TW202126316A

TW202126316A - 製備血小板裂解液的方法及其用於治療聲帶疾病的用途

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Publication number: TW202126316A
Application number: TW109100374A
Authority: TW
Inventors: 李岱蓁; 陳世偉
Original assignee: 亞恩生醫股份有限公司
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2021-07-16
Also published as: TWI772734B

Abstract

本發明提供一種製備血小板裂解液的方法及其用途。所述方法包括：將採集的全血放置於裝有分離膠體的離心管中；對裝有全血及分離膠體的離心管進行第一離心製程，使全血分離成第一上層部分、中間部分以及下層部分；將第一上層部分與中間部分進行混合，以得到富含血小板血漿部分；使富含血小板血漿部分凝結，以得到富含血小板纖維蛋白膠體；以及分離所述富含血小板纖維蛋白膠體，以得到血小板裂解液。

Description

製備血小板裂解液的方法及其用於治療聲帶疾病的用途

本發明是有關於一種製備富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）的衍生物的方法及其用途，且特別是有關於一種製備血小板裂解液的方法及其用於治療聲帶疾病的用途。

富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）為藉由對人類或動物的全血離心而得到的具有高濃度血小板的血漿，而血小板裂解液為富含血小板血漿經進一步處理的衍生物，血小板裂解液含有多種與再生有關的生長因子。因此富含血小板血漿及血小板裂解液已知可被應用在再生醫學。

目前已知製備血小板裂解液的傳統方法為：將PRP進一步加入活化因子後，使用重複解凍冷凍或超音波方式取得血小板裂解液。而上述的傳統方法可能具有以下缺點：收取全血量過多、因分離不完全導致的紅血球汙染、因抗凝劑作用而需重複活化、不易進行濃縮等問題。上述問題會導致收取後的血小板裂解液的生長因子量不足。此外，在製備的血小板裂解液的傳統方式中，需要將PRP自離心管內取出並進行活化，因此在無菌性的效果堪慮，且以冷凍解凍或超音波震盪方式取得血小板裂解液所花的時間過長。因此，如何快速地製備一種具有高濃度生長因子的血小板裂解液，是目前研究人員急欲解決的問題。

聲帶（門）閉合（鎖）不全（Vocal fold insufficiency ; Glottic insufficiency）為一種當發音時，聲帶不完全閉合的症狀，會導致當發音時有不適當的空氣通過聲門，進一步造成聲音嘶啞、發音不長等現象，甚至導致嗆傷的危險，吞嚥困難、痙攣性發聲障礙及因嗆傷而造成之反覆性胸腔感染等都可能因此而產生。然而，造成聲帶閉合不全的成因相當多元，包含：單側或雙側之聲帶麻痺、聲帶萎縮、聲帶溝、聲帶瘢痕或畸形等，其中聲帶瘢痕或畸形可能是由先天性或原發性之疾病、次發性的醫源性損傷如:過長時間的插管或咽喉腫瘤的切除等損傷。

目前聲帶的治療包括音聲治療、玻尿酸或自體脂肪的注射和甲狀軟骨成形術（Thyroplasty）。然而，治療結果並不令人完全滿意，因為聲帶振動最重要的固有層細胞外的基質成分沒有改變，且填充物易被人體吸收，無法進有效的維持。

本發明提供一種製備血小板裂解液的方法，可在無菌的條件下快速地製備具有高濃度生長因子的血小板裂解液。

本發明提供一種包括富含血小板血漿及/或富含血小板血漿的衍生物的醫藥組成物，可有效地修補聲帶。

本發明的實施例提供一種製備血小板裂解液的方法，所述方法包括以下步驟：步驟a)，將採集的全血放置於裝有分離膠體的離心管中，其中分離膠體的密度為1.030 g/cm³ 至1.093 g/cm³ ；步驟b)，對裝有全血及分離膠體的離心管進行第一離心製程，以使全血分離成第一上層部分、中間部分以及下層部分，其中分離膠體位於中間部分與下層部分之間；步驟c)，將第一上層部分與中間部分進行混合，以得到富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）部分；步驟d)，使富含血小板血漿部分凝結，以得到富含血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）膠體；以及步驟e)，分離富含血小板纖維蛋白膠體，以得到血小板裂解液（platelet lysate，PL），其中在步驟a)至步驟e)中未添加抗凝劑。

