CN103007357A - 一种碳纳米管/胶原基复合材料的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碳纳米管/胶原基复合材料的应用,该碳纳米管/胶原基复合材料应用于骨、软骨组织病缺损修复。本发明获得的碳纳米管/胶原基复合材料具有良好的生物相容性、组织修复性能和极低的免疫原性,所需原料易得,制备工艺条件较温和,具有广泛的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于纳米复合材料应用领域,具体涉及一种碳纳米管/胶原基复合材料的应用。
背景技术
近年来随着社会人口剧增,生活节奏的加快,由肿瘤、感染、生理功能减退以及其它病因导致的组织缺(病)损高发,自然灾害、工伤事故的频繁发生和汽车工业的发展及体育运动的普及导致的人类意外伤害剧增并具有年轻化的趋势。以上这些对人类的健康构成极大威胁的组织缺(病)损的修复都需要组织引导再生材料。
胶原是细胞外基质(ECM)的主要成份,属于结构蛋白质,它的出现使组织引导再生材料的研究进入了一个新阶段。胶原具有:(1)特有的网状结构,可引导细胞生长;(2)无抗原性;(3)可参与愈合过程,并能促进细胞生长;(4)物理机械性能优良;(5)生物相容性好;(6)可降解、吸收等优点,这些优点是其他天然材料所不可比拟的,因此胶原是一种性能优良的可降解医用组织引导再生的天然材料。
胶原在体内以胶原原纤维或称胶原纤维的形式存在,胶原纤维的基本结构单位是原胶原分子,呈细棒状,长300 nm,直径1.5 nm,相对分子量为2.85×105。每一个原胶原分子均由3条具有左手螺旋结构的a肽链组成,3条肽链通过互相折叠盘绕形成右手复合螺旋。胶原特有的三重螺旋结构赋予它良好的生物学性能,如高拉伸强度、生物降解性能、低抗原活性、低刺激性和低细胞毒以及促进细胞生长的性能,也同时使它能与其它物质,如羟基磷灰石、碳纳米管和细胞因子等有效结合,所具有的这些特性都使其成为一种理想的生物医用材料和药物载体。
近年来,碳纳米管(CNTs)由于具有很大的比表面积,能与高聚物基体有很好的粘接能力,从而有效提高基体的力学性能,引起了人们广泛的关注。它是由碳原子形成的平面六边形石墨单层为基础卷曲而成的空心小管,可分为多壁碳纳米管和单壁碳纳米管。从微观结构上研究发现,典型形态的单壁碳纳米管直径在0.5-1.5 nm,长约100-300 nm,这和骨骼、软骨中胶原纤维的三螺旋结构(直径1. 5 nm,长300 nm)非常相似。国内外研究表明:CNTs作为单一支架材料虽具有生物力学性能佳、良好的细胞附着率和增殖率的优点,但也存在可塑性难度较大、不能降解的缺点,因此,CNTs与胶原支架等材料的复合有望解决其本身的缺陷。此外,CNTs在养料、药品供给系统方面有很大的应用潜力,可在养料、药品供给系统与细胞之间形成圆筒形的渠道,输送肽、蛋白质、质粒DNA 或寡核苷酸等物质,因此CNTs有可能作为输送细胞因子的有效载体从而应用于骨、软骨等组织缺损修复。
本发明结合了天然胶原与CNTs的优点,制备一种具有组织引导再生作用的碳纳米管/胶原基复合材料,该材料具有良好的生物相容性、组织修复性能和极低的免疫原性,可应用于骨、软骨等组织病缺损修复。
发明内容
本发明的目的在于提供一种碳纳米管/胶原基复合材料的应用,该复合材料是一种具有良好的生物相容性和组织修复性能的新型组织引导再生材料。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种碳纳米管/胶原基复合材料的应用于骨、软骨组织病缺损修复。
一种碳纳米管/胶原基复合材料,该复合材料由胶原蛋白和碳纳米管组成,其中胶原蛋白的质量百分比含量为96.0-99.8%,碳纳米管的质量百分比含量为0.2-4.0%。
所述的胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白或猪皮、牛皮、跟腱的胶原蛋白。
所述的碳纳米管为改性的单壁碳纳米管,或共价改性和非共价改性的多壁碳纳米管。
一种制备如上所述的碳纳米管/胶原基复合材料的方法包括如下步骤:
(1)将富含胶原蛋白的原料机械去除皮下肌肉、脂肪及结缔组织杂质,分切成1 mm × 1 mm碎块后清洗干净;
(2)用0.01 mol/L氢氧化钠和体积分数为1%的过氧化氢的混合溶液、10wt%的异丙醇溶液洗涤脱脂;
(3)溶解在pH=2.0-3.0的稀酸溶液中,所述的酸为乙酸、丙酸或丙二酸;
(4)加入蛋白酶,胶原蛋白与蛋白酶的质量比为50-100:1,4-5℃下酶解16-24h;
