CN1120070A - 一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶及其纯化方法 - Google Patents
一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶及其纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1120070A CN1120070A CN 95109884 CN95109884A CN1120070A CN 1120070 A CN1120070 A CN 1120070A CN 95109884 CN95109884 CN 95109884 CN 95109884 A CN95109884 A CN 95109884A CN 1120070 A CN1120070 A CN 1120070A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- plasmin
- purification process
- straight line
- poisonous
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及从尖吻蝮蛇毒中提取的抗血栓药物纤溶酶及其纯化方法,该纤溶酶的分子量2.8-3.2万,含有Ca++,天冬氨酸、谷氨酸的含量均为2~5%,其N末端为ASP,在纯化方法中包括洗脱粗分、用凝胶过滤柱层析、再脱盐处理,由于洗脱粗分是同时进行缓冲液pH直线梯度和盐直线梯度洗脱,从而缩短了工艺流程,提高了工业化生产率。本法制得的纤溶酶能有效地溶解动、静脉血栓,防止血栓生成,同时凝血系统影响小,无出血性。
Description
现有技术中,关于使用蝮蛇毒来提取抗血栓药物的报道较多,例如,中国医科大学学报,1989.18(专刊)中公开的“抗栓酶1、2、3号研制”一文;CN92102645.5(CN1065680.A)中公开的“提取尖吻蝮蛇蛇毒去纤酶技术”等,国外目前也有多种蛇制剂,例如Ancrod(英国)等。这些蛇毒类抗栓药物,是从蛇毒中提取的蛋白酶组分,从其作用机理上看,都是一种凝血酶样酶,存在着出血副作用,另一方面,由于分离纯化手段问题,使其制品不是高纯度的单一蛋白酶组分,而是多组分的混合物,从而造成了这类药物进一步推广使用的障碍。
本发明的目的在于改进分离纯化方法,从尖吻蝮蛇毒中提取对血栓有直接溶解作用的高纯度的纤溶酶。
本发明所述的纤溶酶,是从尖吻蝮蛇毒中提取并纯化含Ca++金属的蛋白酶溶液,其特征在于,其分子量为2.8-3.2万,氨基酸组分分析表明,该酶中天冬氨酸,谷氯酸含量均为2~5%,氨基酸序列分析表明,该酶的N末端为天门冬氨酸(ASP),其纤溶活力为1-3纤溶活力单位/毫克蛋白,该酶对纤维蛋白有直接水解作用,但对酪蛋白无水解作用,具有较高的特异性,能对纤维蛋白原的A(α)链起作用。动物药效学实验表明,该酶能有效地溶解动、静脉血栓,能有效地防止血栓生成,降低血液粘度,改善微循环,同时该酶对凝血系统影响小,出血可能性小。与现有的其它蝮蛇蛇毒中提取的纤溶酶相比,该酶的分子量较低,纤溶作用明显提高,出血活性小。
本发明所述尖吻蝮蛇毒纤溶酶的纯化方法,包括(1)将粗蛇毒用缓冲液溶解,然后经离心沉淀,阴离子交换柱层析分离,洗脱粗分得到纤溶组分;(2)将该纤溶组分浓缩后经凝胶过滤层析得到精制的纤溶酶原液;(3)将该纤溶酶原液脱盐处理得到纯化的纤溶酶液,其特征在于:
a)在洗脱粗分中,所述缓冲液洗脱是同时进行缓冲液PH直线梯度洗脱和盐直线梯度洗脱,其中,缓冲液PH直线梯度为PH7.5-8.5至PH6.0-7.0,盐直线梯度为0-0.5M,洗脱速度为25-80ml/hr;
b)全工序操作在4-10℃温度范围内进行。
在上述分离纯化过程中,首先取粗毒用适量缓冲液溶解,所述溶解及粗分洗脱用缓冲液是0.02M,PH7.5-8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)或0.02M PH7.5-8.5的磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液,所述阴离子交换柱层析中,所用的阴离子交换剂为弱酸性阴离子交换剂。例如DEAE sephadex A50,DEAE sepharose Fast Flow等,在所述的凝胶过滤层析中,所用的凝胶是用于分离分子量在5000~30万范围之内的物质的凝胶,例如Sephacryl_S-100HR、S-200HR、S-300HR、Sephadex G75等,所用凝胶过滤层析用缓冲液为0.05-0.30M的氯化钠(NaCl)溶液,所述脱盐是指对蒸馏水脱盐1-6小时,所述浓缩是指超滤浓缩,或者冷风吹干(样品置于透析袋中),或者冷冻干燥。
与现有技术相比,本发明所述分离并纯化尖吻蝮蛇毒纤溶酶的方法简单,产品纯度高,由于同时进行PH直线梯度和盐梯度洗脱,缩短了工艺流程,尤其是十分明显地缩短了纯化周期,有利于提高工业化生产效率。
下面通过实施例对其纯化过程进一步描述:
实施例1。
