CN113244380B

CN113244380B - 一种温度敏感型凝胶损伤修复制剂及其应用

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Publication number: CN113244380B
Application number: CN202110722585.8A
Authority: CN
Inventors: 于在林; 富岩; 杨小楠; 富俞淞; 万园; 侯琼; 朱涛; 陈颖
Original assignee: Beijing Meifuyuan Biomedical Technology Co ltd; Fortunerock Biotechnology Beijing Co ltd; Tianjin Sinobiotech Ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Beijing Meifuyuan Biomedical Technology Co ltd; Fortune Rock China Co ltd; Tianjin Sinobiotech Ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113244380A; WO2023272813A1; EP4289442A1; US20240156917A1

Abstract

本发明提供了一种温度敏感型凝胶损伤修复制剂及其应用，属于生物医药制剂技术领域。所述制剂包括0.01~5mg/mL rHSA/EGF、1.9%~2.6%甘氨酸、3.9%~6.2%泊洛沙姆188、16.3%~18.2%泊洛沙姆407和0.5~100mM PB缓冲液。rHSA/EGF作为活性成分，利于提高修复眼角膜眼结膜损伤，预防、缓解和治疗干眼症，同时引导皮肤细胞的生长和损伤的皮肤修复；而辅料不仅能够保证活性成分的结构稳定性，保持药物活性，同时使制剂在0~35℃下维持水剂型，在≥35℃时呈凝胶状，使该制剂在施药局部留存更长时间，更易于活性成分缓慢释放，从而提高活性成分的利用率，缩短用药时间，提高修复速度。

Description

一种温度敏感型凝胶损伤修复制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药制剂技术领域，具体涉及一种温度敏感型凝胶损伤修复制剂及其应用。

背景技术

干眼症可称角结膜干燥症（KCS）或眼干燥症。由泪液的量或质及流体动力学异常引起的泪膜不稳定和眼表损害，而导致眼不适症状及视功能障，长期发展可造成角膜上皮破损。常见症状以眼部干涩、异物感、眼部干燥引起综合征，患者的眼结膜杯状细胞密度降低、细胞核浆比增大、上皮细胞鳞状化、角膜上皮结膜化、破损化，急需眼角膜眼结膜修复。干眼症目前开始年轻化，即在年轻人中因电脑、手机的应用，形成大量需预防或更进一步地需受药干预和临床治疗的实际临床需求，急需干眼症预防和临床治疗的创新药面世。人正常眼球表面，会持续分泌一层由泪液形成的“保护膜”，也叫做泪膜。泪膜就像“补水面膜”，锁住水分，形成平滑的泪液膜覆盖在眼表，避免瞬目时对眼角膜造成损害。泪液含的各种溶菌酶和抗体，杀灭微生物，保护眼表损害，清除外来的异物微粒。人造泪液，可为一种滴眼液、护理液或可称为润滑液，是由一系列保护眼结膜、眼角膜、润滑，保水功能的眼用护理液。

人体外表表皮发生破损、创伤、擦伤、划伤是在军人、运动员、学生等群体中常常发生的现象。破损表皮快速修复、愈合是保证人体维持正常生活所期盼和必要的。这种看起来不是大问题，但非常需要时间和忍受相当的不便才能自愈，才能恢复正常生活，这在临床上对此是有急需特效产品尽快面世的急迫需求。

人血清白蛋白（HSA）是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含50克，其半衰期至少为20天。白蛋白作为一种人体血液中最为关键性基质（载体），可携带传递脂肪酸、类固醇、激素分子，特别是小分子药物、多肽、大分子蛋白质、抗体等，持续在血液中循环的输送功能。人血清白蛋白稳定的惰性性质更是维持血压的一个重要因素。人血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、成熟肽含585个氨基酸的大蛋白。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是疫苗、生物药。借助白蛋白在血液中的极佳稳定性和惰性特征，将半衰期极短的蛋白，经基因工程技术与白蛋白基因融合，在外源基因表达系统中，克隆和构建重组基因表达细胞工程株或基因表达酵母工程株，获得可溶性的融合蛋白是本发明人的实践。利用微生物重组表达白蛋白（rHSA）的方法已在于在林、富岩中国授权专利ZL2004010057313.7中公开。治疗性蛋白质与白蛋白形成融合蛋白后，融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，还可以较高剂量使用，或与未融合的单体治疗性蛋白质临床上的给药剂量相比，可是更低的给药剂量，还可获得相当或更佳的临床疗效（于在林、富岩：更优生物创新药-长效重组人血清白蛋白融合蛋白，中国医药生物技术，2017）。

