ES2893239T3 - Composición de factor de crecimiento nervioso y polvo de inyección - Google Patents

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Abstract

Composición de factor de crecimiento nervioso, caracterizada porque la composición consiste en un factor de crecimiento nervioso, un estabilizador, un tampón de pH y agua; siendo dicho estabilizador al menos uno de sorbitol, dextrano, trehalosa, rafinosa y manitol, y en la que la concentración en masa-volumen de dicho factor de crecimiento nervioso es de 10 mg/ml-100 mg/ml; la concentración en masa-volumen de dicho estabilizador es de 30 mg/ml-120 mg/ml; el tampón de pH mantiene dicha composición de factor de crecimiento nervioso a un valor de pH de 6,8 a 7,0; el disolvente es agua.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de factor de crecimiento nervioso y polvo de inyección
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición de factor de crecimiento nervioso y a un polvo de inyección, y pertenece al campo de la biología farmacéutica.
Técnica anterior
El factor de crecimiento nervioso (NGF) es un regulador del crecimiento de células nerviosas con las funciones biológicas dobles de nutrición neuronal y estimulación del crecimiento de neuritas, y tiene un efecto regulador importante en el desarrollo, la diferenciación, el crecimiento, la regeneración y la expresión de propiedades funcionales de neuronas centrales y periféricas. El NGF contiene tres subunidades, a, p, y, en el que la subunidad p es una región activa, formada por dos cadenas sencillas compuestas por 118 aminoácidos unidas mediante un enlace no covalente. En 1953, la científica italiana Levi-Montalcini descubrió el NGF y ganó el Premio Nobel. En la actualidad, hay varios productos de NGF que han aparecido en el mercado en todo el mundo y se usan de manera clínica principalmente para el tratamiento de la displasia neurológica, incluyendo ambliopía, neuroma, diversas lesiones nerviosas y enfermedades neurológicas y otras enfermedades.
El NGF es similar a otros fármacos proteicos; dado que la proteína tiene una semivida corta, la conformación espacial de la proteína cambia fácilmente y, por tanto, da como resultado la desnaturalización de la proteína cuando se expone a condiciones extremas de temperatura y humedad, o por influencia de factores físicos y químicos; la proteína desnaturalizada perderá su actividad biológica original; además, debido a que la proteína a menudo tiende a adherirse a una superficie sólida, en el proceso de llenado, parte de la proteína se adherirá a la pared interior del recipiente, lo que provocará la pérdida de los principios activos. Para garantizar su actividad biológica, es necesario añadir un estabilizador para impedir la pérdida de la actividad biológica.
En general, la albúmina se usa ampliamente en diversos productos biológicos como un excelente estabilizador y como agente formador de torta. Sin embargo, dado que la albúmina se deriva principalmente de sangre humana, sangre de placenta y la sangre puede portar algunos de los componentes desconocidos que no son fáciles de detectar, la composición del NGF como preparación no estéril que se esteriliza puede contaminarse fácilmente; al mismo tiempo, las aplicaciones amplias y a largo plazo de la albúmina también son propensas a las limitaciones del aporte de sangre y los costes de producción; de nuevo, en la determinación del contenido de los productos intermedios y la preparación del producto terminado, la albúmina puede interferir con una cantidad relativamente pequeña de NGF y, por tanto, afectar a la gestión de la calidad del producto. Por tanto, para evitar los problemas anteriores, es necesario encontrar una composición de NGF libre de albúmina estable.
El documento WO 95/05845 A1 da a conocer formulaciones farmacéuticas acuosas estables de factor de crecimiento nervioso (NGF) humano en disoluciones isotónicas acuosas, tamponadas para mantener el pH desde aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente 6,0 y que contienen opcionalmente un portador. El documento US 2008/0112953 A1 proporciona una formulación que incluye un tampón con un pH desde aproximadamente 4,5­ 7,0, al menos un excipiente que comprende un azúcar o un poliol y una cantidad eficaz de un anticuerpo terapéutico. Los tipos de polipéptidos a modo de ejemplo aplicables para su uso en las formulaciones descritas incluyen todos los tipos de polipéptidos terapéuticos incluyendo, por ejemplo, factores de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento nervioso regulado por el desarrollo VGF, factores neurotróficos, factor neurotrófico NNT-1 y otros polipéptidos.
Sumario de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición de factor de crecimiento nervioso y un polvo de inyección que no sólo proteja al factor de crecimiento nervioso derivado de ratón (mNGF), sino que también pueda garantizar la buena estabilidad del factor de crecimiento nervioso derivado de ser humano (hNGF) y del factor de crecimiento nervioso humano recombinante (rhNGF) en los procesos de preparación, transporte y almacenamiento, y que tenga una mejor seguridad farmacológica clínica y capacidad de control de calidad.
La presente invención proporciona una composición de factor de crecimiento nervioso que consiste en un factor de crecimiento nervioso, un estabilizador, un tampón de pH y agua;
siendo dicho estabilizador al menos uno de sorbitol, dextrano, trehalosa, rafinosa y manitol, y en la que
la concentración en masa-volumen de dicho factor de crecimiento nervioso es de 10 |ig/ml-100 |ig/ml;
la concentración en masa-volumen de dicho estabilizador es de 30 mg/ml-120 mg/ml;
el tampón de pH mantiene dicha composición de factor de crecimiento nervioso a un valor de pH de 6,8 a 7,0; el disolvente es agua.
