CN103740754B

CN103740754B - 含有鼠神经生长因子的表达载体及细胞

Info

Publication number: CN103740754B
Application number: CN201310544508.3A
Authority: CN
Inventors: 饶春明; 徐莉; 李永红; 韩春梅; 史新昌; 陶磊
Original assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2013-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2033-10-25
Also published as: CN103740754A

Abstract

本发明涉及用于表达生长因子的表达载体和细胞，具体地，本发明涉及含有鼠神经生长因子的重组载体及重组细胞，本发明还涉及所述重组细胞的制备方法、鼠神经生长因子的纯化方法以及所述重组载体或重组细胞用于制备鼠神经生长因子的用途。本发明利用哺乳动物细胞表达系统成功表达了鼠神经生长因子，并进一步证明了该鼠神经生长因子序列正确且具有较高的比活性高，具有良好的应用前景。

Description

含有鼠神经生长因子的表达载体及细胞

技术领域

本发明涉及用于表达生长因子的表达载体和细胞，具体地，本发明涉及含有鼠神经生长因子的重组载体及重组细胞，本发明还涉及所述重组细胞的制备方法、鼠神经生长因子的纯化方法以及所述重组载体或重组细胞用于制备鼠神经生长因子的用途。

背景技术

神经生长因子，简称NGF，是一种分泌性蛋白，属于神经营养因子家族，对维持神经元的存活，以及促进其生长具有重要作用。NGF最早在1952年由丽塔蒙特兰奇发现，最初是由蛇毒中分离而得，随后人们发现鼠颌下腺中富含NGF，且比活性很高，从鼠颌下腺中提取NGF工艺相对简便，所以很长一段时期，人们将对NGF的研究集中在鼠颌下腺提取的NGF上。

在鼠颌下腺中，NGF以7SNGF的形式存在，7SNGF有两个阿尔法亚基，两个伽马亚基和两个beta亚基组成的多聚体，在该多聚体中，beta亚基具备能够有效结合NGF受体，且具备完全的NGF活性，由此beta亚基又被称为鼠神经生长因子，简称mNGF。mNGF链内形成3对beta折叠，链内形成3对二硫键，由于这三对二硫键的形成，进行正确复性是比较困难的，另外在mNGF的前体链内有3个N糖基化位点，其中2个位于前肽部分，1个位于成熟肽部分，前肽的N糖基化有助于mNGF的折叠和分泌。

鼠颌下腺提取的NGF，能够有效治疗外周神经损伤，持续性角膜缺损、角膜溃疡、干燥性角膜结膜炎、白内障术后愈合、青光眼等，并成功治愈鼻咽癌放疗引起的放射性颞叶坏死。针对正己烷中毒引起的神经损伤以及视神经损伤，mNGF功效显著，目前已经有上市产品-注射用神经生长因子。

由于市售mNGF都是鼠颌下腺中提取，可能存在动物源性病毒的污染，因此已有研究应用大肠杆菌^[1-4]、酵母^[5]、昆虫细胞^[6-10]和哺乳动物细胞^[11]表达系统对mNGF进行表达。但大肠杆菌表达出的mNGF容易出现错误折叠，导致生物学活性降低，而利用酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达NGF，也存在表达量低或活性偏低的问题。

因此，本领域亟需能够提高NGF表达量和/或维持NGF生物学活性的表达系统。

发明内容

本发明成功构建了鼠神经生长因子的真核表达载体，获得了能够稳定表达鼠神经生长因子的真核表达细胞，以及具有正确序列和较高活性的鼠神经生长因子，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及重组载体，其含有鼠神经生长因子基因的核酸序列。

在本发明的实施方案中，所述载体为适合鼠神经生长因子表达的载体，优选为真核表达载体，例如为pcDNA3.1、pEGFP-C1、pPIC9K；在本发明的具体实施方案中，所述载体为Freedom^TM pCHO1.0。

在本发明的实施方案中，将鼠神经生长因子基因的核酸序列插入载体的多克隆位点，即得到重组载体。

在本发明的具体实施方案中，所述重组载体为pXL-mNGF。

在本发明中的实施方案中，所述鼠神经生长因子基因的核酸序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的序列。其氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的序列。

在本发明的具体实施方案中，所述鼠神经生长因子基因的核酸序列为SEQ ID NO：3所示的序列。

本发明第二方面涉及重组细胞，其含有本发明第一方面任一项的重组载体。

在本发明的实施方案中，所述细胞为适合鼠神经生长因子表达的细胞，优选为真核细胞，例如为CHO细胞、293细胞、Hela细胞；在本发明的具体实施方案中，所述细胞为CHO细胞。

根据本发明第二方面任一项的重组细胞，所述重组细胞为经过无血清培养基驯化培养后的细胞。

在本发明的实施方案中，所述无血清培养基为CD Forti^TM CHO。

在本发明的实施方案中，所述重组细胞是在无血清培养基中培养的。

在本发明的实施方案中，所述重组细胞的培养方式为悬浮培养。

根据本发明第二方面任一项的重组细胞，所述重组细胞为经过氨甲喋呤和嘌呤霉素加压筛选培养后的细胞。

根据本发明第二方面任一项的重组细胞，所述加压筛选为两个阶段的加压筛选。

在本发明的实施方案中，所述第一阶段为细胞培养的第21-29天，例如为第25天。

在本发明的实施方案中，所述第二阶段为第一阶段细胞培养后的18-25天，例如为21天。

在本发明的实施方案中，所述第一阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为100～200nM；第二阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为500～1000nM；

在本发明的实施方案中，所述第一阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为10～20μg/mL；第二阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为30～50μg/mL。

在本发明的实施方案中，细胞的基础培养基为含有8mM谷氨酰胺的无血清培养基。

在本发明的实施方案中，加压筛选时的培养基是在基础培养基中加入氨甲喋呤和嘌呤霉素后得到的选择培养基。

根据本发明第二方面任一项的重组细胞，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC N0.8305。

本发明第三方面涉及鼠神经生长因子，其由本发明第一方面任一项的重组载体或第二方面任一项的重组细胞制备得到。

本发明第四方面涉及本发明第一方面任一项的重组载体或第二方面任一项的重组细胞用于制备或生产鼠神经生长因子的用途。

本发明第五方面涉及本发明第二方面任一项的重组细胞的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将本发明第一方面任一项的重组载体转染入CHO细胞中，在含有无血清培养基的细胞培养瓶中静止培养10～14天（例如12天），所述无血清培养基中氨甲喋呤的浓度为100～200nM，嘌呤霉素的浓度为10～20μg/mL；

（2）将步骤（1）培养获得的细胞转移至摇瓶中摇动培养11～15天（例如第13天），每3～4天传一代，培养基与步骤（1）相同；

（3）适当增加细胞密度，继续在含有无血清培养基的摇瓶中摇动培养18～25天，每3～4天传一代，所述无血清培养基中氨甲喋呤的浓度为500～1000nM，嘌呤霉素的浓度为30～50μg/mL，即获得本发明第二方面任一项的重组细胞；

