CN102080099B - 一种突变蛇毒纤溶酶工程菌株,其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组蝮蛇蛇毒蛋白的制备方法。利用人工合成的美国铜斑蝮蛇(Agkistrodon contortrix)突变蛇毒纤溶酶Alfimeprase基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。将其连接到酵母表达质粒pPIC9K中构建高效表达载体pPIC9K-His-Alf，导入毕赤酵母株GS115，命名为FY-Alf。甲醇诱导表达，表达的重组蛋白经纯化后，用平板溶圈法验证其活性，结果表明含pPIC9K-His-Alf质粒的酵母菌株GS115表达的重组蛋白Alfimeprase具有较高纤溶活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种突变蛇毒纤溶酶工程菌，其制备方法和应用，该突变蛋白有较好的纤溶活性而无出血活性。
背景技术
Alfimeprase(ALF)是通过基因重组技术开发出的一种锌金属蛋白酶，是蝮蛇蛇毒纤溶酶Fibrolase的N端突变体(前3个氨基酸EQR被Ser取代)，是一条含有201个氨基酸的含锌单链多肽，活性分子内部有三对二硫键，与报道的其它锌金属蛋白酶有较高的同源性。Alfimeprase与Fibrolase具有同样的纤溶活性，可以用来治疗老年人群常见高发病周身动脉硬化闭塞病(Peripherial Arterial Occlusive，PAO)。Alfimeprase可以不依赖于血浆酶原激活剂系统而直接作用于纤维蛋白或纤维蛋白原α链使其降解，溶栓能力是血浆酶原激活剂的6倍。
目前，国内外已上市的溶栓累药物较多，如重组链激酶，重组水蛭素，t-PA，葡激酶，纳豆激酶，以及从提取得到的尿激酶，蛇毒溶栓酶等等。这些药物的疗效经临床验证值得肯定，但也存在着不少问题，诸如出血，机体氧化以及再栓塞，原料药来源受限等等。
发明内容
本发明旨在提供一种突变蛇毒纤溶酶工程菌株，其制备方法和应用。
本发明提供一种酵母表达载体，其出发载体为pPIC9K，含有突变蛇毒纤溶酶基因，所述的突变纤溶酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述表达载体的工程菌株，其出发菌为酵母株GS115。
本发明的另一个目的是提供上述工程菌株的制备方法，包括构建含突变蛇毒纤溶酶基因的表达载体pPIC9K-His6-Alf，并将其线性化后导入到酵母株GS115中，获得重组工程菌。
其中，所述的表达载体pPIC9K-His6-Alf通过电转法导入到酵母中。
本发明还提供利用上述工程菌株，制备突变蛇毒纤溶酶的方法，包括如下步骤：
1)在BMG/MY液体培养基中培养，甲醇诱导表达，培养5天后，取菌液少量，高速离心，上清用硫酸铵溶液处理，离心，去上清，沉淀复溶；
2)将步骤1)中复溶的溶液用亲和层析柱纯化，获得纯化蛋白液。
本发明提供的突变蛇毒纤溶酶的制备方法，还可进一步包括将步骤2)获得的纯化蛋白用肠激酶切割，再用硫酸铵沉淀离心，沉淀经透析复溶，得到活性突变蛇毒纤溶酶。
其中，其中BMG/MY培养基配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾pH6.0，0.00004％生物素，1％甘油，0.5％甲醇。
其中，用甲醇诱导表达时，将甲醇采用分批滴加的方式加入培养液中，每天一次，提交量为1～1.5％。
其中，所述的加入硫酸铵后溶液中硫酸铵的终浓度为质量分数45％～50％。
Alfimeprase是Fibrolase的突变体，其N端由丝氨酸(Ser)残基取代了原来的EQR，取代后得到的肽段Alfimeprase与Fibrolase有着相同的溶栓活性，而其端更加稳定，避免了在酵母中表达的Fibrolase存在的有N端异构体的现象。
本发明的优点是：通过基因同源重组技术，使外源基因蛇毒纤溶酶蛋白突变体在毕赤酵母中得以表达，并具有较高活性，为实现蛇毒纤溶酶产业化奠定了基础；所构建菌株稳定，有利于生产的稳定性。
本发明提供的突变蛇毒纤溶酶Alfimeprase的N端由丝氨酸(S)残基取代了原来的EQR，突变后的Alfimeprase与Fibrolase有着相同的溶栓活性，而其端更加稳定，避免了在酵母中表达的Fibrolase存在的有N端异构体的现象。
附图说明
图1为重叠PCR扩增Alfimeprase基因示意图。
图2为每轮PCR扩增条带琼脂糖凝胶电泳图片。
图3为pBS-Alf克隆载体的构建示意图。
图4为酵母表达载体pPic9K-His6-Alf构建示意图。
图5为重组表达载体pPIC9K-His6-Alf的EcoR I和Sal I酶切鉴定。其中，泳道1，2：pPIC9K-His6-Alf质粒用EcoR I and Sal I酶切结果；泳道3：500bp DNA ladder。
图6为pPIC9K-His6-Alf重组菌表达突变蛇毒纤溶酶的SDS-PAGE分析和Western Blotting鉴定。其中，M：分子量标准1：GS115培养4天的上清液；2，3，4：甲醇诱导表达后3、4、5天上清液；5：纯化的突变蛇毒纤溶酶蛋白；6：突变蛇毒纤溶酶杂交结果。