La adición de un estabilizador en la composición de factor de crecimiento nervioso anterior puede evitar o reducir la agregación y despolimerización de proteínas provocadas en el proceso de preparación o almacenamiento, y el término “estabilizador” se refiere a una sustancia que impide que el principio activo se agregue o despolimerice en disolución acuosa, y además de la función de estabilidad, el estabilizador también puede usarse como agente de soporte para mejorar la conformabilidad del producto, sin excluir otras funciones;
en la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, preferiblemente, la concentración en masa-volumen de dicho estabilizador es de 70 mg/ml-120 mg/ml, y más preferiblemente, la concentración en masa-volumen de dicho estabilizador es de 70 mg/ml;
en la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, dicho estabilizador puede ser específicamente uno cualquiera de los siguientes 1) a 8): 1) sorbitol y manitol, 2) sorbitol, dextrano y manitol, 3) trehalosa y manosa, 4) rafinosa y manitol, 5) sorbitol, 6) trehalosa, 7) sorbitol, rafinosa y manitol, 8) dextrano y manitol.
En la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, dicho factor de crecimiento nervioso es un regulador del crecimiento de células nerviosas con las funciones biológicas dobles de nutrición neuronal y estimulación del crecimiento de neuritas, y tiene un efecto regulador importante en el desarrollo, la diferenciación, el crecimiento, la regeneración y la expresión de propiedades funcionales de las neuronas centrales y periféricas;
en la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, preferiblemente, la concentración en masa-volumen de dicho factor de crecimiento nervioso es de 40 |ig/ml-60 |ig/ml, preferiblemente, la concentración en masa-volumen de dicho factor de crecimiento nervioso es de 50 |ig/ml-60 |ig/ml, más preferiblemente, la concentración en masavolumen de dicho factor de crecimiento nervioso es de 60 |ig/ml;
en la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, dicho factor de crecimiento nervioso es un factor de crecimiento nervioso derivado de ratón (mNGF), un factor de crecimiento nervioso derivado de ser humano (hNGF) o un factor de crecimiento nervioso humano recombinante (rhNGF).
En la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, para garantizar que la composición tenga la mayor actividad biológica, generalmente es necesario controlar un intervalo de pH óptimo. El intervalo de pH óptimo para esta estabilidad debe determinarse en el momento de selección de la formulación, habitualmente usando una prueba de factores de influencia (iluminación, alta temperatura, alta humedad), pruebas de estabilidad en condiciones aceleradas y a largo plazo y otros métodos. Después de la determinación de la formulación, la composición en el proceso de producción y almacenamiento debe mantenerse en su intervalo de pH óptimo. Dado que el tampón tiene una buena capacidad de tamponamiento, la estabilidad relativa del pH del producto puede mantenerse en un determinado intervalo; por tanto, a menudo se añade un tampón para el control del valor del pH en la formulación; en la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, la concentración molar de dicho tampón de pH es de 10 mM-50 mM, preferiblemente, la concentración molar de dicho tampón de pH es de 20 mM-30 mM, y más preferiblemente, la concentración molar de dicho tampón de pH es de 25 mM;
en la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, preferiblemente, el valor de pH de dicha composición de factor de crecimiento nervioso es de 6,81-6,87, más preferiblemente, el valor de pH de dicha composición de factor de crecimiento nervioso es de 6,81;
dicho tampón de pH es al menos uno de un fosfato, un citrato, un acetato, un clorhidrato de histidina y un clorhidrato de arginina, y puede ser específicamente uno cualquiera de los siguientes 1)-6): 1) un fosfato, 2) un citrato, 3) un acetato, 4) un clorhidrato de histidina, 5) un clorhidrato de arginina y 6) un citrato y clorhidrato de arginina, en la que la razón molar del citrato con respecto a clorhidrato de arginina en 6) es de 3:2.
En la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, dicha agua es agua para inyección.
En la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, la concentración de cada componente puede ser una cualquiera de las siguientes 1) a 15):
1) el factor de crecimiento nervioso: 10-50 |ig/ml, el estabilizador: 30-64,5 mg/ml, el tampón de pH: 10 mM-25 mM; 2) el factor de crecimiento nervioso: 60-100 |ig/ml, el estabilizador: 55-70 mg/ml, el tampón de pH: 25 mM-50 mM; 3) el factor de crecimiento nervioso: 40-80 |ig/ml, el estabilizador: 40-65 mg/ml, el tampón de pH: 20 mM-30 mM; 4) el factor de crecimiento nervioso: 40-80 |ig/ml, el estabilizador: 60-80 mg/ml, el tampón de pH: 20 mM-30 mM; 5) el factor de crecimiento nervioso: 40-80 |ig/ml, el estabilizador: 64,5-120 mg/ml, el tampón de pH: 20 mM-30 mM; 6) el factor de crecimiento nervioso: 40-60 |ig/ml, el estabilizador: 70-120 mg/ml, el tampón de pH: 20 mM-30 mM; 7) el factor de crecimiento nervioso: 10 |ig/ml, el estabilizador: 30 mg/ml, el tampón de pH: 10 mM;
8) el factor de crecimiento nervioso: 40 |ig/ml, el estabilizador: 40 mg/ml, el tampón de pH: 20 mM;
9) el factor de crecimiento nervioso: 50 |ig/ml, el estabilizador: 55 mg/ml, el tampón de pH: 25 mM;
10) el factor de crecimiento nervioso: 60 |ig/ml, el estabilizador: 80 mg/ml, el tampón de pH: 30 mM;
11) el factor de crecimiento nervioso: 80 |ig/ml, el estabilizador: 64,5 mg/ml, el tampón de pH: 50 mM;
12) el factor de crecimiento nervioso: 100 |ig/ml, el estabilizador: 70 mg/ml, el tampón de pH: 50 mM;
13) el factor de crecimiento nervioso: 100 |ig/ml, el estabilizador: 80 mg/ml, el tampón de pH: 50 mM;
14) el factor de crecimiento nervioso: 100 |ig/ml, el estabilizador: 120 mg/ml, el tampón de pH: 50 mM;
15) el factor de crecimiento nervioso: 60 |ig/ml, el estabilizador: 70 mg/ml, el tampón de pH: 25 mM.
