CN102120985A - 一种高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法。用具体步骤如下：将实验动物打空气栓塞处死后经酒精浸泡15-20min消毒后，置入超净工作台内分离四肢骨，经PBS和DMEM培养液反复冲洗后，剪去骨两端，用含有肝素的DMEM液冲洗骨髓腔；肝素浓度为625U/ml；分别用不同直径大小的注射器针过滤步骤(1)中获取的骨髓液，制成单细胞悬液后缓慢注入含有等体积Percoll的离心管中，离心20分钟，收集中间云雾状细胞层，再以LG-DMEM液洗涤细胞，离心5min，重复洗涤2-3遍；将洗涤好的细胞加入含有适量比例双抗（1%）且包含10%胎牛血清的LG-DMEM液，吹打成细胞悬液，计数并调整细胞密度为1×108/L接种于25cm2塑料培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。本发明能够简便有效的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞，为进一步的基础实验以及临床研究做准备。
Description
技术领域
本发明涉及一种原代细胞的分离培养方法，特别涉及一种高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法。
背景技术
众所周知，胚胎干细胞（ES）与间充质干细胞（MSC）一直是组织工程最为常用的种子细胞。但目前由于ES的分离获取存在医学伦理学的争议，研究受到了一定的限制。而MSC，是一类具有多向分化潜能的干细胞，可来源于骨髓、脂肪、胎盘、脐血、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等各种组织中。在特定条件下可向骨、软骨、心肌、脂肪、血管内皮等间叶组织细胞转化。具有来源广泛、相对容易获取、扩增表型稳定同时避免了医学伦理学争议等优点而越来越受到研究者们的青睐。其中骨髓间充质干细胞不仅来源广、获取容易、扩增表型稳定、无医学伦理学争议且无过大的骨异常增殖趋势，被公认为是目前骨组织工程最为常用的种子细胞。
MSCs在骨髓中的密度很低，而且随着年龄的增长逐渐减少。目前分离骨髓间充质干细胞的常用方法有5种，即全骨髓法、密度梯度离心法 、贴壁筛选法、流式细胞仪法以及免疫磁珠法。全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液弃去不贴壁细胞，从而达到纯化细胞的目的；密度梯度离心法是根据骨髓间充质干细胞与其他细胞的密度不同而采用percoll分离液将其分离出来；贴壁筛选法则是根据骨髓间充质干细胞具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离；流式细胞仪分选法则是根据骨髓间充质干细胞体积小、相对缺少颗粒的特性对它进行分选；而免疫磁珠法则根据骨髓间充质干细胞表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选, 用抗体包被磁珠, 获得相对纯化的骨髓间充质干细胞。其中由于经过流式或磁珠分选后的干细胞会出现增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，二者应用并不广泛。目前最为常用分离骨髓间充质干细胞的方法主要是全骨髓法和密度梯度离心法，由于二者分别存在获取细胞纯度不够及细胞数量较少等缺陷，近年有人尝试用抽取动物四肢骨骨髓结合密度梯度离心与贴壁筛选法分离提取骨髓间充质干细胞。尽管有研究报道利用该方法获取兔骨髓间充质干细胞，具有操作方法简便易行，细胞纯度高，生长状态较好且增殖快等优点，但大量文献报道的采用该方法分离兔骨髓间充质干细胞的实验研究中兔龄至少在2月龄以上甚至有达到5月龄。众所周知，骨髓中干细胞的密度和活力均与年龄有很大的关系，越年轻的动物体骨髓内细胞的密度越大，活力越好，故目前其实仍没有找到一种兼顾操作方法简便易行，获取细胞纯度高，密度大且活力好的分离培养兔骨髓间充质干细胞。
发明内容
本发明的目的是对兔骨髓间充质干细胞的原代培养技术进行探讨，旨在摸索出一种更为简便有效的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法。
本发明提出的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法，利用全骨髓冲洗手段，结合密度梯度离心与贴壁筛选培养方式体外分离培养4-6周新西兰大白兔兔骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：
(1)全骨髓冲洗, 将实验动物打空气栓塞处死后经酒精浸泡15-20min消毒后，置入超净工作台内分离四肢骨，经PBS和DMEM培养液反复冲洗后，剪去骨两端，用含有肝素的DMEM液冲洗骨髓腔；肝素浓度为625U/ml；
(2)密度梯度离心方法，分别用不同直径大小的注射器针过滤步骤(1)中获取的骨髓液，制成单细胞悬液后缓慢注入含有等体积Percoll的离心管中，转速为2500r/min，离心20分钟，收集中间云雾状细胞层，再以LG-DMEM液洗涤细胞，转速为1000r/min，离心5min，重复洗涤2-3遍；
(3)贴壁筛选培养方法，将步骤(2)中洗涤好的细胞加入含有适量比例双抗（1%）且包含10%胎牛血清的LG-DMEM液，吹打成细胞悬液，计数并调整细胞密度为1×108/L接种于25cm2塑料培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。
本发明中，步骤(2)中用于过滤骨髓液的注射器针直径规格分别为10ml-1ml,依次使用。