人表皮生长因子（Human Epidermal Growth Factor, hEGF）是人体分泌的由53个氨基酸所组成的具有生物活性的蛋白质，它广泛分布在血液、唾液、尿液等体液中，具有广泛的生物学活性，能促进表皮细胞的分裂，加速细胞的新陈代谢，使新生的表皮细胞迅速替代老化的细胞。EGF的血液半衰期仅是1小时左右，其半衰期极短，形成的药物作用时间虽然半衰期是略有提高，但仍然需频繁给药才能获得良好的临床疗效。为此，科学家利用基因工程技术，将表皮生长因子长效化，将EGF与人血清白蛋白基因融合，构建毕赤酵母基因工程菌株，利用外源表达生产系统，制备重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白[ZL200710057571.9、WO2009/043277A1、US8,603,973B2]。据此，目前形成了多种不同的生物创新药使重组血清白蛋白融合蛋白以注射的方式给药，例如：注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白、注射用重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白、注射用重组人血清白蛋白/干扰素α2b融合蛋白、注射用重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白等。然而融合蛋白注射剂虽然能够保证融合蛋白较好的发挥药效，但是并不适用外用给药方式，例如干眼症、角膜炎和角膜损伤（眼角膜，眼结膜损伤的统称）角膜手术后修复也是临床上常见的需药物介入的常见病，同时皮肤表皮损伤给药也不适合通过注射给药，而且适合外部给药。然而传统的外用给药，例如针对眼部的滴眼液和外用皮肤喷剂，均是类似水剂形式，给药后施药局部仅能吸收极少部分药物，而大部分药物随重力作用流向非用药部位，这不仅导致药物药效的损失，而且造成药物浪费严重，这给药物的疗效评估以及临床治疗手段的确定带来一定困难。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种温度敏感型凝胶损伤修复制剂及其应用，所述制剂不仅能很好保持重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白（rHSA/EGF）的生物活性，而且可在施药局部形成凝胶，留存更长时间，更易于制剂中的活性融合蛋白缓慢释放，达到更长半衰期，从而提高制剂的治疗效果。

本发明提供了一种温度敏感型凝胶损伤修复制剂，包括以下浓度的组分：0.01~5mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量1.9%~2.6%的甘氨酸、质量百分含量3.9%~6.2%的泊洛沙姆188、质量百分含量16.3%~18.2%的泊洛沙姆407和0.5~100mM的PB缓冲液。

优选的，包括以下浓度的组分：0.01~5mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量1.9~2.1%的甘氨酸、质量百分含量5.8%~6.2%的泊洛沙姆188、质量百分含量16.3%~16.7%的泊洛沙姆407和0.5~100mM的PB缓冲液。

优选的，包括以下浓度的组分：0.01~5mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量1.8%~2.2%的甘氨酸、质量百分含量5.8%~6.2%的泊洛沙姆188、质量百分含量17.8%~18.2%的泊洛沙姆407和0.5~100mM的PB缓冲液。

优选的，包括以下浓度的组分：0.01~5mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量2.0%~2.5%的甘氨酸、质量百分含量4.9%~5.1%的泊洛沙姆188、质量百分含量17.8%~18.2%的泊洛沙姆407和0.5~100mM的PB缓冲液。

优选的，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂包括温度敏感型凝胶滴眼液和温度敏感型凝胶外用喷剂。

本发明提供了所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂在制备修复眼角膜和/或眼结膜损伤的药物中的应用。

本发明提供了所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂在制备预防和/或治疗角膜炎的药物中的应用。

本发明提供了所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂在制备预防、缓解或治疗干眼症的药物中的应用。

本发明提供了所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂在制备治疗皮肤表皮创伤、擦伤或溃疡的药物中的应用。

本发明提供了一种温度敏感型凝胶损伤修复制剂，包括以下浓度的组分：0.01~5mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量1.9%~2.6%的甘氨酸、质量百分含量3.9%~6.2%的泊洛沙姆188、质量百分含量16.3%~18.2%的泊洛沙姆407和0.5~100mM的PB缓冲液。本发明提供的温度敏感型凝胶损伤修复制剂以重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白作为活性成分，可经滴眼进入眼房水，有利于提高修复眼角膜眼结膜损伤，预防、缓解和治疗干眼症；也可经透皮吸收进入皮肤层，引导皮肤细胞的生长和损伤的皮肤修复；同时温度敏感型凝胶损伤修复制剂中还包括甘氨酸、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407和PB缓冲液等辅料，不仅能够保证活性成分的结构稳定性，从而保证活性成分的药物活性，而且还能调节适宜的渗透压，为眼部给药提供保障；此外，所述辅料能够使所述制剂在0~35℃条件下时维持澄清透明水剂剂型；但当在温度等于或高于35℃时则呈凝胶状；与普通非温敏型制剂相比，本发明提供的所述制剂可在施药局部留存更长时间，更易于制剂中的活性蛋白质分子缓慢释放，达到更长半衰期，从而保证药效的发挥，提高活性成分的利用率，缩短用药时间，提高修复速度。同时所述制剂在2~35℃时，为液态，利于生产准备；接触人体是因人体表皮或眼球而形成凝胶状。对人体安全，无刺激性、无毒性，如制成日抛型包装更有利于方便患者自行用药。