(1)将皖南产尖吻蝮蛇毒3g溶于20ml的0.02M PH8.0 Tris-HCl缓冲液中,在3000转/分离心泵中离心15min,取上清液,沉淀用上述缓冲液5ml搅匀,再离心一次,取上清液,并与上次离心所得的上清液合并,置冰箱中4℃保存。
(2)将DEAE Sephadex A-50阴离子交换剂,经碱-酸处理后,用蒸馏水洗涤至中性,再用0.02M PH8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤该胶至洗脱液PH值为8.0,再沸水浴2小时,以脱气、溶胀,冷却后装柱。
(3)取步骤(2)中处理好的胶装柱,柱体积为3×80cm3,平衡后,取步骤(1)中溶解蛇毒所得的上清液上样,直线梯度洗脱,贮瓶缓冲液为Tris-HCl 0.02M,PH6.3,含0.5M NaCl,梯度瓶缓冲液为0.02M,Tris-HCl缓冲液,PH8.0,流速42ml/hr,UV280nm检测洗脱液,上样48小时后用自动部分收集器收集,每管7ml,每小时6管,共洗脱12个峰,其中第6峰即为粗分的纤溶组分,约120ml,含酶量300mg。
(4)将上述粗分的纤溶酶液,装入透析袋中,冷风吹干至体积约为15ml左右,冰箱中4℃保存。
(5)取Sephacryl S-200HR为凝胶层析介质,装凝胶层析柱,柱体积为2.5×70cm3,用0.5M的NaCl溶液以99ml/hr的流速清洗1小时后,用0.15M的NaCl溶液平衡,取上述浓缩好的粗分的纤溶酶液上样,用0.15M NaCl溶液洗脱,流速为18ml/min,第2峰即为精制的纤溶酶原液,共70ml,酶量为170mg。
(6)取上述精制的纤溶酶原液装入透析袋中,对蒸馏水透析3小时,即得纯化的纤溶酶。酶量为170mg,经检测,该酶纤溶活力为1个活力单位/毫克蛋白(纤溶活力单位),等电点为5.8,其分子量为3万,经检查无出血毒副作用。
实施例2
(1)取皖南尖吻蝮蛇毒4.5g用0.02M,PH7.8的磷酸盐缓冲液溶解,其他操作同实施例(1)中步骤(1),取上清液合并后,冰箱中4℃保存。
(2)同实施例(1)步骤(2)。
(3)取上述步骤处理好的胶装柱,柱体积增大至1600ml(4.6×100cm3)其它条件不变,层析后可得酶量460mg。
(4)将上述粗分纤溶酶液,装入透析袋中,冷风吹干至体积约为20ml左右;
(5)取Sephacryl S-300HR为凝胶层析介质,装凝胶层析柱,柱体积为3.1×70cm3,用0.5M的NaCl溶液以99ml/hr的流速清洗1小时后,用0.2M的NaCl平衡,取上述浓缩好的样品上样,洗脱液为0.20M NaCl溶液,流速24ml/min,第2峰即为精制的纤溶酶原液,经脱盐处理得纯酶共100ml,酶量为280mg。
实施例3
(1)取尖吻蝮蛇毒3g溶解,方法同实施例1步骤(1)。
(2)阴离子交换剂为DEAE sepharose Fast Flow,胶处理与装柱同实施例1步骤(2),柱体积为3×80cm3,用0.02M PH8.0的Tris-HCl缓冲液以1.5ml/min的流速冲洗平衡,上样,直线梯度洗脱,洗脱液同实施例1步骤(3),流速80ml/hr,收集可得酶量285mg。
(3)余下操作同实施例1,可得精制纤溶酶60ml,酶量160mg,经检查纤溶活力合格,无出血副作用。
Claims (7)
1.一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶,是从尖吻蝮蛇蛇毒中提取并纯化的含Ca++的金属蛋白酶溶液,其特征在于其分子量2.8-3.2万,氨基酸组分分析表明,该酶中天冬氨酸、谷氨酸的含量均为2~5%;由氨基酸序列分析表明,该酶的N末端为天门冬氨酸(ASP),其纤溶活力为1-3纤溶活力单位/毫克蛋白。
2.如权利要求1所述的尖吻蝮蛇毒纤溶酶的纯化方法,包括(1)将粗蛇毒用缓冲液溶解,然后经离子沉淀、阴离子交换柱层析分离,洗脱粗分得到纤溶组分;(2)将该纤溶组分浓缩后经凝胶过滤柱层析得到精制的纤溶酶原液;(3)将该纤溶酶原液脱盐处理得到纯化的纤溶酶液,其特征在于:
a)在洗脱粗分中,所述用缓冲液洗脱是同时进行缓冲液PH直线梯度和盐直线梯度洗脱,其中缓冲液PH直线梯度为PH7.5-8.5至PH6.0-7.0;盐直线梯度为0-0.5M,洗脱速度为25-80ml/hr。
b)全工序操作在4-10℃温度范围内进行。
3.如权利要求2所述的纯化方法,其特征在于所述溶解粗蛇毒及粗分洗脱缓冲液是0.02M,PH7.5-8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl),或0.02M PH7.5-8.5的磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)溶液。
4.如权利要求2所述的纯化方法,其特征在于凝胶过滤层析所用胶是用于分离分子量在5000-30万范围的物质的凝胶;所用缓冲液为0.05-0.30M的氯化钠(NaCl)溶液。
5.如权利要求2所述的纯化方法,其特征在于在阴离子交换柱层析中,所用的阴离子交换剂为弱酸性阴离子交换剂。
6.如权利要求2所述的纯化方法,其特征在于所述对纤溶酶原液脱盐处理是指其对蒸馏水脱盐1-6小时。