图7为重组突变纤溶酶纤溶活性鉴定。其中，1：GS115/pPIC9空白质粒菌培养上清，阴性对照；2：培养3天重组菌发酵液上清(浓缩50倍)；3：纯化的突变蛇毒纤溶酶；4：经EK切割的突变蛇毒纤溶酶；5天pPIC9K-His6-Alf重组菌表达上清；5.培养5天重组菌发酵液上清(浓缩50倍)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
利用美国国立生物技术中心(NCBI)数据库发表的铜斑蝮蛇(Agkistrodon contortrix)蛇毒Fibrolase蛋白氨基酸序列(GenBankNo.P28891)，将其N端的EQR突变成丝氨酸S，其氨基酸序列如SEQID No.1所示。结合真核生物密码子偏爱性，设计出其核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
采用四轮PCR反应，得到含所需限制性酶切位点，His×6标签，EK酶切位点的编码Alfimeprase的基因片段，其PCR示意图如图1所示。各轮PCR所采用的反应体系如下：
第一轮PCR分别以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，SEQ ID No.9和SEQID No.10，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12，SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14，SEQ ID No.15和SEQ ID No.16为引物进行PCR扩增，得到7个PCR产物，分别记为S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7。
反应体系(20μl)：
10x PCR缓冲液 2μl
dNTPs(2.5mM) 2μl
MgCl2(25mM) 2μl
引物1 2μl
引物2 2μl
pfuTaq酶(5u/μl) 0.1μl，
无菌水 9.9μl
反应程序：
72℃ 5min
第二轮PCR分别以S1，S2为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID
No.6为引物；以S2，S3为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.8为引物；以S4，S5为模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.12为引物；以S6，S7为模板，以SEQ ID No.13和SEQ ID No.16为模板进行PCR反应，得到F1，F2，F3，F4片段。
反应体系(50μl)：
10x PCR缓冲液 5μl
dNTPs(2.5mM) 5μl
MgCl2(25mM) 5μl
引物F 0.5μl
引物R 0.5μl
pfuTaq酶(5u/μl) 0.2μl，
模板1 2μl
模板2 2μl
无菌水 29.8μl
反应程序：
94℃ 8min
72℃ 8min
第三轮PCR以F1，F2为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.8为引物，得到P1片段，以F3、F4为模板，以SEQ ID No.9和SEQ IDNo.16为引物，得到P2片段；
反应体系(50μl)：
10x PCR缓冲液 5μl
dNTPs(2.5mM) 5μl
MgCl2(25mM) 5μl
引物F 0.5μl
引物R 0.5μl
pfuTaq酶(5u/μl) 0.3μl，
模板1 2μl
模板2 2μl
无菌水 29.7μl
反应程序：94℃ 8min
72℃ 8min
第四轮PCR以P1，P2为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.16为引物，得到全长片段。
反应体系(100μl)
10x PCR缓冲液 10μl
dNTPs(2.5mM) 10μl
MgCl2(25mM) 10μl
引物1 1μl
引物2 1μl
rTaq酶(5u/μl) 0.6μl
模板1 5μl
模板2 5μl
无菌水 57.4μl
反应程序：
94℃ 8min
72℃ 10min
各轮PCR产物的电泳检测如图2所示。将PCR产物同pBS-T连接，将连接产物加入含100μl XL1-Blue感受态细胞的EP管中，轻弹混匀，然后将混合好的菌液用冰预冷的无菌的移液枪吸至电击转化杯中，电击，完成后立即加入冰预冷的800μlLB或SOB培养基，铺于含氨苄的LB平板上筛选，挑取阳性克隆测序，测序结果为正确。将测序正确的克隆用甘油管保存与-80℃超低温冰箱，备用，命名为pBS-Alf，质粒图如图3所示。
实施例2
按图4所示方法构建表达载体pPic9K-His-Alf。将实施例1构建的pBS-Alf以及表达载体pPIC9K用EcoR I和Not I双酶切(图5)，纯化收集酶切片段，连接，得到重组表达载体pPIC9K-His6-Alf，双酶切及连接体系如下：
