CN101972224B

CN101972224B - 一种眼用原位凝胶

Info

Publication number: CN101972224B
Application number: CN2010102812922A
Authority: CN
Inventors: 谭剑平; 蒋立新; 潘铁成; 周志文
Original assignee: Staidson Beijing Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Staidson Beijing Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2030-09-13
Also published as: CN101972224A

Abstract

本发明涉及一种眼用原位凝胶组合物。该眼用原位凝胶组合物，包括：神经生长因子50μg/ml～400μg/ml；稳定剂1mg/ml～20mg/ml；温度敏感型凝胶5mg/ml～400mg/ml；水；该原位凝胶组合物的pH值为4.5～7.5。在本发明中，通过使用上述的组成和配比，以及控制原位凝胶组合物的pH值在一定的范围之内，可以得到包含有神经生长因子的眼用原位凝胶制剂。该制剂在常温状态下保存时，该制剂为液态，在进入眼睛之后就成为稳定的半固体凝胶状态。

Description

一种眼用原位凝胶

技术领域

本发明涉及一种眼用原位凝胶组合物。

背景技术

准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)由于术后反应轻、安全性高、预测性好等优点是目前角膜屈光手术中的主流术式。但术后6个月内几乎50％的病例出现干眼症状，部分患者有异物感等不适，不同程度地影响了患者对手术的满意度。研究发现这些症状体征的出现与术中在切开角膜瓣、切削角膜基质的同时，不同程度地损伤了角膜神经有关。促角膜神经损伤修复的药物研究是目前的研究热点。

神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。神经生长因子是具有促进神经元存活、分化以及受损神经再生修复作用的生物活性蛋白，是人体内重要的生物活性物质之一，其对促进和维持人体生命功能起重要作用。它是目前治疗神经损伤理想的有效药物，其作用主要在于提高受损神经细胞的存活率，促进受损神经纤维沿正确的方向生长，趋使生长的神经纤维定位于靶细胞，形成功能性连接。国内外在临床上越来越广泛地应用NGF作为各种神经损伤修复，包括外伤性、生理性(老年)神经损伤修复的手段，而且是目前国内外用于神经损伤治疗的唯一有效生物制剂。

目前，临床使用的NGF为注射剂，使用不便，需经训练的专业人士参与，极大地限制了其在临床上的应用，且大部分生物活性在传导过程中降解失活而不能使NGF达到应有的最佳治疗效果。

临床上使用的眼用局部给药剂型：滴眼液，占眼用制剂60％以上，使用方便、价格低廉。但滞留时间短、生物利用度低。人正常泪液容量约为7μl，若不眨眼，可容纳30μl左右的液体。一般的滴眼液，估计约有70％的药液从眼溢出而造成损失，若眨眼将有90％的药液损失。溢出的药液大部分沿面颊流下，或经鼻泪管进入鼻腔或消化道最终被全身吸收。水凝胶，延长药物在眼部的滞留时间，提高生物利用度。但此类凝胶分剂量不准确，且给药不方便。眼膏，较长的药物滞留时间，但因其剂量不准确、易引起糊视和眼睑起壳导致患者顺应性差，而且通常只能睡前使用。脂质体，具有增加角膜通透性、缓释和降低毒性反应等优点。但其载药量低，稳定性差，无菌化大工业生产成本高，技术上有难度。

眼用原位凝胶：以液体状态给药后，立即在用药部位发生相转变，形成半固体凝胶状态的眼用制剂。FDA已批准了一个此类产品：马来酸噻吗洛尔凝胶，PDR已收载。还有两个采用泊洛沙姆407制备的人工泪液眼用原位凝胶已在澳大利亚和日本上市。和传统眼用局部给药剂型相比，眼用原位凝胶具有以下特点：(1)较好的生物黏附性，较长时间地与眼部紧密接触，克服了传统制剂会很快被眼泪冲刷而无法达到有效药物浓度的缺点，提高了生物利用度。(2)组织相容性好，使用方便，减少了给药频率，患者顺应性提高。(3)三维网状结构高度亲水，可将药物束缚于其中或其间隙中，控制药物释放。(4)理化性能特殊，因其在体外条件下呈易流动的液体状态，故易灌装，便于工业化生产。(5)给药剂量准确，长期给药也不易引起全身毒性和不良反应。(6)较好的生物黏附性，较长时间地与眼部紧密接触，克服了传统制剂会很快被眼泪冲刷而无法达到有效药物浓度的缺点，提高了生物利用度。