En la composición de factor de crecimiento nervioso anterior, dicha composición de factor de crecimiento nervioso se mantiene específicamente a un valor de pH de 6,80-7,00, 6,80, 6,81, 6,83, 6,84, 6,85, 6,87, 6,90, 6,92 ó 7,00.
La presente invención proporciona además un método para preparar un polvo de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso, que comprende la etapa de: liofilizar la composición de factor de crecimiento nervioso anterior para obtener el polvo de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso.
La presente invención también proporciona un polvo de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso para administración por inyección.
En el polvo de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso anterior, el contenido de agua de dicho polvo de inyección puede ser del 1,0%-3,0%, preferiblemente del 1,0%-2,8%, específicamente del 1,1%, el 1,2%, el 1,3%, el 1,6%, el 1,7%, el 2,6% o el 2,8%; el valor de pH de dicho polvo de inyección puede ser de 6,82-7,08, preferiblemente de 6,87-7,08, específicamente de 6,82, 6,85, 6,87, 6,96, 7,02, 7,03 ó 7,05.
El uso de las composiciones de factor de crecimiento nervioso anteriores en el tratamiento de una lesión nerviosa o la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión nerviosa también está dentro del alcance de la presente invención. Dicha composición de factor de crecimiento nervioso puede ser específicamente un polvo de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso. La lesión nerviosa puede ser una lesión del nervio óptico, y la causa de la lesión puede ser una lesión por pelea, un accidente de coche, una lesión por golpe físico o una lesión ocular por explosivo.
La presente invención proporciona además un método de tratamiento de una lesión nerviosa que comprende la etapa de: administrar una cantidad eficaz de una composición de factor de crecimiento nervioso a un paciente con la lesión nerviosa. Dicha composición de factor de crecimiento nervioso puede ser específicamente un polvo de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso. La administración puede ser específicamente una inyección intramuscular. La lesión nerviosa puede ser una lesión del nervio óptico, y la causa de la lesión puede ser una lesión por pelea, un accidente de coche, una lesión por golpe físico o una lesión ocular por explosivo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la curva de cambio del contenido promedio de NGF a lo largo del tiempo en las composiciones de NGF y los polvos de inyección preparados en los ejemplos y la preparación de referencia, en condiciones aceleradas (25°C, HR del 60 10%), en la que -1 representa los polvos de inyección y -2 representa las composiciones.
La figura 2 muestra la curva de cambio de la actividad promedio a lo largo del tiempo de las composiciones de NGF y los polvos de inyección preparados en los ejemplos y la preparación de referencia, en condiciones aceleradas (25°C, HR del 60 10%), en la que -1 representa los polvos de inyección y -2 representa las composiciones.
La figura 3 muestra la curva de cambio del contenido promedio de NGF a lo largo del tiempo en las composiciones de NGF y los polvos de inyección preparados en los ejemplos y la preparación de referencia, en condiciones de estabilidad a largo plazo (6 2°C), en la que -1 representa los polvos de inyección y -2 representa las composiciones.
La figura 4 muestra la curva de cambio de la actividad promedio a lo largo del tiempo de las composiciones de NGF y los polvos de inyección preparados en los ejemplos y la preparación de referencia, en condiciones de estabilidad a largo plazo (6 2°C), en la que -1 representa los polvos de inyección y -2 representa las composiciones.
Descripción detallada de las realizaciones
Los métodos experimentales usados en los siguientes ejemplos son métodos convencionales, a menos que se especifique de otro modo.
Los materiales, reactivos y similares usados en los siguientes ejemplos están disponibles comercialmente, a menos que se especifique de otro modo.
Las disoluciones madre de mNGF y hNGF usadas en los siguientes ejemplos se suministran por Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd., la disolución madre de rhNGF se suministra por Sino Biological Inc. y el resto de los excipientes son todos de calidad para inyección, a menos que se especifique de otro modo.
Con el fin de encontrar un sustituto para la albúmina como estabilizador para el NGF, en la presente invención se han llevado a cabo una gran cantidad de experimentos exploratorios, en los que se usan sorbitol, dextrano, trehalosa, rafinosa y manitol como estabilizador del presente producto, para preparar los diversos polvos de inyección estériles de composición de NGF liofilizada, y se determinan la humedad, el pH, la presión osmótica, el contenido y la actividad del producto terminado después de la liofilización.
