IT202000002599A1 - “siringa dotata di mezzi per la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase, in particolare delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo, kit relativo, e metodo per il suo impiego” - Google Patents
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Description
Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo: ?SIRINGA DOTATA DI MEZZI PER LA SEPARAZIONE SELETTIVA DEI COMPONENTI DI UNA MISCELA ETEROGENEA MULTIFASE, IN PARTICOLARE DELLE CELLULE STAMINALI DERIVATE DA TESSUTO ADIPOSO, KIT RELATIVO, E METODO PER IL SUO IMPIEGO?,
DESCRIZIONE
Campo dell?invenzione
La presente invenzione riguarda in generale la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase che in particolare trova la sua applicazione come nuova tecnica per la separazione delle cellule staminali e stromali derivate o prelevate con metodi meccanici dal tessuto adiposo sottocutaneo.
Un primo aspetto del trovato riguarda i mezzi attraverso i quali si perviene a tale separazione che prevedono la presenza di un dispositivo porta-filtri che pu? scorrere a tenuta all?interno del corpo cilindrico di una siringa o siringotto in cui viene trasferito il prodotto dell?aspirazione di una siringa da prelievo per la successiva centrifugazione. Tale dispositivo porta-filtri permette il montaggio in serie di uno o pi? filtri selettivi al suo interno, con l?interposizione fra un filtro e l?altro di un pozzetto di raccolta che permette di raccogliere selettivamente i componenti della miscela eterogenea multifase una volta effettuata la centrifugazione, secondo modalit? operative che costituiscono un ulteriore oggetto del presente trovato.
Secondo una caratteristica peculiare dell?invenzione, tale dispositivo porta-filtri, ? costituito da un gommino di tenuta, cavo internamente, che sostituisce quelli posizionati in testa al comune pistone di una siringa da prelievo, all?interno del quale possono essere introdotti almeno un filtro o preferibilmente una serie di filtri a permeabilit? selettiva, sovrapposti e stabilmente connessi fra loro con l?interposizione appunto di uno spazio per il confinamento e la raccolta selettiva delle particelle e/o delle cellule che si vogliono ricercare.
Tale dispositivo porta-filtri a gommino viene montato a tenuta in detto siringotto prima dell?inserimento di un pistone a vite, che, introdotto dal basso in detto siringotto, ? atto ad impegnarsi sul fondo di detto dispositivo e ne regola la posizione, lungo l?asse dello stesso siringotto.
Un altro aspetto peculiare del trovato ? relativo all?uso come filtri, nell?ambito della filtrazione e separazione delle particelle staminali e stromali, di membrane liquide a separazione inversa (self-healing materials), composte esclusivamente da liquidi eterogenei e multifasici, che possono ottenere regimi di separazione selettiva delle particelle e/o cellule che non possono essere raggiunti dalle tecnologie convenzionali a membrana solida.
Un altro aspetto del trovato riguarda un innovativo siringotto dotato di raccordo luer lock, costituito da un contenitore dotato di un pistone a vite asportabile, che, nella procedura di separazione delle cellule staminali e stromali dal tessuto adiposo, ? utilizzabile, nella fase di centrifugazione, senza pistone a vite, in sostituzione dei comuni siringotti nel cui interno viene travasato dalla siringa di prelievo l?intero contenuto del prelievo.
Detto siringotto ? caratterizzato dal fatto che incorpora, come mezzo di filtrazione, posizionata in posizione prossimale rispetto al raccordo luer lock, per trovarsi quindi in testa al pistone a vite quando presente, all?interno di un porta-filtro scorrevole a tenuta in detto siringotto, una o pi? membrane autoportanti a filtrazione o separazione invertita, che lasciano passare solo sostanze di dimensioni superiori (maggiore diametro e peso molecolare) ad una ?dimensione critica? per cui, durante il processo di centrifugazione, in presenza di una sola membrana, le particelle che non superano tale dimensione critica vengono separate dalle altre che sono invece confinate in una apposita camera di raccolta sottostante alla membrana stessa, mentre, quando le membrane sono pi? di una, le particelle di diverse dimensioni sono selettivamente confinate, al di sotto della prima membrana, in pi? camere di raccolta interposte tra una membrana e l?altra. In questo modo si possono selezionare, con l?utilizzo di pi? membrane liquide di specifica composizione, gruppi di particelle appartenenti a range dimensionali diversi con il vantaggio di poterle prelevare direttamente, senza problemi di rimescolamento: baster? infatti introdurre l?ago di una comune siringa di prelievo, di lunghezza opportuna, nel connettore luer lock del siringotto secondo il trovato, e, passando attraverso una o pi? membrane liquide self-healing, andare a pescare direttamente nel pozzetto di raccolta delle particelle che si ricercavano, garantendo la sterilit? dell?operazione e sfruttando la caratteristica di self healing (auto guarigione) delle stesse membrane liquide.
L?invenzione riguarda infine anche la metodica di impiego di tale siringotto che prevede, come di consueto, dopo aver effettuato il travaso di quanto prelevato da una siringa di lipoaspirazione attraverso un connettore che collega tra loro i rispettivi attacchi luer lock, e prima che detto siringotto venga alloggiato all?interno della centrifuga, di tapparne opportunamente le sue estremit?, in modo che dopo la centrifugazione, sia possibile rendere macroscopicamente visibili, in diversi livelli, i vari componenti stratificati del materiale aspirato in base ad una separazione avvenuta per gradiente di peso specifico o densit? relativa. Ricordiamo che, a seguito della centrifugazione, ciascun livello ? caratterizzato da un differente aspetto e colore, con lo strato inferiore costituito da una miscela di tessuto stromale e cellule ASCs - od in alternativa di particelle solide di diversa dimensione che saranno reperibili nei diversi pozzetti di separazione, a cui fa seguito: un primo stato intermedio formato da soluzione anestetica (soluzione di Klein o similari) mista al sangue, un successivo strato costituito dal grasso, ed un terzo strato intermedio formato da una sostanza oleosa costituita essenzialmente dal materiale fuoriuscito dalle cellule adipose traumatizzate.
A differenza di quanto noto, la metodica d?impiego del siringotto oggetto del trovato prevede, secondo una caratteristica peculiare dell?invenzione, che al completamento del processo di centrifugazione, il cui range ? variabile tra 1500 e 4000 giri per 5-10 minuti (preferibilmente tra 2500/3000 giri per 7/8 minuiti con centrifuga basculante), dopo aver rimosso il tappo a pressione posto sul connettore Luer lock del siringotto, ed un tappo a vite sul fondo dello stesso, l?operatore provveda ad introdurre ed azionare sempre dal fondo del siringotto, il pistone a vite dello stesso siringotto comprimendo dal basso lo strato inferiore (soluzione acquosa o altro) della colonna di materiale aspirato.
Tale pistone a vite, garantir? attraverso un preciso e lento movimento di avvitamento verso il connettore luer lock, grazie alla presenza del complesso di filtri selettivi costituiti da membrane a separazione invertita contenute nel gommino di tenuta posto in testa dello stesso pistone, la selezione dei componenti ottenuti dalla centrifugazione, in modo da permettere di eliminare direttamente la componente oleosa individuata nella parte superiore, seguita dal grasso e successivamente dalla soluzione acquosa o altro ed infine di prelevare e conservare le cellule di grasso purificato, non traumatizzate e non miste ad altri componenti sul porta-filtri del siringotto, al di sopra di una pluralit? di pozzetti di separazione selettiva presente.