但是目前还没有一种包含有神经生长因子的眼用原位凝胶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种包含有神经生长因子的眼用原位凝胶。

之所以迄今为止市场上仍旧没有出现包含有神经生长因子的眼用原位凝胶，是因为还没有找到一种合适的配比，使得包含有神经生长因子的眼用原位凝胶在进入眼部之前为液体，而在进入眼睛之后成为稳定的半固体凝胶状态。

本发明人成功开发出了这种包含有神经生长因子的眼用原位凝胶。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下的技术方案：

一种眼用原位凝胶组合物，包括：

神经生长因子 50μg/ml～400μg/ml；

稳定剂 1mg/ml～20mg/ml；

温度敏感型凝胶 5mg/ml～400mg/ml；

水；

该原位凝胶组合物的pH值为4.5～7.5。

优选地，所述稳定剂为氨基酸。

优选地，所述稳定剂为氨基酸与非离子表面活性剂的混合物。

优选地，所述稳定剂为氨基酸与醋酸盐。

优选地，所述氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和精氨酸的混合物。

优选地，还包括pH值缓冲剂。

优选地，所述pH值缓冲剂为磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸及盐、碳酸盐。

优选地，温度敏感型凝胶选自泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、壳聚糖及其衍生物。

优选地，该原位凝胶组合物在体外呈液体状态，滴入眼内形成凝胶。

优选地，还包括防腐剂。

优选地，所述防腐剂选自选自苯甲醇、苯酚、间甲酚、羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、三氯叔丁胺醇、苯扎氯铵、苯扎溴胺、洗必泰。

优选地，所述防腐剂的量为0mg/ml～100mg/ml。

优选地，还包括渗透压调节剂。

优选地，所述渗透压调节剂选自甘露醇、山梨醇、氯化钠、枸橼酸钠。

优选地，还包括医用亲水高分子材料，所述医用亲水高分子材料中含有以下物质中的一种或几种：甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、透明质酸钠、甘油磷酸钠。

在本发明中，通过使用上述的组成和配比，以及控制原位凝胶组合物的pH值在一定的范围之内，可以得到包含有神经生长因子的眼用原位凝胶制剂。该制剂在常温状态下保存时，该制剂为液态，在进入眼睛之后就成为稳定的半固体凝胶状态。

同等剂量的NGF眼用原位凝胶和普通NGF滴眼液相比，NGF眼用原位凝胶给药一次可达普通NGF滴眼液给药三次相同效力。

具体实施方式

为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案做出进一步的阐述。

本发明提供的第1个技术方案是，一种眼用原位凝胶组合物，包括：

神经生长因子 50μg/ml～400μg/ml；

稳定剂 1mg/ml～20mg/ml；

温度敏感型凝胶 5mg/ml～400mg/ml；

水；

该原位凝胶组合物的pH值为4.5～7.5。

其中，μg/ml为微克/毫升。

在本发明中，通过使用上述的组成和配比，以及控制原位凝胶组合物的pH值在一定的范围之内，可以得到包含有神经生长因子的眼用原位凝胶制剂。该制剂在常温状态下，例如不超过30℃的条件下保存时，该制剂为液态，在进入眼睛之后就成为稳定的半固体凝胶状态。对于其中的温度敏感型凝胶，例如：选自泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、壳聚糖及其衍生物。

其中，所述神经生长因子的英文是nerve growth factor，在本发明中也简称为NGF。NGF是，由效应神经元支配的靶组织细胞所合成和分泌的具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子。能维持感觉、交感神经元存活，促进受损神经纤维修复，淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞增殖、分化，伤口愈合等。

目前的神经生长因子主要是鼠源的，和从人胎盘中提取的，即人源的，而目前上市的只有鼠源的NGF，人源的没有拿到批件。国外没有上市的NGF品种，国内拿到生产批件的厂家有：丽珠集团丽珠制药厂，产品规格：30μg(生物活性不低于15000AU)/瓶，注射剂；厦门北大之路生物工程有限公司，规格：18μg(≥9000AU)/支，注射剂、6000AU(12μg)/瓶，冻干制剂、2000AU(4μg)/支，冻干制剂；武汉海特生物制药股份有限公司，规格：20μg(≥9000AU)/支，粉针剂。