附图说明

图1为本发明提供的制剂配方中rHSA/EGF融合蛋白的稳定性检测结果，其中由左到右，SSDS-PAGE电泳胶图条带1为标准分子量MK；条带2为空白，条带3-5为制剂配方一至配方三的非还原条件下的蛋白质电泳结果；条带6为空白；条带7-9为制剂配方一至三的还原条件下的电泳结果；

图2为健康人志愿者（左：给药后0min；右：给药后15min；上两图为男，下两图为女）同时施用重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白温敏型凝胶滴眼液和重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白滴眼液（喷剂）单次或者多次施用均未见表皮刺激、过敏、损伤现象发生，温敏型凝胶滴眼液在接触皮肤后因表皮温度而形成凝胶状，可持续至少15min以上；而非温敏型非凝胶制剂滴眼液（或喷剂）则不在皮肤表面聚集和停留，吸收后不留痕迹；

图3为空白对照（生理盐水）、阳性对照（rhEGF滴眼液商品）及rHSA/EGF温敏型凝胶滴眼液在兔右眼通过刮除全部角膜上皮建立角膜损伤动物模型上的药效学研究结果；在造模后立即、首次给药后24h、48h、72h、96h、120h，通过裂隙灯显微镜观察采集角膜图片，测量角膜荧光染色面积（mm²），比较不同组间面积的差异；

图4为放射性标记前后的rHSA/EGF完整性SEC-HLPC分析结果；

图5为新西兰兔单次滴眼给予⁸⁹Zr-重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白温敏型凝胶滴眼液的动物组织分布及药代动力学考察，在不同时间点的PET/CT扫描冠状位层图，分别是0h、2h、6h、12h、24h、48h、96h和168h的扫描结果，可见动物组织分布，及药代动力学变化；

图6为各组织的放射性计数分布图，可见供试药滴眼液在大白兔经眼球滴药方式给药后的代谢分布。

具体实施方式

在本发明中，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂中以重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白（rhSA/EGF）为活性成分。本发明对所述重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白的来源即可。在本发明实施例中，所述重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白的核苷酸序列以及制备方法在申请号ZL200710057571.9、WO2009/043277A1和US8,603,973B2中公开。活性成分分布和药代动力学试验证明，⁸⁹Zr-重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白的组织分布放射性浓度由高到低排序为给药部位＞房水＞胃＞眼球＞肠＞脾＞玻璃体＞肾＞脑＞肝＞心＞胫骨＞肌肉＞肺＞骨关节，说明重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白给药后主要分布在给药部分，能通过眼部进入体内达到眼角膜损伤部位。

在本发明中，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂还包括辅料。所述辅料包括甘氨酸、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407和PB缓冲液。试验证明，所述辅料在上述严格浓度筛选后，具有以下作用：1）能够增强活性组分rhSA/EGF的稳定性，保持rhSA/EGF的原有活性，2）在基质中的rhSA/EGF在施用部位释放过程中，更加容易受到空间位阻效应的影响，因此调整制剂配方中各组分的添加、组分添加的剂量及比例，使得rHSA/EGF的持续释放更加有效；3）辅料的添加对人体，特别是对眼晴有任何刺激和毒副反应作用；4））辅料组分的使用应符合药典标准，并不会发生对人体和施用部位，以及对rHSA/EGF活性有害的反应和影响；5）辅料的种类和配比能够保证制备的制剂能够在0~35℃条件下时维持澄清透明水剂剂型；在大于等于35℃的给药部分形成凝胶，在给药部位停留更长时间，使rhSA/EGF缓慢释放，充分发挥药效，提高制剂的修复和治疗效果。

在本发明中，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂是在非温敏型的损伤修复制剂的基础上优化得到：前期研究表明，甘油具有稳定蛋白质的作用，也是保水剂、具渗透压调节功能和作用，但制备的制剂具有较高的流动性，在含有甘油的基础上，即使增添的CMC具有增加黏度的作用，可稳定滴眼液，减少滴眼液局部的流动性，但蛋白质的稳定性并未达到要求。鉴于此，在含有甘氨酸的基础上增添的泊洛沙姆则具显示具有不错的黏度作用，可形成凝胶状，可减少滴眼液局部的流动性，符合融合蛋白稳定性的基本要求。在此基础上，进一步调控甘氨酸、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407的配比制备不同温度敏感型凝胶制剂。

在本发明中，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂优选包括以下浓度的组分：0.01~5mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量1.9~2.1%的甘氨酸、质量百分含量5.8%~6.2%的泊洛沙姆188、质量百分含量16.3%~16.7%的泊洛沙姆407和0.5~100mM的PB缓冲液，更优选为包括以下浓度的组分：0.2mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量2.0%的甘氨酸、质量百分含量6.0%的泊洛沙姆188、质量百分含量16.5%的泊洛沙姆407和10mM的PB缓冲液。所述制剂形成凝胶的温度为≥35.1℃，且甘氨酸含量的提高不影响蛋白质稳定性和生物活性。