在本發明的一實施例中，在進行步驟c)之前，可更包括移除部分的第一上層部分，以得到第二上層部分，其中第一上層部分與第二上層部分的體積比率為1:0.01~0.99。

在本發明的一實施例中，上述的抗凝劑可包括抗凝血複方檸檬酸鈉溶液A（Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, Solution A，ACD-A）、抗凝血複方檸檬酸鈉溶液B（Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, Solution B，ACD-B）、抗凝血複方檸檬酸鈉溶液C（Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, Solution C，ACD-C）、檸檬酸-磷酸-葡萄溶液（Citrate-phosphate-dextrose Solution ，CPD）、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、肝素（Heparin)、檸檬酸鈉（ Sodium Citrate）或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的分離膠體的材料可包括含矽聚合物、丙烯酸聚合物或聚酯類聚合物。

在本發明的一實施例中，上述的第一離心製程的離心轉速例如是1000 g至4000 g，離心時間例如是3分鐘至10分鐘。

在本發明的一實施例中，上述的第一上層部分為包含血小板的血漿層，中間部分為包含血小板及白血球的白膜層（buffy coat），以及下層部分為包含紅血球的紅血球層。

在本發明的一實施例中，使富含血小板血漿部分凝結包括對富含血小板血漿部分進行第二離心製程。

在本發明的一實施例中，上述的第二離心製程的離心轉速例如是1000 g至4000 g，離心時間例如是3分鐘至10分鐘。

在本發明的一實施例中，分離富含血小板纖維蛋白膠體包括對富含血小板纖維蛋白膠體進行第三離心製程。

在本發明的一實施例中，上述的所述第三離心製程包括：對富含血小板纖維蛋白膠體進行單次離心，其中離心轉速為1000 g至4000 g，離心時間為3分鐘至45分鐘，或者對富含血小板纖維蛋白膠體進行多次離心，其中離心轉速為1000 g至4000 g，每次的離心時間為3分鐘至15分鐘。

在本發明的一實施例中，製備血小板裂解液的整個製程時間為10分鐘至60分鐘。

在本發明的一實施例中，在進行步驟e)之前，更包括對富含血小板纖維蛋白膠體按壓、擠壓、過濾、超音波震盪或進行冷凍解凍循環，以使得血小板裂解液自富含血小板纖維蛋白膠體釋放。

在本發明的一實施例中，上述的血小板裂解液可包括由TGF-β1、PDGF-BB、PDGF-AB、FGF2、EGF、VEGF及VEGFA中選出的至少一種生長因子，其中TGF-β1的濃度為 1 ng/ml至 10000 ng/ml，PDGF-BB的濃度10 pg/ml至500000 pg/ml，PDGF-AB的濃度為10 pg/ml至500000 pg/ml，FGF2的濃度為1 pg/ml至10000 pg/ml，EGF的濃度為1 pg/ml至10000 pg/ml，VEGF的濃度為1 pg/ml至10000 pg/ml，VEGFA的濃度為0.1 pg/ml至5000 pg/ml。

本發明提供一種醫藥組成物用於治療聲帶疾病之藥物的用途，其中所述醫藥組成物包括富含血小板血漿及/或富含血小板血漿的衍生物。

在本發明的一實施例中，上述的富含血小板血漿的衍生物包括血小板裂解液。

在本發明的一實施例中，上述的聲帶疾病包括聲帶閉合不全。

在本發明的一實施例中，上述的富含血小板血漿及所述富含血小板血漿的衍生物包括由TGF-β1、PDGF-BB、PDGF-AB、FGF2、EGF、VEGF及VEGFA中選出的至少一種生長因子。

在本發明的一實施例中，上述的TGF-β1在醫藥組成物中的濃度為0.7 ng/ml至7000 ng/ml，PDGF-BB在醫藥組成物中的濃度7 pg/ml至350000 pg/ml，PDGF-AB在醫藥組成物中的濃度為7 pg/ml至350000 pg/ml，FGF2在醫藥組成物中的濃度為0.7 pg/ml至7000 pg/ml，EGF在醫藥組成物中的濃度為0.7 pg/ml至7000 pg/ml，VEGF在醫藥組成物中的濃度為0.7 pg/ml至7000 pg/ml，VEGFA在醫藥組成物中的濃度為0.06 pg/ml至3500 pg/ml。