本发明提供的第2个技术方案是对第1个技术方案的改进，改进之处在于，所述稳定剂为氨基酸。在本发明中不采用人血清白蛋白，因为人血清白蛋白与其他成分之间的相容性不好。

本发明提供的第3个技术方案是对第1个技术方案的改进，改进之处在于，所述稳定剂为氨基酸与非离子表面活性剂的混合物。

本发明提供的第4个技术方案是对第1个技术方案的改进，改进之处在于，所述稳定剂为氨基酸与醋酸盐。

本发明提供的第5个技术方案是对第2～4个技术方案的改进，改进之处在于，所述氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和精氨酸的混合物。当所述氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和精氨酸的混合物时，则更加容易得到相容性优异的眼用原位凝胶制剂。

本发明提供的第6个技术方案是对第1～5个技术方案的改进，改进之处在于，还包括pH值缓冲剂。pH值缓冲剂的使用，可以使得本发明的眼用原位凝胶组合物的pH值较为稳定，也就是说，当引入酸性或者碱性的添加物质时，本发明的眼用原位凝胶组合的pH值变化小，这对于眼用原位凝胶制剂的配方选择提供了极大的自由度。不像以前的技术中，在眼用原位凝胶组合物中各组分之间存在微妙的平衡，一旦此平衡被打破，那么将很难再次恢复，这就使得眼用原位凝胶制剂的制备和研究必须在非常精确的条件下进行。

本发明提供的第7个技术方案是对第6个技术方案的改进，改进之处在于，所述pH值缓冲剂为磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸及盐、碳酸盐。虽然pH值缓冲剂的种类并没有特别的限制，只要能够用在医药领域即可，但是优选使用上述的pH值缓冲剂。

本发明提供的第8个技术方案是对第1～7个技术方案的改进，改进之处在于，所述温度敏感型凝胶选自泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、壳聚糖及其衍生物。在本发明中使用的温度敏感性凝胶并没有特别的限制，只要能够在35℃以上能够由液态变成凝胶状态即可。通常可以使用的温度敏感性凝胶为泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、壳聚糖及其衍生物。

本发明提供的第9个技术方案是对第1～8个技术方案的改进，改进之处在于，该组合物还包括防腐剂。对于医用组合物，保持药物的特性有利于医用组合物的贮藏，所以优选还包括防腐剂。

本发明提供的第10个技术方案是对第9个技术方案的改进，改进之处在于，所述防腐剂选自选自苯甲醇、苯酚、间甲酚、羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、三氯叔丁胺醇、苯扎氯铵、苯扎溴胺、洗必泰。本发明中所使用的防腐剂的引入并没有特别的限制，只要不影响本发明所要解决的技术问题即可。在此前提下，优选使用上述类型的防腐剂。

本发明提供的第11个技术方案是对第9和10个技术方案的改进，改进之处在于，所述防腐剂的量为0mg/ml～100mg/ml。防腐剂的量只要能够起到防腐剂的作用即可，所以优选为100mg/ml以下，更优选为50mg/ml以下，也可以采用25mg/ml以下。在能够起到防腐剂作用的前提下，要尽量少地添加防腐剂。

本发明提供的第12个技术方案是对第1～11个技术方案的改进，改进之处在于，还包括渗透压调节剂。

本发明提供的第13个技术方案是对第12个技术方案的改进，改进之处在于，所述渗透压调节剂选自甘露醇、山梨醇、氯化钠、枸橼酸钠。++

本发明提供的第14个技术方案是对第1～13个技术方案的改进，改进之处在于，还包括医用亲水高分子材料，所述医用亲水高分子材料中含有以下物质中的至少一种：甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、透明质酸钠、甘油磷酸钠。

以上对本发明所提供的技术方案进行了说明，下面结合给出具体的实施例，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。

实施例1

本实施例的配比如下表所示：

NGF	200μg/ml
		泊洛沙姆407	214mg/ml
泊洛沙姆188	96mg/ml
		苯甲醇	9mg/ml
醋酸盐缓冲液	调至pH5.5
		注射用水	适量

制备方法：冰浴中搅拌将泊洛沙姆加入注射用水，低温储存至泊洛沙姆完全溶解，NGF、苯甲醇先溶于pH5.5醋酸盐缓冲液中，除菌过滤后，加到上述高分子溶液中，注射用水补充至足量，搅拌均匀，无菌分装。

