CN1294147C - 动物血纤维连接蛋白联产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种将FN、SOD、免疫球蛋白、血红素几种生化物质，在同一个工艺流程中分离提取出来的动物血纤维连接蛋白联产方法，向新鲜动物血中加入柠檬酸三钠抗凝，迅速离心，分别收集血浆和血球，贮存于10度以下环境中，向血浆中加硫酸铵至饱和度20——-30%，静置1小时以上，过滤或吊滤，取沉淀物溶鲜，上亲和层析柱，提取分离出FN主峰液，再经分子筛层析纯化，超滤浓缩，除菌，最后冷冻干燥，得FN产品，具有原料来源丰富，工艺简单，适合规模化生产的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种将FN、SOD、免疫球蛋白、血红素几种生化物质，在同一个工艺流程中分离提取出来的动物血纤维连接蛋白联产方法。
背景技术
纤维连接蛋白也称“纤粘蛋白”、“纤维结合索”，国内通用名“FN”，英文Fibronectin。FN是1974年国外研究发现的一种大分子糖蛋白，具有多种生物活性和生物学功能。目前国内外大量对FN的应用研究主要表现在两个方面：1、作为生化试剂，为细胞培养和生物工程的工业化应用提供基础。2、应用于多种疾病的诊断和治疗，(如：伤口的修复和愈合，癌症的诊断和治疗等)。美国sigma公司已生产有牛血，鼠血，人血FN生化试剂。我国至今没有FN上市产品，其应用主要依靠进口。从90年代初开始，我国一些大专院校和科研单位对人血浆提取FN进行研究和小量临床论证，近几年也有少数单位对动物血提取FN开始研究，但至今都处于实验室制备，实验报告，论证探讨阶段。目前报导的制备方法均为单产，工艺复杂，成本高，不适合工业化规模生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足而提供的一种原料来源丰富，工艺简单，适合规模化生产的动物血纤维连接蛋白联产方法。
本发明的目的是这样来实现的：其工艺步骤如下：
A、向新鲜动物血中加入柠檬酸三钠抗凝，离心，分别收集血浆和血球，贮存于10度以下环境中；
B、向A步骤中所得到的血浆中加硫酸铵至饱和度20-30％，静置1小时以上，过滤，收集纤维连接蛋白沉淀物并溶解，上亲和层析柱，提取分离出FN主峰液，再经分子筛层析纯化，超滤浓缩，最后冷冻干燥，得FN产品；
C、向B步骤的滤液中加入硫酸铵至饱和度50-60％，静置1小时以上，过滤，收集沉淀物，经超滤脱盐，冷冻干燥，得免疫球蛋白产品；
D、用生理盐水将A步骤中的血球洗涤干净，加等体积水溶血，溶血液在温度为60---75度下加热10-20分钟，过滤分别收集滤液和血红蛋白沉淀；
E、将D步骤中的滤液按体积加入0.25倍的乙醇、0.15倍的氯仿，在4度环境下静置1小时以上，离心、收集上清液，经超滤浓缩制得SOD粗品液；
F、将D步骤中得到的血红蛋白沉淀物用水调成粥状，然后按体积加入3-5倍丙酮和盐酸混合液，过滤，向滤液中加入滤液体积1％的乙酸钠或5％鞣酸，静置30分钟以上，离心或过滤，收集沉淀物即为血红素粗品。
本发明具有如下优点：
1、工艺为联产，比单产工艺设备利用率高，节约原料、辅料、人力，可显著降低FN、SOD、免疫球蛋白、血红素生产成本。
2、工艺中FN制备采用了盐析，与层析相结合的方法，既可提高投料量，节省价格昂贵的层析介质和生产周期，同时又分离出免疫球蛋白。
3、工艺中SOD制备采用先加热(60---75度)，使大部分血红蛋白热变性分离出来，又保持了SOD活性，血红蛋白沉淀物又可提取出血红素，比单产工艺显著节约试剂的用量。