7.如权利要求2所述的纯化方法,其特征在于所述对纤溶组分浓缩是指超滤浓缩,或冷风吹干(样品置透析袋中),或冷冻干燥。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 95109884 CN1120070A (zh) | 1994-12-26 | 1995-10-09 | 一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶及其纯化方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN94119998 | 1994-12-26 | ||
CN94119998.3 | 1994-12-26 | ||
CN 95109884 CN1120070A (zh) | 1994-12-26 | 1995-10-09 | 一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶及其纯化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1120070A true CN1120070A (zh) | 1996-04-10 |
Family
ID=25743539
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 95109884 Pending CN1120070A (zh) | 1994-12-26 | 1995-10-09 | 一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶及其纯化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1120070A (zh) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1060806C (zh) * | 1997-11-12 | 2001-01-17 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的基因序列 |
CN1088472C (zh) * | 1998-05-05 | 2002-07-31 | 南京大学 | 沙蚕激酶及其提取方法和用途 |
CN100336903C (zh) * | 2004-07-27 | 2007-09-12 | 沈阳斯佳科技发展有限公司 | 从蛇毒中提取降纤酶及降纤酶水针制剂的制备方法 |
CN100424171C (zh) * | 2004-08-16 | 2008-10-08 | 北京赛生药业有限公司 | 高纯度蛇毒纤溶酶的制备方法及其药物制剂 |
CN102080099A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-06-01 | 蚌埠丰原涂山制药有限公司 | 一种突变蛇毒纤溶酶工程菌株,其制备方法和应用 |
CN102080093A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-06-01 | 蚌埠丰原涂山制药有限公司 | 一种突变蛇毒纤溶酶基因及其制备方法 |
CN103184207A (zh) * | 2011-12-31 | 2013-07-03 | 北京康辰药业有限公司 | 一种尖吻蝮蛇溶栓酶及其制备方法和应用 |
CN105567666A (zh) * | 2016-01-07 | 2016-05-11 | 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室 | 基于眼镜蛇毒piii型金属蛋白酶的抗凝血药及其应用 |
CN110579614A (zh) * | 2019-10-30 | 2019-12-17 | 天津市宝坻区人民医院 | 消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方 |
-
1995
- 1995-10-09 CN CN 95109884 patent/CN1120070A/zh active Pending
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1060806C (zh) * | 1997-11-12 | 2001-01-17 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的基因序列 |
CN1088472C (zh) * | 1998-05-05 | 2002-07-31 | 南京大学 | 沙蚕激酶及其提取方法和用途 |
CN100336903C (zh) * | 2004-07-27 | 2007-09-12 | 沈阳斯佳科技发展有限公司 | 从蛇毒中提取降纤酶及降纤酶水针制剂的制备方法 |
CN100424171C (zh) * | 2004-08-16 | 2008-10-08 | 北京赛生药业有限公司 | 高纯度蛇毒纤溶酶的制备方法及其药物制剂 |
CN102080099A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-06-01 | 蚌埠丰原涂山制药有限公司 | 一种突变蛇毒纤溶酶工程菌株,其制备方法和应用 |