Tramite un connettore che colleghi l?attacco luer lock del siringotto con quello di un'altra siringa, possono essere eliminate le fasi non utili gi? citate, partendo dall?estremit? sottostante al luer lock, cio?: la soluzione oleosa, seguita da quella del grasso, che pu? essere utilizzato o meno per il fat graft (innesto del grasso in aree specifiche del volto e del corpo), ed infine la soluzione fisiologica con l?anestetico ed il sangue, mentre le eventuali particelle e/o cellule staminali e le cellule stromali, sono confinate in una camera o camere di raccolta all?interno del dispositivo portafiltri che agisce come separatore multifiltro, per essere direttamente recuperate con und siringa di prelievo dotata dell?apposito ago come precedentemente descritto.
Stato dell?arte
Filtrazione
La separazione delle sostanze ? un passaggio fondamentale per molti processi industriali e medici che vanno dal trattamento e depurazione delle acque reflue alla diagnostica medica. Fino ad oggi la filtrazione su membrane convenzionali a base solida consentono a particelle al di sotto di una ?dimensione critica? di passare attraverso un poro della membrana, mentre inibiscono il passaggio di particelle pi? grandi d detta dimensione critica.
E? noto dallo stato dell?arte, e per tutte le persone esperte del settore, il funzionamento delle membrane classiche, in cui le forze in gioco utilizzate durante il processo della filtrazione, (gravitazionale o da gradienti fisici e/o chimici, possono essere molteplici (ad esempio gradiente di pressione, o di pressione colloidale osmotica (Osmolarit?),o per la differenza di potenziale elettrico, o per gradiente termico, o per gradiente di concentrazione, o la forza di gravit? o la forza centrifuga).
Inoltre, ? possibile utilizzare anche combinazioni di pi? forze motrici nella separazione fisica classica di solidi sospesi, colloidali o disciolti da un mezzo liquido o gassoso.
Ancora, sono note diverse tipologie di filtrazione, come la microfiltrazione, la ultrafiltrazione e la nanofiltrazione.
In generale, gli sforzi dell?ingegneria delle membrane si sono concentrati prevalentemente sui materiali a base solida.
Recentemente, ? stata ideata una nuova tecnologia di membrana denominata ?Free-standing liquid membranes? o membrane autoportanti a separazione inversa. Queste membrane sono in grado di lasciar passare solo le sostanze di dimensioni superiori a quelle critiche relativamente alla specifica composizione della membrana a separazione inversa (M.S.I.), che rimarranno sulla membrana autoportante.
Queste membrane, che sono in grado di mostrare un comportamento inverso, cio? il passaggio di particelle grandi e l'inibizione al passaggio di quelle piccole, sono insolite nelle applicazioni di ingegneria convenzionali. Questa nuova metodologia di filtrazione su membrana si ispira al meccanismo biologico dell'endocitosi cellulare ed alle propriet? autorigeneranti dei liquidi (Self-healing), che coinvolge tra l?altro la tensione superficiale che ogni liquido possiede e che dipende dalla specifica composizione della soluzione utilizzata per la costituzione della membrana a separazione inversa (M.S.I). Le membrane autoportanti a filtrazione inversa, sono composte interamente di un liquido (omogeneo o eterogeneo mono o multifasico) specifico (Self-healing materials), e possono essere progettate per trattenere particelle pi? piccole di una ?dimensione critica? date le propriet? inerziali intrinseche delle particelle o cellule oggetto della separazione.
Come ? noto nello stato dell?arte, le membrane che consentono alle particelle pi? grandi di passare mentre non lo consentono a quelle piccole, devono essere dinamicamente riconfigurabili e basate su sostanze ?intelligenti? con propriet? di autoguarigione, (Self-healing), comunemente manifestate dalle sostanze liquide, in grado di recuperare, parzialmente o totalmente, un danno meccanico o di altra natura, in maniera autonoma od in risposta ad uno qualsivoglia stimolo esterno.
Negli ultimi anni, il concetto di incorporare liquidi in materiali a base solida ha portato a tecnologie di superficie innovative (vedi bibliografia. Ad esempio, l'incorporazione di strati liquidi stabili in solidi porosi consente propriet? autorigeneranti, robusta repellenza liquida antibiofouling propriet? antigelo e persino di gating .
Tuttavia, nonostante le propriet? uniche dei materiali a base liquida (come appunto la rapida auto-guarigione propria dei Self-healing materials), il concetto di utilizzare membrane composte interamente di liquidi come materiali funzionali, ? rimasto inesplorato.
L?impiego di membrane liquide come filtri all?interno di un siringotto di centrifugazione fornisce l?ulteriore vantaggio di consentire il prelievo selettivo dei singoli componenti di una miscela eterogenea multifase che si sono raccolti nei diversi pozzetti di raccolta, dopo la centrifugazione, mediante aspirazione diretta attraverso l?ago di una siringa da prelievo in grado di attraversare tutte le membrane liquide che incontra fino allo specifico pozzetto selezionato, mantenendo sempre le condizioni di sterilit?.
Tale caratteristica ? estremamente rilevante per gli operatori rendendo estremamente semplice e pratica la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase, in particolare delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo.
La descrizione che segue far? riferimento, a titolo esemplificativo ma non limitativo del presente trovato, allo specifico settore della separazione delle cellule staminali e stromali derivate o prelevate con metodi meccanici dal tessuto adiposo sottocutaneo ed all?uso di membrane a separazione inversa (self-healing materials), composte esclusivamente da liquidi, che possono ottenere regimi di separazione delle particelle staminali che non possono essere raggiunti dalle tecnologie convenzionali a membrana.
Cellule staminali
Come sopra riportato la separazione delle sostanze ? un passaggio fondamentale per molti processi; in particolare negli ultimi anni, si ha la necessit? dell?isolamento di differenti tipologie cellulari, o frazioni, come ad esempio isolamento delle cellule staminali, da poter utilizzare in molteplici terapie mediche per le pi? diverse patologie.
Gli studi riguardanti le cellule staminali stanno vivendo un rapido sviluppo. Si tratta di un ambito di ricerca di grande interesse, non solo dal punto di vista scientifico e medico. Si percepisce ottimismo circa il potenziale impatto di queste cellule nello studio e nel trattamento di numerose condizioni patologiche: esso deriva dalla consapevolezza, propria non solo del clinico e del ricercatore, ma anche del paziente e del grande pubblico, che terapie basate su cellule staminali si sono gi? dimostrate valide in clinica. Pratiche quali il trapianto di cellule staminali emopoietiche, epidermiche e corneali sono realt? rivoluzionarie. Il pionieristico lavoro di Till e Mac Cullough (1961) sulle cellule staminali emopoietiche del topo ha costituito senza dubbio la base di partenza per tutte le successive strategie di ricerca sulle cellule staminali.
Come ? noto per una persona esperta nel settore, le cellule staminali sono cellule indifferenziate di un organismo multicellulare che hanno la capacit? di produrre indefinitamente pi? cellule dello stesso tipo. Senza entrare nel dettaglio, una cellula si pu? definire staminale quando possiede le seguenti caratteristiche:
1) La cellula staminale ? una cellula con la capacit? di auto-rinnovarsi e differenziare il potenziale genetico.
2) E? in grado di auto rinnovarsi, con ausilio della divisione cellulare asimmetrica che porta ad almeno una cellula figlia che ? uguale alla cellula madre.
3) Deve impegnarsi in un percorso definito che porta alla differenziazione e all'incapacit? di auto-rinnovamento.
4) La cellula deve poter andare incontro a molteplici e sequenziali divisioni cellulari di auto-mantenimento, un prerequisito per sostenere una popolazione cellulare.
5) Le cellule figlie derivate da una singola cellula staminale devono potersi differenziare in almeno un diverso tipo cellulare rispetto a quello della staminale;
6) Devono possedere la capacit? di ripopolare il tessuto di origine se trapiantate in un sito ricevente danneggiato/malato;
7) Devono essere in grado di contribuire con una progenie differenziata in vivo anche in assenza di danni tessutali.
