla cascata infiammatoria alla base della stimolazione pro-differenziativa delle cellule staminali locali ed iniettate.
-complessivamente, si realizza una matrice rigenerativa, biologica, autoioga, istocompatibile ricca in cellule staminali ed ottenuta con minima manipolazione
Altri vantaggi, caratteristiche e le modalità di impiego della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di alcune forme di realizzazione, presentate a scopo esemplificativo e non limitativo.
Descrizione breve delle figure
la Figura 1 mostra una rappresentazione schematica dei passaggi del metodo secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione: A: il tessuto adiposo dopo il prelievo; B: centrifugazione a 1200 g per 3 minuti; C: gli strati 1 e 3 sono rimossi, mentre gli strati 2 e 4 vengono preservati; D: è eseguita remulsificazione; E: centrifugazione a 1200 g per 3 minuti; F: gli strati I e 3 sono rimossi, mentre gli strati 2 e 4 vengono preservati; il prodotto ottenuto è pronto per la re-iniezione nel paziente.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
E’ qui descritto un procedimento per la preparazione di un preparato di cellule staminali adipose che si compone dei seguenti aspetti, descritti in dettaglio di seguito.
II materiale di partenza utilizzato nei passaggi in vitro è un campione biologico di tessuto adiposo ottenuto da un donatore/paziente.
Tale campione potrà essere preparato mediante prelievo del tessuto adiposo preferibilmente con cannula multiforata con fori da 1 mm collegata a siringa luer-lock da 10 cc.
Il prelievo sarà preceduto da un passaggio d’infiltrazione del sito donatore, ad esempio con una soluzione fisiologica comprendente adrenalina. Nel caso in cui sia necessaria un’anestesia locale, nella soluzione potrà essere aggiunto un anestetico come ad esempio la ropivacaina.
Il procedimento di preparazione comprende i seguenti passaggi operativi in vitro
i) il campione di tessuto adiposo è sottoposto ad un passaggio di centrifugazione, in particolare ad almeno 1200 g per almeno 3 minuti. Preferibilmente il campione sarà centrifugato nello stesso dispositivo usato per il prelievo del tessuto adiposo, ad esempio una siringa, più specificatamente una siringa luer-lock da 10 cc.
ii) dopo la centrifugazione viene rimosso dal campione, mediante aspirazione, l’olio presente nello stato craniale dopo centrifugazione ed il siero presente nello strato inferiore dopo centrifugazione. L’aspirazione sarà eseguita mediante idonei mezzi di aspirazione, in particolare un ago da 18 o 20 G. In questa fase di aspirazione sarà importante evitare di rimuovere il pellet cellulare presente nella porzione più caudale della siringa.
iii) dopo il passaggio ii) il campione è sottoposto ad un passaggio di frammentazione. Il passaggio di frammentazione è eseguito mediante energici passaggi del campione tra due siringhe, preferibilmente da 10 co, connesse mediante un condotto, in particolare un rubinetto ad angolo retto, preferibilmente il condotto sarà nello stesso materiale delle siringhe ad esempio PVC. Il numero di passaggi di frammentazione sarà preferibilmente compreso tra 30 e 60, ancora più preferibilmente almeno 50, sino a raggiungere remulsificazione del prodotto.
iv) dopo il passaggio iii) il campione è sottoposto ad un ulteriore passaggio di centrifugazione, in particolare ad almeno 1200 g per almeno 3 minuti.
v) dopo il secondo passaggio di centrifugazione iv) il campione è sottoposto ad un secondo passaggio di aspirazione dell'olio e del siero. Anche in questo secondo passaggio l'aspirazione sarà eseguita mediante idonei mezzi di aspirazione, come ad esempio un ago da 18 o 20 G. Anche in questa fase di aspirazione sarà importante evitare di rimuovere il pellet cellulare presente nella porzione più caudale della siringa.
Il prodotto ottenuto tramite questo procedimento potrà quindi essere direttamente infiltrato o addizionato con il prodotto ottenuto in altre siringhe con procedimento analogo o con altre sostanze come ad esempio l’acido labronico e/o il collagene.