Ejemplo 1. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesa una cantidad de formulación de un fosfato según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añade una cantidad de formulación de trehalosa y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de hNGF, se ajusta el pH a pH 6,84 tal como se muestra en la tabla 1 con NaOH o ácido fosfórico, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 |im en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de hNGF de aproximadamente 60 |ig/ml.
La composición de hNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 0. 03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para la inyección de hNGF, es decir, un polvo de inyección de hNGF.
Ejemplo 2. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesa una cantidad de formulación de un clorhidrato de arginina según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añaden cantidades de formulación de sorbitol, dextrano y manitol y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de hNGF, se ajusta el pH a pH 6,80 tal como se muestra en la tabla 1 con arginina o HCl, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 |im en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de hNGF de aproximadamente 40 |ig/ml.
La composición de hNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 0,03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para la inyección de hNGF, es decir, un polvo de inyección de hNGF.
Ejemplo 3. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesa una cantidad de formulación de un acetato según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añaden cantidades de formulación de trehalosa y manitol y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de rhNGF, se ajusta el pH a pH 6,87 tal como se muestra en la tabla 1 con NaOH o ácido acético, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 |im en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de rhNGF de aproximadamente 50 |ig/ml.
La composición de rhNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 0. 03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para la inyección de rhNGF, es decir, un polvo de inyección de rhNGF.
Ejemplo 4. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesa una cantidad de formulación de un clorhidrato de histidina según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añaden cantidades de formulación de rafinosa y manitol y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de mNGF, se ajusta el pH a pH 6,85 tal como se muestra en la tabla 1 con histidina o HCl, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 |im en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de mNGF de aproximadamente 10 |ig/ml.
La composición de mNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 0,03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para inyección de mNGF, es decir, un polvo de inyección de mNGF.
Ejemplo 5. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesan cantidades de formulación de un citrato y un clorhidrato de arginina según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añade una cantidad de formulación de sorbitol y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de hNGF, se ajusta el pH a pH 6,92 tal como se muestra en la tabla 1 con NaOH o ácido cítrico, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 |im en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de hNGF de aproximadamente 50 |ig/ml.
La composición de hNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 0,03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para la inyección de hNGF.
Ejemplo 6. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesa una cantidad de formulación de un citrato según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añaden cantidades de formulación de sorbitol, trehalosa y manitol y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de hNGF, se ajusta el pH a pH 6,81 tal como se muestra en la tabla 1 con NaOH o ácido cítrico, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 |im en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de hNGF de aproximadamente 60 |ig/ml.
La composición de hNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 0,03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para la inyección de hNGF, es decir, un polvo de inyección de hNGF.
Ejemplo 7. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesa una cantidad de formulación de un acetato según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añaden cantidades de formulación de sorbitol, rafinosa y manitol y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de mNGF, se ajusta el pH a pH 7,00 tal como se muestra en la tabla 1 con NaOH o ácido acético, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 |im en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de mNGF de aproximadamente 50 |ig/ml.
La composición de mNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 0,03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para inyección de mNGF, es decir, un polvo de inyección de mNGF.
Ejemplo 8. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesa una cantidad de formulación de un citrato según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añaden cantidades de formulación de sorbitol y manitol y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de rhNGF, se ajusta el pH a pH 6,90 tal como se muestra en la tabla 1 con NaOH o ácido cítrico, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 |im en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de rhNGF de aproximadamente 100 |ig/ml.
La composición de rhNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 ± 0. 03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para la inyección de rhNGF, es decir, un polvo de inyección de rhNGF.
Ejemplo 9. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesa una cantidad de formulación de un clorhidrato de histidina según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añaden cantidades de formulación de dextrano y manitol y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de hNGF, se ajusta el pH a pH 6,81 tal como se muestra en la tabla 1 con histidina o HCl, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 ^m en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de hNGF de aproximadamente 80 p,g/ml.
La composición de hNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 ± 0,03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para la inyección de hNGF, es decir, un polvo de inyección de hNGF.
Ejemplo 10. Preparación de la composición de NGF y el polvo de inyección
La composición de NGF y el polvo de inyección se preparan tal como sigue:
Se pesa una cantidad de formulación de un fosfato según la composición de formulación en la tabla 1, se añade una cantidad apropiada de agua para inyección y se agita hasta la disolución completa, entonces se añaden cantidades de formulación de trehalosa y manitol y se agita hasta la disolución completa, se añade una disolución madre de hNGF, se ajusta el pH a pH 6,83 tal como se muestra en la tabla 1 con NaOH o ácido fosfórico, se añade agua para inyección hasta el volumen de la escala, después de haberse mezclado uniformemente, se filtra la mezcla a través de una membrana de microfiltración de 0,22 ^m en un recipiente estéril para preparar una composición que tiene una concentración de hNGF de aproximadamente 50 p,g/ml.
La composición de hNGF anterior se subenvasa en un frasco de inyección de vidrio de borosilicato a 0,63 ± 0,03 ml/frasco para preparar una muestra de composición de NGF. La muestra se liofiliza, para preparar un polvo estéril para la inyección de hNGF, es decir, un polvo de inyección de hNGF.
