TW202026416A - 分離血液的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明公開一種分離血液的方法，其包括以下步驟：首先，將一全血置於一具有分離膠的容器中，其中分離膠含有含矽聚合物，且分離膠的比重介於1.030至1.093之間；接著，使用一第一有效轉速進行離心，以將全血分成一位於分離膠下方的紅血球層、一位於分離膠上方的膚色血球層以及一位於膚色血球層上方的血漿層；然後，將膚色血球層以及血漿層混合，以得到一富含血小板血漿。藉此，透過本發明分離血液的方法可以在同一容器內快速地分離產生富含血小板血漿、富含血小板纖維蛋白或血小板裂解液。

Description

分離血液的方法
本發明涉及一種分離血液的方法，特別是涉及一種可快速分離血液的方法。
隨著再生醫學(regenerative medicine)的進步，利用幹細胞(stem cells)與以及生長因子(growth factor)促進細胞組織修復再生以達到治療效果的應用日漸成熟。
富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)，又稱為高濃度血小板血漿，是將全血經過離心後所得到的，其主要有效成分為血小板。血小板活化後會釋出許多不同功能的顆粒物(granules)，主要為生長因子，其能夠刺激細胞增殖與細胞分化，對於緩解組織發炎反應、與促進細胞組織修復與增生都具有相當好的成效。富含血小板血漿已在運動醫學領域有所臨床應用，例如用於治療職業運動員的軟組織傷害，也可以應用於醫學美容以及牙科領域。此外，含血小板血漿的製備通常是採集自體血液進行製備，因此並不會產生非自體組織的排斥反應。
另外，被稱作二代PRP的富含血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)，其為果凍狀，可塑性較佳，常與骨粉搭配被應用於齒槽骨再生手術，或是將富含血小板纖維蛋白壓製成膜狀後，將其應用於牙周再生手術。
相較於前述兩者，血小板裂解液(platelet lysate,PL)去除了血小板膜、纖維蛋白與細胞碎片等，可讓免疫反應降到最低，同時 保留生長因子。研究指出，血小板裂解液可以明顯促進骨頭再生與修復；其與自體骨髓間質幹細胞混和可以加速成骨速度。
然而，由於富含血小板血漿、富含血小板纖維蛋白以及血小板裂解液的治療通常是採取即時分離後立即使用的方式，而研究指出，紅血球的殘留可能會導致受體的疼痛以及發炎反應。因此，如何快速且有效分離出高濃度有效成分的富含血小板血漿、富含血小板纖維蛋白或血小板裂解液是本技術領域亟待解決的問題。
本發明所要解決的技術問題在於，針對現有技術的不足提供一種分離血液的方法，其可以在同一個分離容器中快速地製備而得的富含血小板血漿或血小板裂解液，並且具有高紅血球移除率。
為了解決上述的技術問題，本發明所採用的其中一技術方案是：一種分離血液的方法，其包括以下步驟。首先，將一全血置於一具有分離膠的容器中，其中所述分離膠含有含矽聚合物，且所述分離膠的比重介於1.030至1.093之間；接著，使用一第一有效轉速進行離心，以將所述全血分成一位於所述分離膠下方的紅血球層、一位於所述分離膠上方的膚色血球層以及一位於所述膚色血球層上方的血漿層；然後，將所述膚色血球層以及所述血漿層混合，以得到一富含血小板血漿。
為了解決上述的技術問題，本發明所採用的另外一技術方案是：一種分離血液的方法，其包括以下步驟。首先，將一全血置於一具有分離膠的容器中，其中所述分離膠含有含矽聚合物，且所述分離膠的比重介於1.030至1.093之間；接著，使用一第一有效轉速進行離心，以將所述全血分成一位於所述分離膠下方的紅血球層、一位於所述分離膠上方的膚色血球層以及一位於所述膚色血球層上方的血漿層；然後，將所述膚色血球層以及所述血漿層混合，以得到一富含血小板血漿；然後，使用一第二有效轉速 進行一多階段離心，以使所述富含血小板血漿形成一血小板裂解液。