其中注射用水适量的意思是指，水的用量为把上述成分的参数调节到表中所示的参数。这对于本领域的技术人员而言是很容易实现的。

泊洛沙姆407、泊洛沙姆188是由德国BASF公司生产的。

实施例2

本实施例的配比如下表所示：

NGF	200μg/ml
		丙氨酸	3.3mg/ml
甘氨酸	3.3mg/ml
		精氨酸	3.3mg/ml
泊洛沙姆407	214mg/ml
		泊洛沙姆188	96mg/ml
苯甲醇	9mg/ml
		磷酸盐缓冲液	调至pH6.5
注射用水	适量

制备方法：冰浴中搅拌将泊洛沙姆加入注射用水，低温储存至泊洛沙姆完全溶解，NGF、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、苯甲醇先溶于pH6.5磷酸盐缓冲液中，除菌过滤后，加到上述高分子溶液中，注射用水补充至足量，搅拌均匀，无菌分装。

实施例3

本实施例的配比如下表所示：

NGF	100μg/ml
		泊洛沙姆407	150mg/ml
泊洛沙姆188	150mg/ml
		壳聚糖	4mg/ml
苯甲醇	9mg/ml
		醋酸盐缓冲液	调至pH5.5
注射用水	适量

制备方法：冰浴中搅拌将泊洛沙姆加入注射用水，低温储存至泊洛沙姆完全溶解，壳聚糖溶于适量稀醋酸，NGF、苯甲醇溶于pH5.5醋酸盐缓冲液中，除菌过滤后，将上述溶液混合，注射用水补充至足量，搅拌均匀，无菌分装。

实施例4

本实施例的配比如下表所示：

NGF	50μg/ml
		壳聚糖	12.5mg/ml
甘油磷酸钠	210mg/ml
		苯甲醇	9mg/ml
醋酸盐缓冲液	调至pH5.5
		注射用水	适量

制备方法：壳聚糖溶解于稀醋酸水溶液，搅拌条件下，缓慢加入甘油磷酸钠溶液，搅拌均匀，调节pH值至5.5，将NGF、苯甲醇溶于醋酸盐缓冲液，加至上述高分子溶液，注射用水补充至足量，搅拌均匀，微孔滤膜过滤，无菌分装。

实施例5

本实施例的配比如下表所示：

NGF	400μg/ml
		丙氨酸	3.3mg/ml
甘氨酸	3.3mg/ml
		精氨酸	3.3mg/ml
羟丙基甲基纤维素K4M	4mg/ml
		泊洛沙姆407	180mg/ml
苯酚	2.5mg/ml
		磷酸盐缓冲液	调至pH7.0
注射用水	适量

制备方法：羟丙基甲基纤维素K4M，加入注射用水，加热至70℃，充分搅拌，放置，至全部溶解，冰浴中搅拌加入泊洛沙姆407，低温储存至完全溶解；将NGF、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、苯酚先溶于pH7.0磷酸盐缓冲液中，除菌过滤后，加至上述配好的高分子溶液中，注射用水加至足量，搅拌均匀，无菌分装。

其中，羟丙基甲基纤维素K4M是由上海卡乐康包衣技术有限公司生产的羟丙基甲基纤维素，K4M为产品型号，它的粘度系数为4000cps。

实施例6

本实施例的配比如下表所示：

NGF	200μg/ml
		丙氨酸	3.3mg/ml
甘氨酸	3.3mg/ml
		精氨酸	3.3mg/ml
泊洛沙姆407	200mg/ml
		透明质酸钠	5mg/ml
苯甲醇	9mg/ml
		磷酸盐缓冲液	调至pH7.0
注射用水	适量

制备方法：透明质酸钠，加入注射用水，充分搅拌，至全部溶解，冰浴中搅拌加入泊洛沙姆407，低温储存至完全溶解，将NGF、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、苯甲醇先溶于pH7.0磷酸盐缓冲液中，除菌过滤后，加至上述高分子溶液中，注射用水补充至足量，搅拌均匀，无菌分装。

实施例7

本实施例的配比如下表所示：

NGF	100μg/ml
		丙氨酸	3.3mg/ml
甘氨酸	3.3mg/ml
		精氨酸	3.3mg/ml
泊洛沙姆407	180mg/ml
		海藻酸钠	10mg/ml
苯甲醇	9mg/ml
		磷酸盐缓冲液	调至pH7.0
注射用水	适量