（4）任选地，还包括对所获得的细胞进行单克隆筛选、以获得更高表达量的细胞株的过程。

在本发明的实施方案中，所述无血清培养基为CD Forti^TM CHO培养基。

在本发明的实施方案中，步骤（1）中接种细胞的密度为1×10⁵～9×10⁵/ml，例如为3×10⁵～8×10⁵/ml，例如为5×10⁵/ml。

在本发明的实施方案中，步骤（2）中接种细胞的密度为1×10⁵～6×10⁵/ml，例如为3×10⁵/ml。

在本发明的实施方案中，步骤（3）中接种细胞的密度为2×10⁵～7×10⁵/ml，例如为4×10⁵/ml。

在本发明的实施方案中，所述单克隆筛选的方法为本领域所公知，例如可采用有限稀释法筛选单克隆细胞。

在本发明的实施方案中，所述细胞培养的条件为37℃，5%～8%CO₂。

在本发明的实施方案中，当在摇床上培养细胞时，摇床的转速为100-150rpm，例如为120rpm。

本发明还涉及鼠神经生长因子的制备方法，其包括本发明第五方面任一项的制备方法，以及培养重组细胞和收获细胞培养上清的步骤。

本发明还涉及鼠神经生长因子的纯化方法，其包括以下步骤：

1）培养表达鼠神经生长因子的重组细胞，收获细胞培养上清；

2）将细胞培养上清用离子交换层析进行纯化，得到纯化后的样品；

3）将步骤2）获得的样品用分子筛层析进行纯化，得到纯化的鼠神经生长因子。

在本发明的实施方案中，所述表达鼠神经生长因子的重组细胞为本发明第二方面任一项的重组细胞；

在本发明的具体实施方案中，所述重组细胞是按照本发明第五方面任一项所述的制备方法制备得到的。

在本发明的实施方案中，所述离子交换层析中的填料为阳离子交换填料；在本发明的具体实施方案中，所述离子交换填料为琼脂糖凝胶，例如为SP Sepharose Fast Flow。

在本发明的实施方案中，所述分子筛层析中的填料为葡聚糖和琼脂糖的混合物，例如为Superdex，例如为Superdex75；在本发明的具体实施方案中，所述分子筛填料为superdex75pre grade。

发明的有益效果

本发明成功构建了鼠神经生长因子的真核表达载体，通过加压筛选获得了稳定表达鼠神经生长因子的真核细胞株，并进一步获得了纯化的鼠神经生长因子。该鼠神经生长因子序列正确、表达量高、活性好，能够在无血清培养基中悬浮培养，为鼠神经生长因子的大规模制备奠定了基础。

附图说明

图1为pXL-mNGF表达质粒示意图

图2为电泳结果图，其中左图为PCR产物电泳结果，laneM：marker DL2000；lane1,lane2：PCR产物；右图为EcoRV、PacI双酶切pXL-mNGF产物电泳结果，Lane M：Marker DL15000；Lane1：EcoRV、PacI双酶切产物；Lane2：未经酶切的表达质粒pXL-mNGF。

图3为pEGFP-N1质粒转染细胞（转染阳性对照组）图。

图4为瞬时转染48h表达上清Western Blot结果，其中1为瞬时转染pXL-mNGF的细胞48小时表达上清；2为阳性对照：鼠颌下腺提取NGF；3为瞬时转染空载体的细胞48小时表达上清。

图5为第二次ELISA实验标准曲线。

图6为鸡胚背根神经节活性测定。

图7为第一阶段筛选活细胞比例随筛选时间的变化趋势图。

图8为蛋白产率评估结果。

图9为Western Blot鉴定结果，其中1为未转染的CHO细胞培养上清；2为稳定转染的细胞表达上清；3为阳性对照（鼠颌下腺提取的NGF）。

图10为克隆扩大培养流程图。

图11为显微镜下单细胞照片，其中左图为96孔板中其中一孔单细胞，右图为96孔板中一单细胞培养12天。

图12为离子交换层析图。

图13为4～12%SDS-PAGE电泳图，其中M：Marker，S1：离子交换上样前的样品

图14为离子交换层析产物经4～12%SDS-PAGE还原电泳图谱，字母t后面的数字表示收集管编号（按照收集顺序编号）：

M为蛋白marker，S1为准备做离子交换的样品。由图可知，在15-20kD之间存在杂蛋白，其分子量与目的蛋白（介于10-15kD之间）很接近；总蛋白中杂蛋白的含量较高，在30kD-260kD之间都存在杂蛋白，大部分杂蛋白集中在30kD-40kD之间。

图15为分子筛层析图

图16为分子筛层析产物经4-12%SDS-PAGE还原电泳图谱。样品1-7为峰1的蛋白，样品8-22为峰2的蛋白，字母T后面的数字表示收集管编号（按照收集的顺序编号）：

图17为SDS-PAGE纯度测定结果。

图18为4-12%SDS-PAGE还原电泳分子量测定结果。

图19为紫外光谱扫描结果。

图20为Western Blot结果。

图21为SEC-HPLC纯度测定结果。

图22为样品溶液的cIEF-WCID的动态分析（不同聚焦时间）。

图23为N-末端氨基酸序列测定结果。

图24为多电荷质谱图。

图25为分子量测定结果

图26为rmNGF样品活性测定（TF-1/MTS法）图。

图27为鸡胚背根神经节活性测定。Std1：3AU/ml标准品；Std2：1AU/ml标准品；Std3：0.33AU/ml标准品；Std4：0.11AU/ml标准品；Std5：0.04AU/ml标准品；SP1：稀释7500倍的样品；SP2：稀释22500倍的样品；SP3：稀释67500倍的样品；SP4：稀释202500倍的样品；SP5：稀释607500倍的样品；Ne：空白对照（DMEM培养基）。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下各实施例中，无血清培养基CD Forti^TM CHO使用时均添加8mM的谷氨酰胺。

实施例1构建载体pXL-mNGF

1.1主要试剂和仪器

NGF Mouse cDNA Clone购自OriGene公司；超保真PCR试剂盒购自NEB公司；DNA分子量Marker DL15000、DL2000购自TaKaRa公司；限制性内切酶EcoRV、PacI购自NEB公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)购自天根生化科技有限公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；DH5α感受态大肠杆菌购自天根生化科技有限公司；质粒提取试剂盒（Plus SV Minipreps DNA Purification System）购自promega公司。

1.2方法

1.2.1PCR获得目的基因

引物设计：

上游引物：

TGCAGGATATC GCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTCTG（SEQ ID NO：1）

下游引物：CCTTAATTAATCAGCCTCTTCTTGTAGCC（SEQ ID NO：2）

引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

PCR反应体系（50μl）：

其中模板为NGF Mouse cDNA Clone。

PCR反应条件：

PCR产物电泳：2.0%琼脂糖凝胶，100V，30-60分钟，紫外灯下观察电泳结果。

目的条带回收：回收步骤按照胶回收试剂盒说明书进行。

将胶回收条带进行酶切后再次电泳胶回收，备连接用。

1.2.2酶切载体

载体为Freedom^TM pCHO1.0，购自life technology公司，用EcoRV和PacⅠ进行双酶切。

反应条件：37℃水浴，酶切4小时。

酶切产物电泳，目的条带回收。

1.2.3连接和转化

将载体片段与插入片段连接，连接产物转化感受态DH5α，

质粒提取参照质粒提取试剂盒（Plus SV Minipreps DNA Purification System）说明书。

1.2.6酶切鉴定和测序鉴定

用EcoRV和PacⅠ进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的质粒送往TaKaRa公司测序，测序正确的载体命名为pXL-mNGF。