在本发明中，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂优选包括以下浓度的组分：0.01~5mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量1.9%~2.1%的甘氨酸、质量百分含量5.8%~6.2%的泊洛沙姆188、质量百分含量17.8%~18.2%的泊洛沙姆407和10mM的PB缓冲液，更优选为0.2mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量2.0%的甘氨酸、质量百分含量6.0%的泊洛沙姆188、质量百分含量18%的泊洛沙姆407和10mM的PB缓冲液。所述制剂形成凝胶的温度为≥33.5℃。

在本发明中，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂优选包括以下浓度的组分：0.01~5mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量2.0%~2.5%的甘氨酸、质量百分含量4.9%~5.1%的泊洛沙姆188、质量百分含量17.8%~18.2%的泊洛沙姆407和0.5~100mM的PB缓冲液，更优选为0.2mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量2.0%的甘氨酸、质量百分含量5.0%的泊洛沙姆188、质量百分含量18%的泊洛沙姆407和10mM的PB缓冲液。

在本发明中，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂优选包括温度敏感型凝胶滴眼液和温度敏感型凝胶外用喷剂。

在本发明中，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂的制备方法，优选将重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、甘氨酸、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407和PB缓冲液混合得到。所述甘氨酸先配制成母液后，再经0.2μM滤膜过滤除菌后备用。所述泊洛沙姆188和泊洛沙姆407优选分别配制成10~200倍母液，再在0.1MPa压力，120~125℃下高压灭菌20分钟，冷却后备用。本发明对所述温度敏感型凝胶滴眼液和温度敏感型凝胶外用喷剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的滴眼液和外用喷剂的制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种温度敏感型凝胶损伤修复制剂及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

对比例1

1.一种含rHSA/EGF的制剂配方一，具体组分含量见表1。

表1 含rHSA/EGF的制剂配方一

序号	名称	用量	用途
				1	rHSA/EGF	0.2mg/mL	原料药
2	甘油	2.4%	渗透压调节
				3	100mM PB	至终浓度为10mM	缓冲液

按照表1的配方配制溶液，制备4ml/瓶×10瓶样品，备用。

2.将制备的制剂进行加速试验分析制剂的稳定性

1）药物所用供试品的容器和包装材料及包装方式应尽可能与上市产品一致；

2）药物稳定性试验，要采用专属性强、准确、精密、灵敏的药物分析方法，以保证药物稳定性结果的可靠性，必要时可制备同质理化对照品和同质生物活性标准品；

3）进行加速稳定性试验的产品，每批溶液配制量应大于一次全检量的8倍；

4）设置温度25℃±2℃，相对湿度25％±2％的条件(可用CH₃COOK·1.5H₂O饱和溶液)下放置规定的时长或6个月；所用设备应能控制温度±2℃，相对湿度±5％，并能对真实温度与湿度进行监测；

5）按规定的检验时间取样，以首次检验的日期为准，加速试验3个月内不得提前取样，但可在规定取样时间后的3日内取样；3个月后（含）的取样时间则可为规定时间的±3天。

3.将制备的制剂进行生物活性测定

具体测定方法按照《中国药典》2015版三部通则3528开展。

4.将制备的制剂进行蛋白质电泳检测

制剂的渗透压、蛋白含量、SDS-PAGE电泳检测方法等，参见《中国药典》2015版三部各相关检定项的通则0632、0731、0541。各制剂配方的渗透压均维持在300±60 mOsmol/kg。

5.微生物限度检测：按照《中国药典》2015版三部通则1101。该制剂配方获得的成品，均符合本品《制检规程》无菌的规定。

结果见图1和表4。结果表明，甘油具有稳定蛋白质的作用，也是保水剂，具渗透压调节功能和作用。融合蛋白的稳定性在该制剂配方经加速考察，获得的蛋白质电泳结果见图1中的配方一电泳结果。

对比例2

一种含rHSA/EGF的制剂配方二

由制剂配方一的分析结果看，仅增添甘油的制剂配方，在黏稠度上不符合要求制剂配方具温敏型和凝胶型的要求。为此，在制剂配方组分中添加羧甲基纤维素钠(Carboxymethyl cellulose Na，CMC)，具体组成见表2。

表2 含rHSA/EGF的制剂制剂配方二

制备4ml/瓶×10瓶样品。按照对比例1记载的方法放入温度25℃、湿度70%的加速试验箱中加速14天的稳定性考察，按时间节点取样进行外观检查、生物活性测定和蛋白质电泳检测以及微生物限度检测。结果见图1和表4。

在甘油的基础上，即使增添的CMC具一定的黏度作用，可稳定滴眼液，减少滴眼液局部的流动性，但融合蛋白稳定性考察结果则表明，蛋白质的稳定性与仅含有甘油的制剂配方相比，并没有达到预期的要求（见图1中的配方二的电泳结果）。