本发明中，步骤(2)中使用的Percoll淋巴细胞分离液浓度为1.073g/L，制备方法为，将浓度为1.131的Percoll淋巴细胞分离液原液取9ml，加入1ml的PBS(10×)，制成10ml工作液，然后按照50%工作液加44%PBS（1×）比例，即可制成1.073g/LPercoll淋巴细胞分离液。
本发明中，步骤(2)中分离细胞过程中使用的离心半径为10cm，洗涤细胞的离心半径为10cm。
本发明中，步骤(3)中所述双抗为青霉素和链霉素，其适量浓度为1%。
本发明中，步骤(3)中细胞初次接种密度为1×108/L，48h后首次细胞换液。
本发明的有益效果在于：能够简便有效的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞，为进一步的基础实验以及临床研究做准备。
附图说明
图1分别表示原代培养兔骨髓间充质干细胞不同时间点图片。a.48小时(×100)；b. 1周(×100)；c. 第3代BMSCs接种培养1w (×100); d. 第5代BMSCs接种培养10d (×100)。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。
实施例1：取1月龄新西兰大白兔1只，耳缘静脉注射空气处死。75%酒精浸泡消毒15-20min，在超净工作台上无菌取出四肢骨，尽量去尽附着在骨上的肌肉，筋膜等软组织，分别经PBS与DMEM培养液容器内清洗，剪去骨两端，用含有适量肝素(625U/ml)的DMEM液冲洗骨髓腔，获得骨髓液约30ml。分别用不同口径大小的注射器针头过滤制成单细胞悬液，将骨髓液均分为6管，注入含有等体积Percoll（1.073g/L）分离液的离心管中，2500r/min离心20min，收集中间云雾状细胞层，再以LG-DMEM液洗涤细胞，1000r/min离心5min，重复2遍，去除多余的脂肪细胞及组织液。加入适量含双抗的10%胎牛血清LG-DMEM培养液吹打制成细胞悬液，计数并调整细胞密度为1×108L-1接种于25cm2塑料培养瓶中，于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和适度条件培养箱中培养。48h后首次换液，弃去未贴壁或已死去的细胞，隔日换液。至10-12d贴壁细胞融合为单层时，用胰蛋白酶按1：2消化传代，继续培养观察细胞形态与生长情况。
实验结果应有数据说明其，获取细胞纯度高，密度大且活力好的分离培养兔骨髓间充质干细胞。
Claims (6)
1.一种高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于利用全骨髓冲洗手段，结合密度梯度离心与贴壁筛选培养方式体外分离培养4-6周新西兰大白兔兔骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：
(1)全骨髓冲洗, 将实验动物打空气栓塞处死后经酒精浸泡15-20min消毒后，置入超净工作台内分离四肢骨，经PBS和DMEM培养液反复冲洗后，剪去骨两端，用含有肝素的DMEM液冲洗骨髓腔；肝素浓度为625U/ml；
(2)密度梯度离心方法，分别用不同直径大小的注射器针过滤步骤(1)中获取的骨髓液，制成单细胞悬液后缓慢注入含有等体积Percoll的离心管中，转速为2500r/min，离心20分钟，收集中间云雾状细胞层，再以LG-DMEM液洗涤细胞，转速为1000r/min，离心5min，重复洗涤2-3遍；
(3)贴壁筛选培养方法，将步骤(2)中洗涤好的细胞加入含有适量比例双抗（1%）且包含10%胎牛血清的LG-DMEM液，吹打成细胞悬液，计数并调整细胞密度为1×108/L接种于25cm2塑料培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于步骤(2)中用于过滤骨髓液的注射器针直径规格分别为10ml-1ml,依次使用。
3.根据权利要求1所述的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于步骤(2)中使用的Percoll淋巴细胞分离液浓度为1.073g/L，制备方法为，将浓度为1.131的Percoll淋巴细胞分离液原液取9ml，加入1ml的PBS(10×)，制成10ml工作液，然后按照50%工作液加44%PBS（1×）比例，即可制成1.073g/LPercoll淋巴细胞分离液。
4.根据权利要求1所述的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于步骤(2)中分离细胞过程中使用的离心半径为10cm，洗涤细胞的离心半径为10cm。
5.根据权利要求1所述的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于步骤(3)中所述双抗为青霉素和链霉素，其浓度为1%。
6.据权利要求1所述的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于步骤(3)中细胞初次接种密度为1×108/L，48h后首次细胞换液。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108865992A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-11-23 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种骨髓间充质干细胞的原代分离方法 |
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2010
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