KR20090129069A - 줄기세포 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 분리방법에 있어서, 흡입물질이 포함된 용기의 내경과 일치되는 피스톤에 1 이상의 관통공이 형성되고, 상기 관통공을 통하여 효소나 세척액이 투입될 수 있도록 연결관을 형성하되 상기 연결관은 선단부가 상기 관통공과 연결되고 말단부가 외부관이나 효소나 세척액 등이 포함된 다른 용기에 연결되어 있어, 상기 효소나 세척액을 흡입물질이 포함된 용기에 투입하기 위하여 상기 피스톤을 당겨 용기 내에 음압을 형성시켜 상기 연결관과 피스톤의 관통공을 통하여 효소나 세척액이 상기 용기 내로 투입되는 줄기세포 분리방법을 제공한다.

Description

줄기세포 분리방법{Method for Isolating stem cell}

본 발명은 지방조직으로부터 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로 공기 노출 기회를 최소화한 줄기세포 분리방법에 관한 것이다.

줄기세포는 자기 복제 능력을 가지면서 2 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로서 최근 골수 외에도 지방조직에서도 줄기세포를 얻을 수 있는 연구들이 진행되고 있다. 지방조직에서 분리한 지방유래줄기세포는 지방세포, 근육세포, 연골세포, 뼈세포 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 다분화능세포(multipotent stem cell)이다.

상기 지방줄기세포는 골수 기원의 간엽줄기세포와 비교하여 자가 재생능력이 뛰어나고 체외 배양이 용이하다는 점과, 지방줄기세포를 분리할 수 있는 지방조직이 풍부하고 채취방법이 간단하며, 안전하다는 장점을 가지고 있으며, 기능적인 측면에서의 지방줄기세포는 골수기원의 간엽줄기세포와 비교하였을 때도 분화능력, 세포학적 특성, 면역학적 특성, 조직재생능력 등 거의 모든 특성이 동일한 것으로 밝혀졌다. 즉 지방줄기세포는 골수 기원의 간엽줄기세포를 대체할 수 있는 높은 가능성을 지닌 줄기세포로서 의학적 유용성이 아주 크게 나타났다.

또한, 지방줄기세포는 간엽줄기세포와 비교하여 조직 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 골수 기원의 간엽줄기세포 보다 우위에 있다할 것이다.

기존에 사용되는 지방분리세포의 분리, 배양법은 흡입된 또는 절제된 지방을 다시 잘게 부수어 콜라지네이즈로 조직을 분해한 후, 원심분리과정을 거치면 침전되어 분리되는 혈관간질획분 (stromal vascular fraction, SVF)에서 세포를 배양하는 방법이 일반적으로 제안되어 왔다.

또한 대한민국 특허발명 제788632에서는 인간 지방조직의 지방흡입술(liposuction)에서 부수적으로 얻어지는 생리식염수에 부유된 지방함유 suspension을 적정양의 생리식염수로 고르게 재부유하여 세포배양용 flask 또는 roller bottle에 적당량을 넣은 다음, 정치 배양 또는 회전배양을 하였다. 정치 배양의 경우, 최소 6시간 내지 12시간 동안 정치하고 그 다음으로, 플라스크 표면에 부착되는 세포층(지방유래 MSC, fibroblast)을 트립신으로 처리하여 회수한다. 이때, 소량의 생리식염수에 부유된 것을 직접 회수하여 바로 사용하거나, 세포층의 부피를 줄이고자 할 경우, 상기 생리식염수로 회수한 세포층을 1000rpm에서 10분간 원심분리하여 가라앉는 펠렛층만을 사용한다. 상기 분리된 세포층에는 성체줄기세포와 섬유아세포가 함유되어 있다. 상기 분리된 세포층을 지방과 혼합하여 성체 줄 기세포, 섬유아세포 및 지방 또는 지방세포를 함유하는 피부 미용 또는 성형용 조성물을 제조하는 방법이 제안되었다.

한편 국제공개특허 WO2005/042730에서는 A) 지방흡입에 의해 흡인물을 수득하는 단계; B) 지방흡입물의 세포 분획을 얻기 위해 원심분리기로 이송하는 단계; C) 비중에 따른 원심분리로 세포 분획을 수득하는 단계; D) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층을 수집하는 단계로 구성된 콜라게나아제 처리를 하지 않은 줄기세포의 제조방법이 제안되었다.

또 근래 임상에서 사용되는 방법은 효소처리 및 원심분리용 용기는, 일단이 모두 차폐된 튜브 형태로서 상부에 튜브의 외부면과 체결되는 마개를 구비한다. 따라서 튜브의 내용물을 이동시키거나 지방유래줄기세포가 포함된 용기내로 세척액 등을 투입하기 위해서는 상기 마개를 개방시켜 분리된 물질을 용기 외부로 제거하거나 세척액 등을 용기 내로 투입한다.