1.3结果

1.3.1表达质粒示意图

图1为pXL-mNGF表达质粒示意图，DHFR为二氢叶酸还原酶基因，pac为嘌呤霉素抗性基因，aph为卡拉霉素抗性基因，mNGF为鼠神经生长因子基因。

1.3.2PCR结果

图2左图为PCR产物电泳结果。目的基因片段（mNGF）的理论大小为753bp，如图所示，可在泳道1和2中看见目的基因条带，片段大小与理论值相等。

1.3.3酶切鉴定结果

对构建的表达质粒pXL-mNGF进行EcoRV、PacI双酶切对酶切产物进行电泳鉴定，结果见图2右图。由图可知，双酶切（泳道1）得到两条带：条带一大于10000bp，条带二约750bp，与预期一致；泳道2中样品为没有进行酶切的表达质粒，由于质粒的闭合环状及部分超螺旋结构，电泳迁移位置较双酶切后载体靠前。

1.3.4测序比对结果

对表达质粒pXL-mNGF中的目的基因进行DNA测序,测序结果与理论序列进行比对，二者完全一致。

目的基因mNGF的核苷酸序列：

ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACTGCGTTTTTGATCGGCGTACAGGCAGAACCGTACACAGATAGCAATGTCCCAGAAGGAGACTCTGTCCCTGAAGCCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCTTGACACAGCCCTCCGCAGAGCCCGCAGTGCCCCTACTGCACCAATAGCTGCCCGAGTGACAGGGCAGACCCGCAACATCACTGTAGACCCCAGACTGTTTAAGAAACGGAGACTCCACTCACCCCGTGTGCTGTTCAGCACCCAGCCTCCACCCACCTCTTCAGACACTCTGGATCTAGACTTCCAGGCCCATGGTACAATCCCTTTCAACAGGACTCACCGGAGCAAGCGCTCATCCACCCACCCAGTCTTCCACATGGGGGAGTTCTCAGTGTGTGACAGTGTCAGTGTGTGGGTTGGAGATAAGACCACAGCCACAGACATCAAGGGCAAGGAGGTGACAGTGCTGGCCGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAGACAGTACTTTTTTGAGACCAAGTGCCGAGCCTCCAATCCTGTTGAGAGTGGGTGCCGGGGCATCGACTCCAAACACTGGAACTCATACTGCACCACGACTCACACCTTCGTCAAGGCGTTGACAACAGATGAGAAGCAGGCTGCCTGGAGGTTCATCCGGATAGACACAGCCTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTACAAGAAGAGGCTGA（SEQ ID NO：3）。

1.4小结

成功构建表达质粒pXL-mNGF，酶切鉴定及DNA测序结果与理论预期一致。

实施例2瞬时转染

2.1主要试剂和仪器

CHO细胞购自life technology公司，货号为A1155701；pEGFP-N1质粒由本室保存；鼠颌下腺提取NGF购自中国食品药品检定研究院；转染试剂FreeStyle^TM MAX Reagent购自life technology公司；培养基OptiPRO^TM SFM购自life technology公司；无血清培养基CD Forti^TM CHO购自life technology公司；一抗：Anti-NGF antibody，购自Abcam公司；二抗：Goat Anti-Rabbit IgG HRP Affinity Purified PAb购自R&D公司；化学发光显色试剂盒：SuperSignal*West Femto Chemiluminescent Substrate,购自Fementas公司。荧光倒置显微镜，型号TE2000-U，NIKON。

2.2方法

2.2.1转染

转染前24小时，传代CHO细胞，播种密度为5×10⁵/ml，播种体积30ml，培养基为添加了8mM谷氨酰胺的CD Forti^TM CHO培养基。转染当天，计数细胞，细胞存活率应高于95%。将用于转染的细胞播种到125ml的三角摇瓶中，播种密度为1×10⁶/ml，共播种30ml。准备高质量的表达质粒pXL-mNGF，浓度为1μg/μL，溶剂为水。用空载体作转染阴性对照，用绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1作转染阳性对照。用50ml离心管混匀最终转染的混合物。加入50μg（0.05ml）质粒DNA到1.45ml的OptiPRO^TM SFM培养基中，终体积为1.5ml，轻轻混匀。加入50μL的FreeStyle^TM MAX Reagent到1.45ml的OptiPRO^TM SFM培养基中，终体积为1.5ml，轻轻混匀。将稀释好的FreeStyle^TM MAX Reagent溶液（步骤6终溶液）加入稀释好的DNA溶液（步骤5终溶液）中，混匀；室温静止放置10分钟。将混合液滴加到准备好的细胞悬液中。将转染好的细胞放在CO₂培养箱中培养48h，37℃，8%CO₂。培养48h后，于镜下观察细胞。同时观察阳性对照组，镜下观察阳性对照组状态见图3。取培养的细胞悬液2ml，用离心机5000rpm，10min离心后，弃细胞，取离心后上清，置于-80℃冰箱中保存。以备用于ELISA、Western Blot和鸡胚背根神经节实验分析。其余细胞离心后，用选择培养基（添加了相应浓度甲氨蝶呤和嘌磷霉素的CD Forti^TM CHO培养基）重悬，计数，直接进入第一阶段筛选。

2.2.2ELSIA测定mNGF含量

ELISA实验方法参照ELISA试剂盒（ChemiKine Nerve Growth Factor,Sandwich ELISA;购自Millipore公司,货号为CYT304.）说明书。

2.2.3鸡胚背根神经节法测定mNGF活性

根据ELISA测定的含量进行预稀释，预稀释至3ng/ml，进行鸡胚背根

神经节实验，具体方法见后，实验结果见图6。

2.2.4Western Blot

设立阴性对照和阳性对照，阴性对照为转染空载体的细胞上清，阳性对照为鼠颌下腺提取的NGF，实验结果见图4。

2.3结果

2.3.1转染阳性对照结果

图3为转染阳性对照组细胞（即转染了pEGFP-N1质粒的细胞）的镜下照片，其中呈现绿色荧光者为表达绿色荧光蛋白的细胞。由图可知，本次实验转染效率较高。

2.3.2Western Blot实验结果

图4为免疫印迹的结果，其中1为瞬时转染pXL-mNGF质粒的细胞48h培养上清；2为阳性对照，即鼠颌下腺提取的NGF；3为瞬时转染空载体的细胞48h培养上清。由图可知，48h表达上清中含有鼠NGF，其分子量与理论值一致，与阳性对照也一致，阴性对照中不含NGF，即转染空载体的细胞不表达NGF。

2.3.3ELISA实验结果

（1）第一次ELISA实验结果

第一次ELISA实验直接取上清进行测定，未作稀释，实验结果数据见表2-1和表2-2。表2-2中样品1为转染表达载体的细胞48h培养上清；样品2为转染空载体的细胞48h培养上清；样品3为未作任何转染的CHO细胞48h培养上清。由数据可知，转染空载体和未作转染的CHO细胞48h培养上清吸光值基本一致，均低于0pg/ml浓度标准品的吸光值，证明二者上清中均不含NGF成分；瞬时转染表达载体的细胞48h培养上清吸光值已超过标准曲线线性范围，无法定量，需作稀释后进一步测定。

表2-1第一次ELISA测定标准品的吸光度值

表2-2第一次ELISA测定样品的吸光度值

（2）第二次ELISA实验结果

第二次ELISA实验数据见表2-3，标准曲线见图5。根据第一次实验结果，对样品1进行2倍倍比稀释，共8个稀释度。将稀释128倍的样品吸光值扣除空白后带入标准曲线方程计算知样品1浓度为103ng/ml。