CN102080093A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-06-01 | 蚌埠丰原涂山制药有限公司 | 一种突变蛇毒纤溶酶基因及其制备方法 |
CN102080093B (zh) * | 2010-12-01 | 2012-09-05 | 安徽丰原药业股份有限公司 | 一种突变蛇毒纤溶酶基因及其制备方法 |
CN102080099B (zh) * | 2010-12-01 | 2012-10-10 | 安徽丰原药业股份有限公司 | 一种突变蛇毒纤溶酶工程菌株,其制备方法和应用 |
CN103184207A (zh) * | 2011-12-31 | 2013-07-03 | 北京康辰药业有限公司 | 一种尖吻蝮蛇溶栓酶及其制备方法和应用 |
CN105567666A (zh) * | 2016-01-07 | 2016-05-11 | 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室 | 基于眼镜蛇毒piii型金属蛋白酶的抗凝血药及其应用 |
CN105567666B (zh) * | 2016-01-07 | 2020-06-02 | 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室 | 基于眼镜蛇毒piii型金属蛋白酶的抗凝血药及其应用 |
CN110579614A (zh) * | 2019-10-30 | 2019-12-17 | 天津市宝坻区人民医院 | 消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0230945B1 (en) | Thrombin-binding substance and process for preparing the same | |
CN104861082B (zh) | 一种利用胆碱离子液双水相体系分离多糖和蛋白质的方法 | |
CN1120070A (zh) | 一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶及其纯化方法 | |
CN106589167B (zh) | 高效价粗品肝素钠的制备方法及其生产装置 | |
CN101358184A (zh) | 尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶 | |
US4137127A (en) | Process for the preparation of thrombin-like enzymes from snake venoms | |
JPH0545600B2 (zh) | ||
US3879369A (en) | Anti-coagulant isolation from malayan pit viper using affinity chromatography | |
CN100506983C (zh) | 一种从矛头蝮蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法 | |
CN102925422B (zh) | 尖吻蝮蛇血凝酶-b | |
CN101348779B (zh) | 从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶的方法 | |
CN106366200A (zh) | 制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法 | |
CN1159438C (zh) | 一种尖吻蝮蛇毒凝血酶及其生产方法 | |
CN102965362B (zh) | 一种肝素黄杆菌肝素酶ⅱ的制备方法 | |
CN1188517C (zh) | 从蛇毒中纯化凝血酶样蛋白酶 | |
CN101538561B (zh) | 一种提取芹菜中celⅰ核酸酶的方法 | |
CN1548534B (zh) | 一种蛇毒血凝酶及其生产方法与应用 | |
CN102021160A (zh) | 一种蛇毒丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用 | |
CN1159437C (zh) | 尖吻蝮蛇毒凝血酶及其生产方法 | |
CN1850858A (zh) | 一种适于规模化生产的小鼠神经生长因子的纯化方法 | |
CN1439718A (zh) | 一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的制备方法 | |
CN105349514A (zh) | 快速简易分离纯化降纤酶的方法 | |
CN1807613A (zh) | 一种从蛇毒中提取单一成分降纤酶的方法 | |
CN1303207C (zh) | 组织型纤溶酶原激活剂突变体的复性分离纯化方法 | |
CN102242103A (zh) | 一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |