CN101613394B - 鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠神经生长因子(NGF)的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法。本发明中的鼠神经生长因子的制备方法在传统工艺中加入100KD和5KD超滤膜过滤和巴氏消毒工艺，可有效过滤大分子病毒，同时通过巴氏消毒法进一步灭活伪狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、脑心肌炎(EMC)病毒等潜在病毒，既不引入任何外来有机溶剂和去污剂等污染物，又能保持鼠神经生长因子的高纯度、高比活及高安全性。

Description

鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法

技术领域

本发明涉及一种鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法，尤其涉及一种使用新型的病毒灭活法制备鼠神经生长因子的方法。

背景技术

鼠神经生长因子(NGF)是从小鼠颌下腺中分离纯化的神经生长因子的冻干制品，其传统制备工艺为：将小鼠颌下腺组织匀浆，得匀浆上清液；然后将匀浆上清液离心、去沉淀后，上离子交换层析I，收集流穿液；流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液；酸解上清液上离子交换层析，收集目标蛋白峰，即得神经生长因子原液；再加入赋形剂甘露醇和稳定剂人血白蛋白，经除菌过滤后，分装，冻干得制品。

由于鼠神经生长因子来源于小鼠，因而该制品存在生物安全性问题，主要是鼠源性病毒对原材料颌下腺的污染或潜在性污染。为了保证该制品的安全性，在控制供体鼠饲养环境和原材料颌下腺质量的同时，研究生产过程中去除或灭活病毒工艺对制品的安全性起着十分重要的作用。

对于血液制品来说，国内外较成熟的病毒灭活/去除工艺方法有巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品尤其是规模化生产量的鼠神经生长因子的病毒灭活工艺，国内外报道很少。

有机溶剂/去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。但该方法对非脂包膜病毒没有去除作用，并且人为引入了有机溶剂和去污剂，而彻底清除有机溶剂和去污剂有很大难度，因而加大了产品污染的风险；纳米膜过滤法主要利用病毒颗粒和蛋白分子的大小差异通过纳米级的滤膜把病毒除去，适用于分子量较小(直径较小)的蛋白，不适于较大直径蛋白制品的病毒去除，且纳米膜价格昂贵；光化学法是利用某些光敏剂对病毒表面及病毒核酸结构有强烈的亲和性，在适当波长的光照下易激活，从而通过光化学作用破坏与其接触的病毒结构，但是光化学法对神经生长因子蛋白的活性损伤较大；巴氏消毒法属热力处理灭活病毒方法，即通过热量使病毒蛋白变性，破坏病毒结构进而灭活病毒，对脂质膜病毒及非脂质膜病毒均能有效去除，临床记录显示：巴氏消毒法是目前病毒灭活方法中最可靠的方法。但热力也常使蛋白制品变性或生物学活性降低。如何能既保持神经生长因子活性，又能彻底地去除病毒，这是目前尚待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种鼠神经生长因子的制备方法，以解决现有技术中的上述问题。本发明中的鼠神经生长因子的制备方法在传统工艺中加入100KD和5KD超滤膜过滤和巴氏消毒工艺，可有效过滤大分子病毒，同时通过巴氏消毒法进一步灭活伪狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、脑心肌炎(EMC)病毒等潜在病毒，既不引入任何外来有机溶剂和去污剂等污染物，又能保持鼠神经生长因子注射液的高纯度、高比活及高安全性。

本发明还有一个目的是提供一种注射用鼠神经生长因子的制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种鼠神经生长因子的制备方法，将小鼠颌下腺组织匀浆，反复冻融破碎细胞，离心去沉淀，得匀浆上清液；匀浆上清液去除细胞碎片后上阳离子交换层析I，收集流穿液，流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液；将酸解上清液上阳离子交换层析II，收集目标蛋白峰，得蛋白收集液，其特征在于：将蛋白收集液进行超滤结合巴氏消毒法去除病毒，再经超滤浓缩，除菌过滤后制得。

前述鼠神经生长因子的制备方法中，将蛋白收集液进行100KD超滤膜过滤后，将100KD超滤膜滤下液用注射用水或注射用生理盐水稀释至1～40μg/ml，在55～65℃水浴中恒温1～12小时，然后经5KD超滤膜和除菌过滤制得神经生长因子原液。

100KD超滤膜过滤可去除液体中的大分子病毒；在55～65℃水浴中恒温1～12小时，可有效灭活伪狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、脑心肌炎(EMC)病毒等潜在病毒，并保持所制得的鼠神经生长因子的生物学活性；5KD超滤膜过滤可在浓缩样品的同时转换缓冲液。

