CN1850858A - 一种适于规模化生产的小鼠神经生长因子的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及小鼠神经生长因子的制备方法。所要解决的问题是：提供一种适于规模化生产的小鼠神经生长因子的纯化方法。特点是：将匀浆、离心后小鼠颌下腺上清液，采用截留分子量为10K的中空纤维柱超滤上清至pH6.8，20mmol/L磷酸盐缓冲液中，超滤液上样于Sepharose XL柱层析，再用截留分子量为10K的中空纤维柱超滤至纯水中，超滤液酸解后，上样于Sepharose FF柱层析，收集目的蛋白，上样于Superdex 75prepgrade柱，收集目的蛋白，得小鼠神经生长因子原液。本发明方法与现有技术的方法相比大大缩短了生产周期；提高了生产效率，适用于规模化生产。

Description

一种适于规模化生产的小鼠神经生长因子的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物医药提取技术领域，具体地说是一种小鼠神经生长因子(NerveGrowth Factor，NGF)的制备方法。
背景技术
神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是迄今为止发现的唯一不仅对中枢及外周神经的正常神经细胞有营养因子作用，而且具有调节损伤神经修复机能的生物活性分子。神经生长因子在临床上有重大的应用价值，目前的适应症主要包括各种外周神经病、视神经损伤、脊椎损伤、颅脑损伤、中枢神经系统缺氧和缺血造成的损伤及早老性痴呆等。：NGF可以从雄性小鼠的颌下腺、人胎儿脑髓、人胎盘及蛇毒等组织中提取，也可以通过基因工程的方法制备。其中，基因工程表达的NGF是发展趋势，但由于神经生长因子须在CHO细胞等真核表达系统中才有较好的生物活性，技术难度大，形成工业化生产尚有相当长的时间。而人胎儿脑髓、人胎盘及蛇毒等组织都存在来源困难、批间次差异大、回收低、成本高的缺陷。我们选用雄性小鼠的颌下腺作为原材料来源，不仅来源方便、得率高，而且由于小鼠实验动物中心专门提供，每批出据检测报告，保证了原材料的质量稳定性、避免了鼠源污染的可能。
现有的小鼠神经生长因子的制备方法，具体步骤为：
小鼠颌下腺经高速匀浆后，匀浆液于4°C静置30min后，12000rpm离心30min，收集上清液，对pH6.8，20mmol/L PB溶液(pH6.8的磷酸盐缓冲液)透析16h，透析液上CM-52柱(I柱)，收集流穿液对水透析16h，酸化解离液上CM-52柱(II柱)，收集目的蛋白峰，上样于含0.15mol/LNaCl的pH7.2，20mmol/L的PB溶液平衡的Superdex75prep grade凝胶过滤柱，收集洗脱峰，为小鼠神经生长因子原液。
此制备过程中所采用的是羧甲基纤维素阳离子层析介质(CM-52)，此介质在使用过程中由于流速太慢，柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变，而且不能承受0.1M以上NaOH在位清洗，重生效果差，若用于规模化生产，就会影响生产效率。另外，现有技术中，小鼠颌下腺匀浆液及I柱流穿液均需透析24h，使生产周期过长，增加了蛋白被污染的可能性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种生产周期短、生产效率高、采用超滤替代透析以及使用高流速、高载量的离子交换凝胶Sepharose XL(SP XL)和Sepharose Fast Flow(SP FF)来制备小鼠神经生长因子、适于规模化生产的小鼠神经生长因子的纯化方法。
具体操作方法如下：
(1)小鼠颌下腺经高速匀浆后，匀浆液于4℃静置30min后，12000rpm离心30min，收集上清液，选用截留分子量为10K的中空纤维柱超滤上清液至pH6.8，20mmol/L PB溶液中。
(2)超滤液上样于pH6.8，20mmol/L PB溶液平衡好的Sepharose XL柱(琼脂糖凝胶SP XL柱)(I柱)层析，收集流穿液。
(3)流穿液对截留分子量为10K的中空纤维柱超滤至纯水中，酸化解离。
(4)酸化解离液上Sepharose Fast Flow柱(琼脂糖凝胶SP FF柱)(II柱)层析，洗脱后，收集目的蛋白峰，上样于含0.15mol/L氯化钠溶液的pH7.2，20mmol/L的PB溶液平衡的Superdex 75 prep grade凝胶过滤柱，收集目的蛋白，得小鼠神经生长因子(NGF)原液。
本发明方法与原有的方法相比大大缩短了生产周期。
步骤(1)与步骤(2)中所采用的中空纤维柱，内有在超滤过程中起决定作用的是超滤膜。中空纤维超滤膜是以高分子材料采用特殊工艺制成的不对称半透膜，呈中空毛细管状，微孔密布管壁。在压力的作用下能使小分子物质透过膜成为超滤液，其它的高分子物质，胶体，超微粒子，细菌等则被膜面阻挡成为浓缩液，从而达到物质的分离，浓缩和提纯之目的。超滤分离对于极稀溶液中分离溶质具有广泛的适应性，与其它分离过程相比，有如下特点：1、超滤过程在常温低压下进行，能耗低，不需加热，无热效应及相态变化，不需加入任何其它物质即可达到分离、浓缩、纯化及分级等目的，故特别适用于：1)热敏性物质(生物制品、菌体、蛋白质等)的分离浓缩。2)极稀溶液的浓缩回收。3)恒体积恒浓度下的脱盐纯化。2、超滤膜耐化学侵蚀，PH适应范围广。
步骤(2)中采用琼脂糖凝胶Sepharose XL为一柱，有以下特点：a、介质载体为刚性材料，粒度为90μm，流速快，蛋白结合量大，线速度可达到300～500cm/小时，对粗提液处理速度快。b、该介质再生效果好。活性峰洗脱后，用强碱溶液进行在位清洗，可以有效清洗出吸附在介质上的色素。c、该介质装填十分容易不需特殊设备，可以按比例放大适合工业化生产。
步骤(4)中采用琼脂糖凝胶Sepharose Fast Flow柱作为二柱，具有高流速、高载量、高化学稳定性的优点，配合有效的在位清洗，可反复重生上千次。
本发明通过使用超滤替代透析，大大缩短了生产周期。采用SP XL及SP FF柱取代传统的CM-52柱，流速快，载量高，并且可以在位清洗，提高了生产效率，适用于规模化生产。
附图说明
图1为本发明步骤(2)中超滤液过Sepharose XL柱(琼脂糖凝胶SP XL柱)层析的色谱图，其中峰1A代表流穿液。
图2为本发明步骤(3)中酸化解离液过Sepharose Fast Flow柱(琼脂糖凝胶SPFF柱)层析的色谱图，其中小鼠神经生长因子目的蛋白峰在组分2A中被洗脱出来。
图3为本发明目的蛋白峰过Superdex 75 prep grade柱(凝胶柱)过滤的色谱图，纯的小鼠神经生长因子分布在峰3A中。
具体实施方式
下面结合通过实施例，结合附图对本发明作进一步地描述。
实施例：
一种适于规模化生产的小鼠神经生长因子的纯化方法，具体操作方法如下：
1.颌下腺处理
取出冷冻的雄性小鼠颌下腺，融化后，加入5倍预冷的高压灭菌水，放入匀浆器中匀浆。匀浆后，匀浆液于4℃静置30min后，12000rpm离心30min，收集上清液，选用截留分子量为10K的中空纤维柱超滤上清液至pH6.8，20mmol/L PB溶液中。
2.Sepharose XL(SP XL)(琼脂糖凝胶SP XL柱)层析
将超滤后的上清液上样于pH6.8，20mmol/L PB溶液平衡好的Sepharose XL阳离子交换柱(XK 26/50，Amersham Biosciences公司)上，流速10ml/min，收集流穿液，见图1。
3.流穿液酸化解离
选用截留分子量为10K的中空纤维柱超滤，将流穿液超滤至纯水中。根据超滤液的总量，按比例加入pH4.0，lmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液，至终浓度为50mmol/L，同时加入分析纯氯化钠(NaCl)至终浓度为0.4mol/L，4℃放置10min，10,000rpm离心40min，取上清液。
4.Sepharose Fast Flow(SP FF)(琼脂糖凝胶SP FF柱)层析
将酸化解离后上清液上样于含0.4mol/L NaCl溶液的pH4.0，50mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液平衡后的SP FF柱，流速10ml/min。上样完毕，依次用含0.4mol/L NaCl溶液的pH4.0，50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲；pH4.0，50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲；pH9.0，50mmol/L三羧甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-Cl)洗柱及洗脱杂蛋白，然后用含0.4mol/LNaCl溶液的pH9.0，50mmol/LTris-Cl缓冲液洗脱并收集目的蛋白，见图2。
5.Superdex 75 prep grade柱(凝胶柱)过滤
将收集到的目的蛋白直接上样于含0.15mol/L氯化钠溶液的pH7.2，20mmol/L的PB溶液平衡后的Superdex 75 prep grade凝胶过滤柱(XK26/100)，流速8ml/min，收集目的蛋白即得小鼠神经生长因子原液，见图3。