制备方法：海藻酸钠，加入注射用水，充分搅拌，至全部溶解，冰浴中搅拌加入泊洛沙姆407，低温储存至完全溶解，将NGF、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、苯甲醇先溶于pH7.0磷酸盐缓冲液中，除菌过滤后，加至上述高分子溶液中，注射用水补充至足量，搅拌均匀，无菌分装。

实施例8

本实施例的配比如下表所示：

NGF	100μg/ml
		泊洛沙姆407	170mg/ml
卡波姆974P	3mg/ml
		苯酚	2.5mg/ml
醋酸盐缓冲液	调至pH5.5
		注射用水	适量

制备方法：卡波姆，加入注射用水，充分搅拌，至全部溶解，冰浴中搅拌加入泊洛沙姆407，低温储存至完全溶解，将NGF、苯酚溶于pH5.5醋酸盐缓冲液中，除菌过滤后，加至上述高分子溶液中，注射用水补充至足量，搅拌均匀，无菌分装。

卡波姆974P是美国诺誉化工有限公司生产的。

实施例9

本实施例的配比如下表所示：

NGF	200μg/ml
		丙氨酸	3.3mg/ml
甘氨酸	3.3mg/ml
		精氨酸	3.3mg/ml
泊洛沙姆407	214mg/ml
		泊洛沙姆188	96mg/ml
苯甲醇	9mg/ml
		醋酸盐缓冲液	调至pH5.5
甘露醇	50mg/ml
		注射用水	适量

制备方法：冰浴中搅拌将泊洛沙姆、苯甲醇加入注射用水，低温储存至泊洛沙姆完全溶解。将NGF、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甘露醇先溶于pH5.5醋酸盐缓冲液中，除菌过滤后，采用低温冷冻干燥法冻干，先将冻干机、冻干箱温度降至-45℃，再将样品放入预冻3小时，启动真空泵，待真空达到一定数值后，缓缓打开阀门，关闭冷冻机，缓缓升温至-33℃，待水分蒸发完后升温，在30摄氏度时转入再干燥，然后封盖。临用前，将泊洛沙姆溶液加至NGF冻干中，溶解混匀。

以上的实施例1～9所制备的眼用原位凝胶制剂，在常温(0℃～30℃)条件下保存时为液态，在进入眼睛之后就成为稳定的半固体凝胶状态。

下面将继续研究本发明的眼用原位凝胶组合物的一些性质

试验例1

NGF与医用高分子材料相容性试验

将NGF原液(30μg)与医用高分子材料溶液按比例混合，采用鸡背神经节法检测NGF的生物活性。

1.1 仪器：

超净台：型号DL-CJ-2N(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，高压灭菌锅：型号YXQG02(山东新华医疗器械股份有限公司)，二氧化碳培养箱：型号MCO-15AC(日本三洋)，倒置显微镜：型号CKX41(奥林巴斯)。

1.2 试剂和试液：小牛血清(美国invitrogen生命技术公司)、DMEM高糖培养液(美国invit rogen生命技术公司)、鼠尾胶原(Sigma公司)、生理盐水(山东华鲁制药有限公司)。

DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。

1.3 操作步骤：

1.3.1 取高压灭菌后的玻璃细胞瓶，将冻存的鼠尾胶原融化后，按每个细胞瓶约取50ul(微升)，用弯头玻璃棒均匀涂布于瓶底的里1/3处，去掉瓶盖，置于超净台中自然干燥两天。

1.3.2 每个细胞瓶中加入10％小牛血清的DMEM培养液2ml，盖上瓶盖，浸泡过夜。

1.3.3 实验时，在平皿中倒入灭菌的生理盐水，于解剖镜下取7～9日龄鸡胚的背根神经节，接种于涂有鼠尾胶原的培养瓶中，每瓶接种3～5个神经节。于37℃下保温2小时。

1.3.4 NGF样品的稀释：

取样品，加DMEM培养液，稀释5000倍作为待测样品。

1.3.5 NGF参考品(标示量为1000AU/支)的稀释：

取1支加无血清DMEM培养液1.0ml溶解为被测母液，取被测母液0.5ml加DMEM培养液9.5ml配成A液，取A液0.3ml加DMEM培养液4.7ml配成参考品对照液。