实施例1

一种含rHSA/EGF的制剂配方三

鉴于对比例1和对比例2中添加甘油或同时再增加CMC都并没有显著改善融合蛋白的稳定性，为此，改用甘氨酸加泊洛沙姆作为蛋白质稳定性和增加滴眼液的黏稠度的制剂配方辅料，具体见表3。

表3 一种含rHSA/EGF的制剂配方三

制备4ml/瓶×10瓶样品。按照对比例1记载的方法放入温度25℃、湿度70%的加速试验箱中加速14天的稳定性考察，按时间节点取样进行外观检查、生物活性测定及蛋白质电泳检测。

结果见表4。

检测时，以样品0天的生物比活性值确认为100%，考察不同时间点与0天时的生物比活性相对值之差，作为为计算依据。个别制剂配方中由于添加有影响蛋白质完整性的组分（制剂配方二），SDS-PAGE电泳结果虽然显示有降解发生，生物活性测定并不能表现出来。这是因为降解物中含有EGF单体，并且因时间短，含EGF的蛋白质片段，生物比好像并没有显著下降。这是因为单体的EGF生物活性比融合蛋白要高很多（按2015版中国药典三部，rhEGF生物比活性值：5×10⁵ IU/mg；rHSA/EGF的生物比活性：8×10⁴ IU/mg；HSA分子量为66Kd；EGF分子量为0.68Kd。二者间因HSA无表皮生长因子活性，在比活性值上就存在有6.2倍之差）。

此外，配方三结果表明，在含有甘氨酸的基础上增添的泊洛沙姆188和泊洛沙姆407则具显示具不错的黏度作用，可形成凝胶状，能减少滴眼液局部的流动性。融合蛋白稳定性考察结果也表明，蛋白质的稳定性与仅含有甘油的制剂配方相比更好，达到保护融合蛋白的预期要求。研究结果表明，制剂配方三符合融合蛋白稳定性的制剂配方的基本要求。

对比例3

一种温敏型凝胶制剂配方四

为了进一步制备适合人体使用的温敏型凝胶制剂，在制剂配方三的基础上，提出配方四（见表5），通过调整泊洛沙姆188和泊洛沙姆407的用量，追求达到滴眼液在0-35℃条件下是液态；35℃以上是凝胶态（显著减少滴眼液的流动性）的目的。

表5 温敏型凝胶制剂

制备4ml/瓶×10瓶样品。按照对比例1记载的方法放入温度25℃、湿度70%的加速试验箱中加速14天的稳定性考察，按时间节点取样进行外观检查、生物活性测定及蛋白质电泳检测。另外，将制备的制剂放入40℃水浴锅中，将温度计插入样品中并时刻观察滴眼液的流动性，随着温度上升找到制剂配方的凝固温度。

结果见表7。结果表明，本制剂配方的温敏型凝胶形成温度在39.2℃。同时测定甘氨酸含量的提高不影响蛋白质稳定性和生物活性。

实施例2

一种温敏型凝胶制剂配方五

为了达到滴眼液在0~35℃条件下是液态，35℃以上是凝胶态（显著减少滴眼液的流动性）的目的，在制剂配方四的基础上进一步通过调整泊洛沙姆188和泊洛沙姆407的用量，具体见表6。

表6 温敏型凝胶制剂配方五

组分序号	名称	用量	用途
				1	rHSA/EGF	0.2mg/mL	原料药
2	甘氨酸	2%	稳定剂
				3	泊洛沙姆188	6%	增稠剂
4	泊洛沙姆407	16.5%	增稠剂
				5	100mM PB	至终浓度为10mM	缓冲液

制备4ml/瓶×10瓶样品。按照对比例1记载的方法放入温度25℃、湿度70%的加速试验箱中加速14天的稳定性考察，按时间节点取样进行外观检查、生物活性测定及蛋白质电泳检测。另外，将制备的制剂放入40℃水浴锅中，将温度计插入样品中并时刻观察滴眼液的流动性，随着温度上升找到制剂配方的凝固温度。配方五的流动性结果表明，本制剂配方的温敏型凝胶形成温度在35.1℃。

稳定性加速试验考察结果见表8。

实施例3

一种温敏型凝胶制剂配方制剂配方六

为了达到滴眼液在0-35℃条件下是液态，35℃以上是凝胶态（没有流动性）的目的，在制剂配方五的基础上，进一步通过调整泊洛沙姆188和泊洛沙姆407的用量，具体见表7。

表7 温敏型凝胶制剂配方制剂配方六

组分序号	名称	用量	用途
				1	rHSA/EGF	0.2mg/mL	原料药
2	甘氨酸	2%	稳定剂
				3	泊洛沙姆188	6%	增稠剂
4	泊洛沙姆407	18%	增稠剂
				5	100mM PB	至终浓度为10mM	缓冲液