Tabla 1. Las cantidades de componentes en los ejemplos 1-10
Figure imgf000007_0001
Ejemplo 11. Prueba de rendimiento de las composiciones de NGF preparadas en los ejemplos 3, 6 y 7 y los polvos de inyección de los ejemplos 1-10
(1) Prueba de aspecto, humedad, presión osmótica, pH, contenido y actividad
Se observan las composiciones de NGF preparadas en los ejemplos 3, 6 y 7, los polvos de inyección de composición de NGF preparados en los ejemplos 1-10 y una preparación de referencia (factor de crecimiento nervioso de ratón para inyección, nombre comercial: Sutaisheng, fabricado por Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd.) para comprobar los aspectos, respectivamente, y se determinan sus humedades, presiones osmóticas, pH, contenidos y actividades. El método de determinación del contenido de NGF se lleva a cabo según el método descrito en el ejemplo 1 en la solicitud de patente n.° 200510130348.3, titulada “Method for Determining the Content of Nerve Growth Factor”. El método de prueba de la actividad se determina mediante un método celular, y el método detallado de operación se lleva a cabo según el método del ejemplo 1 en la publicación de patente n.° CN 103376248A, titulada “Method for Quantitative Determination of Nerve Growth Factor Activity”. Los resultados experimentales se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Resultados de prueba de los elementos de prueba en los ejemplos
Figure imgf000008_0001
Tal como puede observarse a partir de la tabla 2, los índices de las composiciones de NGF y los polvos de inyección preparados en la presente invención cumplen todos ellos los requisitos de las normas de calidad.
(2) Detección del intervalo de pH estable
Según la composición de formulación del ejemplo 3, se formulan 3 composiciones de NGF, en las que la cantidad total de acetato se mantiene constante y se ajusta la razón relativa de ácido acético con respecto a acetato de sodio, de modo que los valores de pH de las composiciones de NGF en disolución intermedia son de 6,0, 6,8 y 7,4, respectivamente, entonces se introducen en frascos de penicilina, respectivamente, y se liofilizan para preparar polvo de inyección estéril. Se toman muestras, y se añade una cantidad apropiada de agua para inyección estéril para formular las disoluciones. En condiciones de temperatura ambiente, se observa el aspecto de las disoluciones y se determina el valor de pH, el contenido y la actividad a las 0, 4, 8, 12 y 24 horas, respectivamente. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 3. Resultados de la detección del intervalo de pH estable de las composiciones de NGF
Figure imgf000009_0002
A partir de los datos de la tabla anterior puede observarse que, después de que las tres composiciones de NGF con diferentes valores de pH se colocan a temperatura ambiente durante 24 h, los índices no tienen cambios significativos con respecto a las 0 h, todos cumplen los requisitos de las normas de calidad, lo que indica que en las condiciones de temperatura ambiente, las disoluciones de muestra pueden permanecer estables en el plazo de 24 h en un intervalo de pH de 6,0-7,4, más preferiblemente a pH 6,8.
(3) Prueba de estabilidad
A. Prueba de estabilidad en condiciones aceleradas
Según los requisitos de las “Technical Guidelines for Research on Stability of Biological Products”, se examinan las muestras de la preparación de referencia (Sutaisheng), las composiciones de NGF preparadas en los ejemplos 3, 6 y 7 y los polvos de inyección de composición de NGF preparados en los ejemplos para determinar la estabilidad en condiciones aceleradas durante 0-6 meses en condiciones de 25°C, HR del 60 ± 10%. Las muestras se observan para comprobar los aspectos, y se determinan las humedades, las presiones osmóticas, los valores de pH, los contenidos y las actividades. Los resultados se muestran en la tabla 4 y la figura 1 (la curva de cambio del contenido promedio a lo largo del tiempo) y la figura 2 (la curva de cambio de la actividad promedio a lo largo del tiempo).
Tabla 4. Resultados de la prueba de estabilidad en condiciones aceleradas de las composiciones de NGF, los polvos de inyección y la preparación de referencia
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Figure imgf000010_0001
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Tal como puede observarse a partir de la figura 1, el contenido promedio de NGF en la preparación de referencia, las composiciones de NGF preparadas en los ejemplos 3, 6 y 7 y los polvos de inyección de composición de NGF preparados en los ejemplos presentan una tendencia a la reducción a lo largo del tiempo en condiciones aceleradas (25°C, HR del 60 10%), en las que la velocidad de reducción en el contenido promedio de NGF en la preparación de referencia es significativamente mayor que la de los ejemplos de la presente invención. Tal como puede observarse a partir de los resultados en la tabla 4, los aspectos, las humedades, los valores de pH y las presiones osmóticas de las muestras no cambian significativamente en las condiciones aceleradas (25°C, HR del 60 10%) durante 6 meses, pero el contenido de la preparación de referencia se reduce en aproximadamente el 9,8%, las tasas de reducción en el contenido de los polvos de inyección de composición de NGF de los ejemplos 1 a 10 son del 1,7%, el 3,9%, el 2,2%, el 4,4%, el 6,4%, el 0,9%, el 3,6%, el 3,4%, el 4,6%, el 1,2%, respectivamente, y las tasas de reducción en el contenido de las composiciones de NGF de los ejemplos 3, 6 y 7 son del 2,6%, el 1,5% y el 4,3%, respectivamente, lo que indica que la estabilidad de los ejemplos de la presente invención es superior a la de la preparación de referencia en las condiciones aceleradas, particularmente la estabilidad del ejemplo 1, el ejemplo 3, el ejemplo 6 y el ejemplo 10 es significativamente superior a la de la preparación de referencia, y la estabilidad de los polvos de inyección de composición es superior a la de las composiciones.