In sostanza, le cellule staminali sono caratterizzate dal notevole potenziale di svilupparsi in molti diversi tipi di cellule del nostro corpo durante lo stato iniziale di vita e durante la crescita dell?individuo. La caratteristica distintiva delle cellule staminali ? la loro capacit? di rinnovarsi attraverso la divisione cellulare e la loro capacit? di trasformarsi in cellule specifiche di tessuti o organi con funzioni speciali.
Le cellule staminali pluripotenti hanno il potenziale per differenziarsi in ciascuna delle tre linee germinali: Endoderma (rivestimento interno dello stomaco, tratto gastrointestinale, polmoni), Mesoderma (muscolo, ossa, sangue, urogenitale) o Ectoderma (tessuti epidermici e sistema nervoso).
In alcuni organi, come l'intestino ed il midollo osseo, le cellule staminali si dividono regolarmente per riparare e sostituire i tessuti usurati o danneggiati. In altri organi, come il pancreas e cuore, cellule staminali si dividono solo in condizioni particolari.
Le Mesenchimali stromali/cellule staminali (MSC), che offrono un elevato potenziale di applicazioni terapeutiche molteplici in medicina rigenerativa ed estetica, si trovano principalmente nel midollo osseo, ma possono essere isolate da altri tessuti (ad esempio cartilagine, grasso, cellule muscolari, etc). Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono considerate come cellule staminali adulte prototipiche che sono caratterizzate dalla loro capacit? di differenziarsi in una variet? di tipi di cellule, tra cui osteoblasti (cellule ossee), condrociti (cellule della cartilagine), miociti (cellule muscolari), e adipociti (cellule del grasso).
A causa dell'enorme interesse nell'uso di cellule derivate da tessuto adiposo nelle molteplici "terapie" cliniche, ? importante sapere che cos'? una composizione cellulare di questo tessuto. Molto spesso il tessuto grasso viene indicato come la "fonte pi? ricca di cellule staminali" nel nostro corpo.
Si tratta quindi di definire che tipo di cellule staminali esistono nel tessuto adiposo.
Possiamo grossolanamente definire il tessuto adiposo come costituito da adipociti maturi, sangue e tutto il resto.
Quest'ultimo ? spesso chiamato "frazione vascolare stromale" (SVF). SVF ? arricchito per popolazioni di cellule progenitrici multiple e cellule staminali.
La frazione vascolare stromale (SVF) ? un componente del lipoaspirato che pu? essere estratto tramite la tecnica della liposuzione, dal tessuto adiposo del corpo umano. Il lipoaspirato consiste in una miscela eterogenea di cellule ed ha un alto contenuto di cellule staminali, denominate cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC o ADSC), che mostrano affinit? con le cellule staminali del midollo osseo, come ad esempio la loro capacit? di differenziarsi in molteplici linee cellulari.
La popolazione eterogenea di SVF, comprende cellule endoteliali, eritrociti, fibroblasti, linfociti, monociti, macrofagi e periciti, cos? come una frazione importante di cellule staminali (ASC) derivate da tessuto adiposo. Cellule stromali/staminali derivate da tessuto adiposo (ASC) Cellule stromali/staminali derivate da Adiposo (ASC/ADSC) rilasciano alti livelli di fattori di crescita bioattivi come fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), fattore di crescita dei fibroblasti basico (b FGF), fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) fattore di crescita piastrinico (PDGF), fattore di crescita degli epatociti (HGF), fattore di crescita trasformante beta (TGF-?), fattore di crescita dell'insulina (IGF) e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF).
Le ACS, cio? le cellule staminali adipocitarie, non rilasciano solo fattori di crescita, ma secernono anche citochine (Le citochine sono molecole proteiche prodotte da vari tipi di cellule e secrete nel mezzo circostante, di solito in risposta a uno stimolo, e inducono nuove attivit? come crescita, differenziazione e morte. La loro azione di solito ? locale, ma talvolta pu? manifestarsi su tutto l'organismo. Le citochine possono quindi avere un effetto autocrino (modificando il comportamento della stessa cellula che l'ha secreta), o paracrino (modificano il comportamento di cellule adiacenti). Alcune citochine possono invece agire in modo endocrino, modificando cio? il comportamento di cellule molto distanti da loro. Hanno una vita media di pochi minuti). e interleuchine tra cui ligando della tirosina chinasi 3 (Flt-3).
La SVF fu isolata per la prima volta da Rodbell nel 1964 usando enzimi proteolitici e centrifugazione.
Il "potenziale multipotente" delle cellule staminali derivante dalla popolazione di tipo SVF derivata dal grasso umano ? stato caratterizzato da Zuk nel 2001. Zuk ha chiamato queste cellule "cellule PLA", a causa della loro origine, cio? prelevate da materiale lipoaspirato.
Nell'ultimo decennio c?? stata molta confusione in seno alla nomenclatura delle cellule staminali, derivate dal tessuto adiposo. Alcuni professionisti hanno chiamato le SVF "cellule staminali", ma altri usano questo termine solo per le cellule propagate in coltura.
Fino ad ora, ? possibile trovare, per le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo, diversi termini utilizzati come sinonimi in letteratura. Per esempio: cellule staminali adulte derivate da ADAS (ADAS); cellule stromali adulte derivate da adulti; cellule stromali derivate da tessuto adiposo (ADSC); cellule stromali adipose (ASC); cellule staminali mesenchimali adipose (AdMSC); preadipocytes; cellule lipoaspirate processate (PLA); cellule stromali / staminali derivate da tessuto adiposo (ASC); lipoblasti; periciti.
L'International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) ha un ruolo guida nello stabilire la nomenclatura e gli standard per l'utilizzo di cellule derivate da tessuto adiposo in medicina.
Circa 6 anni fa, l'IFATS ha raccomandato di utilizzare il termine "cellule staminali derivate da tessuto adiposo" (ASC) per identificare ?la popolazione cellulare isolata, plastica-aderente e multipotente".
Tuttavia, l'istruzione IFATS successiva non consiglia l'uso di "cellule staminali" a termine, ma utilizza "cellule stromali derivate da tessuto adiposo (ASC)" invece di caratterizzare cellule propagate in coltura.
Pertanto, nonostante la raccomandazione dell'IFATS, non vi ? chiarezza nella letteratura sull'uso di "cellule staminali" per le cellule derivate da tessuto adiposo propagate in coltura.
Riteniamo pertanto necessario indicare che nel proseguo della presente descrizione, a supporto di una domanda di brevetto per invenzione industriale, relativa ad un dispositivo e metodo per la separazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo, adotteremo la seguente nomenclatura:
Stromal Vascular Fraction (SVF) = frazione cellulare eterogenea appena isolata, isolata dal tessuto adiposo nativo o da liposuzione aspirata; e Cellule staminali derivate da tessuto adiposo = cellule stromali derivate da tessuto adiposo (ASC), popolazione cellulare aderente, plastica, derivata da SVF e propagata o propagabile in coltura.
Da quanto riportato sopra ? chiara l?importanza di poter separare in modo efficiente la frazione delle cellule staminali di interesse.
Stato dell?arte dei metodi di separazione delle cellule staminali
Attualmente, e per una persona esperta del settore, sono noti diversi metodi di separazione delle cellule staminali.
In particolare, ? noto come le cellule staminali autologhe degli adulti possono essere estratte dalle seguenti fonti:
1) Dal midollo osseo, che richiede l'estrazione dal tessuto di raccolta, che si realizza con la biopsia ossea.
2) Dal tessuto adiposo (cellule lipidiche), che richiede l'estrazione con la metodica della liposuzione.