1.3.6 将上述预稀释后的NGF样品和参考品用无血清DMEM培养液作3倍倍比稀释，样品作6至7个稀释度(应稀释至出现阴性结果)，加入培养瓶中，同时设空白对照。于5％CO2，37℃二氧化碳培养箱中培养18～24小时。

1.3.7 在倒置显微镜下观察结果，根据神经节突起生长的不同程度，每个分别作分级记录(用#、++++、+++、++、+、-表示)。

1.3.8 判定：

神经节无突起生长为阴性，以“-”表示；神经节突起生长但较稀疏，以“+”表示；明显生长以“++”表示；生长较好以“+++”表示；生长最好以“++++”表示；出现过量抑制以“#”表示。一般地，从出现阴性结果的稀释度开始往回数第3和第4两稀释度中取生长最好的作为判定终点计算效价(效价＝AU/ml)。如果出现这两个稀释度长得同样好，则取两者的平均值。

1.4 合格限度标准：≥15000AU/支

1.5 计算公式：

1.6 结果记录：

参考品结果记录：标示活性：1000AU/支

待测液编号	1	2	3	4	5	6
							标示活性(AU/ml)	3	1	1/3	1/9	1/27	1/81
预稀释倍数	1000/3	1000	3000	9000	27000	81000
							参考品生长	#	++++	+++	++	+	-

阴性对照：-

1.7 结果判定：

样品结果判定

NGF+泊洛沙姆407+泊洛沙姆188 相容性良好

NGF+人血白蛋白+泊洛沙姆407+泊洛沙姆188 出现白色沉淀，相容性差

NGF+丙氨酸+甘氨酸+精氨酸+泊洛沙姆407+泊洛沙姆188 相容性良好

NGF+卡波姆相容性良好

NGF+壳聚糖相容性良好

NGF+海藻酸钠相容性良好

NGF+透明质酸钠相容性良好

NGF+羟丙基甲基纤维素相容性良好

试验例2

稳定剂的加入对NGF眼用原位凝胶稳定性试验影响

传统的NGF制剂多采用人血白蛋白作为保护剂，但使用人血白蛋白存在很大局限，且易与高分子材料出现相容性问题，因此，我们使用氨基酸、醋酸盐作为稳定剂，并考察稳定剂对NGF眼用原位凝胶的影响。

将NGF眼用原位凝胶置于湿度为92％、温度为40℃的孵箱中分别存放0天、5天、15天、20天、1月、2月，然后采用鸡胚背根神经节法检测NGF的生物活性。

在实施例中使用的处方如下表所示：

	处方1	处方2	处方3
				NGF	50μg/ml	50μg/ml	50μg/ml
丙氨酸	-	-	3.3mg/ml
				甘氨酸	-	-	3.3mg/ml
精氨酸	-	-	3.3mg/ml
				泊洛沙姆407	214mg/ml	214mg/ml	214mg/ml
泊洛沙姆188	96mg/ml	96mg/ml	96mg/ml
				醋酸盐缓冲液	-	调至pH5.5	调至pH5.5
注射用水	适量	适量	适量

活性测定结果如下表所示：

0天

5天

15天

20天

1月

2月

处方1

++++

++

-

处方2

++++

+++

处方3

++++

结果显示，不含稳定剂的凝胶稳定性很差，稳定剂氨基酸、醋酸盐的加入可使NGF原位凝胶的稳定性显著提高。

试验例3

溶液型眼用制剂每滴的体积平均40μl，而结膜囊内泪液的体积为7μl。温度敏感型凝胶，合适的处方，常温应为液体，与模拟人工泪液(simulated tearfluid，STF)按比例混合，依然能够在35℃(结膜囊内温度)发生相变。测定实施例1所制得的NGF眼用原位凝胶经STF按40∶7(V/V，体积比)稀释后相变温度。结果见表1。

相变温度的测定方法：将适量NGF眼用原位凝胶溶液放入西林瓶，将其放入冰浴中。瓶的橡胶塞中间打孔并插入精度为0.1℃的精密温度计，温度计的水银球完全没入溶液中。用磁力搅拌子搅拌泊洛沙姆溶液，同时缓慢升高水浴温度，升温速度约为1℃/2min，使溶液内部温度均匀。同时，将西林瓶不断倾斜60°，以溶液不发生流动时的温度为相变温度。