表2-3第二次ELISA测定样品和标准品吸光度值

样品1：转染表达载体的细胞48h培养上清

2.3.4鸡胚背根神经节实验结果

由图6可知，阴性对照未见神经轴突生长。样品浓度在3ng/ml时，神经轴突的生长受到明显的抑制；样品浓度在1ng/ml时，神经轴突的生长最为茂盛，与标准品（鼠颌下腺提取的mNGF，即活性参考品，购自中国食品药品检定研究院）1AU/ml相当；样品浓度稀释到0.11ng/ml和0.03ng/ml时，未见神经轴突的生长。可认为样品的比活为1AU/ng，即1×10⁶AU/mg。

Std1：3AU/ml标准品；Std2：1AU/ml标准品；Std3：0.33AU/ml标准品；Std4：0.11AU/ml标准品；Std5：0.04AU/ml标准品；SP1：3ng/ml瞬时表达上清；SP2：1ng/ml瞬时表达上清；

SP3：0.33ng/ml瞬时表达上清；SP4：0.11ng/ml瞬时表达上清；SP5：0.04ng/ml瞬时表达上清；

Ne：空白对照（转染空载体的细胞48h培养上清）。

2.4小结

通过Western Blot鉴别实验证明瞬时转染48h的细胞培养上清中含有鼠NGF蛋白。镜下观察和细胞计数及台盼蓝染色都显示细胞状态良好，活细胞占总细胞数的比例为99%，活力很高，排除上清中mNGF是细胞裂解后释放出来，证明转染质粒pXL-mNGF的细胞能够分泌表达mNGF，与预期一致。通过ELISA实验测定瞬时转染48h后细胞培养上清中mNGF含量为103ng/ml。

通过鸡胚背根神经节方法进行活性测定，结果表明瞬时转染48h的细胞培养上清中mNGF比活性较高，可达1×10⁶AU/mg，证明表达所得mNGF能够有效的与其受体结合，发挥生物学效应，据此判断表达所得mNGF具有正确的空间结构。

实施例3稳定克隆筛选

3.1主要试剂与仪器

氨甲喋呤（amethopterin,MTX）购自sigma-aldrich公司；嘌呤霉素（Puromycin）购自life technologies公司；葡萄糖溶液购自sigma-aldrich公司。细胞计数仪，型号countess automated cell counter，invitrogen公司。

3.2方法

3.2.1第一阶段筛选

计数转染48h的CHO细胞，计数活细胞和总细胞。配制两种浓度的选择培养基：（1）添加Puromycin至终浓度10μg/mL，MTX至终浓度100n M；（2）添加Puromycin至终浓度20μg/mL，MTX至终浓度200n M。配制完成后，将选择培养基预热至37℃备用，基础培养基为CD Forti^TM CHO培养基中添加8mM的谷氨酰胺。离心收集细胞，用选择培养基重悬，并计数。调整细胞密度至5×10⁵/ml，播种到两个T150（培养面积150cm²）细胞培养瓶中，播种体积为40ml/瓶。第一个T150细胞瓶，标记为T1，其选择培养基配方为：Puromycin终浓度10μg/mL，MTX终浓度100n M；第二个T150细胞瓶，标记为T2，其选择培养基配方为：Puromycin终浓度20μg/mL，MTX终浓度200n M。将两瓶细胞放在CO₂培养箱中静止培养。分别于培养的第2、4、6、8、10、11、12天取T2瓶中细胞计数，计活细胞数占总细胞的比例，简称细胞活力，结果见表3-1和图7。培养的第12天，将细胞转移到125ml的三角摇瓶中，播种密度为3×10⁵/ml，播种体积为30ml。将摇瓶中细胞置于CO₂培养箱中摇床上培养，调节摇床转速为120rpm。在三角摇瓶中进行传代：3天传一代，传代播种密度为3×10⁵个/ml，并添加合适量的Puromycin（分别为10μg/mL或20μg/mL）和MTX（分别为100n M或200n M）。第一阶段筛选的第21天，细胞活力大于85%，活细胞密度大于1×10⁶活细胞数/ml，继续传代。第一阶段筛选第25天，细胞活力为99%，即第一阶段筛选完成。一部分细胞用于冻存，一部分直接播种并进入第二阶段的筛选。

3.2.2第二阶段筛选

将第一阶段筛选出来的细胞进行计数，调整细胞密度至4×10⁵/ml，播种到两个125ml三角摇瓶中，播种体积30ml/瓶。第一瓶：添加Puromycin至终浓度30μg/mL，添加MTX至终浓度500nM。第二瓶：添加Puromycin终浓度50μg/mL，添加MTX至终浓度1000nM。将三角摇瓶置于CO₂培养箱摇床上培养：37℃，8%CO₂，120rpm。细胞传代：3-4天传一代，播种密度3×10⁵个/ml，每次传代时补加适量的Puromycin（分别为30μg/mL或50μg/mL）和MTX（分别为500nM或1000nM）。第二阶段筛选的第18天，计数细胞活力为90%。第二阶段筛选第21天，计数细胞，活力为95%，即第二阶段筛选完成，继续传代至有足够量的细胞用于冻存及单克隆筛选和蛋白产率评估。将部分细胞用于冻存，部分细胞用于播种进行蛋白产率评估，部分细胞用于铺板进行单克隆筛选。

3.2.3蛋白产率评估

将第二阶段筛选完成的细胞播种到125ml三角摇瓶中，培养基为基础培养基，播种密度为3×10⁵/ml，播种体积为30ml。将细胞置于CO₂培养箱中摇床上培养：37℃，8%CO₂，120rpm。每天取样测定细胞密度、细胞活力以及细胞表达上清中NGF含量直到培养的第12天。在第3、5、7天取样后，向培养基中补加葡萄糖继续培养：第3天添加葡萄糖至终浓度4g/L；第5天添加葡萄糖至终浓度4g/L；第7天添加葡萄糖至终浓度6g/L。每天取样进行细胞计数，并离心收集细胞上清用于ELISA含量测定。蛋白产率评估结果见图8。

3.2.4Western Blot

3.3结果

3.3.1第一阶段筛选细胞活力变化趋势图

由图可知，第0到8天细胞活力逐渐下降，第8天时细胞活力降至最低13%，第8天以后细胞活力开始恢复，至第12天时细胞活力恢复至42%。

表3-1筛选时间和对应时间的活细胞比例

3.3.2蛋白产率评估实验结果

表3-2为蛋白产率评估实验的数据结果，图3-2为蛋白评估试验中细胞密度及细胞培养上清中总mNGF浓度随着培养时间变化的折线图。由图可知，第1-6天，细胞密度增加趋势和上清中mNGF浓度增加趋势基本一致；第7-8天细胞密度最高，达9×10⁶/ml，mNGF浓度达13.7μg/ml；第9-12天细胞密度降低；至第12天时，细胞密度已降至4×10⁶/ml，但是mNGF浓度仍然缓慢增加，未见降低趋势。

3.3.3Western Blot实验结果

由图9可知，稳定转染的细胞培养上清能与鼠NGF抗体发生特异性免疫反应，且条带的分子量与理论预期一致，与阳性对照鼠颌下腺提取的NGF一致。

3.4小结

完成两阶段稳定筛选工作，获得稳定转染的混合克隆细胞株。通过Western Blot实验鉴别，稳定转染的混合克隆细胞株表达mNGF。通过ELISA实验测定，连续培养12天的稳定转染混合克隆细胞培养上清中mNGF浓度为14.24μg/ml。

