CN1477130A - 香菇菌多糖的分离纯化工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种香菇菌多糖的分离纯化工艺，主要解决现有香菇菌多糖含量低、难溶于水、分子量不确定而导致其不能充分发挥医疗效果的不足。该工艺以深层发酵获得的香菇菌多糖粗品为原料，经过热水抽提、微米级过滤器预滤、分子量截留值为5～10万道尔顿的超滤膜级分、分子量截留值为0.6～5万道尔顿的超滤膜浓缩、常规过滤器终滤、乙醇沉淀以及干燥等步骤，而获得质量稳定、有效成份含量高、易溶于水、且平均分子量被严格控制在4～9万道尔顿的香菇菌多糖粉，而该平均分子量正是临床所需要的。所制得的香菇菌多糖粉可直接用作口服制剂，也可作为肌肉注射制剂的原料。

Description

香菇菌多糖的分离纯化工艺
                 技术领域
本发明涉及香菇多糖的提取技术，具体地指一种从深层发酵获得的香菇菌多糖粗品中分离纯化香菇菌多糖的工艺。
                 背景技术
目前，香菇菌多糖由于其具有增强人体T淋巴细胞活性、调节人体体液免疫功能、激活人体抗肿瘤因子等特点，而被作为一种生物反应调节剂广泛应用于病毒性肝炎、免疫功能低下、以及恶性肿瘤等的治疗和辅助治疗中。但现有用于临床上的香菇菌多糖制剂特别是口服制剂大都存在着如下的不足：制剂中香菇菌多糖的含量太低，一般是在15～28％的范围内，其中的杂质成份过高，使得其有效成份既不纯也不稳定，从而影响治疗效果；同时，制剂中香菇菌多糖的专属性太差，分子量未严格控制，从1万至100万道尔顿不等，其中相当一部分香菇菌多糖的分子量在10万道尔顿之上，与临床治疗需要平均4～9万道尔顿的分子量相差甚远，其分子量过小则代谢太快不利于在人体内驻留吸收，其分子量过大则水溶性变差也不易于为人体吸收，这些均使得其治病防病的疗效大打折扣。为了解决上述问题，授权公告号为CN1032428C的中国发明专利说明书公开了一种香菇多糖或香菇菌多糖的提取新工艺，该工艺采用单级超滤器截留、乙醇沉淀来提取香菇多糖，虽然可以提高香菇菌多糖的含量，但其收率仅为1～1.5％，且香菇多糖的分子量特别是大分子量的香菇多糖未加控制，其中的无效成份和杂质均较多，其质量和疗效仍不理想。公开号为CN1140202A的中国发明专利申请公开说明书提供了一种从深层发酵获得的香菇多糖粗品中提取注射用香菇多糖的方法，该方法采用不同浓度的醇析、醇沉步骤来制得水溶性香菇多糖，虽然也能提高香菇多糖的含量，但该方法所用设备体积大，溶剂回收量大，所得香菇多糖的分子量也未加控制，同样会影响其质量和疗效。
                发明内容
本发明的目的就是要提供一种香菇菌多糖的分离纯化工艺，使采用该工艺制得的香菇菌多糖质量稳定、有效成份含量高、且分子量被严格控制在临床治疗需要范围内。
为实现上述目的，本发明所提出香菇菌多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
1)取经深层发酵获得的重量含量为15～28％的香菇菌多糖干粉，用热水抽提，然后静置分层，去除下层沉淀物，得到茶色的上层抽提液。在此步骤中，含量偏低、平均分子量未控制的香菇菌多糖干粉内的大部分不溶于水的杂质被清除出去。
2)用滤膜孔径为5～15微米的过滤器对所得上层抽提液进行预先过滤，进一步去除不溶于水的杂质，得到澄清的预滤抽提液。在此步骤中，残留在上层抽提液内的极少量不溶于水的杂质被彻底去掉，有利于香菇菌多糖的纯化，也可以防止这些残存杂质对后续步骤中的超滤膜产生损害，延长超滤膜的使用寿命。