Ulteriore oggetto della presente descrizione è il preparato di cellule staminali adipose ottenibile con il procedimento sopra descritto. Il preparato costituito da un concentrato cellulare, si caratterizza per essere una matrice rigenerativa, biologica, autoioga, istocompatibile, ricca in cellule staminali (che ne sono la componente prevalente) ed ottenuta con minima manipolazione. L’eliminazione degli adipociti maturi e dell’olio derivante dalla frammentazione degli stessi garantisce un elevato rapporto cellule staminali/volume, con una concentrazione media di cellule staminali adipose del 44% (in un range tra il 44 ed il 69%) a fronte di una concentrazione media di partenza del grasso del 6% (in un range tra ΙΊ.5 e ΙΊ 1 %), ossia ottenendo, per la prima volta in letteratura con una minima manipolazione, una concentrazione delle cellule staminali adipose di 7 volte rispetto al tessuto adiposo di partenza (a differenza del prodotto descritto nella pubblicazione di Takanobu Mashiko et al ove la concentrazione di cellule staminali adipose nel prodotto emulsificato è di sole 1,8 volte quella del tessuto adiposo). Pertanto è teoricamente possibile ottenere un’elevata efficacia rigenerativa iniettando un volume ridotto. In tal modo, si previene l’aumento eccessivo della pressione interstiziale, evitando la compromissione del micro-circolo locale e permettendo un migliore attecchimento delle cellule iniettate.
Inoltre il preparato cellulare è caratterizzato dall’assenza di olio, questa caratteristica previene l’isto-tossicità locale su base ossidativa.
Ulteriore oggetto della presente descrizione sono composizioni comprendenti il preparato cellulare ed uno o più veicolanti, diluenti e/o eccipienti farmacologicamente accettabili. Le composizioni della presente invenzione potranno essere formulata con uno o più veicolanti e/o diluenti e/o eccipienti secondo le tecniche note, ad esempio acido ialuronico e collagene. Le composizioni saranno preferibilmente in forma di soluzione o sospensione.
Il preparato cellulare secondo la presente invenzione e le composizioni che lo comprendono potranno essere usate in un metodo di trattamento di ulcere croniche, ringiovanimento cutaneo, riempimento di rughe superficiali, alopecia, smagliature, radiodermiti croniche, patologie degenerative acute e croniche, rigenerazione tissutale, patologie immuno-degenerative come ad esempio lichen scleroatrofico, lupus, sclerodermia.
Un ulteriore oggetto qui descritto è un metodo in vivo per il trattamento della patologie sopra dette comprendente i passaggi in vitro sopra descritti ed un ulteriore passaggio d’infiltrazione del preparato cellullare o di una composizione che lo comprende nello stesso paziente da cui è stato eseguito il prelievo del tessuto adiposo.
La presente invenzione è stata fin qui descritta con riferimento a forme preferite di realizzazione. È da intendersi che possano esistere altre forme di realizzazione che afferiscono al medesimo nucleo inventivo, come definito daN’ambito di protezione delle rivendicazioni qui di seguito riportate.
ESEMPI
Esempio 1 Procedimento per la preparazione delle cellule staminali da tessuto adiposo secondo una forma di realizzazione preferita.
Il procedimento ha previsto i seguenti passaggi:
1. Infiltrazione del sito donatore con parte di una soluzione costituita da 1 litro di soluzione fisiologica ed 1 co di adrenalina in caso di anestesia generale, da 1 litro di soluzione fisiologica, 1 co di di adrenalina e 225 mg di Ropivacaina in caso di intervento eseguito in sedazione o anestesia locale.
2. Prelievo del tessuto adiposo mediante cannula multiforata con fori da 1 mm collegata a siringa luer-lock da 10 co.
3. La siringa utilizzata per il prelievo viene posizionata in centrifuga ed il materiale ivi contenuto sottoposto a centrifugazione a 1200 g per 3 minuti.
4. Vengono rimossi, mediante aspirazione con una siringa collegata ad un ago da 18 o 20 G, l’olio (presente nello strato craniale dopo centrifugazione) ed il siero con l'anestetico precedentemente infiltrato (presenti in uno strato inferiore rispetto a quello del tessuto adiposo dopo centrifugazione, cranialmente al pellet cellulare), evitando di rimuovere il pellet cellulare presente nella porzione più caudale della siringa.
5. Il materiale residuo viene frammentato mediante ripetuti passaggi (circa 50) tra 2 siringhe da 10 co connesse mediante un rubinetto ad angolo retto.
6. Il prodotto così ottenuto viene nuovamente centrifugato a 1200 g per 3 minuti.
7. Vengono rimossi, mediante aspirazione con una siringa collegata ad un ago da 18 o 20 G, l’olio (presente nello strato craniale dopo centrifugazione) ed il siero con l’anestetico precedentemente infiltrato (presenti in uno strato inferiore rispetto a quello del tessuto adiposo dopo centrifugazione, cranialmente al pellet cellulare), evitando di rimuovere il pellet cellulare presente nella porzione più caudale della siringa.
8. Il prodotto residuo nella siringa può essere direttamente infiltrato o addizionato con il prodotto ottenuto in altre siringhe con procedimento analogo o altri presidi medici (ad es. ac. ialuronico, collagene..).