实施例4单克隆筛选

4.1材料

96孔细胞培养板，24孔细胞培养板，6孔细胞培养板，购自康宁公司；50ml无菌离心管，125ml透气盖三角摇瓶，购自康宁公司；一次性无菌加样槽，购自Biologix公司。

4.2方法

4.2.1单克隆铺板筛选

准备40个96孔板。准备5个50ml离心管，作标记：1，2，3，4，5。取细胞悬液，置于离心机中1000rpm，5min离心去上清，用克隆培养基重悬细胞并计数，细胞密度为1.6×10⁶/ml，细胞活力为98%，取适量细胞悬液加入1号管中。分别向2，3，4号管中加入9ml的克隆培养基，向5号管中加入3ml克隆培养基。取1ml细胞悬液到2号管中，拧紧管盖，颠倒混匀；从2号管中取1ml细胞悬液到3号管中，拧紧管盖，颠倒混匀；从3号管中取1ml细胞悬液到4号管中，拧紧管盖，颠倒混匀，即4号管细胞密度为1.6×10³/ml；从4号管中取5ml细胞悬液到5号管中，拧紧管盖，颠倒混匀，则5号管中细胞密度为1×10³/ml。从5号管中取0.2ml细胞悬液到含有39.8ml克隆培养基的离心管中，使得终体积为40ml，则管中细胞密度为5个/ml，即1个/200μl。拧紧管盖，颠倒离心管混匀细胞悬液，将细胞悬液转移到无菌加样槽中。用排枪吸取细胞悬液，以200μl/孔的体积，加到96孔板的中间60个孔中。在96孔板四周的36个边孔中各添加200μl/孔的PBS缓冲液以避免在细胞长时间的培养过程中造成的培养基蒸发。总共铺40个96孔板。将铺好细胞的96孔板置于显微镜下观察，仔细观察每孔中细胞情况，将细胞数为一个的孔作好标记，作为后续单克隆挑选的孔。在镜下观察没有细胞或者有一个以上细胞的孔不作标记，作为废弃的孔。将镜下观察完毕的96孔板放置在CO₂培养箱中静止培养，培养第12天于镜下观察克隆生长情况。在第17或者第18天在镜下观察，观察各克隆的生长情况，不同孔中的克隆生长状况不同，根据细胞密度将克隆分批挑取，密度基本一致的克隆作为同一批，吸取孔中少许培养基用于ELISA检测（仅检测是否为阳性反应）。挑取克隆：准备足够数量的24孔板，每孔中添加0.5ml的克隆生长培养基，预热至37℃。将96孔板中生长起来的单克隆细胞逐孔转移到24孔板中，放置在CO₂培养箱中静止培养。待24孔板中细胞长到合适密度后，将细胞转移到6孔板中，每孔中添加2ml克隆生长培养基。在6孔板中进行传代，传3代左右，分出一部分细胞铺板进行克隆的蛋白表达量评估。将各克隆按照3×10⁵/ml的密度播种3ml到6孔细胞培养板中。将6孔板放在湿盒中连续培养5天。第5天收集6孔板中各孔细胞培养液，离心去细胞取上清进行ELISA含量测定。根据ELISA实验测定的NGF含量，从高到低进行排序，选择表达量较高的单克隆细胞株进行克隆扩大培养，其余单克隆全部扔掉。克隆扩大培养流程如图10所示。待细胞传至125ml摇瓶中时，可进行细胞株冻存，并且再次评价保留的各单克隆株蛋白表达量。播种各株细胞到125ml的三角摇瓶中，播种密度3×10⁵/ml，播种体积30ml，将三角摇瓶放置在CO₂培养箱中摇床上培养，120rpm，8%CO₂，连续培养5天。培养第5天收集细胞培养上清进行ELISA测定，按照测定结果再次对各株细胞进行排序。选取其中一株细胞在1000ml的三角摇瓶中培养，播种密度3×10⁵/ml，播种体积300ml/瓶，连续培养5天用于后续蛋白纯化。其余细胞株冻存于液氮中。

4.2.2计算单克隆率

单克隆效率=显示单克隆生长的孔数/播种的单细胞孔数×100%

4.3结果

单克隆筛选阶段共铺40个96孔板，总计2400孔细胞。铺板后于镜下观察，1036个孔里仅含单个细胞，图11左图为其中一孔中单细胞照片。1036孔单细胞中共有882孔生长起来，单克隆效率为85%，图11右图为其中一孔中单细胞培养12天的照片。

用ELISA方法对96孔板中882孔单克隆细胞培养上清进行测定，有871株细胞为阳性反应。将这871株细胞进行扩大培养至6孔板后，对其细胞培养上清进行ELISA测定，选取表达量最高的20株，分别编号C1#～C20#，将这20株细胞分别经25cm²细胞培养瓶，75cm²细胞培养瓶，125ml三角摇瓶进行扩大培养至足够量后进行冻存。

取细胞株C10#进行后续扩大培养用于纯化及后续研究。该细胞株名称为CHO-S-pXL-C10#，分类命名为中国仓鼠卵巢细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.8305。

4.4小结

铺40个96孔板即2400孔细胞，有1036孔为单个细胞，其中882个孔中单细胞生长起来，单克隆率为85%。

通过ELISA检测，882孔单细胞中有871孔培养上清反应呈阳性，即表达mNGF蛋白。

通过评估mNGF表达量，最终选择20株单克隆细胞留存，依次编号：C1#～C20#。选择细胞株C10#进行扩大培养用于蛋白纯化研究。

实施例5蛋白表达与纯化

5.1材料、试剂和仪器

层析柱，XK16，购自GE Healthcare公司；离子交换填料，SP Sepharose Fast Flow购自GE Healthcare公司；分子筛填料，superdex75pre grade购自GE Healthcare公司。蛋白电泳缓冲液MES SDS Running Buffer，上样bufferLDS Sample Buffer，Novex4-12%Bis-Tris Gel1.0mm10Well，Novex4-12%Bis-Tris Gel1.0mm12Well，预染蛋白Marker Sharp Pre-stained Protein Standard均购自life technologies公司；考马氏亮蓝染色液：考马氏亮蓝R2501g，甲醇200ml，冰醋酸50ml，水250ml；考马氏亮蓝脱色液：量取甲醇400ml，冰醋酸100ml，水500ml混匀。蛋白质纯化系统，AKTA explorer P-900，Amersham Pharmacia Biotech；紫外分光光度计，DU800，美国Beckman公司；蛋白质电泳仪，Novex Mini-Cell，invitrogen公司。

5.2方法

5.2.1细胞培养

将编号为C#10的单克隆细胞株播种到1000ml的三角摇瓶中，密度为3×10⁵/ml，300ml每瓶，共计4瓶，置于CO₂培养箱中摇床上培养，摇床转速为120rpm，连续培养5天，基础培养基为CD Forti^TM CHO培养基中添加8mM的谷氨酰胺。

5.2.2CHO培养液预处理

培养第5天，将摇瓶培养的CHO细胞培养上清全部收集，共1000ml，使用低温冷冻高速离心机离心，转速为12000rpm，4℃离心30min，弃去细胞，取上清。

用离子交换的流动相A（即2.3SPFF离子交换层析中流动相A）稀释上清至2L，调节pH至6.5，使用0.45μm膜过滤。

5.2.3SPFF离子交换层析

配制流动相：

流动相A：10mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠，pH6.5；

流动相B：1mol/L NaCl，10mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠，pH6.5。