3) Dal sangue, che richiede l'estrazione attraverso l?aferesi, in cui il sangue dal donatore passa attraverso un sistema di ?dialisi? da cui le cellule staminali vengono estratte dal sangue, mentre gli altri componenti del sangue ritorna indietro dal donatore.
Isolamento delle ASC dai tessuti adiposi
L'isolamento delle ASC dai tessuti adiposi fu sviluppato da Rodbell e Jones nel 1960 (18, 19).
Inizialmente, gli innesti di grasso erano tagliati in piccoli pezzi per liberare le cellule di grasso, mentre in seguito l'invenzione della tecnologia della liposuzione ha semplificato questo processo.
La liposuzione ? una procedura in cui un chirurgo od il medico operatore, inietta della soluzione salina contenente un anestetico e/o dell?adrenalina nel tessuto adiposo sottocutaneo e quindi rimuove una miscela contenente cellule adipose e detriti cellulari attraverso l'aspirazione (20). Questa procedura ? composta da diversi passaggi e ogni fase pu? influire sulla quantit? e sulla qualit? delle ASC, tra cui:
1) Lo schiacciamento del tessuto adiposo, in cui Atala et al (21) hanno riscontrato che lo schiacciamento dei tessuti adiposi, che ? influenzato dal diametro della cannula di aspirazione, influenza la vitalit? delle ASC isolate. Altri studi hanno indicato che la sola aspirazione della liposuzione non altera in modo significativo la vitalit? delle ASC isolate (21-23);
2) La velocit? di centrifugazione, in cui il recupero delle ASC pu? essere ulteriormente migliorato manipolando la velocit? di centrifugazione utilizzata nel processo di purificazione ASC. La velocit? di centrifugazione ottimale ? di 1.200 g (24,25).
3) L?et? del paziente, poich? la capacit? di differenziazione delle ASC varia con l'et? del paziente, dove i pazienti pi? giovani hanno una maggiore capacit? di differenziazione delle ASC (26);
4) Il sito di isolamento delle ASC. Le ASC dell'addome sembrano avere una resa maggiore, rispetto a quelle dell'anca o della coscia (27);
5) La fase di lavaggio nella purificazione delle ASC, necessaria per la purificazione delle ASC (28). Questo passaggio viene eseguito per rimuovere i contaminanti ematici, tuttavia, non influenza l'integrit? od il numero di adipociti e consente il recupero di un numero maggiore di cellule endoteliali e ASC.
Sono state sviluppate altre strategie per migliorare l'isolamento delle ASC. Queste strategie includono:
A) Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (29),
B) Sfere immunomagnetiche rivestite con anticorpi specifici (30) e
C) Selezione per l'espressione dell?aldeide deidrogenasi (31).
I metodi usati per isolare le ASC possono influenzare la quantit? e la qualit? delle ASC. E? opportuno esaminarne brevemente i pi? significativi, per rendersi conto della complessit? e dei limiti che un corretto isolamento delle cellule staminali attualmente comportano.
1) Isolamento di CSM da tessuto adiposo e mantenimento in coltura
Il tessuto adiposo sottocutaneo viene prelevato tramite ago-aspirazione, previa anestesia, effettuata con l'uso di Medetomidina 0,5 mg/ml al dosaggio di 15 mcg/kg. Tale procedura ? stata eseguita secondo quanto previsto dal D.L. 116/92 e dalla Direttiva 201/63/UE.
Il tessuto adiposo prelevato ? immerso in soluzione salina addizionata di antibiotici e antimicotici al 5% (penicillina, streptomicina ed amfotericina b) e mantenuto un'ora a temperatura ambiente per favorire la decontaminazione da eventuali agenti microbici. Il campione viene pesato, frammentato meccanicamente e sottoposto a ripetuti lavaggi (almeno 3) con Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, PAA the Cell Colture Company) addizionata di antibiotici e antimicotici al 2%.
Dopo aver eliminato la soluzione salina, il campione viene posto in una beuta con una soluzione di collagenasi tipo lA (GIBCO) allo 0,2% (20 ml di enzima/grammo di tessuto da digerire), in Phosphate Buffered Saline (PBS) addizionato di antibiotici al l%.
La collagenasi agisce sul collagene, che compone la matrice extracellulare, permettendo l'isolamento cellulare dallo stroma che compone il tessuto adiposo. Il PBS ? una soluzione salina a base acquosa contenente cloruro e fosfato di sodio od, in alcune formulazioni, cloruro e fosfato di potassio. I gruppi fosfato del buffer permettono di mantenere costante il pH. Il campione viene posto a 37?C in bagno termostatico, in agitazione, per 2-3 ore fino a completa digestione. Al termine del processo, l'attivit? dell'enzima viene neutralizzata aggiungendo Siero Fetale Bovino (SFB, Euro Clone) al 20%. Quindi, il tessuto digerito viene filtrato attraverso garze sterili, posto in tubi da 50 ml e centrifugato a 2700 giri per l O minuti a temperatura ambiente. Il surnatante, ricco di gocciole lipidiche derivate dalla disgregazione degli adipociti, ? eliminato. Il pellet cellulare ottenuto viene risospeso in 10 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (lg/L di glucosio), addizionato di SFB al 20% e contenente una soluzione di antibioticiantimicotici al l%, e centrifugato 2 volte a 1400 giri per 10 minuti a temperatura ambiente. Il pellet viene risospeso in 10 ml di terreno nuovo, filtrato attraverso filtri da 70 Jlm e centrifugato nuovamente, seguendo le precedenti condizioni, al fine di eliminare ogni residuo di soluzione enzimatica. Il pellet, infine, viene risospeso in 3 ml di terreno e viene eseguita una conta di vitalit? cellulare con Trypan Blue in camera di Burker, che viene utilizzata come strumento per il conteggio di globuli rossi e bianchi del sangue di origine animale od umana.
Poich? il colorante ? in grado di penetrare solo all'interno delle cellule la cui membrana cellulare ? disgregata, alla visione al microscopio, le cellule vive avranno un citoplasma chiaro, mentre quelle non vitali si coloreranno di blu. Le cellule vengono poste in fiasche da 25 cm<2 >ad una concentrazione di 50.000 cellule/ml di terreno ed incubate a 37?C in atmosfera di CO2 al 5%. Dopo 48 ore di incubazione, viene eseguito il primo cambio di terreno per eliminare la componente cellulare non adesa (cellule ematiche fisiologicamente presenti nel tessuto). Quando le cellule mesenchimali in coltura hanno raggiunto una confluenza di circa l'80% vengono effettuate le subcolture (passaggi cellulari) che prevedono un preliminare trattamento enzimatico. Il terreno viene aspirato e le piastre vengono sopposte a lavaggio con PBS. La soluzione viene eliminata, si aggiunge la soluzione enzimatica tripsina 0,05% -EDTA 0,02% in modo da indebolire le interazioni cellulari, consentendo il distacco delle cellule dalla plastica a cui aderiscono. La tripsina, un enzima proteolitico, ha specificit? per lisina e arginina, mentre l'EDTA ? un chelante degli ioni bivalenti implicati nell'interazione cellulare. Le cellule vengono incubate per qualche minuto a 37?C e successivamente l'azione della tripsina viene bloccata con terreno contenente SFB. La sospensione cellulare viene raccolta in tubi da 15 ml e centrifugata. Il pellet ottenuto ? risospeso in DMEM (lg/L di glucosio) addizionato di SFB al 20% e una soluzione di antibiotici-antimicotici al 1%. Al termine di ogni passaggio cellulare si effettua la conta con camera di Burker e si seminano 50.000 cellule/mi di terreno e vengono incubate a 37?C al 5% di C02.
2) Isolamento della frazione stromale vascolare (SVF) per cavitazione ultrasonica.