Claims (1)

1、一种适于规模化生产的小鼠神经生长因子的纯化方法，包括将雄性小鼠颌下腺经高速匀浆后，匀浆液于4℃静置30min后，12000rpm离心30min，收集上清液，其特征在于：
(1)、选用截留分子量为10K的中空纤维柱超滤上清液至pH6.8，20mmol/L PB溶液，即pH6.8的磷酸盐缓冲液中；
(2)、将超滤后的上清液上样于pH6.8，20mmol/L PB溶液平衡好的Sepharose XL上层析，流速10ml/min，收集流穿液；
(3)、选用截留分子量为10K的中空纤维柱超滤流穿液至纯水中，酸化解离后，在离心机中10,000rpm离心40min，得到酸化解离后的上清液；
(4)、将酸化解离后的上清液上样于含0.4mol/L NaCl的pH4.0，50mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液平衡后的Sepharose Fast Flow柱上层析，流速10ml/min；上样完毕，依次用含0.4mol/L NaCl的pH4.0，50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲；pH4.0，50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲；pH9.0，50mmol/L三羧甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，洗柱及洗脱杂蛋白，然后用含0.4mol/L NaCl的pH9.0，50mmol/L三羧甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白峰；
(5)、将收集目的蛋白峰直接上样于含0.15mol/L氯化钠溶液，pH7.2，20mmol/L的PB溶液平衡后的Superdex 75 prep grade柱，流速8ml/min，收集目的蛋白，即为小鼠神经生长因子原液。
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