将SPFF阳离子交换填料按说明书装入层析柱中，柱体积24ml。将柱子与AKTA Explore100快速液相色谱仪相连，设置流速为10ml/min，检测波长：214nm和280nm。首先，用5个柱体积的1mol/L NaCl溶液再生柱子；然后，用流动相A平衡5个柱体积，至电导率稳定。通过系统泵上样，流速10ml/min，收集穿透峰。上完样后进行洗脱，首先用流动相A洗至基线平，然后按照线性梯度方式洗脱。在洗脱的过程中，根据紫外检测波长吸收情况分管收集，共收集170管，按照顺序作标号标记t1～t170。最终用100%B洗脱，并用1mol/L NaOH清洗柱子，再用20%酒精保存柱子。分别取 t1、t2、t5、t16、t26、t36、t46、t56、t66、t76、t86、t96、t106、t116、t121、t127、t136、t146、t156、t166、t170进行SDS-PAGE电泳鉴定，电泳结果见图14，根据电泳结果，合并管t16～t26中的样品共32ml，用于下一步分子筛层析分离。

5.2.4Superdex75prep grade分子筛层析

配制0.05mol/L的磷酸盐缓冲盐缓冲液，调节pH6.8。将Superdex75prep grade分子筛填料按照说明书装入层析柱中，柱体积111ml。将柱子与AKTA Explore100快速液相色谱仪相连，并用pH6.8，浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲盐缓冲液充分平衡。通过上样环进行上样，上样体积2ml，上样流速1ml/min。上样完毕后开始洗脱，洗脱液为pH6.8，0.05mol/L的磷酸盐缓冲盐缓冲液，洗脱流速为1ml/min，根据紫外吸收情况开始手动分管收集，基线降至初始位置时停止收集目标蛋白。共分离得三个峰，峰1、2、3（见图15），分别对三个峰进行分段收集，共收集260管，收集管依次按照顺序编号T1～T260，其中T1～T75为峰1成分，T76～T175为峰2成分，T176～T260为峰3成分。分别取T11、T21、T31、T41、T51、T61、T71、T81、T91、T101、T111、T121、T125、T130、T135、T140、T145、T150、T155、T160、T165、T170、T180、T190、T200、T210、T220、T230、T240、T250、T260进行SDS-PAGE电泳鉴定，电泳结果见图16，根据电泳结果，合并管T111～T145中的样品共20ml，用于后续理化分析和生物学活性测定。

5.2.5ELISA

ELISA测定收集的细胞上清及纯化终产物的mNGF含量。

5.2.6计算回收率

回收率=纯化终产物中mNGF含量/IL细胞上清中mNGF含量×100%。

5.3结果

5.3.1离子交换层析

5.3.1.1离子交换的过程图

离子交换的过程如图12所示，图中0-175ml之间为流动相A平衡柱子阶段，175-2175ml之间为上样阶段，2175-2550之间为流动相A洗脱阶段，2550-2800ml之间为0%B-100%B线性梯度洗脱阶段，2800ml以后为100%B洗脱阶段。由图可知，流动相A洗脱阶段没有峰，线性洗脱阶段得一个峰。图14为经离子交换纯化后分段收集的电泳结果。由图可知，t16～t26的目的蛋白含量较高，t36～t66阶段主要去除了15kD-20kD以及50-60kD之间的杂蛋白，t86～t116阶段主要去除了分子量特别接近目的蛋白的杂蛋白，t121～t170 阶段电泳未见蛋白。合并t16-t26的蛋白，并浓缩至2ml进行分子筛层析。

5.3.1.2离子交换电泳结果见图13。

图13下方标记为M的泳道为蛋白marker，标记为S1的泳道为准备做离子交换的样品。由图可知，在15-20kD之间存在杂蛋白，其分子量与目的蛋白（介于10-15kD之间）很接近；总蛋白中杂蛋白的含量较高，在30kD-260kD之间都存在杂蛋白，大部分杂蛋白集中在30kD-40kD之间。

5.3.2分子筛层析

5.3.2.1分子筛过程图

分子筛过程见图15，图中-120ml～0ml为平衡柱子阶段，0ml～2ml为上样阶段，2ml处开始进行洗脱。

由图可知，经分子筛层析分离后得三个峰，峰1、2、3。

5.3.2.2分子筛电泳图

图16为经分子筛纯化后分段收集的电泳结果。由图可知，T31～T71同时存在介于30～40kD以及10kD～15kD（分子量与目的条带一致）之间的蛋白；T81～T165目的蛋白纯度较高；T111～T145的目的蛋白浓度较高；T180～T260电泳未见条带（图片未展示）。合并T111-T145的蛋白，进行后续理化分析和生物学活性测定。

1.3ELISA结果及回收率

ELISA测定1L细胞上清中mNGF浓度为8.4μg/ml，含量为8.4mg，纯化终产物20ml，mNGF浓度为31μg/ml，总含量为0.62mg，回收率为7.38%。

5.4小结

通过阳离子交换和分子筛层析对细胞培养上清进行了蛋白纯化，最终纯化得到蛋白0.62mg，回收率7.38%。

实施例6理化分析

6.1试剂与耗材

异硫氰酸苯溶液、三甲胺溶液、三氟乙酸、25%三氟乙酸购自日本岛津公司；乙酸乙脂、氯丁烷、37%乙腈溶液、聚凝胺和玻璃膜，购自日本岛津公司；CEInfinite电极液；CEInfinite IEF溶液；CEInfinite FC分离柱盒（Advanced Electrophoresis Solutions Ltd,Cambridge,Canada).；高效液相色谱柱：TSK-GEL3000swxl（7.8mm*30cm）；反相色谱柱：ACQUITY UPLC BEH300C4；ACQUITY UPLC BEH Glycan column，1.7um；ODS-120T反相C₁₈柱，4.6mm×25cm，5μm；

6.1.2仪器

电泳仪，Novex Mini-Cell，invitrogen公司；蛋白干式转印仪，7-Minute Blotting System，invitrogen公司；凝胶照相及图像分析系统，LAS-3000，日本富士公司；CEInfinite2020紫外吸收全柱检测毛细管电泳仪；氨基酸序列分析仪，PROTEIN SEQUENER PPSQ-21A测序仪，日本岛津公司；HPLC系统：WATERS2695HPLC系统、2489紫外检测器、WATERS MILLENNIUM³²数据管理系统；蛋白/核酸分析仪，DU-800，BECKMAN；超高压液相色谱仪，H-Class，Waters公司；质谱仪，Xevo G2Q-TOF，Waters公司；质谱结果分析软件：Masslynx4.0；Biopharmalynx1.3.2。

6.2方法

6.2.1SDS-PAGE纯度测定

6.2.2SDS-PAGE分子量测定

6.2.3紫外光谱扫描

用分光光度计对纯化所得mNGF进行紫外全波长扫描。

6.2.4Western Blot

6.2.5HPLC纯度测定

配制洗脱液：分别称取43.67g十二水合磷酸氢二钠、19.98g二水合磷酸二氢钠、8.466g氯化钠，用适量超纯水溶解，并定容至1000ml，调节pH至6.8，用0.45μm水系过滤膜过滤备用。设定色谱条件为：流速0.8ml/min，上样量60μl，柱温为室温，样品池温度为12℃，检测波长214nm。用洗脱液以0.8ml/min流速平衡高效液相系统至基线平稳。取60μl样品上柱，以0.8ml/min流速洗脱，同时在214nm波长下记录色谱图及相关数据，记录时间为40min。测定结果见图19。