本發明的其中一有益效果在於，本發明所提供的分離血液的方法，其能通過“以一第一有效轉速離心全血，使所述分離膠將所述全血分為所述紅血球層、所述膚色血球層以及所述血漿層”以及“所述分離膠含有含矽聚合物，且所述分離膠的比重介於1.030至1.093之間”的技術方案，以在同一容器內快速地分離出富含血小板血漿或血小板裂解液。
為使能更進一步瞭解本發明的特徵及技術內容，請參閱以下有關本發明的詳細說明與圖式，然而所提供的圖式僅用於提供參考與說明，並非用來對本發明加以限制。
S100~S108‧‧‧步驟
1‧‧‧分離容器
11‧‧‧儲血管
12‧‧‧分離膠
13‧‧‧蓋體
2‧‧‧全血
21‧‧‧紅血球層
22‧‧‧膚色血球層
23‧‧‧血漿層
24‧‧‧富含血小板血漿
241‧‧‧上層分離液
242‧‧‧下層分離液
30‧‧‧注射器
40‧‧‧成型皿
圖1為本發明的分離血液的方法的流程圖。
圖2為本發明的分離血液的方法中所使用的分離容器的側視圖。
圖3為圖1中步驟S100的示意圖。
圖4為圖1中完成步驟S102的示意圖。
圖5為圖1中完成步驟S104的示意圖。
圖6為圖1中步驟S106的示意圖。
圖7為圖1中完成步驟S108的示意圖。
近年來，因自體生長因子再生療法的需求增加，導致如何有效且快速分離出高濃度的富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)、富含血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)與血小板裂解液(platelet lysate,PL)具迫切需要。此外，需要確保患者於自體再生療程時，不會因PRP、PRF或PL中殘留有紅血球而產生疼痛或 發炎反應。因此，本發明提供一種分離血液的方法，其能快速有效地在同一分離容器中直接製備得到富含血小板血漿或血小板裂解液。
以下是通過特定的具體實施例來說明本發明所公開有關“分離血液的方法”的實施方式，本領域技術入員可由本說明書所公開的內容瞭解本發明的優點與效果。本發明可通過其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節也可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明的構思下進行各種修改與變更。另外，本發明的附圖僅為簡單示意說明，並非依實際尺寸的描繪，事先聲明。以下的實施方式將進一步詳細說明本發明的相關技術內容，但所公開的內容並非用以限制本發明的保護範圍。
應當可以理解的是，雖然本文中可能會使用到“第一”、“第二”、“第三”等術語來描述各種元件或者信號，但這些元件或者信號不應受這些術語的限制。這些術語主要是用以區分一元件與另一元件，或者一信號與另一信號。另外，本文中所使用的術語“或”，應視實際情況可能包括相關聯的列出項目中的任一個或者多個的組合。
請參閱圖1所示，本發明實施例提供一種分離血液的方法，其主要包括：步驟S100，將一全血置於一具有分離膠的容器中；步驟S102，使用第一有效轉速進行離心，將全血分成紅血球層、膚色血球層及血漿層；以及步驟S104，混合膚色血球層與血漿層，得到富含血小板血漿。
請參閱圖2所示，本發明中所使用的一種分離容器1其包括一儲血管11、一分離膠12以及一蓋體13。其中，儲血管11是一具有一開口端與一相對於封閉端的硬質管；分離膠12是置於儲血管11內，例如：置於靠近封閉端；蓋體13可拆卸地緊密卡合於儲血管11的開口處，用以將開口外露或封閉。值得注意的是，分 離膠12含有含矽聚合物，且所述分離膠12的比重可介於1.030至1.093之間，但不限於此。在本實施例中，分離膠12視需要可含有其他成分，例如觸變劑及無毒性的惰性有機潤滑劑等。詳細而言，觸變劑是用以調整分離膠的黏度。分離膠12的物理性質如下表1所示：
Figure 108101218-A0101-12-0005-1
舉例而言，分離容器1為塑膠離心管或玻璃離心管，但並不以此為限。於其施用狀態時，是經過採血之後，再於無菌狀態下將血液移置分離容器1中，且分離容器1可以被置於離心機中進行離心。
請再次參閱圖1所示，本發明實施例提供一種分離血液的方法，可再進一步包括：步驟S106，將富含血小板血漿自容器中取出，使其凝結，藉以形成富含血小板纖維蛋白。
或者，本發明實施例提供一種分離血液的方法，另可進一步包括：步驟S108，使用一第二有效轉速進行一多階段離心，使富含血小板血漿形成一血小板裂解液。
值得說明的是，於步驟S104所得到的富含血小板血漿、於步驟S106所得到的富含血小板纖維蛋白以及於步驟S108所得到的血小板裂解液，皆屬於本發明分離血液的方法的目標產物。以下將分別詳細敘述分離出各目標產物的方法。
圖1為本發明的分離血液的方法的步驟流程圖。以下製備例 請搭配圖1所示。
製備例1 富含血小板血漿(Platelet-Rich Plasma,PRP)的製備
於本發明所述之分離血液的方法中，全血可以是採集自哺乳動物自體血液，因此，在得到自體促進再生物質(例如：富含血小板血漿、富含血小板纖維蛋白、血小板裂解液)之後可應用於自體的療程使用，而並不會造成免疫反應的排斥問題。
請參閱圖1的步驟S100，將一全血置於一具有分離膠的容器中。再參閱圖3所示，於本製備例中，首先將10ml受體的全血2採集至前述之分離容器1中，一般而言，分離膠12可以是裝填於儲血管11中的底部，厚度大於5mm，但不以此為限。全血的採集可以是同前述的真空採血管採血，也可以是將真空採血管中的血液無菌置入分離容器1中。
接著，如圖1所示的步驟S102，使用第一有效轉速進行離心。於本實施例中，以一第一有效轉速離心含有全血2的分離容器1。第一有效轉速可以是介於3000rpm至4000rpm，離心時間可以是介於3分鐘至10分鐘，但不以此為限。經過離心後，請參閱圖5所示，分離容器1由下至上會有紅血球層(red blood cells layer)21、分離膠12、膚色血球層(buffy coat layer)22以及血漿層(blood plasma layer)23，共四層分離層。
紅血球層21的主要內容物為紅血球，其約占全血2總體積的40%，並負責氧氣與二氧化碳的運輸。在全血2中，僅有紅血球的比重大於分離膠12的比重，因此，在離心時僅有紅血球可以通過分離膠12並沉澱於分離容器1的最下層，使分離膠12位於紅血球層21與膚色血球層22之間，意即，分離膠12隔離了紅血球層21。
膚色血球層22的主要內容物為有核細胞(例如：幹細胞與白 血球等)以及血小板，其約占全血總體積的5%。血漿層23的主要內容物為全血的清液成分，約占全血總體積的55%，血漿層23中包含有水分以及許多蛋白質，例如抗體、酵素、激素等。
最後，如圖1的步驟S104，混合膚色血球層以及血漿層，得到富含血小板血漿。在分離容器1中將膚色血球層22以及血漿層23混合，以得到一富含血小板血漿24(如圖5所示)。
更進一步而言，在混合膚色血球層22以及血漿層23之前，可以取出血漿層23總體積的1體積%至90體積%，並保留剩餘的血漿層23，藉以在步驟S104最後可以得到濃度高1.3至25倍的富含血小板血漿24。例如，將原本離心後為5ml的血漿層23取出4ml，保留約1ml的血漿層23後，再將膚色血球層22以及血漿層23混合，以得到濃縮型的富含血小板血漿24，但不以此為限。舉例而言，於手術操作時，醫生會依據患部評估PRP的施打總量，進而回推血漿層23所需剩餘的含量。
值得說明的是，分離膠12並不會隨著分離容器1傾斜倒置而翻轉，因此，本發明的分離血液的方法可以直接在同一分離容器1內進行混合膚色血球層22以及血漿層23的步驟，而得到富含血小板血漿24。混合的方式可以是使用電動吸管輔助器(pipette aid)或微量分注器反覆吸放混合，也可以將分離容器1的蓋體13蓋緊後，以反覆傾斜分離容器1的兩端進行混合，過程中因為有分離膠12的阻擋，紅血球層21並不會因為反覆傾斜而參雜到富含血小板血漿24中。
研究指出，當有紅血球殘留於自體促進再生物質中(例如：富含血小板血漿、富含血小板纖維蛋白、富含血小板裂解液)時，其可能會造成患者產生疼痛、發炎等反應。然而，一般血液分離方式只能將全血分層，因此紅血球層會緊鄰膚色血球層，必須捨棄部份的膚色血球層才可以避免取到紅血球，進而導致血小板的含量較低。換言之，若欲得到血小板含量較高的富含血小板血漿， 需要將血漿層及膚色血球層盡可能地取出，其過程中有可能會取到紅血球，因此造成紅血球的殘留率以及患者產生副作用的風險也會較高。此外，由於紅血球層緊鄰膚色血球層，因此需要將血漿層與膚色血球層取出至另外一容器中才可以將其混合，進而增加了操作步驟以及作業時間，而本發明所述的分離血液的方法只需要不到10分鐘的操作步驟即可以完成自體富含血小板血漿的製備。
值得說明的是，由於抗凝血劑會抑制血小板的活化，當血小板處於未活化的狀態時，由血小板所分泌的生長因子的產量會大幅降低。本發明的分離血液的方法不含有抗凝血劑，因此，相較於含有抗凝血劑的分離血液方法，本發明的分離血液的方法所製備而得的富含血小板血漿、富含血小板纖維蛋白以及富含血小板裂解液中的生長因子濃度可高出2.6至13倍。
製備例2 富含血小板纖維蛋白(Platelet-Rich Fibrin,PRF)的製備
請參閱圖1所示，本發明的分離血液的方法可進一步藉由步驟S106，將富含血小板血漿自容器中取出，使其凝結，以形成富含血小板纖維蛋白。如圖6所示，將由製備1製備所得到的富含血小板血漿24使用一注射器30取出並放置於一成型皿40內，並靜置一段時間，靜置時間是依據受患者身體狀況與先前服用藥物影響而定，一般為15至45分鐘，但不在此限，富含血小板血漿24會自然凝結，則可得到富含血小板纖維蛋白。進一步而言，也可以使用無菌紗布將富含血小板纖維蛋白擠壓，則可得到富含血小板纖維蛋白膜。
更進一步而言，富含血小板纖維蛋白也可以是使用濃縮型的富含血小板血漿24所製備而得。
值得說明的是，成型皿40可以依據手術或應用的需求而調整 形狀，使得富含血小板纖維蛋白可以隨著成型皿40的形狀成型，因此，讓富含血小板纖維蛋白在醫療手術上的應用十分廣泛。
製備例3 血小板裂解液(Platelet Lysate,PL)的製備
血小板裂解液是血小板經過裂解後的液體部分，其保留了許多生長因子，並除去了血小板膜以及其他細胞碎片，可進一步降低移植再生時所產生的免疫反應。
請參閱圖1所示，本發明的分離血液的方法也可進一步藉由的步驟S108，使用一第二有效轉速進行一多階段離心，使富含血小板血漿形成一血小板裂解液。將由製備1製備所得到的富含血小板血漿24保留於分離容器1中，以多階段離心，使富含血小板血漿24分成上層分離液241以及下層分離液242(如圖7所示)。上層分離液241為血小板裂解液，下層分離液242則是包含血小板纖維蛋白、血小板膜以及其他細胞碎片。
詳細而言，多階段離心中的第二有效轉速可以是介於3500rpm至4500rpm，離心時間可以是介於3分鐘至15分鐘，但不以此為限。且多階段離心包括是以一預定間隔時間進行間歇離心處理，例如，依據第二有效轉速反覆離心5至15次，且反覆離心的次數是以富含血小板血漿24是否有產生上下層分離液為判斷依據。
[應用說明]
由上述的分離血液的方法製備而得到的富含血小板血漿、富含血小板纖維蛋白以及血小板裂解液當中富含許多生長因子，可以應用於牙科、骨科、復健科、醫學美容、婦產科等再生療法中。
進一步而言，該些生長因子包含：類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、上皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)及結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)等，但不以此為限。上述的生長因子的主要功能包含刺激細胞增生、刺激細胞移行、幫助傷口癒合、促進血管新生、促進膠原蛋白分泌等。