在本發明的一實施例中，上述的醫藥組成物更包括選自玻尿酸、生理食鹽水、自體脂肪及自體幹細胞中的至少一者。

在本發明的一實施例中，上述的醫藥組成物是以注射方式給藥至聲帶。

基於上述，由於本發明的製備血小板裂解液的方法在整個製程皆未添加抗凝劑，因此並沒有將血小板裂解液自離心管取出並重覆活化的額外步驟，藉此可縮短製程時間。此外，本發明的製備血小板裂解液的整個製程皆在同一個離心管中進行操作，因此具有避免污染且具有無菌性的優點。

此外，本發明的包括富含血小板血漿及/或富含血小板血漿的衍生物的醫藥組成物可有效地修補聲帶。

本發明提供一種製備血小板裂解液的方法，可在特定的操作條件下得到具有高濃度生長因子的血小板裂解液，且此方法操作過程簡單、製程時間短，且整個過程無需添加任何抗凝劑。

此外，本發明所提供的含有富含血小板血漿及/或富含血小板血漿的衍生物的醫藥組成物，可有效地修補聲帶。

為了能徹底地了解本發明，將在以下詳盡描述所述製備血小板裂解液的製程步驟。然而，眾所皆知的組成或製程步驟並未描述於細節中，以避免限制本發明。本發明的較佳實施例會詳細描述如下，但本發明不限於此，本發明還可廣泛地施行在其他的實施例中，且本發明的範圍不受限定，以其後的專利範圍為準。

圖1為依照本發明的一實施例的製備血小板裂解液的方法的流程圖。本發明的製備血小板裂解液的方法包括以下步驟。

首先，進行步驟a)，將採集的全血10放置於裝有分離膠體20的離心管30中。在一實施例中，全血10例如是新鮮的哺乳類動物的全血。在本實施例中，全血10例如是新鮮的人類全血。

在本實施例中，分離膠體20的密度為1.030 g/cm³ 至1.093 g/cm³ 。在本實施例中，分離膠體20的材料例如是含矽聚合物、丙烯酸聚合物或聚酯類聚合物。

接著，進行步驟b)，對裝有全血10及分離膠體20的離心管30進行第一離心製程，以使全血10分離成第一上層部分12、中間部分14以及下層部分16，其中分離膠體20位於中間部分14與下層部分16之間。在本實施例中，步驟b)的第一離心製程的離心轉速例如是1000 g至4000 g。在一實施例中，步驟b)的第一離心製程的離心轉速例如是1500g至3000 g。在本實施例中，步驟b)的第一離心製程的離心時間例如是3分鐘至10分鐘。在一實施例中，步驟b)的第一離心製程的離心時間例如是4分鐘至8分鐘。在一實施例中，步驟b)的第一離心製程的離心轉速例如是1500 g，離心時間例如是5分鐘。

在本實施例中，在進行步驟b)後，使得全血10分離成三層的程度，其中最上層（即第一上層部分12）為包含血小板的血漿層，中間層（即中間部分14）為包含血小板及白血球的白膜層（buffy coat），最下層（即下層部分16）為包含紅血球的紅血球層。

在本實施例中，本發明的分離膠體20可有效地隔離紅血球與血小板，使得紅血球幾乎僅存在於下層部分16中，以及使得血小板存在於第一上層部分12及中間部分14中。具體來說，第一上層部分12及中間部分14中的血小板濃度高於全血及下層部分16中的血小板濃度。

在本實施例中，在進行步驟b)後，可接著進行步驟c)，但本發明不限於此。在另一實施例中，在進行步驟b)之後且進行步驟c)之前，可選擇性地進一步移除部分的第一上層部分12，以得到第二上層部分13。在本實施例中，第一上層部分12與第二上層部分13的體積比率例如是1:0.01~0.99。在一實施例中，第一上層部分12與第二上層部分13的體積比率例如是1:0.1-0.8。在上述的體積比例範圍內，可得到較高濃度的血小板裂解液。在本實施例中，移除部分的第一上層部分12的方法例如是將針頭刺入離心管30的第一上層部分12處，並將部分的第一上層部分12吸取至離心管30外部。

在本實施例中，在進行步驟b)之後且進行步驟c)之前，由於移除了部分的第一上層部分12而得到較小體積的第二上層部分13，因此在後續製程自富含血小板纖維蛋白膠體所分離的血小板裂解液可存在較小體積的溶液中，藉此達成濃縮的效果。