3)用分子量截留值为5～10万道尔顿的超滤膜对所得预滤抽提液进行级分，去除截留液，得到绝大部分香菇菌多糖分子量在10万道尔顿以下的超滤级分液。在此步骤中，预滤抽提液内大部分分子量在10万道尔顿以上、水溶性差的香菇菌多糖及其他杂质被截留掉了。
4)用分子量截留值为0.6～5万道尔顿的超滤膜对所得超滤级分液进行浓缩，去除超滤液，得到绝大部分香菇菌多糖分子量在0.6～10万道尔顿之间的截留浓缩液。在此步骤中，超滤级分液内大部分分子量在0.6万道尔顿以下、在人体内驻留时间太短的香菇菌多糖也被过滤掉了。
5)将所得截留浓缩液静置一段时间，再用常规过滤器作最后的过滤，去除残留在其中的极少数大分子量香菇菌多糖混浊物，得到透明浓缩液。由于一般超滤膜的截留率在85～90％之间，经过上面超滤级分和浓缩的截留浓缩液内仍然会残存少量大分子量的混浊物，若不除去，会使最终产品的平均分子量偏高，水溶性变差，防治疾病的效果降低。而在此步骤中，截留浓缩液内的大分子量杂质可被彻底清除干净。
6)将所得透明浓缩液用浓度为20～50％的乙醇进行醇析，醇析的沉淀物再用浓度为80～99.5％的乙醇进行洗涤，最后经过干燥即得平均分子量控制在4～9万道尔顿之间、完全满足临床需要的纯化香菇菌多糖粉。经测定其香菇菌多糖的重量含量在50～80％之间，收得率为5～8％，溶于水中清澈透明。
本发明的优点在于：采用级分和浓缩两级特殊膜径的超滤膜处理工艺对原料香菇菌多糖干粉水提液进行处理后，所得纯化香菇菌多糖的平均分子量可稳定地控制在临床治疗需要的范围内，而在这两级超滤膜处理工艺前后采用的预先过滤和最后过滤处理工艺则可以将其中不溶于水的杂质和大分子量的香菇多糖混浊物彻底清除干净。从而使所得成品纯度高、质量好、易溶于水，经薄层色谱法检测与标准品甘露糖、葡萄糖显相同颜色斑点，按中国药典2000年版二部附录VII测定其平均分子量为4～9万道尔顿，而这正是临床需要的分子量。同时本发明还具有分离纯化工艺简短、有机溶媒单一、无公害污染、收得率高等特点，可直接用作口服制剂，也可作为肌肉注射制剂的原料。
                 具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明：
本发明所述的香菇菌多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
1)取经深层发酵获得的重量含量为15～28％的香菇菌多糖干粉，与蒸馏水混合，香菇菌多糖干粉与蒸馏水的重量比为1∶20～100，较好的重量比为1∶30～50，蒸馏水的温度控制在60～70℃，在搅拌状态下提取4～5小时，这样可使香菇菌多糖充分溶解在水中，提高原料的提取效率。停止搅拌将混合液先置于室温，然后移入1～10℃的温度条件下静置分层，这样可快速去除下层沉淀物，而得到茶色的上层抽提液。
2)用滤膜孔径为5～15微米的过滤器对所得上层抽提液进行预先过滤。此过滤器可选用蜂房式过滤器，滤膜孔径取10微米为佳，过滤面积为0.1平方米，透水量为每小时20升。这样可进一步去除不溶于水的杂质，得到澄清的预滤抽提液。
3)用分子量截留值为5～10万道尔顿的超滤膜组件对所得预滤抽提液进行级分。级分用超滤膜组件的过滤面积为0.1平方米，透水量为每小时10升。预滤抽提液的温度控制在10～45℃，压力控制在0.1～0.2Mpa。去除截留液，就可得到绝大部分香菇菌多糖分子量在10万道尔顿以下的超滤级分液。