酶切反应体系1： 酶切反应体系2：
pBS-Alf质粒 10μl pPIC9k质粒 10μl
EcoR I(12u/μl) 2.0μl EcoR I(12u/μl) 1.5μl
Not I(10u/μl) 2.0μl Not I(10u/μl) 1.5μl
10x酶切缓冲液 6μl 10x酶切缓冲液 6μl
10xBSA 6μl 10xBSA 6μl
无菌水 34μl 无菌水 34.5μl
总体积 60μl 总体积 60μl
连接反应体系：
回收纯化的pPIC9K质粒 1.5μl
回收纯化目的片段His6-Alf 5μl
T4 DNA连接酶 1μl
10x连接缓冲液(含BSA) 1μl
无菌水 1.5μl
重组表达载体pPIC9K-His6-Alf用Sal I单酶切线性化后，电击转化入GS115感受态细胞中，铺于含100μg/ml博来霉素(Zeocin)YPD平板(蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％)上培养，筛选抗性转化子。挑取转化子再用含2.0mg/ml G418抗生素的YPD平板上复筛，选出高抗性的生长良好的菌落。
实施例3
在BMG/MY液体培养基中摇瓶培养，装液量100ml，摇床转速250rpm，当培养至OD600值达到1～1.5时，加入无菌甲醇1～2ml诱导表达，后每隔24小时加入一次。连续取样电泳测定，培养5天。
收集发酵液，10000rpm离心，低温真空浓缩，浓缩液逐渐加入硫酸铵至终浓度为50％，并不断轻轻搅拌，沉淀3000rpm离心，去上清，沉淀用生理盐水复溶。溶液按照Novagen公司His-Bind蛋白纯化试剂盒操作说明，纯化蛋白。收集纯化后蛋白液，用肠激酶EK切割，并再次用硫酸铵沉淀，离心，沉淀透析复溶，得到活性Alfimeprase。
分别取pPIC9K-His6-Alf重组菌经甲醇诱导表达3、4、5天后的上清液和纯化后的ALF蛋白，以空白的酵母株GS115上清液为对照，进行SDS-PAGE分析，结果表明，pPIC9K-His6-Alf重组菌经甲醇诱导表达3、4、5天后的上清液和纯化后的突变蛇毒纤溶酶均有特异条带产生，而空白对照无该特异条带(图6)。将纯化后的突变蛇毒纤溶酶进行Western Blotting鉴定(图6)，结果表明为所获得的确为突变蛇毒纤溶酶。其中所涉及的样品处理、SDS-PAGE、Western-Blot等方法均参考分子克隆(三版)。
取纯化的突变蛇毒纤溶酶及未经EK切割除His-Tag的纯化蛋白，稀释至0.5μg/μl浓度，各取10μl；取空白对照菌发酵液离心后的上清，重组菌发酵液离心后的上清，浓缩10倍，各取10μl，加入纤维蛋白平板(1％琼脂，0.15mol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，0.2％人纤维蛋白原，pH7.5，铺板前加入1ml含10单位凝血酶溶液)小孔中，37℃放置3-4天，观察纤溶圈的大小情况，据此判别纤溶能力大小，结果如图7所示。
结果表明，采用本方法获得的纯化蛋白具有一定的纤溶活性，带纯化标签和经肠激酶切去除标签的蛋白具有相近的活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种酵母表达载体，其出发载体为pPIC9K，其特征在于，含有突变蛇毒纤溶酶基因，所述的突变蛇毒纤溶酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.含有权利要求1所述表达载体的工程菌株，其特征在于，所述出发菌为酵母株为GS115。
3.制备权利要求2所述工程菌株的方法，其特征在于，构建含突变蛇毒纤溶酶基因的表达载体pPIC9K-His6-Alf，并将其线性化后导入到酵母株GS115，获得重组工程菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表达载体pPIC9K-His6-Alf通过电转法导入到酵母株GS115中。
5.一种利用权利要求2所述工程菌株制备突变蛇毒纤溶酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)在BMG/MY液体培养基中培养，甲醇诱导表达，培养5天后，取菌液少量，高速离心，上清用硫酸铵溶液处理，离心，去上清，沉淀复溶；所述BMG/MY培养基配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾pH6.0，0.00004％生物素，1％甘油，0.5％甲醇；用甲醇诱导表达时，将甲醇采用分批滴加的方式加入培养液中，每天一次，添加量为1～1.5％；所述的加入硫酸铵后溶液中硫酸铵的终浓度为质量分数45％～50％；
2)将步骤1)中复溶的溶液用亲和层析柱纯化，获得纯化蛋白液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括将步骤2)获得的纯化蛋白用肠激酶切割，再用硫酸铵沉淀离心，沉淀经透析复溶，得到活性蛇毒纤溶酶。
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