舉例而言，患者可以透過本發明的分離血液的方法，得到的自體的富含血小板血漿，將其與玻尿酸混合後，注射於患者的真皮層與皮下層，藉以達到修飾臉部以及消除靜皺紋的效果。
再舉例而言，一名齒槽骨萎縮的患者，可以透過本發明的分離血液的方法，得到的自體的富含血小板纖維蛋白。接著，將富含血小板纖維蛋白沾取骨粉後，再填入該患者的齒槽骨中，以幫助成骨細胞增生以及加速傷口癒合。
又舉例而言，一名罹患關節炎的患者，可以透過本發明的分離血液的方法，得到的自體的血小板裂解液，再以直接注射患部的方式治療關節炎，使得其關節炎獲得改善。
[實施例的有益效果]
本發明的其中一有益效果在於，本發明所提供的分離血液的方法，其能通過“以一第一有效轉速離心全血，使所述分離膠將所述全血分為所述紅血球層、所述膚色血球層以及所述血漿層”以及“所述分離膠含有含矽聚合物，且所述分離膠的比重介於1.030至1.093之間”的技術方案，以在同一容器內快速地分離出富含血小板血漿或血小板裂解液。
以上所公開的內容僅為本發明的優選可行實施例，並非因此侷限本發明的申請專利範圍，所以凡是運用本發明說明書及圖式內容所做的等效技術變化，均包含於本發明的申請專利範圍內。
指定代表圖為流程圖，故無符號簡單說明

Claims (10)

  1. 一種分離血液的方法，其包括：(a)將一全血置於一具有分離膠的容器中，其中所述分離膠含有含矽聚合物，且所述分離膠的比重介於1.030至1.093之間；(b)使用一第一有效轉速進行離心，以將所述全血分成一位於所述分離膠下方的紅血球層、一位於所述分離膠上方的膚色血球層以及一位於所述膚色血球層上方的血漿層；以及，(c)將所述膚色血球層以及所述血漿層混合，以得到一富含血小板血漿。
  2. 如請求項1所述的分離血液的方法，其中，在所述步驟(c)之後，更進一步包括以下步驟：將所述富含血小板血漿從所述容器中取出，並使其凝結以形成富含血小板纖維蛋白。
  3. 如請求項1或2所述的分離血液的方法，其中，在所述步驟(b)與(c)之間，更進一步包括以下步驟：所述血漿層的總體積的1體積%至90體積%，以提高所述富含血小板血漿的濃度為1.3至25倍。
  4. 如請求項1所述的分離血液的方法，其中，所述步驟(b)中離心的所述第一有效轉速為3000rpm至4000rpm，離心時間為3至10分鐘。
  5. 一種分離血液的方法，其包括：(a)將一全血置於一具有分離膠的容器中，其中所述分離膠含有含矽聚合物，且所述分離膠的比重介於1.030至1.093之間；(b)使用一第一有效轉速進行離心，以將所述全血分成一位於所 述分離膠下方的紅血球層、一位於所述分離膠上方的膚色血球層以及一位於所述膚色血球層上方的血漿層；(c)將所述膚色血球層以及所述血漿層混合，以得到一富含血小板血漿；以及，(d)使用一第二有效轉速進行一多階段離心，以使所述富含血小板血漿形成一血小板裂解液。
  6. 如請求項5所述的分離血液的方法，其中，所述步驟(b)中離心的所述第一有效轉速為3000rpm至4000rpm，離心時間為3至10分鐘。
  7. 如請求項5所述的分離血液的方法，其中，所述步驟(d)中所述多階段離心的所述第二有效轉速為3500rpm至4500rpm，離心時間為3至15分鐘。
  8. 如請求項5所述的分離血液的方法，其中，在所述步驟(b)與(c)之間，更進一步包括以下步驟：所述血漿層的總體積的1體積%至90體積%，以提高所述血小板裂解液的濃度為1.3至25倍。
  9. 如請求項7所述的分離血液的方法，其中，所述多階段離心包括以一預定間隔時間進行間歇離心處理。
  10. 如請求項9所述的分離血液的方法，其中，所述間歇離心處理是依據所述第二有效轉速反覆離心5至15次。
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