(5)在离心收集的上清液中加入NaCl或KCl,使终浓度达到0.9 mo1/L,静置10-12 h,5000 r/min 离心20 min,收集得到的沉淀物;
(6)将沉淀物溶于10 倍体积的 0.5 mol/L 乙酸溶液中,离心收集上清液;
(7)在10 倍体积的 0.1 mol/L 乙酸溶液中透析 12 h ,每 3 h 换液一次,最后用纯化水透析至中性;
(8)取透析后胶原和碳纳米管混合,磁力搅拌10 h,冷冻干燥后在交联剂溶液中交联;
(9)用纯化水将交联后的复合材料充分冲洗,再次冷冻干燥,取出后置于两块四氟乙烯平板间加压24 h使之平整,得到碳纳米管/胶原基复合材料。
所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。
所述的交联剂配方为:0.2 mol/L核糖 + 10wt%丙酮 + 2wt%氨水,或甲醛、戊二醛、碳化亚胺、双环氧化合物、京尼平、原花青素中的一种或几种。
所述的交联剂溶液中交联剂的质量百分含量为0.3-3%。
本发明的有益效果在于:本发明获得的碳纳米管/胶原基复合材料具有良好的生物相容性、组织修复性能和极低的免疫原性,所需原料易得,制备工艺条件较温和,具有广泛的推广应用价值。
附图说明
图1为碳纳米管/胶原基复合材料场发射扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1:制备碳纳米管/胶原基复合材料,具体步骤如下:
(1)将富含胶原蛋白的鱼皮机械去除皮下肌肉、脂肪及结缔组织等杂质,分切成约1mm x 1 mm碎块后清洗干净;
(2)用0.01 mol/L氢氧化钠和含体积分数为1%的过氧化氢混合溶液、10%的异丙醇溶液洗涤脱脂;
(3)溶解在pH 2.0的乙酸溶液中;
(4)向上述溶液中加入蛋白酶,胶原蛋白与蛋白酶的质量比为50:1,4℃下酶解24 h;
(5)在离心收集的上清中加入NaCl,使终浓度达到0.9 mo1/L, 静置12 h,5000r/min 离心20 min,收集得到的沉淀物;
(5)将沉淀物溶于10 倍体积的 0.5mol/L 乙酸溶液中,离心收集上清;
(7)在10 倍体积的 0.1mol/L 乙酸溶液中透析 12 h ,每 3 h 换液一次,最后用纯化水透析至中性;
(8)取透析后胶原按干重96.0%和4%的碳纳米管混合,磁力搅拌10 h,冷冻干燥后在交联剂溶液中交联,交联液配方:0.2 mol.L-1核糖 + 10% 丙酮 + 2% 氨水;
(8)用纯化水将交联后的复合材料充分冲洗,再次冷冻干燥,取出后置于两块四氟乙烯平板间加压24 h使之平整,得到碳纳米管/胶原基复合材料(见图1)。
(9)将得到的碳纳米管/胶原基复合材料裁成f0.5 mm、高0.3±0.05 mm的圆柱体,无菌条件下用高密度聚乙烯(HDPE)薄膜袋密封包装后经25.0 kGy 剂量b射线照射,然后于5-8℃储存备用。
实施例2:制备碳纳米管/胶原基复合材料,具体步骤如下:
(1)将富含胶原蛋白的鱼皮机械去除皮下肌肉、脂肪及结缔组织等杂质,分切成约1 mm x 1 mm碎块后清洗干净;
(2)用0.01 mol/L氢氧化钠和含体积分数为1%的过氧化氢混合溶液、10%的异丙醇溶液洗涤脱脂;
(3)溶解在pH 3.0的丙二酸溶液中;
(4)向上述溶液中加入蛋白酶,胶原蛋白与蛋白酶的质量比为100:1,5℃下酶解16 h;
(5)在离心收集的上清中加入KCl,使终浓度达到0.9 mo1/L, 静置10 h,5000r/min 离心20 min,收集得到的沉淀物;
(6)将沉淀物溶于10 倍体积的 0.5mol/L 乙酸溶液中,离心收集上清;
(7)在10 倍体积的 0.1 mol/L 乙酸溶液中透析 12 h ,每 3 h 换液一次,最后用纯化水透析至中性;
(8)取透析后胶原按干重99.8%和0.2%的碳纳米管混合,磁力搅拌10 h,冷冻干燥后在0.3%甲醛溶液中交联;
(9)用纯化水将交联后的复合材料充分冲洗,再次冷冻干燥,取出后置于两块四氟乙烯平板间加压24 h使之平整,得到碳纳米管/胶原基复合材料。
(10)将得到的碳纳米管/胶原基复合材料裁成f0.5 mm、高0.3±0.05 mm的圆柱体,无菌条件下用HDPE薄膜袋密封包装后经25.0 kGy 剂量b射线照射,然后于5-8℃储存备用。
实施例3:碳纳米管/胶原基复合材料的骨、软骨组织病缺损修复作用,具体步骤如下:
(1)动物分组:取健康6月龄骨髂成熟的新西兰兔18只,雌雄不限,体重2.6–3.4 kg。将动物随机分成3组:手术对照组、胶原材料组和碳纳米管/胶原基复合材料组,每组6只。