Esempio 2 Caratterizzazione del preparato ottenuto dall’esempio 1
Un’aliquota del prodotto ottenuto è stata utilizzata, in studi preliminari, per caratterizzare le cellule prodotte con tale metodica.
In particolare, le cellule sono state analizzate mediante citofluorimetria a flusso (BD FACS canto II), utilizzando anticorpi specifici per marcatori di superficie quali CD34, CD44, CD45, CD90 e CD105 (BD).
La concentrazione media di cellule staminali adipose nel prodotto è stata del 44% a fronte di una concentrazione media di partenza del grasso del 6% (in un range tra Γ 1.5 e Γ 11 %)
La vitalità del concentrato cellulare è stata dimostrata mediante coltura del prodotto ottenuto: le cellule, dopo circa una settimana di quiescenza dal prelievo, cominciavano a proliferare attivamente, assumendo una morfologia simil-fibroblastoide tipica delle cellule staminali mesenchimali e delle cellule staminali adipose. La multipotenzialità differenziativa è stata dimostrata in vitro mediante induzione verso le linee osteogenica ed adipogenica, utilizzando specifici terreni di coltura.
Claims (19)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento in vitro per la preparazione di cellule staminali adipose comprendente i seguenti passaggi: i) sottoporre un campione di tessuto adiposo ad un primo passaggio di centrifugazione; ii) aspirare l’olio ed il siero dal campione centrifugato al passaggio i); iii) sottoporre a frammentazione il campione dopo l'aspirazione del passaggio ii); iv) sottoporre ad un secondo passaggio di centrifugazione il campione ottenuto dalla frammentazione del passaggio iii); v) eseguire un secondo passaggio di aspirazione dell’olio e del siero dal campione ottenuto dopo la seconda centrifugazione del passaggio iv), in cui detto procedimento è caratterizzato dal fatto che detto passaggio di frammentazione è eseguito mediante due siringhe connesse mediante un condotto ad angolo retto, in particolare mediante un rubinetto.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui detto primo e/o secondo passaggio di centrifugazione sono eseguiti ad una velocità di 1200 g per un tempo di almeno 3 minuti.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui durante uno o più passaggi del procedimento il campione di tessuto adiposo è mantenuto nello stesso dispositivo in cui è stato conservato dopo l'aspirazione dal paziente, in particolare detto dispositivo è una siringa luer-lock da 10 co.
- 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto primo e/o secondo passaggio di aspirazione è eseguito mediante un ago da 18 o 20 G.
- 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui in detto primo e/o secondo passaggio di aspirazione l’olio è aspirato nello strato craniale e/o il siero è aspirato nello strato inferiore rispetto allo strato del tessuto adiposo.
- 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui in detto primo e/o secondo passaggio di aspirazione non è rimosso il pellet cellulare presente nella porzione più caudale del dispositivo che contiene il campione.
- 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto passaggio di frammentazione è eseguito sino a raggiungere emulsificazione.
- 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto passaggio di frammentazione è eseguito per un numero di volte compreso tra 30 e 60, in particolare 50.
- 9. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto passaggio di frammentazione è eseguito mediante due siringhe da 10 co..
- 10. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto campione di tessuto adiposo è ottenuto da un donatore mediante aspirazione.
- 11. Preparato di cellule staminali adipose ottenibili secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti con una concentrazione media di cellule staminali adipose comprese tra il 44% ed il 69%.
- 12. Preparato di cellule staminali adipose caratterizzato da una concentrazione media di cellule staminali adipose superiore al 44%
- 13. Preparato di cellule staminali adipose secondo la rivendicazione 12 caratterizzato da una concentrazione media di cellule staminali adipose comprese tra il 44% ed il 69%.
- 14. Preparato di cellule staminali adipose secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 13 per uso in un metodo di trattamento di ulcere croniche, radiodermiti croniche, patologie degenerative acute e croniche, rigenerazione tissutale, patologie immuno-degenerative.
- 15. Composizione comprendente il preparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 14 e uno o più veicolanti e/o diluenti e/o eccipienti farmacologicamente accettabili.
- 16. Composizione secondo la rivendicazione 15 per uso in un metodo di trattamento di ulcere croniche, radiodermiti croniche, patologie degenerative acute e croniche, rigenerazione tissutale, patologie immuno-degenerative.
- 17. Composizione secondo la rivendicazione 16 in cui detta patologia immunodegenerativa è scelta tra lichen scleroatrofico, lupus o sclerodermia.
- 18. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 17 ulteriormente comprendente collagene e/o acido ialuronico.
- 19. Uso cosmetico del preparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 13 o della composizione una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 18 per 11 ringiovanimento cutaneo, il riempimento di rughe superficiali, l’alopecia o le smagliature.
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