상기 방법들과 같이 지방유래줄기세포를 제조하기 위해서는 흡입된 또는 절제된 지방으로부터 유효성분을 얻기 위해 세척액으로 배액하여 이를 원심분리 하여야 한다. 또한 성형용도 등으로 2차적 용도 전개를 위해 혼합물을 형성하여야 한다.

이러한 과정에서 크게 문제될 수 있는 부분이 첫째 원심분리과정에서 실제 유효성분분리가 용이치 않아 임상에서는 약 100cc의 흡입지방조직으로부터 통상 50만개의 세포를 분리할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 전체 세포 수의 백만분의 1에 해당하는 세포만을 획득할 수 있는 비효율적인 방법이라는 점이다. 즉 원심 분리과정에서 분리에 장시간이 소요될 뿐 아니라 분리시 가혹한 조건 때문에 유효세포의 손상이 지대하다.

또한 지방추출물을 처리하는 과정에서 혼합되어야 할 성분들간의 혼합이 용이치 않은 문제가 있다.

또 다른 문제는 치명적일 수 있다. 즉 지방의 획득, 분리, 유효성분의 추출, 배양, 재주입의 과정에서 세포가 외부에 노출되는 동안 미생물 오염 위험이 존재하는 등 인체에 대한 안전성이 문제되어 2차 감염이나 오염으로 인한 부작용이 발생할 수 있다.

즉 용기에 연결된 마개를 개방하는 순간 용기 내부의 유효성분은 다량의 공기와 접촉이 되고 낙진에 의한 오염이 가능하다. 따라서 종래 임상에서는 클래스 1000 이상의 클린룸에서 줄기세포 분리가 이루어지는 등의 안정성에 많은 비용과 시간이 소요되었다. 또 분리된 물질을 제거하는 등의 경우 임상자가 눈으로 층을 구분하여 분리하는 등 이러한 과정에서 유효성분의 손실등의 문제가 있었다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명의 목적은 지방조직의 손상을 최소화하면서 수율이 향상된 줄기세포 분리방법를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 일반 대기조건에서 오염될 가능성을 차단함으로서 안정성이 향상된 줄기세포 분리방법를 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 줄기세포 분리방법에 있어서, 흡입물질이 포함된 용기의 내경과 일치되는 피스톤에 1 이상의 관통공이 형성되고, 상기 관통공을 통하여 효소나 세척액이 투입될 수 있도록 연결관을 형성하되 상기 연결관은 선단부가 상기 관통공과 연결되고 말단부가 외부관이나 효소나 세척액 등이 포함된 다른 용기에 연결되어 있어, 상기 효소나 세척액을 흡입물질이 포함된 용기에 투입하기 위하여 상기 피스톤을 당겨 용기 내에 음압을 형성시켜 상기 연결관과 피스톤의 관통공을 통하여 효소나 세척액이 상기 용기 내로 투입되는 줄기세포 분리방법을 제공한다.

또한 본 발명은 줄기세포 분리방법에 있어서, 흡입물질이 포함된 용기의 내경과 일치되는 피스톤에 1 이상의 관통공이 형성되고, 상기 관통공을 통하여 효소나 세척액이 투입될 수 있도록 연결관을 형성하되 상기 연결관은 선단부가 상기 관통공과 연결되고 말단부가 외부관이나 효소나 세척액 등이 포함된 다른 용기에 연결되어 있어, 상기 용기의 피스톤을 밀어 용기 내에 양압이 형성되면 피스톤 부분의 상승 유체가 관통공과 연결관을 통하여 외부로 유출되는 줄기세포 분리방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 세척액 등이 투입된 흡입물질을 원심분리 등의 과정을 거쳐 줄기세포와 같은 유효성분이 분리된 후 상기 용기의 피스톤을 밀어 용기 내에 양압이 형성되면 피스톤 부분의 상승 유체가 관통공과 연결관을 통하여 외부로 유 출되는 줄기세포 분리방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 연결관이 튜브가 더 연결되어 다른 용기와 연결되는 줄기세포 분리방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 연결관 또는 튜브와 다른 용기가 연결되는 구간에 정량제어를 위한 계량수단이나 1 이상의 용기와 선택적으로 연결되기 위해 밸브가 더 형성된 줄기세포 분리방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 밸브가 판막형 원웨이 밸브 또는 루어락 3-웨이 밸브인 줄기세포 분리방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 3-웨이 밸브에 있어서 제1밸브가 연결관 또는 튜브와 연결되고, 제2밸브가 세척액 등이 포함된 용기 또는 유효성분 추출용기에 연결되고, 제3밸브가 제거성분 추출용기 또는 세척액 등이 포함된 용기에 연결된 줄기세포 분리방법을 제공한다.