4)用分子量截留值为0.6～5万道尔顿的超滤膜组件对所得超滤级分液进行浓缩。浓缩用超滤膜组件的过滤面积为0.1平方米，透水量为每小时10升。超滤级分液的温度控制在10～45℃，压力控制在0.1～0.2Mpa。去除超滤液，就可得到绝大部分香菇菌多糖分子量在0.6～10万道尔顿之间的截留浓缩液。保持上述适宜的超滤级分和超滤浓缩参数，可稳定滤速，确保得到满足平均分子量最佳要求的香菇菌多糖。
5)将所得截留浓缩液在温度为1～10℃的条件下静置一段时间，再用常规的中速滤纸作最后的过滤，即可彻底去除残留在其中的极少数大分子量香菇菌多糖混浊物，得到透明浓缩液。
6)将所得透明浓缩液在搅拌状态下用浓度为40％的乙醇进行醇析，使其充分沉淀，过滤醇析沉淀物并抽干，然后用浓度为99％的乙醇进行浸泡洗涤，再行过滤并抽干，最后经过30～50℃干燥，即得平均分子量控制在4～9万道尔顿之间的香菇菌多糖粉成品。

Claims (6)

1.一种香菇菌多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：
1)取经深层发酵获得的重量含量为15～28％的香菇菌多糖干粉，用热水抽提，然后静置分层，去除下层沉淀物，得到茶色的上层抽提液；
2)用滤膜孔径为5～15微米的过滤器对所得上层抽提液进行预先过滤，进一步去除不溶于水的杂质，得到澄清的预滤抽提液；
3)用分子量截留值为5～10万道尔顿的超滤膜对所得预滤抽提液进行级分，去除截留液，得到绝大部分香菇菌多糖分子量在10万道尔顿以下的超滤级分液；
4)用分子量截留值为0.6～5万道尔顿的超滤膜对所得超滤级分液进行浓缩，去除超滤液，得到绝大部分香菇菌多糖分子量在0.6～10万道尔顿之间的截留浓缩液；
5)将所得截留浓缩液静置一段时间，再用常规过滤器作最后的过滤，去除残留在其中的极少数大分子量香菇菌多糖混浊物，得到透明浓缩液；
6)将所得透明浓缩液用浓度为20～50％的乙醇进行醇析，醇析的沉淀物再用浓度为80～99.5％的乙醇进行洗涤，最后经过干燥即得平均分子量控制在4～9万道尔顿之间的香菇菌多糖粉。
2.根据权利要求1所述的香菇菌多糖的分离纯化工艺，其特征在于：所说的步骤1)中香菇菌多糖干粉与水的重量比为1∶20～100，水温控制在60～70℃，在搅拌状态下提取4～5小时，在1～10℃静置分层。
3.根据权利要求1所述的香菇菌多糖的分离纯化工艺，其特征在于：所说的步骤2)中选用滤膜孔径为10微米的蜂房式过滤器，过滤面积为0.1平方米，透水量为每小时20升。
4.根据权利要求1所述的香菇菌多糖的分离纯化工艺，其特征在于：所说的步骤3)中级分用超滤膜的过滤面积为0.1平方米，透水量为每小时10升；预滤抽提液的温度为10～45℃，压力为0.1～0.2Mpa。
5.根据权利要求1所述的香菇菌多糖的分离纯化工艺，其特征在于：所说的步骤4)中浓缩用超滤膜的过滤面积为0.1平方米，透水量为每小时10升；超滤级分液的温度为10～45℃，压力为0.1～0.2Mpa。
6.根据权利要求1所述的香菇菌多糖的分离纯化工艺，其特征在于：所说的步骤5)中将截留浓缩液在温度为1～10℃的条件下静置一段时间，再用中速滤纸过滤。
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