Tal como puede observarse a partir de la figura 2, la actividad promedio de NGF en la preparación de referencia, las composiciones de NGF preparadas en los ejemplos 3, 6 y 7 y las composiciones de NGF y los polvos de inyección de composición de NGF preparados en los ejemplos presentan una tendencia a la reducción a lo largo del tiempo en condiciones aceleradas (25°C, HR del 60 10%), en las que la actividad de la preparación de referencia se reduce rápidamente después de dos meses de condiciones aceleradas. Tal como puede observarse a partir de los resultados en la tabla 4, los aspectos, las humedades, los valores de pH y las presiones osmóticas de las muestras no cambian significativamente en condiciones aceleradas (25°C, HR del 60 10%) durante 6 meses, pero la actividad de la preparación de referencia se reduce en el 10,4%, las tasas de reducción en las actividades de los polvos de inyección de composición de NGF de los ejemplos 1 a 10 son del 4,5%, el 5,8%, el 5,4%, el 6,9%, el 8,0%, el 3,6%, el 6,6%, el 6,0%, el 6,0% y el 4,9%, respectivamente, y las tasas de reducción en las actividades de las composiciones de NGF de los ejemplos 3, 6 y 7 son del 6,4%, el 4,3% y el 7,6%, respectivamente, lo que indica que la estabilidad de los ejemplos de la presente invención es superior a la de la preparación de referencia en las condiciones aceleradas, particularmente la estabilidad del ejemplo 1, el ejemplo 3, el ejemplo 6 y el ejemplo 10 es significativamente superior a la de la preparación de referencia, y la estabilidad de los polvos de inyección de composición es superior a la de las composiciones.
B. Prueba de estabilidad a largo plazo
Según los requisitos de las “Technical Guidelines for Research on Stability de Biological Products”, se examinan las muestras de la preparación de referencia (Sutaisheng), las composiciones de NGF preparadas en los ejemplos 3, 6 y 7 y los polvos de inyección de composición de NGF preparados en los ejemplos para determinar la estabilidad a largo plazo durante 0-12 meses en condiciones de 6 2°C. Las muestras se observan para comprobar los aspectos, y se determinan las humedades, las presiones osmóticas, los valores de pH, los contenidos y las actividades. Los resultados se muestran en la tabla 5 y la figura 3 (la curva de cambio del contenido promedio a lo largo del tiempo) y la figura 4 (la curva de cambio de la actividad promedio a lo largo del tiempo).
Tabla 5. Resultados de la prueba de estabilidad a largo plazo de las composiciones de NGF, los polvos de inyección y la preparación de referencia
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Tal como puede observarse a partir de la figura 3, el contenido promedio de NGF en la preparación de referencia, las composiciones de NGF preparadas en los ejemplos 3, 6 y 7 y los polvos de inyección de composición de NGF preparados en los ejemplos presentan una tendencia a la reducción a lo largo del tiempo en condiciones de estabilidad a largo plazo (6 2°C), en las que la velocidad de reducción en el contenido promedio de NGF en la preparación de referencia es significativamente mayor que la de los ejemplos de la presente invención. Tal como puede observarse a partir de los resultados en la tabla 5, los aspectos, las humedades, los valores de pH y las presiones osmóticas de las muestras no cambian significativamente en condiciones a largo plazo durante 12 meses, pero el contenido de la preparación de referencia se reduce en aproximadamente el 5,6%, las tasas de reducción en el contenido de los polvos de inyección de composición de NGF de los ejemplos 1 a 10 son del 1,3%, el 2,8%, el 1,8%, el 3,8%, el 4,8%, el 0,7%, el 2,9%, el 2,9%, el 4,2% y el 0,9%, respectivamente, y las tasas de reducción en el contenido de las composiciones de NGF de los ejemplos 3, 6 y 7 son del 2,0%, el 0,9% y el 3,3%, respectivamente, lo que indica que la estabilidad de los ejemplos de la presente invención es superior a la de la preparación de referencia en las condiciones a largo plazo, particularmente la estabilidad del ejemplo 1, el ejemplo 3, el ejemplo 6 y el ejemplo 10 es significativamente superior a la del preparación de referencia, y la estabilidad de los polvos de inyección es superior a la de las composiciones.