前述鼠神经生长因子的制备方法中，所述100KD超滤膜滤下液优选用注射用水或注射用生理盐水稀释至5～30μg/ml，特别优选用注射用生理盐水稀释至20μg/ml。

前述鼠神经生长因子的制备方法中，所述20μg/ml 100KD超滤膜滤下液优选在60℃±1℃水浴中恒温10小时，从而可最大程度地保持鼠神经生长因子生物学活性。

前述鼠神经生长因子的制备方法中，将阳离子交换层析II经Tris-HCl流洗后用Tris-HCl-NaCl溶液洗脱，收集目标蛋白峰，得蛋白收集液。

前述鼠神经生长因子的制备方法中，阳离子交换层析I流穿液优选用pH4.0的醋酸缓冲液进行酸化解离10分钟。

前述鼠神经生长因子的制备方法中，阳离子交换层析柱I的介质为CM-Cellulose 52或CM-Sepharose FF，阳离子交换层析柱II的介质为CM-Cellulose 52或CM-SepharoseFF。

一种注射用鼠神经生长因子的制备方法，在注射用生理盐水中加入前述方法中制得的神经生长因子原液中加入赋形剂和稳定剂，除菌过滤后分装冻干得制品。

前述注射用鼠神经生长因子的制备方法中，赋形剂优选为甘露醇，稳定剂优选为人血白蛋白。

本发明中的新型的鼠神经生长因子的制备方法在传统工艺中加入100KD、5KD超滤膜过滤和巴氏消毒工艺，可有效过滤大分子病毒，同时通过巴氏消毒法进一步灭活伪狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、脑心肌炎(EMC)病毒等潜在病毒，从而在不引入任何外来有机溶剂和去污剂等污染物的基础上，保持鼠神经生长因子的生物学活性，得到高纯度、高比活及高安全性的鼠神经生长因子产品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

将小鼠颌下腺组织匀浆，反复冻融破碎细胞，离心去沉淀，得匀浆上清液；匀浆上清液去除细胞碎片后上CM-Cellulose 52柱，收集流穿液，流穿液进行透析、用pH4.0的醋酸缓冲液进行酸化解离10分钟、离心，得酸解上清液；将酸解上清液上CM-Cellulose52柱，经Tris-HCl流洗后用Tris-HCl-NaCl溶液洗脱收集目标蛋白峰，得蛋白收集液。

用100KD超滤膜对蛋白收集液进行超滤，以去除大分子病毒；100KD超滤膜滤下液用注射用水稀释至5μg/ml，在60℃水浴中恒温10小时，然后经5KD超滤膜超滤及过滤除菌，即得鼠神经生长因子原液；鼠神经生长因子的检测数据如表1所示。

实施例2

与实施例1的不同之处在于：将100KD超滤膜滤下液用注射用水稀释至10μg/ml，在55℃水浴中恒温12小时，然后经5KD超滤膜超滤及过滤除菌，即得鼠神经生长因子原液。鼠神经生长因子的检测数据如表1所示。

实施例3

与实施例1的不同之处在于：将100KD超滤膜滤下液用注射用生理盐水稀释至20μg/ml，在60℃水浴中恒温10小时，然后经5KD超滤膜超滤及过滤除菌，即得鼠神经生长因子原液。鼠神经生长因子的检测数据如表1所示。

实施例4

与实施例1的不同之处在于：将100KD超滤膜滤下液用注射用生理盐水稀释至30μg/ml，在65℃水浴中恒温1小时，然后经5KD超滤膜超滤及除菌过滤，即得鼠神经生长因子原液。鼠神经生长因子的检测数据如表1所示。

实施例5

用注射用水配制生理盐水，加入鼠神经生长因子原液至终浓度为18μg/ml或30μg/ml，并加入检定合格的人血白蛋白使其终含量为1％，甘露醇终浓度为5％，经混匀、除菌过滤后，分装、冻干，得注射用鼠神经生长因子冻干制品。

本申请人对实施例1～4中制得的鼠神经生长因子(中间品)巴氏消毒法灭活病毒前后的质量指标进行测定对比，结果表明在5～30μg/ml浓度下，鼠神经生长因子经55℃～65℃处理1～12小时后，其pH值、蛋白含量、比活性和紫外扫描光谱均维持稳定。而当浓度大于40μg/ml的鼠神经生长因子经过55℃～65℃处理10小时后，其蛋白含量、比活性、紫外扫描光谱均发生较大变化或偏离。

表1鼠神经生长因子(中间品)巴氏消毒法灭活病毒后主要参数测定结果

中国药品生物制品检定所在实施例3巴氏消毒法灭活病毒前加入指示病毒伪狂犬病毒(PRV)，对病毒灭活效果做了验证，病毒滴定方法采用96孔细胞病变法，计算按Karber法，验证结果如表2所示：

表2巴氏法灭活鼠神经生长因子中PRV指示病毒的效果

注：本试验样本中病毒最低检测限为-0.50LgTCID₅₀/0.1ml。

验证结果：三批鼠神经生长因子采用实施例3中的生产工艺，在59～61℃进行10小时加热处理后，可灭活所加入指示病毒PRV分别为：S20040201批≥6.50LgTCID₅₀/0.1ml，S20040202批≥6.62LgTCID₅₀/0.1ml，S20040203批≥6.88LgTCID₅₀/0.1ml。