상술한 바와 같이 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포 분리방법은 용기 내부에 수용된 지방흡입물질이 외부와 접촉할 수 있는 기회를 차단함으로서 안정성이 확보된 지방유래줄기세포를 수득할 수 있는 효과가 있다.

또한 본 발명에 의한 방법은 흡입시술시 사용된 주사기를 사용하여 지방유래줄기세포를 분리할 수 있어 세포 오염을 방지하여 결국 수율을 향상시킬 수 있는 특징이 있다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

이 하 본 발명의 방법 및 장치는 지방을 예로서 설명되나 그 조직의 유형은 지방 조직, 혈액, 골수, 근육, 피부, 간, 연결 조직, 근막(fascia) 및 기타 부드러운 액상의 조직 또는 조직성분을 포함하며, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용되는 지방흡입 물질이라 함은 지방흡입 시 발생하는 모든 물질을 의미한다. 전형적으로 그러한 지방흡입 물질은 지방조직 및 지방흡입에 의한 흡인물을 포함한다.

본 발명에 의한 줄기세포 분리에 있어서, 우선 출발물질을 획득하여야 한다. 상기 출발물질은 지방으로서 지방흡입을 통하여 수득할 수 있다. 상기 지방은 인간의 지방일 수 있으며, 지방유래줄기세포로 배양되어 성형용도 등으로 사용될 경우 자가지방일 수 있다. 한편 지방흡입은 원하는 시술부위에서 이루어질 수 있으며, 주사기를 통하여 지방을 채취할 수 있다. 이 때 사용될 수 있는 주사기는 지방을 채취할 수 있는 모든 유형을 포함하며, 비제한적인 예로서 본 발명자가 기 제안한 대한민국 특허출원 제 2003-5029호, 제2005-61134호, 제2005-34848호, 제2006- 64946호, 대한민국 실용신안출원 제2003-21484호, 제2004-10685호, 제2006-26454호에 개시된 주사기일 수 있다. 상기 주사기의 특징은 지방흡입과 동시에 흡인된 지방흡입물질이 대기와 차단된다는 특징이 있다.

상기 흡인된 지방흡입물질은 원심분리를 통해 유효성분만을 추출한 후 콜라겐아제와 같은 효소로서 처리될 수 있다. 이와 같은 효소처리나 세척액 투입시 종래에는 지방흡입물질이 포함된 용기의 일단을 개방하여 상기 효소나 세척액을 투입하였다. 이 과정에서 흡입물질은 대기에 노출되어 안정성이 손상되는 문제가 발생한다.

따라서 본 발명은 상기 흡입물질이 대기에 노출되는 현상을 최소화하기 위하여 흡입물질이 포함된 용기 110의 내경과 일치되는 피스톤 130을 사용할 수 있다. 상기 피스톤은 1 이상의 관통공 131이 형성될 수 있으며, 상기 관통공 131을 통하여 효소나 세척액이 투입될 수 있도록 연결관 150을 이용할 수 있다. 상기 연결관 150은 선단부 151이 상기 관통공 131과 연결되고 말단부 153이 튜브 170이나 효소나 세척액 등이 포함된 다른 용기에 연결될 수 있다.

한편 상기 연결관 150은 사용의 편의를 위해 별도의 튜브가 더 연결되어 다른 용기 등과 연결될 수 있으며, 다른 용기 등과 연결되는 임의의 구간에 정량제어를 위한 계량수단이나 1 이상의 용기와 선택적으로 연결되기 위해 비제한적인 예로 판막형 원웨이 밸브, 루어락 3-웨이 밸브(3-way valve with Luor Lock)와 같은 밸브 190이 사용될 수 있다. 상기 밸브는 수동형 또는 자동형일 수 있다.

상기 효소나 세척액을 흡입물질이 포함된 용기에 투입하기 위해서 상기 용기 의 피스톤을 당겨 용기 내에 음압을 형성시킨다. 그러면 상기 연결관과 피스톤의 관통공을 통하여 효소나 세척액이 상기 용기 내로 투입될 수 있다.