Tal como puede observarse a partir de la figura 4, la actividad promedio de NGF en la preparación de referencia, las composiciones de NGF preparadas en los ejemplos 3, 6 y 7 y las composiciones de NGF y los polvos de inyección de composición de NGF preparados en los ejemplos presentan una tendencia a la reducción a lo largo del tiempo en condiciones de estabilidad a largo plazo (6 2°C), en las que la velocidad de reducción en la actividad de la preparación de referencia es mayor que la de los ejemplos de la presente invención. Tal como puede observarse a partir de los resultados en la tabla 5, los aspectos, las humedades, los valores de pH y las presiones osmóticas de las muestras no cambian significativamente en condiciones a largo plazo durante 12 meses, pero la actividad de la preparación de referencia se reduce en el 5,8%, las tasas de reducción en las actividades de los polvos de inyección de composición de NGF de los ejemplos 1 a 10 son del 3,6%, el 4,8%, el 3,8%, el 5,1%, el 5,0%, el 3,3%, el 4,8%, el 4,8%, el 4,7% y el 3,7%, respectivamente, y las tasas de reducción en las actividades de las composiciones de NGF de los ejemplos 3, 6 y 7 son del 4,6%, el 3,9% y el 6,2%, respectivamente, lo que indica que la estabilidad de los ejemplos de la presente invención es superior a la de la preparación de referencia en las condiciones a largo plazo, particularmente la estabilidad del ejemplo 1, el ejemplo 3, el ejemplo 6 y el ejemplo 10 es significativamente superior a la de la preparación de referencia, y la estabilidad de los polvos de inyección es superior a la de las composiciones.
(4) Evaluación clínica
Un total de 271 pacientes con lesión del nervio óptico se someten a un ensayo clínico de 12 semanas mediante el diseño de estudio clínico controlado multicéntrico no aleatorizado; todos los sujetos tienen 14 años o más y pueden comunicarse bien con los investigadores, comprender y cumplir con los requisitos del ensayo clínico y firmar un consentimiento informado.
Estado del sujeto: 14 años o más.
Sexo: hombre o mujer.
Origen de los sujetos: se incluyeron 409 pacientes con lesión del nervio óptico provocada por diversas causas procedentes de diversas unidades de investigación oftálmica.
Causa de la lesión: 136 casos de lesión por pelea (136 ojos), 152 casos de accidente de coche (152 ojos), 73 casos de lesión por golpe físico (73 ojos), 49 casos de lesión ocular por explosivo (49 ojos). No todos los casos van acompañados por rotura del globo ocular ni daño provocado por la compresión del nervio óptico debido a fracturas orbitarias.
Método de tratamiento: se le inyecta al grupo de tratamiento la preparación de referencia y las composiciones de NGF de la presente invención mediante inyección intramuscular una vez al día con 30 |ig cada uno, y todos los casos reciben administración de manera continua durante 12 semanas. El grupo de placebo se trata con un control negativo (sin principio activo, siendo los excipientes restantes iguales que los de las composiciones de NGF).
El grupo de tratamiento comprende 271 casos (271 ojos), con edades de 18 a 63 años, y la edad promedio de 34,2 años; 189 hombres (189 ojos), 82 mujeres (82 ojos); 147 ojos derechos, 124 ojos izquierdos. El grupo de placebo comprende 138 pacientes (138 ojos), con edades de 13-55 años, y la edad promedio de 33,9 años, 96 hombres (96 ojos), 42 mujeres (42 ojos), 45 ojos derechos y 93 ojos izquierdos.
Diseño de los grupos: los grupos se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 6. Grupos del ensayo clínico y número de sujetos
Figure imgf000016_0002
Nota: para el grupo de composición de NGF en la tabla anterior, se usa la composición de factor de crecimiento nervioso preparada en el ejemplo 6, la misma que a continuación.
Evaluación de reacciones adversas clínicas comunes: el grupo de placebo, el grupo de preparación de referencia y el grupo de composición de NGF reciben la administración, respectivamente, y se observan para determinar los síntomas y la incidencia de las reacciones adversas en cada grupo.
Tabla 7. Reacciones adversas clínicas comunes al NGF
Figure imgf000016_0001
Nota: * indica que hay una diferencia significativa en comparación con el grupo de placebo (P < 0,05), # indica que hay una diferencia significativa en comparación con el grupo de preparación de referencia (P < 0,05).
A partir de la tabla anterior puede observarse que, en comparación con el grupo de placebo, las principales reacciones adversas de las composiciones preparadas en la presente invención son dolor local y mareo, y en comparación con el grupo de preparación de referencia, las composiciones de NGF preparadas en la presente invención pueden aliviar significativamente las reacciones adversas, tales como dolor local, urticaria, mareo, etc. Eficacia farmacológica clínica: el grupo de placebo, el grupo de preparación de referencia y el grupo de composición de NGF reciben la administración, respectivamente, y se observan para determinar la eficacia clínica en cada grupo. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 8. Comparación de la eficacia clínica de NGF
Figure imgf000016_0003
La eficacia clínica en la tabla anterior se evalúa usando los siguientes criterios evaluación de la eficacia clínica: ® Recuperación: la visión se recupera a 1,0 o más, y desaparecen las manchas oscuras en el campo visual central; @ Eficaz: la visión aumenta en 4 líneas o más, se reducen las manchas oscuras en el campo visual central o las manchas oscuras absolutas se convierten en manchas oscuras relativas;
@ Alivio: la visión aumenta en 2 líneas o más, y no hay cambios en el campo visual;
@ Ineficaz: la visión y el campo visual son los mismos que antes del tratamiento, o disminuyen.
A partir de la tabla anterior puede observarse que, en comparación con el grupo de placebo, las composiciones de NGF y los polvos de inyección de la presente invención pueden ser eficaces en el tratamiento de la lesión del nervio óptico provocada por diversas causas, tienen la eficacia integral del tratamiento de lesión del nervio óptico que es superior a la del grupo de preparación de referencia, pueden reducir significativamente la incidencia de las reacciones adversas y tienen un buen efecto terapéutico clínico.