中国药品生物制品检定所在实施例3巴氏消毒法灭活病毒前加入指示病毒Sindbis病毒，对病毒灭活效果做了验证，病毒滴定用BHK-21细胞，方法采用6孔盘蚀斑法。验证结果如表3所示：

表3巴氏法灭活鼠神经生长因子中Sindbis指示病毒的效果

验证结果：三批鼠神经生长因子采用实施例3中的生产工艺，在59～61℃进行10小时加热处理后，可灭活所加入指示病毒Sindbis分别为：S20040201批≥6.49LgPFU/ml，S20040202批≥6.45LgPFU/ml，S20040203批≥6.60LgPFU/ml。

中国药品生物制品检定所在实施例3巴氏消毒法灭活病毒前加入指示病毒脑心肌炎(EMC)病毒，对病毒灭活效果做了验证，病毒滴定用VERO细胞，96孔微量病变法。验证结果如表4所示：

表4巴氏法灭活鼠神经生长因子中EMC指示病毒的效果

验证结果：三批鼠神经生长因子采用实施例3中的生产工艺，在59～61℃进行10小时加热处理后，可灭活所加入指示病毒EMC分别为：S20040201批≥4.25LgTCID₅₀/0.1ml，S20040202批≥5.00LgTCID₅₀/0.1ml，S20040203批≥5.13LgTCID₅₀/0.1ml。

病毒灭活验证结论：根据中国药品生物制品检定所检定的结果，可以认为本方法是有效的鼠源病毒去除方法。

为有效保证注射用鼠神经生长因子的质量及其安全性，按本发明实施例3工艺连续生产的三批鼠神经生长因子原液，S04、S05、S06，检测结果见表5；按本发明实施例5工艺连续生产三批注射用鼠神经生长因子产品，批号20040504、20040505、20040506，委托中国药品生物制品检定所进行检测，检测结果见表6：

表5三批鼠神经生长因子原液检测结果汇总表

检验项目	标准规定	S04	S05	S06
					蛋白含量测定	Lowry法	0.3355mg/ml	0.3441mg/ml	0.3473mg/ml
活性测定	鸡胚背神经节培养法	340000AU/ml	340000AU/ml	340000AU/ml
					比活性计算	≥500,000AU/mg	1010000AU/mg	988000AU/mg	979000AU/mg
纯度测定	≥98％	99.9％	99.5％	99.7％
					分子量测定	13.5±10％	13.11KD	13.20KD	13.47KD
等电点测定	8.9-9.3之间	符合规定	符合规定	符合规定
					鉴别实验	/	符合规定	符合规定	符合规定
紫外光谱	280nm±3nm	279nm	280nm	280nm
					鼠源病毒	/	符合规定	符合规定	符合规定
热原	/	符合规定	符合规定	符合规定

表6  三批注射用鼠神经生长因子成品检测结果汇总表

结果表明鼠神经生长因子原液和鼠神经生长因子冻干制品全部质量指标均符合标准规定。

上述三批注射用鼠神经生长因子成品经稳定性考察，结果显示用本方法制备的注射用鼠神经生长因子在2～8℃条件下保存42个月质量稳定。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鼠神经生长因子的制备方法，将小鼠颌下腺组织匀浆，反复冻融破碎细胞，离心去沉淀，得匀浆上清液；匀浆上清液去除细胞碎片后上阳离子交换层析I，收集流穿液，流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液；将酸解上清液上阳离子交换层析II，经Tris-HCl流洗后用Tris-HCl-NaCl溶液洗脱；收集目标蛋白峰，得蛋白收集液，蛋白收集液进行100KD超滤膜过滤后，将100KD超滤膜滤下液用注射用水或注射用生理盐水稀释至1～40μg/ml，在55～65℃水浴中恒温1～12小时，然后经5KD超滤膜和除菌过滤制得神经生长因子原液，其中，所述的阳离子交换层析柱I的介质为CM-Cellulose 52或CM-Sepharose FF，阳离子交换层析柱II的介质为CM-Cellulose52或CM-Sepharose FF。

2.根据权利要求1中所述的鼠神经生长因子的制备方法，其特征在于：100KD超滤膜滤下液用注射用水或注射用生理盐水稀释至5～30μg/ml。

3.根据权利要求2中所述的鼠神经生长因子的制备方法，其特征在于：100KD超滤膜滤下液用注射用生理盐水稀释至20μg/ml。

4.根据权利要求3中所述的鼠神经生长因子的制备方法，其特征在于：所述20μg/ml100KD超滤膜滤下液在60℃±1℃水浴中恒温10小时。

5.根据权利要求1中所述的鼠神经生长因子的制备方法，其特征在于：阳离子交换层析I流穿液用pH4.0的醋酸缓冲液进行酸化解离10分钟。

6.一种注射用鼠神经生长因子的制备方法，在注射用生理盐水中加入权利要求1～5中任一项制得的鼠神经生长因子原液中加入赋形剂和稳定剂，除菌过滤后分装、冻干得制品。

7.根据权利要求6中所述的注射用鼠神经生长因子的制备方法，其特征在于：赋形剂为甘露醇，稳定剂为人血白蛋白。