制备4ml/瓶×10瓶样品。按照对比例1记载的方法放入温度25℃、湿度70%的加速试验箱中加速14天的稳定性考察，按时间节点取样进行外观检查、生物活性测定及蛋白质电泳检测。另外，将制备的制剂放入40℃水浴锅中，将温度计插入样品中并时刻观察滴眼液的流动性，随着温度上升找到制剂配方的凝固温度。结果表明，本制剂配方的温敏型凝胶形成温度在33.5℃。制剂配方四的温敏型凝胶形成温度为39℃，显示太高了。制剂配方五和配方六比较，制剂配方五可在35℃时形成凝胶，比在33.5℃时就形成凝胶，作为温敏型凝胶滴眼液会更好些，在室温维持非凝胶状的抵抗能力更高些。因此，优选制剂配方五制备温敏型凝胶滴眼液或外用喷剂。

三种制剂配方经稳定性加速试验考察结果见表8。

制剂配方四~配方六在25℃的加速稳定性考察中，可确定制剂配方均符合温敏型凝胶制剂的要求（参见表二）。

实施例4

重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白温敏型凝胶滴眼液每天2次重复滴眼给予新西兰兔28天的眼刺激性试验

本项试验委托北京昭衍新药研究中心股份有限公司完成。试验选用8只雄性新西兰兔，随机分为2组，使用制剂配方五，按低剂量组（200μg/ml）和高剂量组（500μg/ml），4只/组，结膜囊滴眼，2次/天，间隔10~12小时，连续给药28天。首次给药当天计为D1，给药期间（D1~D28），每日进行1次一般临床观察。D1、D4、D8、D11、D14、D21、D28动物称重1次。试验开始前24小时内、D1、D4、D8、D11、D14、D21、D28第一次给药前，以及D28末次给药后1、2、4、24、48、72h对动物进行裂隙灯检查。D32将所有动物移交兽医统一管理。

试验期间，动物未见死亡，未见与供试品相关的异常临床反应。试验期间，两个剂量供试品眼刺激反应积分均值均为0，根据眼刺激性评价标准进行评价，各组个时间点眼刺激反应分类均为无刺激性。动物角膜荧光素染色均为阴性，未见角膜上皮损伤。结果表明本发明形成的含有重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白的创新温敏型滴眼液制剂配方对兔眼无可见临床刺激反应。

实施例5

含有重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白的创新温敏型凝胶滴眼液制剂配方对健康人自愿者表皮皮肤刺激、致敏试验

皮肤刺激和致敏试验的开展是在受试者手掌上方胳膊内侧皮肤表皮上连续施用由配方五制备的温敏型凝胶外用喷剂7天。施用后即时考察皮肤施用处及持续每天观察施用部位的皮肤是否出现发红、发疹、水泡等现象，每个给药过程的以手机视频或拍照留存记录，方法是皮肤表皮局部给药部位在给药前，给药后均拍照，或给药同时视频。

图2显示健康人志愿者（左：给药后0min；右：给药后15min；上两图为男，下两图为女）同时施用重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白温敏型凝胶滴眼液和重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白滴眼液（喷剂）单次或者多次施用均未见表皮刺激、过敏、损伤现象发生，温敏型凝胶滴眼液在接触皮肤后因表皮温度而形成凝胶状，可持续至少15min以上；而非温敏型非凝胶指导滴眼液（或喷剂）则不在皮肤表面聚集和停留，吸收后不留痕迹。

结果表明，本发明制备的含有重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白创新温敏型制剂配方，无论是以滴眼液、温敏型滴眼液、外用喷剂、温敏型外用制剂配方，均在人体体表施用后，无表皮刺激反应、无过敏反应、无致敏反应和无损伤发生，如图2：健康人志愿者（左：给药后0min；右：给药后15min；上两图为男，下两图为女）同时施用重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白温敏型凝胶滴眼液和重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白滴眼液（喷剂）单次或者多次施用均未见表皮刺激、过敏、损伤现象发生，温敏型凝胶滴眼液在接触皮肤后因表皮温度而形成凝胶状，可持续至少15min以上；而非温敏型非凝胶指导滴眼液（或喷剂）则不在皮肤表面聚集和停留，吸收后不留痕迹。

实施例6

考察重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白温敏型凝胶滴眼液对新西兰兔角膜上皮损伤的修复作用

本项试验委托北京昭衍新药研究中心股份有限公司完成。取雄性新西兰兔24只，随机分成4组，每组6只，所有动物右眼通过刮除全部角膜上皮建立角膜损伤模型，造模结束后，角膜荧光染色，除模型对照组动物给予生理盐水外，其余动物每天均右眼滴眼给予50μL的供试品/对照品，供试品（供试品1为滴眼液剂型，制剂配方一；供试品2为温敏型凝胶滴眼液，制剂配方五）每天给药2次，阳性对照（重组人表皮生长因子滴眼液（酵母），桂林华诺威基因药业有限公司，批号：201709133C）每天4次，连续给药7天。在造模后立即0h、首次给药后24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，分别不用时间节点荧光染色，通过裂隙灯显微镜观察采集角膜图片，测量角膜荧光染色面积（mm²），比较不同组间面积的差异。造模后用荧光染色法判断造模是否成功，角膜发生损伤的区域就可被着色，未发生损伤的角膜区域就不着色，而修复好后的角膜区域也不着色，可评定为角膜修复成功，有疗效。不着荧光色的角膜区域/部位代表已被修复好。