Fa ormai parte dello stato dell?arte nota che la cavitazione ultrasonica ? un metodo meccanico altamente efficace per isolare le cellule staminali da tessuto adiposo umano. La frazione stromale vascolare (SVF) isolata tramite l?utilizzo della su citata cavitazione ultrasonica mostra un alto potenziale rigenerativo per applicazioni mediche.
Gli Hielscher ultrasuoni processori UP200Ht e UP200St con sonotrodo S26d14, sono comunemente utilizzati per il trattamento di cellule staminali autologhe. Tramite il sonotrodo (sonda ultrasonica), le onde ultrasoniche sono accoppiate direttamente nel grasso autologo in modo che la cavitazione ultrasonica rilascia le cellule staminali e le cellule stromali del tessuto residuo.
Tuttavia, questo metodo richiede una apparecchiatura specifica, costosa e non consente la completa sterilit? del sistema, come sarebbe altamente auspicabile.
Applicazione clinica del Fat Transfer (FG), o fat grafting, o lipofilling
La FG, ossia il lipotrasferimento cellulare, ? una tecnologia di nuova concezione, in cui la stessa frazione vascolare stromale (SVF) dei pazienti, ricca di ASC, ? isolata dalla met? del grasso aspirato e miscelata con un'altra met?, prima della miscela iniettata nelle parti desiderate del corpo.
Aggiungendo la SVF nel grasso aspirato, che ? basso in ASC, la si converte in grasso ricco in ASC.
I risultati preliminari hanno suggerito che la FG ? una tecnologia efficace e sicura per l'aumento dei tessuti molli ed ? superiore alla lipoiniezione convenzionale (Yoshimura K, Sato K, Aoi N,Kurita M, Hirohi T and Harli K: Cell- assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: Supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plast Surg. 32:48-55, Discussion 56-57. 2008.)
Soluzione del problema tecnico secondo il presente trovato
In base a quanto sopra riportato e noto dallo stato dell?arte, il corretto isolamento delle cellule staminali ? fondamentale per le future applicazioni delle stesse. I metodi comunemente utilizzati risultano laboriosi, lenti e/o richiedono l?utilizzo di sofisticate attrezzature. Inoltre, possono avere effetti diretti sulla vitalit? e resa delle cellule staminali isolate.
E?particolarmente sentita quindi la necessit? di superare tutti i limiti e gli inconvenienti finora presenti nella separazione delle cellule staminali e stromali derivate o prelevate con metodi meccanici dal tessuto adiposo sottocutaneo.
Ci? ? stato ottenuto secondo un primo aspetto della presente invenzione attraverso l?uso di un siringotto di separazione a pistone che utilizza, posizionandola sulla testa di detto pistone, almeno una membrana a separazione inversa in grado di lasciar passare solo sostanze di dimensioni superiori ad una ?dimensione critica? per cui le particelle di dimensioni inferiori non attraversano tale membrana e, raccogliendosi al di sopra della stessa membrana, evitano, al momento dell?espulsione dal siringotto, ogni possibile commistione dei vari componenti
In particolare la membrana a separazione inversa utilizzata ? una membrana liquida denominata ?Freestanding liquid membranes?, ottenuta con una nuova tecnologia di membrana, che trae ispirazione dal meccanismo biologico dell?endocitosi cellulare e dalle propriet? autorigeneranti dei liquidi (Selfhealing,) che coinvolge la tensione superficiale che ogni liquido possiede. La caratteristica peculiare di tale tecnologia ? quella che permette di lasciar passare solo particelle superiori a quelle critiche, inibendo invece il passaggio alle particelle pi? piccole.
Nella fattispecie quindi, ? sufficiente sintonizzare una specifica tensione superficiale della membrana ed i suoi parametri geometrici (dimensione, forma, ecc.) per progettare una membrana in grado di trattenere particelle pi? piccole di una dimensione critica corrispondente a quella delle cellule staminali di derivazione stromale.
Cos? facendo, a seconda delle varie applicazioni, ? possibile superare i limiti imposti dall?attuale stato dell?arte aumentando la selettivit? dell?isolamento delle cellule staminali, attraverso una successione di membrane a separazione inversa opportunamente modulate, che potranno essere poste sulla testa del pistone a vite di una siringa o siringotto, variandone anche il numero, da una a tre, sino ad un numero indefinito indicato con N, per trattenere, a partire da una dimensione critica, particelle comprese in range di dimensioni progressivamente crescenti, ciascuna con uno specifico pozzetto di raccolta e di prelievo.
Il tutto riducendo contemporaneamente la complessit? dei passaggi operativi per tale isolamento ed i tempi di esecuzione.
E? infatti particolarmente rilevante il fatto che le propriet? autorigeneranti (Self-healing,) dei liquidi che costituiscono le membrane autoportanti a separazione inversa del presente trovato permettono di prelevare, dopo la centrifugazione, dagli spazi di raccolta interposti fra una membrana e l?altra, le particelle selettivamente raccolte mediante il semplice prelievo con l?ago di una comune siringa da prelievo, passando attraverso il raccordo luer lock del siringotto, sempre in condizioni di sterilit?, e con la massima semplicit? operativa.
Elenco delle figure
Ulteriori caratteristiche e vantaggi del trovato risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata dell?invenzione che segue, facendo riferimento alle allegate tavole di disegno che ne illustrano a solo titolo di esempio non limitativo una preferita forma realizzativa. Nelle tavole:
la fig. 1A ? una vista in elevazione esplosa dell?insieme di una tradizionale siringa di prelievo, di un luer lock e di un siringotto secondo il presente trovato, il quale ? dotato all?interno di un pistone a vite e di un dispositivo porta-filtri, scorrevole a tenuta, posizionato in testa a detto pistone;
la fig. 1B ? una vista in elevazione parzialmente sezionata del siringotto di fig. 1A che mostra l?inserimento di una interfaccia solida di connessione tra pistone a vite e porta-filtri, che viene applicata sul fondo del porta-filtri per fornire a quest?ultimo, durante l?avvitamento del pistone, solo una spinta assiale;
la fig.2 ? una vista in elevazione del portafiltri preferibilmente in gomma, che indicheremo nel seguito come gommino;
la fig.3 ? una vista in pianta dello stesso gommino;
la fig.4 ? una vista in sezione verticale secondo il piano di traccia A-A della fig.3 dello stesso gommino di lunghezza variabile;
la fig. 5 ? una vista in pianta dall?alto di un singolo elemento modulare di filtro a membrana liquida da introdurre nel gommino;
la fig. 6A ? una sezione secondo il piano di traccia B-B di fig. 5 dello stesso elemento modulare di filtro a membrana, che ? costituito da una membrana liquida confinata in un anello di contenimento che ? dotato sia di un distanziatore inferiore che di una scanalatura superiore atta ad alloggiare la base del distanziatore dell?elemento modulare di filtro sovrastante;
la fig. 6B ? la stessa sezione della fig. 6A, operata su un elemento modulare di filtro simile al precedente ma dotato di un fondo chiuso;
le figg.7 e 8 sono rispettivamente una vista in pianta dall?alto ed una vista in sezione secondo il piano di traccia C-C del gommino a soffietto di fig.2 in cui sono montati a titolo esemplificativo quattro elementi modulari di filtro a membrana liquida di figg.5,6a e 6b; in particolare in fig.8 sono evidenziate le diverse densit? delle particelle che si sono raccolte nel gommino al termine dell?avvitamento del pistone: in alto sono raccolte le pi? leggere, mentre scendendo verso il basso si incontrano particelle di dimensioni sempre crescenti;
la fig. 8a mostra in sezione, a titolo esemplificativo, un elemento rigido di interfaccia per la connessione tra gommino e pistone a vite;
la fig. 9 ? una vista in elevazione della siringa di prelievo collegata tramite il luer lock al siringotto secondo il presente trovato, per trasferirvi il materiale prelevato;
la fig. 10 ? una vista in elevazione del siringotto dopo la centrifugazione, ancora chiuso alla sua estremit? superiore, che evidenzia le stratificazioni in cui si distribuisce il materiale di prelievo, prima dell?introduzione dal basso dello pistone a vite che deve essere azionato, per far fuoriuscire i diversi componenti separati;
la fig.11 riporta due schemi che mostrano rispettivamente le differenze dei materiali e del meccanismo di separazione tra una tradizionale membrana solida A, ed una membrana liquida utilizzata nella presente invenzione;
la fig.12 mostra il prelievo delle cellule di dimensioni steriche desiderate, mediante l?introduzione nel siringotto dell?ago di una siringa in modo da raggiungere, nel gommino porta-filtri, il pozzetto di raccolta corrispondente, attraversando anche delle membrane liquide;
la fig.13 mostra l?ago di prelievo, dotato di marker per valutare la posizione dei diversi pozzetti nel porta filtro.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Con riferimento alle figure, l?invenzione introduce l?uso di membrane autoportanti a separazione inversa composte esclusivamente da liquidi nella fase di separazione di cellule staminali derivate da tessuti adiposi umani che permettono di ottenere regimi di separazione delle particelle che non possono essere raggiunti dalle tecnologie convenzionali a membrana solida. Specificatamente, sintonizzando una specifica tensione superficiale della membrana ed i parametri geometrici (dimensioni, forma etc.) si pu? progettare una membrana in grado di trattenere particelle pi? piccole di una dimensione critica (che sar? quella delle cellule staminali di derivazione stromale), basata sulle propriet? inerziali delle cellule staminali e stromali (nelle loro diverse fasi del ciclo cellulare vitale) di origine adiposa.