상기 세척액 등이 투입된 흡입물질은 원심분리 등의 과정을 거쳐 줄기세포와 같은 유효성분이 분리된다. 상기 유효성분을 제외한 다른 성분들은 상기 용기 내에서 제거되어야 한다. 상기 제거과정은 투입과정과 정반대로 진행될 수 있다. 즉 상기 용기의 피스톤을 밀어 용기 내에 양압이 형성되면 피스톤 부분의 상승 유체는 관통공과 연결관을 통하여 외부로 유출될 수 있다. 이 때 상기 연결관이나 튜브의 타 말단부는 상기 제거될 성분을 수용하기 위한 다른 용기와 연결된 상태일 수 있다.

또한 3-웨이 밸브가 형성된 경우 선택적으로 상기 제거성분을 용기 내에서 제거한 후 또 다른 용기(예를 들어 주사기)에 유효성분만을 추출할 수도 있고, 상기 세척액 등의 포함된 용기에 연결되어 있을 수도 있다. 즉 상기 3-웨이 밸브는 제1밸브가 연결관 또는 튜브와 연결되거나, 제2밸브가 세척액 등이 포함된 용기 또는 유효성분 추출용기에 연결되거나, 제3밸브가 제거성분 추출용기 또는 세척액 등이 포함된 용기에 연결될 수 있다. 다만 상기 연결구조는 일 예시이며 이에 제한되는 것은 아니다.

통상 줄기세포 분리시 세척과정은 수회 반복적으로 실시될 수 있다는 점에서 유효성분이 대기와 노출될 기회를 최소화할 수 있다. 또 상기 흡입물질이 포함된 용기는 흡입시술시 사용된 주사기 일 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 의한 분리방법을 수행하는 장치의 사시도.

도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 의한 분리방법을 수행하는 장치의 분해사시도.

도 3은 본 발명의 다른 실시예에 의한 분리방법을 수행하는 장치의 사시도.

도 4는 본 발명의 다른 실시예에 의한 분리방법을 수행하는 장치의 분해사시도.

Claims (7)

1. 줄기세포 분리방법에 있어서,

   흡입물질이 포함된 용기의 내경과 일치되는 피스톤에 1 이상의 관통공이 형성되고, 상기 관통공을 통하여 효소나 세척액이 투입될 수 있도록 연결관을 형성하되 상기 연결관은 선단부가 상기 관통공과 연결되고 말단부가 외부관이나 효소나 세척액 등이 포함된 다른 용기에 연결되어 있어,

   상기 효소나 세척액을 흡입물질이 포함된 용기에 투입하기 위하여 상기 피스톤을 당겨 용기 내에 음압을 형성시켜 상기 연결관과 피스톤의 관통공을 통하여 효소나 세척액이 상기 용기 내로 투입됨을 특징으로 하는 줄기세포 분리방법.
2. 줄기세포 분리방법에 있어서,

   흡입물질이 포함된 용기의 내경과 일치되는 피스톤에 1 이상의 관통공이 형성되고, 상기 관통공을 통하여 효소나 세척액이 투입될 수 있도록 연결관을 형성하되 상기 연결관은 선단부가 상기 관통공과 연결되고 말단부가 외부관이나 효소나 세척액 등이 포함된 다른 용기에 연결되어 있어,

   상기 용기의 피스톤을 밀어 용기 내에 양압이 형성되면 피스톤 부분의 상승 유체가 관통공과 연결관을 통하여 외부로 유출됨을 특징으로 하는 줄기세포 분리방법.
3. 제1항에 있어서,

   상기 세척액 등이 투입된 흡입물질을 원심분리 등의 과정을 거쳐 줄기세포와 같은 유효성분이 분리된 후 상기 용기의 피스톤을 밀어 용기 내에 양압이 형성되면 피스톤 부분의 상승 유체가 관통공과 연결관을 통하여 외부로 유출됨을 특징으로 하는 줄기세포 분리방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 연결관은 튜브가 더 연결되어 다른 용기와 연결됨을 특징으로 하는 줄기세포 분리방법.
5. 제4항에 있어서,

   상기 연결관 또는 튜브와 다른 용기가 연결되는 구간에 정량제어를 위한 계량수단이나 1 이상의 용기와 선택적으로 연결되기 위해 밸브가 더 형성됨을 특징으로 하는 줄기세포 분리방법.
6. 제5항에 있어서,

   상기 밸브는 판막형 원웨이 밸브 또는 루어락 3-웨이 밸브임을 특징으로 하는 줄기세포 분리방법.
7. 제6항에 있어서,

   상기 3-웨이 밸브는 제1밸브가 연결관 또는 튜브와 연결되고, 제2밸브가 세척액 등이 포함된 용기 또는 유효성분 추출용기에 연결되고, 제3밸브가 제거성분 추출용기 또는 세척액 등이 포함된 용기에 연결됨을 특징으로 하는 줄기세포 분리방법.

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