6.2.6全柱成像毛细管电泳等电点测定

IEF溶液150μl添加至样品液中，加入pI4.14、pI6.61和pI9.77三个pI Marker各1μl。聚焦程序为1000V/1分钟;2000V/1分钟;3000V/4分钟，记录聚焦过程，6分钟完成全部分析过程。

6.2.7N-末端氨基酸序列测定

6.2.7.1SDS-PAGE电泳：非还原SDS-PAGE。

6.2.7.2转膜。

6.2.7.3考马斯亮蓝染色与脱色

将转好的PVDF膜取下，浸于考马斯亮蓝染液中染色1分钟。将膜取出，用高纯水稍加淋洗，置于脱色液中脱色至完全褪去背景色，蛋白条带显现。将膜取出，自然晾干，小心剪取包含目的条带的部分膜，备测序用。

6.2.7.4N-末端测序

运用Edman降解法进行N-末端序列测定。将包含目的蛋白的PVDF膜放在N-末端测序仪的相关装置中。运行测序程序进行序列测定。

6.2.8质谱分子量测定

（1）高效液相参数设置

流动相A：0.1%TFA水溶液；流动相B：0.8%TFA乙腈溶液；流速：0.2ml/min，进样量：10μl，检测波长：220nm，柱温：50℃；按表6-1梯度洗脱，并采集图谱。

表6-1洗脱条件

时间（分钟）	流动相A（％）	流动相B（％）
			0	98	2
5	98	2
			125	50	50
140.00	5	95
			140.01	98	2
155.00	98	2

（2）质谱参数设置：

选用ESI离子源，正离子和分辨率模式；毛细管电压：3000V；锥孔电压：40V；离子源温度：100℃；脱溶剂气体温度：200℃；碰撞能量：6V：锥孔气体流速：50L/h；脱溶剂气体流速：600L/h；扫描范围100-2500m/z。其它参数按照默认设置。

Lock Spray选用GFP；扫描周期：10s；碰撞能量：6V。

6.3结果

6.3.1SDS-PAGE纯度

SDS-PAGE纯度测定结果见图17。PAGE胶经凝胶成像系统扫描，有三条带：1，2，3；其中3为目的条带，占95.33%比例，即样品的电泳纯度为95.33%。

6.3.2SDS-PAGE分子量

样品的SDS-PAGE分子量测定结果见图18，其中条带1-12为marker的条带，条带S为样品的条带，由结果可知样品分子量为13.76kD，见表6-2。

表6-2

6.3.3紫外光谱扫描

紫外光谱扫描：对蛋白进行2000nm～400nm光谱扫描，结果见图19，由图可知重组mNGF蛋白在280nm处有最大吸收。

6.3.4Western Blot

Western Blot鉴别实验结果见图20，图中条带1为阳性对照鼠颌下腺提取NGF，条带2为样品，3为分子量marker。由图可知，样品和对照品结果一致，均在10kD和15kD之间出现单一免疫印迹条带。

1阳性对照（鼠颌下腺提取NGF,购自中国食品药品检定研究院）；2本发明的重组mNGF；3蛋白分子量Marker。

6.3.5HPLC纯度

HPLC-SEC纯度测定结果见图21。共检测到5个峰，其中峰2为主峰，即目的蛋白mNGF，由表6-3中积分结果可知mNGF纯度为98.6%。

表6-3

6.3.6全柱成像毛细管电泳等电点测定

全柱成像毛细管电泳等电点测定结果见图22。图中给出的是样品在整个分离柱（50毫米）于不同时间的聚焦过程。y轴是不同时间样品的吸收（和浓度相关）。实验选择了pI4.41，pI6.61和pI9.77三个pIMarker作为样品pI测定的参考物，目标蛋白质的pI测定为9.11。

6.3.7N-末端氨基酸序列测定结果

N-末端测序结果见组图23，组图23中共有15张图，每张图中间红色英文字母代表氨基酸残基，右上角的红色阿拉伯数字表示氨基酸顺序。由结果可知，测得N-末端15个氨基酸序列为：SSTHPVFHMGEFSVC，与理论序列完全一致。

6.3.8质谱分子量测定结果

质谱分子量测定结果见图24和图25，图24为多电荷质谱图，图25为分子量测定结果图。由结果可知质谱实测分子量为13465.00Da，理论分子量13465.23Da，二者相差0.23Da，相对误差为0.002%。

6.4小结

对纯化所得mNGF样品进行了理化分析。SDS-PAGE纯度95.3%，HPLC纯度98.6%，；SDS-PAGE分子量13.73kD，质谱分子量13465.00Da，与理论分子量13465.23Da相差0.23Da，相对误差为0.002%；N末端序列为SSTHPVFHMGEFSVC，与理论序列一致；等电点为9.11；Western Blot鉴别试验阳性，且和对照品一致。

实施例7生物学活性测定

（一）TF-1细胞/MTS法测定NGF活性

7.A.1材料

RPMI1640培养液：GIBCO72400120，4℃条件下保存。基础培养液：量取胎牛血清100ml，加入RPMI1640培养液900ml中，4℃保存。完全培养液：基础培养液添加鼠神经生长因子（苏肽生15000AU）至终浓度为每1ml含25ng。PBS缓冲液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g加水溶解并稀释至1000ml，经121℃，15分钟灭菌。置于玻璃瓶中室温保存。使用期限不得超过12个月。MTS溶液：Promega5430，4℃避光保存。样品：实施例5纯化所得重组mNGF。对照品为鼠颌下腺提取mNGF（也叫苏肽生，购自舒泰神（北京）生物制药股份有限公司）。标准品：重组人神经生长因子标准品，93/556,购自NIBSC。

7.A.2方法

取适量Eppendorf管、96孔细胞培养板等做相应标记。将实验所用溶液预温至37℃。取足量TF-1细胞培养物1000rpm离心5分钟，弃去上清，收集TF-1细胞。加入10ml RPMI1640培养液1000rpm离心5分钟后弃去上清，如此洗2次后重悬于基础培养液配成每1ml含5.0×10⁴个细胞的细胞悬液，置于37℃、5%二氧化碳条件下备用。取鼠神经生长因子标准品复溶后，用基础培养液预稀释至每1ml含100U。将样品和供试品用基础培养液预稀释成约每1ml含100U，每步稀释最大不超过10倍。在96孔细胞培养板中,自A行至H行进行3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔，每孔分别留100μl溶液，弃去孔中多余溶液。向加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中加入细胞悬液，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养72小时。

（第三天）每孔加入MTS溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养4小时。入酶标仪，于波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。将该实验重复做三次。

7.A.3结果

图26为本次试验三次活性测定结果之一，以该结果为例，图中有三条曲线，其中红色为标准品量效关系曲线，蓝色为对照品（鼠颌下腺提取mNGF）量效关系曲线，绿色为样品（rmNGF）量效关系曲线。

按照公式（如下）计算标本效价：

由图下方的计算结果可知，标本1即对照品（鼠颌下腺提取mNGF）测定效价为271696U/ml,标本2即样品（rmNGF）测定效价为69295U/ml。

三次实验活性测定结果汇总见表7-1、7-2，由表中数据可知样品（rmNGF）三次测定的均值为51560U/ml,比活性为1663237U/m个；对照品（鼠颌下腺提取mNGF）三次测定的均值为309857U/ml,比活性为1589012U/mg，二者比活性基本一致。