Come sopra riportato, secondo un primo aspetto dell?invenzione, la separazione dei componenti di una miscela eterogenea multifase ed in particolare delle cellule staminali e stromali da una miscela di cellule derivate da tessuto adiposo, ? ottenuta mediante l?utilizzo di un siringotto 10, che presenta un corpo trasparente formato da un corpo cilindrico cavo all'interno del quale scorre a tenuta un pistone ad avvitamento 12, sul cui apice o testa ? posizionato, come verr? meglio descritto pi? avanti, un dispositivo porta filtri 14, (figg.1? s,1B).
Come si vede in fig.2, il gommino 14 ? in forma di un soffietto ed ? atto a fare tenuta sulla parete interna del siringotto 10.
Secondo una preferita forma realizzativa, il corpo cilindrico del siringotto 10 (detto anche camicia, parte esterna o camera), su cui sono indicate delle tacche di misura, ? dotato di un raccordo 36 (o punta) di diametro ridotto che consente l?innesto di un tubicino attraverso cui passa il liquido che viene iniettato o aspirato.
Detto raccordo o punta 36 del siringotto 10 pu? essere di tipo luer-lock o luer-slip: la prima ha un sistema di avvitamento che blocca l'attacco per evitarne la rimozione accidentale, la seconda non ha alcun blocco<[>.
L?estremit? inferiore del siringotto 10 ? chiusa invece da un tappo 37 (vedi fig. 10) ad incastro o avvitabile in una sede opportunamente filettata sulla quale si avvita anche il pistone a vite asportabile 12.
All'estremit? superiore di detto pistone 12, il comune anello o la capsula di gomma che ? presente per garantire la scorrevolezza controllata e costante di un pistone in una siringa, ? sostituito, come si vede in fig.2, dal dispositivo porta filtri 14 che ? costituito da un elemento di ingombro sostanzialmente cilindrico, cavo internamente, preferibilmente in gomma, altres? detto gommino 14, che fa da supporto ad una pluralit? di filtri, indicati singolarmente con 22, a pianta circolare che vengono inseriti uno sull?altro nel suo interno.
Secondo una caratteristica peculiare dell?invenzione, tali filtri sono costituiti da elementi rigidi modulari di forma cilindrica 22a in ciascuno dei quali ? montata una membrana autoportante liquida a filtrazione invertita 22b. Detti elementi rigidi modulari 22a vengono inseriti uno sull?altro all?interno del gommino 14 in modo che ogni membrana 22b vada a posizionarsi in una delle pieghe a fisarmonica che costituiscono detto soffietto.
Nella preferita forma realizzativa, mostrata nelle figure, ciascuna di queste membrane 22b ? costituita da uno strato liquido autoportante incastonato in una apposita sede a pianta circolare, ricavata per restringimento di diametro alla estremit? superiore di detto elemento cilindrico rigido 22a. Lungo la periferia di detta sede circolare che fa da anello di contenimento della membrana autoportante 22b ? ricavata una scanalatura circolare 22c che fa da alloggiamento per la base inferiore 22b dell?elemento semicilindrico sovrastante, come si vede in fig.8. In questo modo, sovrapponendo pi? elementi modulari 22a, tra una membrana e l?altra si viene a definire una camera di raccolta chiusa la cui altezza corrisponde sostanzialmente all?altezza dell?elemento rigido modulare di supporto della stessa membrana.
E? quindi possibile impilare, all?interno del gommino 14, una pluralit? di filtri a membrana 22, distanziati fra loro verticalmente a partire dalla loro estremit? distale, definendo una successione di camere di raccolta o vani 30, in cui possono raccogliersi i componenti separati selettivamente di una miscela eterogenea multifase centrifugata. In fig.6b ? illustrato l?elemento cilindrico modulare destinato ad assumere la posizione terminale inferiore di qualunque serie di elementi impilati uno sull?altro, essendo dotato di per s? di una camera di raccolta sottostante munita di un proprio fondo.
Ogni gommino 14 ? chiuso inferiormente (fig.8) da un elemento rigido 13 di connessione con il pistone a vite 12, dotato di un perno inferiore 12a e conformato in modo da trasferire il moto assiale dello pistone allo stesso gommino 14, senza farlo ruotare.
Trasferito secondo consuetudine, tramite un raccordo luer-lock 33, il contenuto del prelievo da una comune siringa 31, che ha effettuato l?aspirazione, al siringotto 10, quest?ultimo viene immesso, chiuso sia nella sua parte superiore con un tappo a pressione 35 (fig.10) che nella parte inferiore con un tappo a vite 37, ed in assenza del pistone 12, in una centrifuga, non rappresentata, e sottoposto ad un processo di separazione del materiale in esso contenuto in base al gradiente di peso specifico o densit?.
Rimosso il tappo posto nella parte inferiore del siringotto, l?operatore operer? la selezione dei componenti ottenuti dalla centrifugazione attraverso un preciso e lento movimento di avvitamento del pistone a vite 12 che tramite queste membrane autoportanti a filtrazione invertita consente di lasciar passare solo sostanze di dimensioni superiori ad una ?dimensione critica? per cui sono separabili facilmente le particelle di uno specifico peso, mediante la semplice aspirazione, e modulando il numero di anelli/membrane e/o regolando la tensione superficiale delle membrane liquide e/o variando la composizione dei liquidi auto-riparanti che compongono le membrane liquide autoportanti a filtrazione inversa. In questo modo, sar? possibile trattenere sopra una determinata membrana autoportante le cellule staminali desiderate specifiche per dimensione, mentre il resto verr? raccolto nel pozzetto sottostante.
Il principio su cui si basano le membrane solide ? basato sul processo biologico dell?endocitosi. In dettaglio, con riferimento alla fig.11, con A si indica lo schema di funzionamento delle membrane solide convenzionali che usano geometrie porose per consentire il passaggio di piccole particelle mentre inibiscono meccanicamente il passaggio di particelle grandi.
Lo schema B ? invece relativo alle membrane liquide che si basano su meccanismi completamente diversi per la separazione delle particelle e consentono il comportamento di separazione inversa: come si vede, piccole particelle possono essere trattenute, mentre quelle grandi passano attraverso la membrana.
In particolare, sintonizzando una specifica ?tensione superficiale? della membrana ed i parametri geometrici (dimensioni forma, etc.), si pu? progettare una membrana in grado di trattenere particelle pi? piccole di una dimensione critica (che nel caso che ci interessa sar? quella delle cellule staminali e stromali di derivazione adiposa), basata sulle propriet? inerziali delle cellule staminali di origine stromale adiposo. Vedi ad esempio l?articolo ?Free-standing liquid membranes as unusual particle separators ? in : Science Advances 24 ago 2018: Vol.
4, no.8, eaat3276 (2018) DOI: 10.1126 / sciadv.aat3276 a cui rimandiamo per completezza.
Pi? specificatamente le membrane liquide sono costituite da un materiale liquido stabilizzato che pu? essere semplice come un sistema a due componenti (bifasico) [ad esempio, acqua con un tensioattivo che pu? essere costituito nella sua estrinsecazione pi? semplice da un micro film di sapone o da un complesso sistema multicomponente (polifasico) progettato ad hoc, per un'applicazione specifica.
La pi? semplice membrana liquida stabilizzata pu? essere preparata miscelando ?acqua deionizzata con diverse concentrazioni di tensioattivo? [ad esempio, sodio dodecil solfato (SDS)]. Un anello solido pu? essere utilizzato per supportare una tale membrana autoportante liquida.
Variando la concentrazione di SDS, possiamo accordare la tensione superficiale del film da ~ 35 a ~ 72,1 ? 0,4 mN / m
La dimensione relativa delle cellule staminali di nostro interesse ? compresa tra 10~ 30 ?m. Tuttavia quando vengono a contatto con altre superfici, potrebbero essere larghe pi? di 50 ?m.
Con la disposizione, che si ? descritta, di elementi modulari rigidi con sede di contenimento per membrane liquide autoportanti a separazione invertita, impilati all?interno di un gommino in testa al pistone ad avvitamento, sar? possibile isolare cellule staminali di diverse dimensioni semplicemente variando la composizione delle membrane a separazione invertita MSI presenti nel gommino, e/o regolando i valori di tensione superficiale delle membrane liquide a separazione invertita.
Le formulazioni poi di tali membrane liquide saranno molteplici: a titolo puramente illustrativo e non gi? limitativo, la pi? semplice membrana liquida stabilizzata pu? essere preparata miscelando acqua deionizzata con diverse concentrazioni di tensioattivo quale il sodio dodici solfato (SDS). Un anello solido pu? essere utilizzato per supportare una tale membrana autoportante liquida.
Variando la concentrazione di SDS, possiamo portare la tensione superficiale del film da circa 35 a circa 72 mN/m. Le cellule cosi isolate in funzione della loro dimensione, si troveranno all?interno della camera di raccolta o sulla superficie dei filtri su citati.
L?invenzione ? stata descritta sulla base di una preferita forma realizzativa. E? peraltro evidente all?esperto del ramo che numerose modifiche e varianti possono essere apportate senza uscire dall?ambito di tutela dell?invenzione stessa, come definito dalle rivendicazioni che seguono.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1) Un dispositivo porta filtri da utilizzare per la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase, caratterizzato dal fatto che ? costituito da un elemento cilindrico, cavo internamente, nel cui interno vengono inseriti a tenuta uno o pi? filtri selettivi solidi o liquidi, con diverse capacit? filtranti, che sono disposti in successione distanziati verticalmente lungo il suo asse, dando luogo ad almeno una camera di raccolta, il quale dispositivo portafiltri pu? scorrere a tenuta all?interno del corpo cilindrico di una siringa o siringotto in cui viene trasferito il prodotto dell?aspirazione di una siringa da prelievo per la successiva centrifugazione. 2)Il dispositivo porta filtri della riv.1 caratterizzata dal fatto che la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase, porta al loro confinamento, all?interno di almeno una camera di raccolta e sulla superficie di almeno uno dei filtri utilizzati. 3) Un dispositivo porta filtri come alla rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che viene montato a tenuta in detto siringotto in testa ad un pistone a vite che, introdotto dal basso in detta siringa o siringotto, ne regola la posizione lungo l?asse dello stesso siringotto. 4) Un dispositivo porta-filtri come ad una qualunque delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che ? realizzato in gomma od in materiale elastico equivalente. 5) Un dispositivo porta filtri come ad una qualunque delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che ? in forma di soffietto con pieghe a fisarmonica. 6) Un dispositivo porta-filtri come ad una qualunque delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che nell?ambito della filtrazione e separazione di particelle staminali e stromali, derivate da tessuto adiposo, i filtri sono costituiti da membrane liquide a separazione inversa autoportanti ed autoriparanti (self-healing materials), che possono ottenere regimi di separazione delle particelle e/o cellule che non possono essere raggiunti dalle tecnologie convenzionali a membrana solida. 7) Un dispositivo porta-filtri come alla rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che tali membrane liquide sono costituite da un materiale liquido stabilizzato che pu? essere semplice come un sistema a due componenti (bifasico) o da un complesso sistema multicomponente (polifasico) progettato per l?applicazione specifica che scherma gli oggetti pi? piccoli consentendo a quelli pi? piccoli di passare attraverso. 8) Un dispositivo porta filtri come ad una qualunque delle rivendicazioni da 6 in poi in cui tale membrana liquida ? preparata miscelando acqua deionizzata con diverse concentrazioni di tensioattivo, come il sodio dodici solfato (SDS). 9) Un dispositivo porta filtri come alla rivendicazione precedente in cui variando la concentrazione del tensioattivo, la tensione superficiale del film ? accordata a valori compresi tra ~ 35 a ~ 72,1 ? 0,4 mN/m. 10) Un dispositivo porta filtri come ad una qualunque delle rivendicazioni da 6 in poi, caratterizzato dal fatto che ciascuna di queste membrane autoportanti sono incastonate all?interno di un anello rigido che ? inseribile e disinseribile all?interno di detto dispositivo il quale ? posizionato al di sopra del pistone a vite della siringa. 11) Un dispositivo porta filtri come alla rivendicazione 10 caratterizzato dal fatto che l?anello rigido in cui ? incastonata ciascuna membrana autoportante di filtrazione ? dotato inferiormente di un distanziatore e superiormente di una sede di tenuta atta a cooperare con il distanziatore della membrana sovrastante in modo da mantenere costante la distanza fra le singole membrane all?interno di detto dispositivo porta filtri. 12) Un siringotto del tipo utilizzato per la fase di centrifugazione di una miscela eterogenea multifase, con un contenitore cilindrico dotato di un pistone a vite asportabile dal basso, ed un raccordo superiore per il passaggio del liquido contenuto in entrata ed in uscita munito di un tappo di chiusura, caratterizzato dal fatto che incorpora, posizionandolo al di sopra dello stesso pistone a vite, un dispositivo porta filtri costituito da un elemento sostanzialmente cilindrico, cavo internamente, scorrevole a tenuta all?interno di detto contenitore, che sostituisce il comune anello o la capsula di gomma che ? presente per garantire la scorrevolezza controllata e costante del pistone stesso, il quale elemento contiene, come mezzo di filtrazione, almeno una membrana autoportante a filtrazione inversa che lascia passare, solo sostanze di dimensioni superiori, vale a dire di maggiore diametro e peso molecolare, rispetto ad una ?dimensione critica?, per cui le particelle di una specifica dimensione, che si vogliono ricercare, vengono separate dalle altre che sono confinate in una camera di raccolta che ? sottostante alla detta membrana di filtrazione quando la membrana ? una sola od in pi? camere di raccolta che sono interposte tra le membrane di filtrazione sottostanti alla prima quando le membrane di filtrazione sono pi? di una, dette particelle di una specifica dimensione essendo prelevabili introducendo l?ago di una comune siringa da prelievo nel raccordo attraverso cui passa il liquido, per raggiungere la camera in cui sono raccolte, attraversando tutte le membrane interposte. 13) Un siringotto come alla rivendicazione 12 in cui il raccordo attraverso il quale viene iniettato od aspirato il contenuto della siringa di prelievo, ? di tipo Luer-lock o Luer-slip, detto siringotto essendo dotato inferiormente di una chiusura a tappo filettata sul quale va ad avvitarsi anche il pistone a vite che regola la posizione del dispositivo porta filtri. 14) Un siringotto come ad una qualunque delle rivendicazioni da 12 in poi in cui il dispositivo porta-filtri ? realizzato in gomma od in materiale elastico equivalente. 15) Un siringotto come alla rivendicazione 12 in cui ciascuna di dette membrane sono incastonate all?interno di un anello rigido dotato di mezzi distanziatori, e detti anelli sono inseriti vincolati in successione fra loro all?interno di detto porta filtri a tenuta in testa al pistone della siringa, dette membrane essendo estraibili e modulabili all?interno di detto porta-filtri. 16) Un siringotto come ad una delle riv. da 12 in poi in cui il dispositivo porta-filtri ? in forma di soffietto con pieghe a fisarmonica. 17) Un siringotto come ad una delle riv. da 12 in poi in cui in base alla disposizione di una o pi? membrane, ? possibile isolare cellule staminali di diverse dimensioni semplicemente variando il settaggio del pistone e regolando i valori di tensione superficiale della o delle membrane liquide, cos? come la composizione stessa dei componenti di ciascuna membrana. 18) Un siringotto come alla riv. 17 caratterizzato dal fatto che variando la concentrazione di SDS, possiamo accordare la tensione superficiale del film che costituisce la membrana liquida da ~ 35 a ~ 72,1 ? 0,4 mN/m. 19) Un siringotto come ad una delle rivendicazioni da 12 in poi caratterizzato dal fatto che il dispositivo porta-filtri ? in forma di un soffietto che viene connesso con il pistone a vite tramite un elemento rigido di connessione che viene fissato al suo fondo, e che permette di trasferire, durante l?avvitamento, il moto assiale dello pistone allo stesso porta-filtri, senza farlo ruotare. 20) Metodo di impiego del siringotto secondo le rivendicazioni da 12 a 19 per la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase, caratterizzato dal fatto che prevede: di riempire il siringotto, in assenza del pistone a vite e tappato inferiormente, con il materiale prelevato dalla siringa di prelievo; di tapparne, prima che detto siringotto venga alloggiato all?interno della centrifuga, la sua estremit? superiore, in modo che dopo la centrifugazione, sia possibile rendere macroscopicamente visibili in diversi livelli i vari componenti stratificati del materiale aspirato in base ad una separazione avvenuta per gradiente di peso specifico o densit? relativa, e dopo la centrifugazione, rimosso il tappo a pressione superiore e quello a vite posto nella parte inferiore del siringotto, l?operatore operi la selezione dei componenti ottenuti dalla centrifugazione attraverso un preciso e lento movimento di avvitamento dello pistone a vite che, tramite dette membrane liquide autoportanti a filtrazione inversa, consente di lasciar passare solo sostanze di dimensioni superiori ad una ?dimensione critica? separando cos? le particelle di una specifica dimensione in corrispondenti camere di raccolta interposte tra una membrana e l?altra, e di asportare direttamente dallo stesso siringotto le particelle che si ricercano introducendo l?ago di una siringa da prelievo sul quale sono disegnati markers, indicanti la diversa profondit? di penetrazione dello stesso ago e corrispondenti ai diversi pozzetti di prelievo presenti sul portafiltri nel punto medio dello spessore di ciascun pozzetto, in modo da portare la punta dell?ago, attraverso una serie di membrane sovrapposte, nel punto medio della camera di raccolta della membrana interessata. 21) Metodo di impiego del siringotto come alla rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che sono separabili facilmente le particelle di una specifica dimensione modulando il numero di anelli/membrane e/o regolando la tensione superficiale delle membrane liquide e/o variando la composizione dei liquidi auto-riparanti componenti le membrane liquide autoportanti a filtrazione inversa. 22) Uso come filtro per la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase, in particolare delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo, di almeno una membrana liquida a separazione inversa in grado di lasciar passare solo sostanze di dimensioni superiori ad una ?dimensione critica?, per cui le particelle di una specifica dimensione, che si vogliono ricercare, vengono separate dalle altre riducendo la complessit? dei passaggi operativi per tale isolamento ed i tempi di esecuzione. 23) Uso come filtro per la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase di almeno una membrana liquida a separazione inversa in grado di lasciar passare solo sostanze di dimensioni superiori ad una ?dimensione critica?, come alla rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che ? possibile isolare cellule staminali di diverse dimensioni semplicemente regolando i valori di tensione superficiale della detta membrana liquida, cos? come la composizione stessa dei suoi componenti. 24) Un kit per la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase, in particolare per la separazione delle cellule staminali e stromali derivate o prelevate con metodi meccanici dal tessuto adiposo sottocutaneo comprendente: a) una siringa o siringotto con un corpo cilindrico cavo in cui viene trasferito il prodotto dell?aspirazione di una siringa da prelievo per la successiva centrifugazione, detto corpo cilindrico presentando un luer lock superiore ed una sede di avvitamento inferiore per un pistone a vite ed un tappo di chiusura inferiore; b) un dispositivo porta filtri da utilizzare per la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase, ed il loro confinamento in una apposita camera di raccolta, costituito da un elemento cilindrico, cavo internamente, atto a scorrere a tenuta all?interno del corpo cilindrico di detta siringa o siringotto, c) uno o pi? filtri selettivi costituiti da membrane liquide autoportanti a separazione inversa, con diverse capacit? filtranti, da montare o montati a tenuta all?interno di detto elemento cilindrico in successione distanziate verticalmente lungo l?asse di detto siringotto, per formare, fra un filtro e l?altro, una camera di raccolta, d) un pistone a vite da montare all?interno di detta siringa o siringotto; ed e) un elemento di connessione tra detto dispositivo porta filtri e detto pistone a vite per trasmettere a detto dispositivo porta filtri solo un movimento assiale, quando il pistone viene avvitato. 25) Il kit secondo la rivendicazione 24 caratterizzato dal fatto che l?elemento cilindrico cavo internamente ? in forma di un soffietto di materiale gommoso o simile. 26) Il kit secondo una qualunque delle rivendicazioni da 24 in poi caratterizzato dal fatto che ? dotato ulteriormente di un ago per una siringa da prelievo il quale ago ha su disegnati markers indicanti la diversa profondit? di penetrazione dello stesso ago e corrispondenti ai diversi pozzetti di raccolta presenti sul dispositivo portafiltri in modo da definire precisamente le successive penetrazioni di detto ago da prelievo, nel punto medio dello spessore di ciascun pozzetto. 27) Il kit secondo una qualunque delle rivendicazioni da 24 in poi caratterizzato dal fatto che ciascuna di queste membrane autoportanti sono incastonate all?interno di un anello rigido che ? inseribile e disinseribile all?interno di detto dispositivo che ? posizionato al di sopra del pistone a vite della siringa, il quale anello rigido ? dotato inferiormente di un distanziatore e superiormente di una sede di tenuta atta a cooperare con il distanziatore della membrana sovrastante in modo da mantenere costante la distanza fra le singole membrane all?interno di detto dispositivo porta filtro.
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