然後，進行步驟c)，將第一上層部分12（或第二上層部分13）與中間部分14進行混合，以得到富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）部分15。在本實施例中，使第一上層部分12（或第二上層部分13）與中間部分14進行混合的方法例如是將離心管30均勻搖晃，使得第一上層部分12（或第二上層部分13）與中間部分14混合。但本發明不限於此，任何可使第一上層部分12（或第二上層部分13）與中間部分14均勻混合的方式皆可應用在此步驟中。

之後，進行步驟d)，使富含血小板血漿部分15凝結，以得到富含血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）膠體17。在本實施例中，使富含血小板血漿部分15凝結的方法例如是對富含血小板血漿部分15進行第二離心製程。在本實施例中，步驟d)的第二離心製程的離心轉速例如是1000至4000 g。在一實施例中，步驟d)的第二離心製程的離心轉速例如是1500至3000 g。在本實施例中，步驟d)的第二離心製程的離心時間例如是3分鐘至10分鐘。在一實施例中，步驟d)的第一離心製程的離心時間例如是4分鐘至8分鐘。在一實施例中，步驟d)的第一離心製程的離心轉速例如是1500 g，離心時間例如是5分鐘。在進行第二離心製程的過程中，血小板血漿部分15會自我凝結成富含血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）膠體17。

然後，進行步驟e)，分離富含血小板纖維蛋白膠體17，以得到血小板裂解液（platelet lysate，PL）18。在本實施例中，分離富含血小板纖維蛋白膠體17的方法例如是對富含血小板纖維蛋白膠體17進行第三離心製程。在一實施例中，第三離心製程例如是對富含血小板纖維蛋白膠體17進行單次離心，其中其中離心轉速為1000 g至4000 g，離心時間為3分鐘至45分鐘。在另一實施例中，第三離心製程例如是對富含血小板纖維蛋白膠體17進行多次離心，其中離心轉速為1000 g至4000 g，每次的離心時間為3分鐘至15分鐘。在本實施例中，多次離心的離心次數例如是5次至15次，但本發明不限於此，可視需求而調整離心的次數。在進行第三離心製程的過程中，血小板裂解液18自富含血小板纖維蛋白膠體17中釋放出來，同時富含血小板纖維蛋白膠體17的膠體部分19因離心力而被壓縮在分離膠體20上，藉此使得血小板裂解液18與膠體部分19分離。

在本實施例中，在進行步驟d)之後且進行步驟e)之前，可進一步對富含血小板纖維蛋白膠體17按壓、擠壓、過濾、超音波震盪或進行冷凍解凍循環，有助於使血小板裂解液18自富含血小板纖維蛋白膠體17釋放出來。

在一實施例中，血小板裂解液18包括由TGF-β1、PDGF-BB、PDGF-AB、FGF2、EGF、VEGF及VEGFA中選出的至少一種生長因子，其中TGF-β1的濃度為 1 ng/ml至 10000 ng/ml，PDGF-BB的濃度10 pg/ml至500000 pg/ml，PDGF-AB的濃度為10 pg/ml至500000 pg/ml，FGF2的濃度為1 pg/ml至10000 pg/ml，EGF的濃度為1 pg/ml至10000 pg/ml，VEGF的濃度為1 pg/ml至10000 pg/ml，VEGFA的濃度為0.1 pg/ml至5000 pg/ml。

在另一實施例中，血小板裂解液18包括由TGF-β1、PDGF-BB、PDGF-AB、FGF2、EGF、VEGF及VEGFA中選出的至少一種生長因子，其中TGF-β1的濃度為5 ng/ml至3000 ng/ml，PDGF-BB的濃度50 pg/ml至50000 pg/ml，PDGF-AB的濃度為100 pg/ml至50000 pg/ml，FGF2的濃度為20 pg/ml至6000 pg/ml，EGF的濃度為1.5pg/ml至2000 pg/ml，VEGF的濃度為15 pg/ml至6000 pg/ml，VEGFA的濃度為0.2 pg/ml至1500 pg/ml。