(2)手术操作:实验动物用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)经耳缘静脉注射麻醉,仰卧位固定,膝关节备皮、消毒和铺单。无菌条件下经双膝内侧纵向切一长约3-4 cm切口,外推髌骨使之脱位,暴露骸股关节面。在关节面中央钻一直径4 mm、深5 mm的圆形骨/软骨缺损,刮除缺损处残余软骨和骨碎片。按上述分组,碳纳米管/胶原基复合材料组植入按上述实施例所述方法制备的碳纳米管/胶原基复合材料,胶原材料组植入不含碳纳米管的胶原材料,手术对照组只造成圆形缺损,不植入任何材料,最后无菌缝合伤口。术中动物因麻醉或意外死亡用额外兔子补齐。术后连续肌注青霉素3 d ,40万u/只。
(3)实验结果:术后第12周耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠处死动物,肉眼观察切口愈合情况,取材,分别进行苏木精-伊红(HE)和阿尔辛蓝染色。结果可见:手术对照组缺损的大部分未被完全填充,染色结果显示缺损区纤维组织大量增生,无序排列,软骨下骨未见修复;碳纳米管/胶原基复合材料组缺损绝大多数被填充,新生组织表面有光泽,与周围软骨界限较模糊。染色结果显示新生组织与周围软骨和软骨下骨整合紧密、上层细胞形态与正常软骨组织相似,呈柱状排排列,并有较多异染的蛋白聚糖成分;胶原材料组与碳纳米管/胶原基复合材料组结果类似,但其软骨下骨的修复效果较碳纳米管/胶原基复合材料组为差。
因此,本实验结果可初步证明:使用本发明的碳纳米管/胶原基复合材料植入软骨/软骨下骨病缺损部位,可有效的诱导软骨和软骨下骨(骨组织)的生成和重构,从而达到恢复骨、软骨组织病缺损修复的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种碳纳米管/胶原基复合材料的应用,其特征在于:该碳纳米管/胶原基复合材料应用于骨、软骨组织病缺损修复。
2.根据权利要求1所述的碳纳米管/胶原基复合材料的应用,其特征在于:该复合材料由胶原蛋白和碳纳米管组成,其中胶原蛋白的质量百分比含量为96.0-99.8%,碳纳米管的质量百分比含量为0.2-4.0%。
3.根据权利要求1所述的碳纳米管/胶原基复合材料的应用,其特征在于:所述的胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白或猪皮、牛皮、跟腱的胶原蛋白。
4.根据权利要求1所述的碳纳米管/胶原基复合材料的应用,其特征在于:所述的碳纳米管为改性的单壁碳纳米管,或共价改性和非共价改性的多壁碳纳米管。
5.根据权利要求1所述的碳纳米管/胶原基复合材料的应用,其特征在于:所述的碳纳米管/胶原基复合材料的制备方法包括如下步骤:
(1)将富含胶原蛋白的原料机械去除皮下肌肉、脂肪及结缔组织杂质,分切成1 mm × 1 mm碎块后清洗干净;
(2)用0.01 mol/L氢氧化钠和体积分数为1%的过氧化氢的混合溶液、10wt%的异丙醇溶液洗涤脱脂;
(3)溶解在pH=2.0-3.0的稀酸溶液中,所述的酸为乙酸、丙酸或丙二酸;
(4)加入蛋白酶,胶原蛋白与蛋白酶的质量比为50-100:1,4-5℃下酶解16-24h;
(5)在离心收集的上清液中加入NaCl或KCl,使终浓度达到0.9 mo1/L,静置10-12 h,5000 r/min 离心20 min,收集得到的沉淀物;
(6)将沉淀物溶于10 倍体积的 0.5 mol/L 乙酸溶液中,离心收集上清液;
(7)在10 倍体积的 0.1 mol/L 乙酸溶液中透析 12 h ,每 3 h 换液一次,最后用纯化水透析至中性;
(8)取透析后胶原和碳纳米管混合,磁力搅拌10 h,冷冻干燥后在交联剂溶液中交联;
(9)用纯化水将交联后的复合材料充分冲洗,再次冷冻干燥,取出后置于两块四氟乙烯平板间加压24 h使之平整,得到碳纳米管/胶原基复合材料。
6.根据权利要求5所述的碳纳米管/胶原基复合材料的应用,其特征在于:所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。
7.根据权利要求5所述的碳纳米管/胶原基复合材料的应用,其特征在于:所述的交联剂配方为:0.2 mol/L核糖 + 10wt%丙酮 + 2wt%氨水,或甲醛、戊二醛、碳化亚胺、双环氧化合物、京尼平、原花青素中的一种或几种。
8.根据权利要求5所述的碳纳米管/胶原基复合材料的应用,其特征在于:所述的交联剂溶液中交联剂的质量百分含量为0.3-3%。
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