具体实施方式
采集新鲜动物血，加入柠檬酸三钠抗凝，迅速离心，分别收集血浆和血球，贮存于10度以下环境中；向血浆中加硫酸铵至饱和度20-30％，静置1小时以上，过滤，取纤维连接蛋白沉淀物溶解，上亲和层析柱，提取分离出FN主峰液，再经分子筛层析纯化，超滤浓缩，除菌，最后冷冻干燥，得FN产品。
向滤液中加入硫酸铵至饱和度50-60％，静置1小时以上，过滤，收集沉淀物，经超滤脱盐，脱水浓缩，冷冻干燥，得免疫球蛋白产品。
用生理盐水将血球洗涤干净，加等体积水溶血，溶血液在温度为60---75度下加热10-20分钟，过滤分别收集滤液和血红蛋白沉淀；将滤液按体积加0.25倍的乙醇、0.15倍的氯仿，在4度环境下静置1小时以上，离心、收集上清液，经超滤浓缩制得SOD粗品液；血红蛋白沉淀物用水调成粥状，然后按体积加入3-5倍丙酮和盐酸混合液，过滤，向滤液中加入滤液体积1％的乙酸钠或5％鞣酸，静置30分钟以上，离心或过滤，收集沉淀物即为血红素粗品。
动物血与3.8％的柠檬酸三钠抗凝剂的重量比优选：7-10∶1，离心时间为10-20分钟，每分3000-5000转。纤维连接蛋白沉淀物溶解上亲和层析柱再经分子筛层析柱进行纯化，将纯化液经超滤浓缩，冷冻干燥。经离心后得到的血球用生理盐水洗涤2-3次，之后，加入蒸馏水，蒸馏水体积与干净红血球体积比：1∶1，使血球变成溶血液，然后60-75度加热10-20分钟使大部分血红蛋白沉淀。溶血液先加热使血红蛋白沉淀，滤液加95％乙醇和氯仿，4度预冷。将SOD粗品液经过离子交换层析、分子筛层析分离纯化得SOD成品液。血红蛋白沉淀用少量水调成粥状，加丙酮盐酸液为pH2～3，搅拌水解10～30分。
实施例1：
以1000毫升动物血进行FN联产工艺生产方法如下：
1、采集新鲜动物血1000毫升，加入100毫升量的3.8％的柠檬酸三钠抗凝剂，离心10分钟，每分钟5000转，分别收集血球和血浆，贮存于10度以下环境中。
2、向所得到的血浆中，按体积加入硫酸铵至饱和度20％，搅拌溶解后静置1小时以上。过滤或吊滤，分别收集纤维连接蛋白沉淀物和滤液。
将纤维连接蛋白沉淀物溶解，上亲和层析柱，所述的上亲和层析柱是明胶-琼脂糖凝胶2B，提取分离出FN主峰液；再经分子筛层析柱，所述的分子筛层析柱是葡聚糖凝胶G75，进行纯化，将纯化液经超滤浓缩，除菌，冷冻干燥得FN成品。
将滤液按体积第二次加入硫酸铵至均和度50％，静置1小时以上，过滤，收集沉淀物，经超滤脱盐，脱水浓缩，冷冻干燥，得免疫球蛋白。
3、将第一步骤中的血球用生理盐水洗涤2次，干净红血球按体积加等量蒸馏水，搅拌溶血。溶血液加热至60℃，保温10分钟。然后过滤或离心分别收集滤液和血红蛋白沉淀。
滤液按体积加0.25倍乙醇(95％)和0.15倍氯仿，放4℃环境下静置1小时以上，离心10分钟，收集上清液，经超滤浓缩制得SOD粗品液。将SOD粗品液经过离子交换层析(所述的离子交换层析是二乙胺基乙基-葡聚糖凝胶A25)和分子筛层析(所述的分子筛层析是葡聚糖凝胶G75)分离纯化得SOD成品液。
血红蛋白沉淀物用少量水调成粥状，加入3倍的丙酮和盐酸混合液(Ph值为2)，搅拌水解10分钟，过滤或离心，收集滤液，向滤液中加入滤液体积1％的乙酸钠或5％鞣酸，充分搅拌，静置30分钟以上，离心或过滤，收集沉淀物，经脱水，干燥得血红素粗品。
实施例2：
1、采集新鲜动物血1000毫升，加入142毫升的3.8％的柠檬酸三钠抗凝剂，离心20分钟，每分3000转，分别收集血球和血浆。