在本實施例中，在整個製備血小板裂解液的過程中未添加任何抗凝劑。抗凝劑例如是抗凝血複方檸檬酸鈉溶液A（Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, Solution A，ACD-A）、抗凝血複方檸檬酸鈉溶液B（Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, Solution B，ACD-B）、抗凝血複方檸檬酸鈉溶液C（Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, Solution C，ACD-C）、檸檬酸-磷酸-葡萄溶液（Citrate-phosphate-dextrose Solution ，CPD）、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、肝素（Heparin)、檸檬酸鈉（ Sodium Citrate）或其組合。

在本實施例中，由於本發明的製備血小板裂解液的整個過程皆未添加抗凝劑，因此並沒有將血小板裂解液自離心管取出並重覆活化的額外步驟，藉此可縮短製程時間。在本實施例中，製備血小板裂解液的整個製程時間為10分鐘至60分鐘，明顯短於傳統製備血小板裂解液的方法。此外，本發明的製備血小板裂解液的整個製程皆在同一個離心管中進行操作，因此具有避免污染且具有無菌性的優點。

本發明提供一種用於治療聲帶疾病的醫藥組成物，其包括富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）及/或富含血小板血漿的衍生物。在一實施例中，富含血小板血漿的衍生物例如是血小板裂解液（platelet-rich fibrin，PRF）。

在一實施例中，製備富含血小板血漿的方法例如是將自體的血液進行離心，以使全血分離成血漿層、白膜層以及紅血球層，並將所取得到血漿層及白膜層混合以得到富含血小板血漿。在一實施例中，製備富含血小板血漿的方法例如是如上述製備血小板裂解液的方法中的步驟a)至步驟c)的方式製備富含血小板血漿。

在一實施例中，製備血小板裂解液的方法例如是將富含血小板血漿加入氯化鈣溶液並混合均勻，接著進行冷凍解凍循環，以得到血小板裂解液。在一實施例中，富含血小板血漿的衍生物例如是由上述製備血小板裂解液的方法（步驟a)至步驟e)）所製備的血小板裂解液。

在一實施例中，富含血小板血漿及富含血小板血漿的衍生物可包括由TGF-β1、PDGF-BB、PDGF-AB、FGF2、EGF、VEGF及VEGFA中選出的至少一種生長因子。

在一實施例中，TGF-β1在醫藥組成物中的濃度為3 ng/ml至2000 ng/ml，PDGF-BB在醫藥組成物中的濃度35 pg/ml至35000 pg/ml，PDGF-AB在醫藥組成物中的濃度為70 pg/ml至35000 pg/ml，FGF2在醫藥組成物中的濃度為15 pg/ml至4000 pg/ml，EGF在醫藥組成物中的濃度為1 pg/ml至1400 pg/ml，VEGF在醫藥組成物中的濃度為10 pg/ml至4000 pg/ml，VEGFA在醫藥組成物中的濃度為0.1 pg/ml至1000 pg/ml。

富含血小板血漿（或富含血小板血漿的衍生物）為一種富含生長因子、細胞黏附分子以及細胞因子的自體血液產物。這些生長因子可將未分化的細胞吸引到聲帶的新形成的基質中來促進癒合，從而引發細胞分裂並有利於血管生成及聲帶修補。

在一實施例中，醫藥組成物可更包括選自玻尿酸、生理食鹽水、自體脂肪及自體幹細胞中的至少一者。在本實施例中，上述玻尿酸、生理食鹽水、自體脂肪及自體幹細胞可作為填充物，用以填充聲帶損傷處的基質區域。

在一實施例中，自體幹細胞例如是脂肪幹細胞或間質幹細胞，但本發明不限於此。在一實施例中，自體脂肪例如是自體腹部脂肪。

在一實施例中，醫藥組成物可更包括自體脂肪，其中自體脂肪與富含血小板血漿（或富含血小板血漿的衍生物）的體積比為0.5~10。在一實施例中，自體脂肪與富含血小板血漿（或富含血小板血漿的衍生物）的體積比為0.5~2。

自體脂肪包括高含量的脂肪幹細胞（ADSC），脂肪幹細胞可分化成傷口癒合細胞（例如纖維細胞及角質形成細胞）且具有促進血管生成的特性。然而，脂肪移植物的維持率是高度變化的，原因是脂肪的移植與血管再生不同，自體脂肪容易於被人體吸收，因此失去其填充及注射的意義。而在本發明的醫藥組成物同時包括血小板血漿（及/或富含血小板血漿的衍生物）以及自體脂肪的情況下，血小板血漿（及/或富含血小板血漿的衍生物）可改善可以對脂肪的癒合潛力產生協同效應，並可增加脂肪的維持率，進而達到一個長效填充及協助修復功能。