结果见图3：空白对照（生理盐水）、阳性对照（rhEGF滴眼液商品）及rHSA/EGF温敏型凝胶滴眼液在兔右眼通过刮除全部角膜上皮建立角膜损伤动物模型上的药效学研究。在造模后立即、首次给药后24h、48h、72h、96h、120h，通过裂隙灯显微镜观察采集角膜图片，测量角膜荧光染色面积（mm²），比较不同组间面积的差异。结果表明，与同期模型对照组相比，阳性对照药每天给药4次，与本发明的温敏型凝胶滴眼液，每天给药2次的疗效相当，且疗效为非劣。例如，与阳性对照药在首次给药后的96h，供试药在首次给药后96h时角膜荧光素钠染色面积均显著降低（p≤0.05）。

研究确认本发明形成的含有重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白的创新温敏型滴眼液制剂配方对眼角膜、眼结膜具修复作用，以及临床治疗用的药物长效化显著作用。

实施例7

新西兰兔单次滴眼给予⁸⁹Zr-重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白温敏型凝胶滴眼液的组织分布研究及药代动力学考察

本项研究是由米度（南京）生物技术有限公司开展和完成。新西兰大白兔单次滴眼给予⁸⁹Zr-重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白（rHSA/EGF，代码：X012）（以下简称⁸⁹Zr-X012）后进行PET/CT扫描，勾画眼球、房水、玻璃体及其它感兴趣区域获得放射性摄取值，研究受试药物在新西兰大白兔体内的组织分布特征。采用⁸⁹Zr同位素标记示踪方法进行新西兰大白兔单次滴眼给予⁸⁹Zr-X012的组织分布等药代动力学研究。试验首先对受试物进行[⁸⁹Zr]标记，质控合格后开展动物试验。参照[⁸⁹Zr]标记方法，将样品进行[^natZr]标记后邮寄给委托方完成标记后样品的生物活性检测。3只新西兰大白兔（2雄1雌）单次滴眼给予⁸⁹Zr-X012（约20μg/眼、约30μCi/眼），G1-M-01-r给予⁸⁹Zr-X012后于0 h（给药后立即）、2h、6h、12h、24h、48h、96h、168h进行PET/CT扫描；G1-M-02-r和G1-F-01-r给予⁸⁹Zr-X012后于0h（给药后立即）、2h、6h、12h、24h进行PET/CT扫描，保持动物固定不动，在PET扫描前/后完成CT扫描。扫描完成后进行图像重建，采用PMOD软件处理图像及数据，勾画眼球、房水、玻璃体及其它感兴趣区域，获得兴趣区域的放射性活度浓度（即单位体积的放射性活度值），根据给药剂量计算各脏器标准摄取值（简称SUV），再根据受试物的比活度折算出受试物的放射性浓度。

矫正活度=

公式I

每克组织的百分注射剂量率（%ID/g）=

公式II

标准摄取值=

公式III

组织的放射性浓度（μg Equ/g）=

公式IV

根据各动物的组织放射性物质浓度，利用DAS 3.2.8非房室模型计算药物在各组织中的药代动力学参数。以感兴趣的器官局部的放射性扫描值为纵坐标，以PET-CT扫描时间为横坐标，做对数曲线，使用PMOD软件，按放射性衰减，对应的横坐标时间点开展药代参数及半衰期计算。

动物代码G1-M-01-r给予⁸⁹Zr-X012后于0h、2h、6h、12h、24h、48h、96h、168h经耳缘静脉采血约1mL；动物代码G1-M-02-r和G1-F-01-r给予⁸⁹Zr-X012后于0h、2h、6h、12h、24h经耳缘静脉采血（约1mL），采血均在每个时间点PET/CT扫描结束后立即进行。0h、2h、6h、12h、24h和48h时间点移液器移取100μL全血转移至放免管，使用γ计数仪检测放射性；剩余全血在4℃和3000rpm条件下离心10min分离血清，96h和168h时间点，使用移液器移取100μL全血转移至放免管并使用γ计数仪检测放射性，全部制备血清。-80℃保存十个⁸⁹Zr核素半衰期（从实验动物给药时间开始计算时间），-20℃冷链运输至天津福盈生物制药有限公司进行ELISA检测。试验结果表明：