Aplicación industrial
Las composiciones de factor de crecimiento nervioso y los polvos de inyección preparados en la presente invención conservan una buena estabilidad en los procesos de preparación, transporte y almacenamiento: (1) en el proceso de preparación: después de almacenar los polvos de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso preparados en la presente invención a temperatura ambiente durante 24 horas, el contenido y la actividad del NGF en ellos no tienen ningún cambio significativo; (2) en comparación con la preparación de referencia, en los procesos convencionales (6 2°C) de transporte y almacenamiento, los polvos de inyección de composición de NGF de la presente invención tienen una reducción del contenido de NGF de sólo el 0,7%-4,8% y una reducción de actividad de sólo el 3,3%-5,0%, después de almacenarse durante 12 meses, teniendo de ese modo una excelente estabilidad. Las composiciones de factor de crecimiento nervioso y los polvos de inyección preparados en la presente invención pueden reducir significativamente la incidencia de las reacciones adversas en el ensayo clínico, tienen un buen efecto terapéutico clínico y tienen una mejor seguridad farmacológica clínica y capacidad de control de calidad en comparación con la preparación de referencia existente.
La presente invención tiene los siguientes efectos beneficiosos:
(1) Las composiciones de factor de crecimiento nervioso y los polvos de inyección de la presente invención pueden evitar el riesgo potencial que resulta de los virus u otros componentes desconocidos portados en la albúmina al usar un hidrato de carbono o un alcohol de azúcar en lugar de albúmina como estabilizador.
(2) En las composiciones de factor de crecimiento nervioso y los polvos de inyección de la presente invención, además del factor de crecimiento nervioso como principio activo, sólo están contenidos dos componentes de un estabilizador y un tampón de pH, sin el tensioactivo, agente de soporte y similares convencionales; por tanto, tales composiciones tienen una composición sencilla, mejor seguridad y una incidencia significativamente reducida de las reacciones adversas; y las composiciones tienen componentes definidos, son fácilmente cualitativas y cuantitativas y el estabilizador usado en ellas tiene una alta pureza, una fuente amplia y una fácil producción en masa a largo plazo, lo que facilita el control del coste y la mejora de la calidad del producto.
(3) Las composiciones de factor de crecimiento nervioso y los polvos de inyección de la presente invención no sólo tienen un efecto protector sobre el factor de crecimiento nervioso de ratón (mNGF), sino que también pueden garantizar la buena estabilidad del factor de crecimiento nervioso humano (hNGF) y del factor de crecimiento nervioso humano recombinante (abreviado como rhNGF) en los procesos de preparación, transporte y almacenamiento, y tienen una mejor seguridad farmacológica clínica y capacidad de control de calidad.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Composición de factor de crecimiento nervioso, caracterizada porque la composición consiste en un factor de crecimiento nervioso, un estabilizador, un tampón de pH y agua;
    siendo dicho estabilizador al menos uno de sorbitol, dextrano, trehalosa, rafinosa y manitol, y en la que la concentración en masa-volumen de dicho factor de crecimiento nervioso es de 10 |ig/ml-100 |ig/ml; la concentración en masa-volumen de dicho estabilizador es de 30 mg/ml-120 mg/ml;
    el tampón de pH mantiene dicha composición de factor de crecimiento nervioso a un valor de pH de 6,8 a 7,0;
    el disolvente es agua.
  2. 2. Composición de factor de crecimiento nervioso según la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración en masa-volumen de dicho estabilizador es de 70 mg/ml-120 mg/ml.
  3. 3. Composición de factor de crecimiento nervioso según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la concentración en masa-volumen de dicho factor de crecimiento nervioso es de 40 |ig/ml-60 |ig/ml, preferiblemente, la concentración en masa-volumen de dicho factor de crecimiento nervioso es de 50 |ig/ml-60 |ig/ml.
  4. 4. Composición de factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicho factor de crecimiento nervioso es un factor de crecimiento nervioso derivado de ratón, un factor de crecimiento nervioso derivado de ser humano o un factor de crecimiento nervioso humano recombinante.
  5. 5. Composición de factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la concentración molar de dicho tampón de pH es de 10 mM-50 mM, preferiblemente, la concentración molar de dicho tampón de pH es de 20 mM-30 mM.
  6. 6. Composición de factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicho tampón de pH es al menos uno de un fosfato, un citrato, un acetato, un clorhidrato de histidina y un clorhidrato de arginina.
  7. 7. Composición de factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque en dicha composición de factor de crecimiento nervioso:
    la concentración en masa-volumen de dicho factor de crecimiento nervioso es de 60 |ig/ml;
    la concentración en masa-volumen de dicho estabilizador es de 80 mg/ml;
    la concentración molar de dicho tampón de pH es de 30 mM.
  8. 8. Método para la preparación de un polvo de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso, caracterizado por: liofilizar la composición de factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para obtener dicho polvo de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso.
  9. 9. Polvo de inyección de composición de factor de crecimiento nervioso preparado mediante el método según la reivindicación 8.
  10. 10. Composición de factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de una lesión nerviosa, en la que la lesión nerviosa puede ser una lesión del nervio óptico.
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