在一實施例中，聲帶疾病包括聲帶閉合不全。在一實施例中，聲帶閉合不全例如是由聲帶萎縮、聲帶麻痺、聲帶外傷或聲帶老化所導致。

在本實施例中，醫藥組成物可製作成無菌注射溶液。在一實施例中，醫藥組成物例如是以注射方式給藥至聲帶。具體來說，醫藥組成物例如是以注射方式給藥至聲帶萎縮處。在一實施例中，可使用彎曲注射器（美敦力公司（Medtronic））將醫藥組成物注射至聲帶萎縮處。在一實施例中，醫藥組成物的給藥量例如是0.5 mL至5 mL。

以下將以實驗例具體說明本發明，但實驗例之參數與其數據結果僅是用來說明本發明的功效，而並非是用以限定本發明之範圍。

[ 血小板裂解液的製備 ]

實驗例 1

首先，自受試者採取靜脈血液10毫升，並以18G的針頭將新鮮全血注入含有分離膠體的離心管中。將離心管放入離心機內，以1500 g的條件離心5分鐘，以使全血分離成血漿層、白膜層以及紅血球層，其中血漿層為少量血小板血漿（Platelet-Poor Plasma，PPP）。

接著，利用18G針頭連接10毫升針筒移除2毫升的血漿層。將離心管上下均勻搖晃，使得剩餘的血漿層與白膜層混合，以得到富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）。

然後，將同一離心管放入離心機內，以1500 g的條件離心5分鐘，以得到富含血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）膠體。

之後，將同一離心管放入離心機內，以1500 g的條件離心5分鐘。重覆上述離心條件離心10次，藉此得到位於離心管頂部的血小板裂解液。

比較例 1

首先，自受試者採取靜脈血液10毫升，並以18G的針頭將新鮮全血注入含有抗凝劑（ACD Solution-A，ACDA）的離心管中。將離心管放入離心機內，以1500 g的條件離心5分鐘，以使全血分離成血漿層、白膜層以及紅血球層。

接著，取出血漿層及白膜層，移至另一無菌容器內，加入氯化鈣溶液並混合均勻，此步驟為活化血小板。接下來進行冷凍解凍循環，將此活化的溶液放置室溫一小時，接著放進-80度冰箱進行冷凍，於4小時後取出，即可進行生長因子測定。

[ 生長因子的測定 ]

在本實施例中，使用酵素連結免疫吸附法（Enzyme-linked Immuno-Sorbent Assay，ELISA）測定實驗例1的富含血小板血漿、實驗例1的血小板裂解液與比較例1的血小板裂解液中生長因子TGF-β1、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF及VEGFA的含量，並將結果記載於表1。表1中的結果皆以>平均值±標準差>表示，每個生長因子實施例與比較例間有顯著差異（P>0.05）。

[表1]

	TGF-β1 （ng/ml）	PDGF-AB （pg/ml）	PDGF-BB （pg/ml）	VEGF （pg/ml）	VEGFA （pg/ml）
實驗例1的PRP	296.0±26.2	5000.0±343.1	4333.2±403.3	263.0±37.3	62.4±15.8
實驗例1的PL	532.5±75.1	10620.3±1096.9	11904.9±2595.7	565.2±106.7	202.7±46.5
比較例1的PL	214.2±21.7	3211.6±339.8	1431.7±175.7	168.3±26.5	21.3±6.6

由表1的內容可知，相對於傳統方法所製備的血小板裂解液（即比較例1的PL），由本發明的製備血小板裂解液的方法所製備的血小板裂解液（即實驗例1的PL）以及富含血小板血漿（即實驗例1的PRP）皆具有較高濃度的生長因子。此外，本發明的製備血小板裂解液的方法由於在整個製程皆未添加抗凝劑，因此並沒有將血小板裂解液自離心管取出並重覆活化的額外步驟，藉此可縮短製程時間。此外，本發明的製備血小板裂解液的整個製程皆在同一個離心管中進行操作，因此具有避免污染且具有無菌性的優點。

[ 醫藥組成物對於聲帶萎縮患者的效用 ]