1、标记结果：X012可实现[⁸⁹Zr]标记，标记后质控合格，放射性化学纯度（以下简称RCP）均大于90%；批号为L19092802的⁸⁹Zr-X012在2～8℃条件下放置5 h后RCP为96.42%，体外稳定性符合试验要求；[^natZr]标记后受试物的生物活性为标记前的87.3%，活性满足试验要求（70%～130%）。生物活性测定时，样品的放射性已处于安全性放射值（15天后），才能用于细胞生物活性检测，由此，放标过程和样品等待衰减的过程，理论上会均产生一定的生物活性损失发生。但不影响动物试验结果（见图4：⁸⁹Zr-X012的Radio-HPLC图谱（批号L19092802））。

2、组织分布试验结果：新西兰大白兔单次滴眼给予⁸⁹Zr-X012后，放射性主要分布于给药部位。眼球、玻璃体、房水、胃、脾和肠中有一定放射性分布，其余组织放射性浓度很低。各组织/体液放射性按照AUC_{(0-24 h)}排序由大到小依次为：给药部位＞房水＞胃＞眼球＞肠＞脾＞玻璃体＞肾＞脑＞肝＞心＞胫骨＞肌肉＞肺＞骨关节。各组织/体液放射性按照AUC_{(0-168 h)}排序由大到小依次为：给药部位＞房水＞胃＞肠＞脾＞眼球＞玻璃体＞脑＞肾＞肝＞胫骨＞肌肉＞心＞肺＞骨关节（见图5新西兰大白兔单次滴眼给予⁸⁹Zr-X012后0~24h各组织的放射性体内暴露量分布图）。

图6为各组织的放射性计数分布图，可见供试药滴眼液在大白兔经眼球滴药方式给药后的代谢分布。给药0h后，放射性在给药部位、眼球、玻璃体和房水中达峰，放射性浓度分别为17377.1ng Equ./mL、900.7ng Equ./mL、15.6ng Equ./mL、和1390.7ng Equ./mL。给药2h后，放射性在胃中达峰，放射性浓度为138.3ng Equ./mL，给药后24h，放射性在脾和肠中达峰，放射性浓度分别为16.6ng Equ./mL、16.6ng Equ./mL。截止给药后24h，给药部位、眼球、玻璃体和房水中的放射性浓度已降低至峰值的1/10以下；截止给药后168h，胃、脾和肠中的放射性浓度已降低至峰值的1/10以下，其他组织中的放射性摄取在试验期间均很低。

3、全血放射性检测结果：新西兰大白兔单次滴眼给予⁸⁹Zr-X012后，0h、2h、6h、12h、24h和48h时间点移液器移取100μL全血转移至放免管，使用γ计数仪检测放射性，均低于γ计数仪检测下限。单眼单次给药50μl，含rHSA/EGF为10μg，但以放射性方法检测，仍然未能在血液中检测到。

试验结论：新西兰大白兔单次滴眼给予⁸⁹Zr-X012后，放射性主要分布于给药部位。眼球、玻璃体、房水、胃、脾和肠中有一定放射性分布，其余组织放射性浓度很低。

⁸⁹Zr-X012通过滴眼给药在眼球表面形成凝胶，少量放射性可通过鼻泪管分布至食道、胃、肠，微量放射性在肠道吸收入血，随血液循环分布至脾、肾等其他组织。

各组织/体液放射性按照AUC_{(0-24 h)}排序由大到小依次为：给药部位＞房水＞胃＞眼球＞肠＞脾＞玻璃体＞肾＞脑＞肝＞心＞胫骨＞肌肉＞肺＞骨关节。各组织/体液放射性按照AUC_{(0-168 h)}排序由大到小依次为：给药部位＞房水＞胃＞肠＞脾＞眼球＞玻璃体＞脑＞肾＞肝＞胫骨＞肌肉＞心＞肺＞骨关节。

各动物的全身蛋白当量在给药后0h均为最高值，截止给药后24h，各动物全身蛋白当量都有不同程度的明显下降，截止给药后168h，G1-M-01-r动物的全身蛋白当量已下降至峰值的约1/3。

0～24h，各动物眼球的药物半衰期平均值为53.259 h，房水的药物半衰期平均值为31.729 h。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种温度敏感型凝胶损伤修复制剂，其特征在于，由以下浓度的组分组成：0.2mg/mL重组人血清白蛋白/表皮生长因子融合蛋白、质量百分含量2.0%的甘氨酸、质量百分含量6.0%的泊洛沙姆188、质量百分含量16.5%的泊洛沙姆407和10mM的PB缓冲液。

2.根据权利要求1所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂，其特征在于，所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂包括温度敏感型凝胶滴眼液和温度敏感型凝胶外用喷剂。

3.权利要求1或2所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂在制备修复眼角膜和/或眼结膜损伤的药物中的应用。

4.权利要求1或2项所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂在制备预防和/或治疗角膜炎的药物中的应用。

5.权利要求1或2所述温度敏感型凝胶损伤修复制剂在制备预防、缓解或治疗干眼症的药物中的应用。