人工泪液的配置：根据泪液的电解质组成配制人工泪液，其每100g中含的组成成分：氯化钠0.68g，碳酸氢钠0.22，二水合氯化钙0.008g，氯化钾0.14g。

下表是实施例1凝胶在STF稀释前后的胶凝温度

结论：NGF眼用原位凝胶与模拟人工泪液按比例混合，依然能够在35℃发生相变。

试验例4

眼部滞留时间的长短是衡量眼部外用剂型的一个重要指标，本实验采用荧光素法，分别进行了NGF眼用原位凝胶(实施例1)和滴眼液的眼部滞留实验，并对二者作了比较。

在NGF眼用原位凝胶(实施例1)和滴眼液中分别加入微量的绿色荧光蛋白。将健康家兔6只固定头部，提起下眼睑，把结膜囊拉成小杯状，在家兔左眼结膜囊内滴入绿色荧光蛋白NGF眼用原位凝胶40μl，同时在这6只家兔右眼的结膜囊内滴入40μl绿色荧光蛋白NGF滴眼液作为对照。给药后，使家兔各眼被动闭合10秒，将家兔放在蓝色光470nm(纳米)波长下观察(绿色荧光蛋白在450～490nm蓝色光照射下有绿色荧光)，记录给药后结膜和角膜绿色荧光蛋白的荧光消褪时间，以两个部位荧光的最长消褪时间定义为眼部滞留时间。

下表是NGF眼用原位凝胶(实施例1)和滴眼液的眼部滞留时间测定结果

结论：与传统滴眼液相比，NGF眼用原位凝胶眼部滞留时间显著增长。

试验例5

家兔眼刺激性实验：眼睛是最敏感的器官，且本研究中的基质辅料为高分子化合物，所以需考察制剂对兔眼的刺激性。

采用动物同体左右侧自身对比法：

单次给药刺激性实验：将NGF眼用原位凝胶(实施例1)1滴滴入兔子右眼结膜囊内，左眼滴入生理盐水作空白对照。给药后，兔眼睑被动闭合约10秒钟，记录给药后6、24、48、72小时、7天眼局部反应情况。

多次给药刺激性实验：将NGF眼用原位凝胶(实施例1)以临床用量直接滴入兔右眼，左眼滴入生理盐水作空白对照。给药后，兔双眼睑被动闭合约10秒钟，每日2次，连续2周。观察每天给药前眼部情况(每天给药前观察一次，共两次，取两次中的最高分)，以及最后一次给药后12h(小时)、24h、48h、72h时各兔角膜、虹膜及结膜的情况。

下表是眼部刺激性试验评分表

下表是刺激性评价标准

刺激程度	积分
		无刺激性	0-3分
轻度刺激性	4-8分
		中度刺激性	9-12分
重度刺激性	13-16分

下表是单次给药对家兔眼刺激性实验结果

下表是多次给药刺激性实验结果

家兔眼刺激性实验结论：

1.单次给药：结膜与虹膜无充血、红肿与肿胀，角膜无混浊等现象。刺激性评分均为零。

2.多次给药：兔眼有轻微的结膜充血现象，计为1分，停药后1至2天充血现象消失，眼部刺激反应平均积分均不超过1分。

NGF眼用原位凝胶(实施例1)单次与多次给药对兔眼无刺激

试验例6

NGF眼用原位凝胶对LASIK术后角膜神经再生作用的动物研究

1.试验方法

选取体检合格的比利时兔施行双侧LASIK手术，右眼为自身对照组，左眼为试验组，分别给以生理盐水和不同浓度NGF眼用原位凝胶。将手术成功的兔子随机分成5组，每组6只，共24只。组I、组II、组III、组IV、组V的每只兔子左眼分别给不同浓度NGF眼用原位凝胶0、50、100、200、400μg/ml进行治疗，右眼给生理盐水。每组从术后第一天起给药，20μl/次，每日2次，给药时间为6个月。在术前、术后1d、14d、1m、3m、6m测定手术眼及对照眼角膜神经数量。