實驗例 2

在本實施例中，受試者為10位年齡介於25至80歲被診斷出嗓音障礙指數（Voice Handicap Index-10, VHI-10）評分≥11的聲帶萎縮患者。此外，本實施例以與實驗例1相同的製備方法製備富含血小板血漿並作為醫藥組成物。

首先，將受試者進行全身麻醉後，藉由纖維鏡監測器（fiberscopic monitoring）並使用彎曲注射器將1 mL~2 mL的所製備的富含血小板血漿注射至受試者的聲帶萎縮處，並在注射後記錄受試者的聲帶膨脹的情況。

在進行注射後3、6個月，測定受試者的嗓音障礙指數。

實驗例 3

在本實施例中，受試者為10位年齡介於25至80歲被診斷出嗓音障礙指數（Voice Handicap Index-10, VHI-10）評分≥11的聲帶萎縮患者。以與實驗例1相同的製備方法製備血小板裂解液並作為醫藥組成物。

首先，將受試者進行全身麻醉後，藉由纖維鏡監測器（fiberscopic monitoring）並使用彎曲注射器將1 mL~2 mL的所製備的血小板裂解液注射至受試者的聲帶萎縮處，並在注射後記錄受試者的聲帶膨脹的情況。

在進行注射後3、6個月，測定受試者的嗓音障礙指數。

實驗例2與實驗例3所測定的嗓音障礙指數如下表2所示。

[表2]

	手術前的VHI-10 (平均值)	手術後3個月的VHI-10(平均值)	手術後6個月的VHI-10(平均值)
實驗例2	31	21	16
實驗例3	35	25	13

由表2的結果可以看出，將本發明的包括富含血小板血漿（即實驗例2）或血小板裂解液（即實驗例3）的醫藥組成物注射至患者的聲帶萎縮處後，患者的VHI明顯下降，藉此可證實本發明的包括富含血小板血漿或血小板裂解液的醫藥組成物可有效地修補聲帶。

10:全血 12:第一上層部分 13:第二上層部分 14:中間部分 15:富含血小板血漿部分 16:下層部分 17:富含血小板纖維蛋白膠體 18:血小板裂解液 19:膠體部分 20:分離膠體 30:離心管