表7-1ELISA测定蛋白含量结果

表7-2TF-1/MTS活性测定结果

（二）鸡胚背根神经节法测定NGF活性

7.B.1材料与方法

样品预稀释7500倍后进行3倍梯度（1×，3×，9×，27×，81×）稀释进行活性测定。活性参考品（为鼠颌下腺提取NGF，购自中国食品药品检定研究院）预稀释200倍后，再进行3倍梯度（1×，3×，9×，27×，81×）稀释进行活性测定。阳性对照品（简称对照品）为鼠颌下腺提取mNGF（也叫苏肽生，购自舒泰神（北京）生物制药股份有限公司），阳性对照品预稀释40000倍后进行3倍梯度（1×，3×，9×，27×，81×）稀释进行活性测定。阴性对照为DMEM培养基。

7.B.2结果见图27和表7-3。

表7-3鸡胚背根神经节活性测定

7.B.3小结

应用TF-1细胞/MTS测定样品活性，以NIBSC重组人NGF（93/556）为标准品，测得比活为1.7×10⁶U/mg，与对照品市售的鼠颌下腺提取mNGF比活性1.6×10⁶U/mg基本一致。

应用鸡胚背根神经节法测定样品活性，以中国食品药品检定研究院鼠NGF活性参考品为标准，测得比活性为7.3×10⁵AU/mg，与对照品市售的鼠颌下腺提取NGF比活性6.1×10⁵AU/mg基本一致。

附：鸡胚背根神经节法测定NGF活性的材料和方法

1.材料

鼠尾胶原，本科室保存。制备方法为：

所有物品经严格消毒后方可使用，配制0.1%醋酸溶液，经10磅10分钟高压蒸汽灭菌后备用。取250克体重大白鼠一只，从尾部切断鼠尾，置75%酒精中浸泡30分钟。无菌条件下将鼠尾切成1.5厘米左右的小段，剥去毛皮，抽出尾键置平皿中。剪碎尾键，浸入150毫升的醋酸溶液，置4℃冰箱，并不时振摇。四十八小时后，移入灭菌离心管中，以4000转/分钟速度离心30分钟（最好在4℃条件）吸取上清液分装入小瓶，-20℃冰箱保存。残渣加入到40毫升醋酸溶液，24小时后，再次离心，上清液分装入小瓶，低温冰冻保存。

10%FCS DMEM培养液，无血清DMEM培养液；

鼠颌下腺提取NGF参考品购自中国食品药品检定研究院；

8日龄鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

2.方法

取高压灭菌后的玻璃细胞瓶（每个样品需5个细胞瓶），将冻存的鼠尾胶原融化后，按每个细胞瓶取50μl，用弯头玻棒均匀涂布于瓶底的里1/3处，去掉瓶盖，置于超净台中自然干燥两天。向每个细胞瓶中加入10%FCS DMEM培养液2ml，盖上瓶盖，浸泡过夜。实验时，将每瓶中的培养液倒入灭菌的瓶皿中，将解剖神经节的器械浸入平皿内，于解剖镜下取8日龄鸡胚的背根神经节，接种于涂有鼠尾胶原的培养瓶中，每瓶种3个神经节，于37℃下保温2小时。样品和参考品的预稀释：将参考品预稀释到3AU/ml，样品稀释到3ng/ml。样品和参考品用无血清DMEM培养液作3倍倍比稀释，每个样品作5个稀释度，加入培养瓶中，同时设立空白对照。于37℃、5%CO2孵箱中培养24小时，在显微镜下观察结果，根据神经节突起生长的不同程度作分级记录（用＃、+、++、+++、++++表示），其中神经节不长为阴性，以“—”表示；神经节突起生长但较稀疏，以“+”表示；明显生长以“++”表示；生长较好以“+++”表示；生长最好以“++++”表示；出现过量抑制以“＃”表示。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

参考文献

[1]Lin B,Pirrung M C,Deng L,et al.Neuroprotection by small molecule activators of the nerve growth factor receptor[J].J Pharmacol Exp Ther,2007,322(1):59-69.

[2]Pakzaban P,Geller A I,Isacson O.Effect of exogenous nerve growth factor on neurotoxicity of and neuronal gene delivery by a herpes simplex amplicon vector in the rat brain[J].Hum Gene Ther,1994,5(8):987-95.

[3]Capsoni S,Covaceuszach S,Ugolini G,et al.Delivery of NGF to the brain:intranasal versus ocular administration in anti-NGF transgenic mice[J].J Alzheimers Dis,2009,16(2):371-88.

[4]Bradbury J.Hope for AD with NGF gene-therapy trial[J].Lancet Neurol,2005,4(6):335.

[5]Tuszynski M H,Thal L,Pay M,et al.A phase1clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease[J].Nat Med,2005,11(5):551-5.

[6]Lambiase A,Tirassa P,Micera A,et al.Pharmacokinetics of conjunctivally applied nerve growth factor in the retina and optic nerve of adult rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46(10):3800-6.

[7]Mesulam M M,Mufson E J,Levey A I,et al.Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain:cytochemistry and cortical connections of the septal area,diagonal band nuclei,nucleus basalis(substantia innominata),and hypothalamus in the rhesus monkey[J].J Comp Neurol,1983,214(2):170-97.

[8]Mufson E J,Bothwell M,Hersh L B,et al.Nerve growth factor receptor immunoreactive profiles in the normal,aged human basal forebrain:colocalization with cholinergic neurons[J].J Comp Neurol,1989,285(2):196-217.

[9]Mandel R J.CERE-110,an adeno-associated virus-based gene delivery vector expressing human nerve growth factor for the treatment of Alzheimer's disease[J].Curr Opin Mol Ther,2010,12(2):240-7.

[10]McArthur J C,Yiannoutsos C,Simpson D M,et al.A phase II trial of nerve growth factor for sensory neuropathy associated with HIV infection.AIDS Clinical Trials Group Team291[J].Neurology,2000,54(5):1080-8.

[11]Apfel S C,Schwartz S,Adornato B T,et al.Efficacy and safety of recombinant human nerve growth factor in patients with diabetic polyneuropathy:A randomized controlled trial.rhNGF Clinical Investigator Group[J].JAMA,2000,284(17):2215-21.

Claims

1.重组细胞，其含有重组载体，所述重组载体含有鼠神经生长因子基因的核酸序列，所述载体为Freedom^TM pCHO1.0，所述细胞为CHO细胞，所述重组细胞为经过氨甲喋呤和嘌呤霉素加压筛选培养后的细胞，所述加压筛选为两个阶段的加压筛选，

所述第一阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为100～200nM；第二阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为500～1000nM；

所述第一阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为10～20μg/mL；第二阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为30～50μg/mL。

2.权利要求1的重组细胞，其中所述重组载体为pXL-mNGF。

3.权利要求1的重组细胞，其为经过无血清培养基驯化培养后的细胞。

4.权利要求3的重组细胞，其中所述无血清培养基为CD Forti^TMCHO。

5.权利要求1-4任一项的重组细胞，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.8305。

6.权利要求1-5任一项的重组细胞用于制备或生产鼠神经生长因子的用途。

7.鼠神经生长因子的纯化方法，其包括以下步骤：

1)培养表达鼠神经生长因子的重组细胞，收获细胞培养上清；

2)将细胞培养上清用离子交换层析进行纯化，得到纯化后的样品；

3)将步骤2)获得的样品用分子筛层析进行纯化，得到纯化的鼠神经生长因子；

所述表达鼠神经生长因子的重组细胞为权利要求1-5任一项的重组细胞。