2.试验结果

LASIK术后各组试验兔角膜神经纤维数量见表7。

下表表示：LASIK术后各时间点角膜神经纤维数量

时间	NS	NGF50μg/ml	NGF100μg/ml	NGF200μg/ml	NGF400μg/ml
						0d	42.60±2.38	40.11±1.41	39.74±1.54	42.33±2.73	41.12±2.29
1d	2.60±0.38	2.11±0.46	2.75±0.51	2.39±0.28	2.32±0.24
						14d	3.90±0.77	4.31±0.62	4.80±0.60^*	5.10±0.57^*	5.70±0.81^*
1m	6.83±0.75	6.97±0.84	7.25±0.72^*	9.06±0.70^**	9.18±0.76^**
						3m	13.52±1.97	16.75±1.72^*	25.18±2.35^**	29.80±2.60^**	32.39±2.31^**
6m	26.47±2.47	30.10±2.88^*	40.76±3.71^**	44.89±3.30^**	45.57±2.86^**

与NS组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01

结论：NGF各试验剂量组均有促进LASIK术后角膜神经纤维数量增加的作用，并呈量效关系，各剂量组均较对照组有显著性差异。

试验例7

NGF眼用原位凝胶(实施例1)与NGF滴眼液用于LASIK术后角膜瓣神经修复治疗比较

采用随机双盲前瞻性对照研究，将30例(60眼)行LASIK的青壮年近视患者随机分为NGF眼用原位凝胶组15例(30眼)和NGF滴眼液组15例(30眼)，2组患者在行LASIK术后分别接受NGF眼用原位凝胶或NGF滴眼液局部点眼，所有患者用药10天，NGF眼用原位凝胶组每日1次，NGF滴眼液组每日3次，分别检查术前、术后6个月角膜神经密度。术后10天，30例患者除16眼角膜可见上皮下纵行1～2支神经纤维外，余角膜未见上皮下神经丛。NGF眼用原位凝胶组与NGF滴眼液组无明显差异。术后6个月切削区内角膜上皮下浅基质层神经纤维仍未达到术前水平。2组角膜瓣中央区新生神经纤维数量均明显增加，且NGF眼用原位凝胶组优于NGF滴眼液组。2组患者中均未发现角膜新生血管、结膜充血、上皮细胞剥落、基质层水肿、内皮减少等不良事件。结果表明NGF在LASIK术后对角膜神经纤维的修复有促进作用，NGF眼用原位凝胶与NGF滴眼液均安全有效，用药过程未发现全身不良反应，局部反应轻微。但NGF眼用原位凝胶不易外溢，可以减少滴眼次数，给药次数仅是滴眼剂的1/3，且NGF眼用原位凝胶与NGF滴眼液相比异物感下降显著。原位凝胶优于滴眼液。

Claims

1.一种眼用原位凝胶组合物，包括：

神经生长因子 50μg/ml～400μg/ml；

稳定剂 1mg/ml～20mg/ml；

温度敏感型凝胶 5mg/ml～400mg/ml；

水；

该原位凝胶组合物的pH值为4.5～7.5；

其中，所述稳定剂选自氨基酸、氨基酸与非离子表面活性剂的混合物和氨基酸与醋酸盐；所述温度敏感型凝胶在35℃以上能够由液态变成凝胶状态。

2.根据权利要求1所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，所述稳定剂为氨基酸。

3.根据权利要求1所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，所述稳定剂为氨基酸与非离子表面活性剂的混合物。

4.根据权利要求1所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，所述稳定剂为氨基酸与醋酸盐。

5.根据权利要求2～4的任意一项所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，所述氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和精氨酸的混合物。

6.根据权利要求1所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，还包括pH值缓冲剂。

7.根据权利要求6所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，所述pH值缓冲剂为磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸及盐、碳酸盐。

8.根据权利要求1所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，温度敏感型凝胶选自泊洛沙姆407、泊洛沙姆188和壳聚糖。

9.根据权利要求1所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，还包括防腐剂。

10.根据权利要求9所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，所述防腐剂选自苯甲醇、苯酚、间甲酚、羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、三氯叔丁胺醇、苯扎氯铵、苯扎溴胺、洗必泰。

11.根据权利要求9或10所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，所述防腐剂的量为0mg/ml～100mg/ml。

12.根据权利要求1所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，还包括渗透压调节剂。

13.根据权利要求12所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，所述渗透压调节剂选自甘露醇、山梨醇、氯化钠、枸橼酸钠。

14.根据权利要求1所述的眼用原位凝胶组合物，其特征在于，还包括医用亲水高分子材料，所述医用亲水高分子材料中含有以下物质中的至少一种：甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、透明质酸钠、甘油磷酸钠。