圖1為依照本發明的一實施例的製備血小板裂解液的方法的流程圖。

10:全血

12:第一上層部分

13:第二上層部分

14:中間部分

15:富含血小板血漿部分

16:下層部分

17:富含血小板纖維蛋白膠體

18:血小板裂解液

19:膠體部分

20:分離膠體

30:離心管

Claims

一種製備血小板裂解液的方法，所述方法包括以下步驟：步驟a)，將採集的全血放置於裝有分離膠體的離心管中，其中所述分離膠體的密度為1.030 g/cm³ 至1.093 g/cm³ ；步驟b)，對裝有所述全血及所述分離膠體的所述離心管進行第一離心製程，以使所述全血分離成第一上層部分、中間部分以及下層部分，其中所述分離膠體位於所述中間部分與所述下層部分之間；步驟c)，將所述第一上層部分與所述中間部分進行混合，以得到富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）部分；步驟d)，使所述富含血小板血漿部分凝結，以得到富含血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）膠體；以及步驟e)，分離所述富含血小板纖維蛋白膠體，以得到血小板裂解液（platelet lysate，PL），其中在所述步驟a)至所述步驟e)中未添加抗凝劑。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中在進行所述步驟c)之前，更包括移除部分的所述第一上層部分，以得到第二上層部分，其中所述第一上層部分與所述第二上層部分的體積比率為1:0.01~0.99。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中所述抗凝劑包括抗凝血複方檸檬酸鈉溶液A（Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, Solution A，ACD-A）、抗凝血複方檸檬酸鈉溶液B（Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, Solution B，ACD-B）、抗凝血複方檸檬酸鈉溶液C（Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, Solution C，ACD-C）、檸檬酸-磷酸-葡萄溶液（Citrate-phosphate-dextrose Solution ，CPD）、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、肝素（Heparin)、檸檬酸鈉（ Sodium Citrate）或其組合。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中所述分離膠體的材料包括含矽聚合物、丙烯酸聚合物或聚酯類聚合物。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中所述第一離心製程的離心轉速為1000 g至4000 g，離心時間為3分鐘至10分鐘。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中所述第一上層部分為包含血小板的血漿層，所述中間部分為包含血小板及白血球的白膜層（buffy coat），以及所述下層部分為包含紅血球的紅血球層。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中使所述富含血小板血漿部分凝結包括對所述富含血小板血漿部分進行第二離心製程。
如申請專利範圍第7項所述的製備血小板裂解液的方法，其中所述第二離心製程的離心轉速為1000 g至4000 g，離心時間為3分鐘至10分鐘。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中分離所述富含血小板纖維蛋白膠體包括對所述富含血小板纖維蛋白膠體進行第三離心製程。
如申請專利範圍第9項所述的製備血小板裂解液的方法，其中所述第三離心製程包括：對所述富含血小板纖維蛋白膠體進行單次離心，其中離心轉速為1000 g至4000 g，離心時間為3分鐘至45分鐘，或者對所述富含血小板纖維蛋白膠體進行多次離心，其中離心轉速為1000 g至4000 g，每次的離心時間為3分鐘至15分鐘。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中製備所述血小板裂解液的整個製程時間為10分鐘至60分鐘。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中在進行所述步驟e)之前，更包括對所述富含血小板纖維蛋白膠體按壓、擠壓、過濾、超音波震盪或進行冷凍解凍循環，以使得所述血小板裂解液自所述富含血小板纖維蛋白膠體釋放。
如申請專利範圍第1項所述的製備血小板裂解液的方法，其中所述血小板裂解液包括由TGF-β1、PDGF-BB、PDGF-AB、 FGF2、EGF、VEGF及VEGFA中選出的至少一種生長因子，其中所述TGF-β1的濃度為1 ng/ml至10000 ng/ml，所述PDGF-BB的濃度10 pg/ml至500000 pg/ml，所述PDGF-AB的濃度為10 pg/ml至500000 pg/ml，所述FGF2的濃度為1 pg/ml至10000 pg/ml，所述EGF的濃度為1 pg/ml至10000 pg/ml，所述 VEGF的濃度為1 pg/ml至10000 pg/ml，VEGFA的濃度為0.1 pg/ml至5000 pg/ml。
一種醫藥組成物用於製備治療聲帶疾病之藥物的用途，其中所述醫藥組成物包括富含血小板血漿及/或富含血小板血漿的衍生物。
如申請專利範圍第14項所述的醫藥組成物用於製備治療聲帶疾病之藥物的用途，其中所述富含血小板血漿的衍生物包括血小板裂解液。
如申請專利範圍第14項所述的醫藥組成物用於製備治療聲帶疾病之藥物的用途，其中所述聲帶疾病包括聲帶閉合不全。
如申請專利範圍第14項所述的醫藥組成物用於製備治療聲帶疾病之藥物的用途，其中所述富含血小板血漿及所述富含血小板血漿的衍生物包括由TGF-β1、PDGF-BB、PDGF-AB、FGF2、EGF、VEGF及VEGFA中選出的至少一種生長因子。
如申請專利範圍第17項所述的醫藥組成物用於製備治療聲帶疾病之藥物的用途，其中所述TGF-β1在所述醫藥組成物中的濃度為0.7 ng/ml至7000 ng/ml，所述PDGF-BB在所述醫藥組成物中的濃度7 pg/ml至350000 pg/ml，所述PDGF-AB在所述醫藥組成物中的濃度為7 pg/ml至350000 pg/ml，所述FGF2在所述醫藥組成物中的濃度為0.7 pg/ml至7000 pg/ml，所述EGF在所述醫藥組成物中的濃度為0.7 pg/ml至7000 pg/ml，所述VEGF在所述醫藥組成物中的濃度為0.7 pg/ml至7000 pg/ml，所述VEGFA在所述醫藥組成物中的濃度為0.06 pg/ml至3500 pg/ml。
如申請專利範圍第14項所述的醫藥組成物用於製備治療聲帶疾病之藥物的用途，其中所述醫藥組成物更包括選自玻尿酸、生理食鹽水、自體脂肪及自體幹細胞中的至少一者。
如申請專利範圍第19項所述的醫藥組成物用於製備治療聲帶疾病之藥物的用途，其中自體幹細胞包括脂肪幹細胞或間質幹細胞。
如申請專利範圍第20項所述的醫藥組成物用於製備治療聲帶疾病之藥物的用途，其中所述醫藥組成物是以注射方式給藥至聲帶。