2、血浆按体积加入硫酸铵至饱和度30％，搅拌溶解后静置1小时以上。过滤或吊滤，分别收集沉淀和滤液。将沉淀物溶解上亲和层析柱，所述的上亲和层析柱是明胶-琼脂糖凝胶6B，再经分子筛层析柱，所述的分子筛层析柱是葡聚糖凝胶G200，进行纯化，将纯化液经超滤浓缩，冷冻干燥得FN成品。
将滤液按体积第二次加入硫酸铵至均和度60％，过滤，收集沉淀，经超滤脱盐，冷冻干燥，得免疫球蛋白。
3、血球用生理盐水洗涤3次，干净红血球按体积加等量蒸馏水，搅拌溶血。溶血液加热至75℃，保温20分钟。然后过滤或离心分别收集滤液和血红蛋白沉淀。
滤液按体积加0.25倍乙醇(95％)和0.15倍氯仿，放10℃环境下静置1小时以上。离心20分，收集上清液，经超滤浓缩制得SOD粗品液。将SOD粗品液经离子交换层析，所述的离子交换层析是二乙胺基乙基-葡聚糖凝胶A50，分子筛层析，所述的分子筛层析是葡聚糖凝胶G200，分离纯化得SOD成品液。
血红蛋白沉淀用少量水调成粥状，加入5倍丙酮盐酸液(Ph3)搅拌水解30分，过滤或离心，收集红色清液(滤液)。按体积加入5％鞣酸(或1％乙酸钠)，充分搅拌，静置30分钟以上，离心或过滤，收集沉淀，经脱水，干燥得血红素粗品。
Claims (5)
1、一种动物血纤维连接蛋白联产方法，其特征在于：由下述步骤完成：
A、向新鲜动物血中加入柠檬酸三钠抗凝，离心，分别收集血浆和血球，贮存于10度以下环境中；
B、向A步骤中所得到的血浆中加硫酸铵至饱和度20-30％，静置1小时以上，过滤，收集纤维连接蛋白沉淀物并溶解，上亲和层析柱，提取分离出FN主峰液，再经分子筛层析纯化，超滤浓缩，最后冷冻干燥，得FN产品；
C、向B步骤的滤液中加入硫酸铵至饱和度50-60％，静置1小时以上，过滤，收集沉淀物，经超滤脱盐，冷冻干燥，得免疫球蛋白产品；
D、用生理盐水将A步骤中的血球洗涤干净，加等体积水溶血，溶血液在温度为60---75度下加热10-20分钟，过滤分别收集滤液和血红蛋白沉淀；
E、将D步骤中的滤液按体积加入0.25倍的乙醇、0.15倍的氯仿，在4度环境下静置1小时以上，离心、收集上清液，经超滤浓缩制得SOD粗品液；
F、将D步骤中得到的血红蛋白沉淀物用水调成粥状，然后按体积加入3-5倍丙酮和盐酸混合液，过滤，向滤液中加入滤液体积1％的乙酸钠或5％鞣酸，静置30分钟以上，离心或过滤，收集沉淀物即为血红素粗品。
2、根据权利要求1所述的一种动物血纤维连接蛋白联产方法，其特征在于：在A步骤中柠檬酸三钠的浓度为3.8％，动物血与的柠檬酸三钠抗凝剂的重量比为：7-10∶1，离心时间为10-20分钟，每分钟3000-5000转。
3、根据权利要求1所述的一种动物血纤维连接蛋白联产方法，其特征在于：在B步骤中所述的上亲和层析柱是明胶—琼脂糖凝胶2B，所述的分子筛层析柱是葡聚糖凝胶G75。
4、根据权利要求1所述的一种动物血纤维连接蛋白联产方法，其特征在于：将E步骤中的SOD粗品液经过离子交换层析和分子筛层析分离纯化得SOD成品液，所述的离子交换层析是二乙胺基乙基—葡聚糖凝胶，所述的分子筛层析是葡聚糖凝胶。
5、根据权利要求1所述的一种动物血纤维连接蛋白联产方法，其特征在于：在所述的F步骤中的丙酮和盐酸混合液中，丙酮与盐酸的体积比为97∶3，丙酮和盐酸混合液的pH为2～3，血红蛋白沉淀物与丙酮和盐酸混合液的搅拌水解时间为10～30分钟。
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