MX2007014571A

MX2007014571A - Purificacion de trombina.

Info

Publication number: MX2007014571A
Application number: MX2007014571A
Authority: MX
Inventors: Dan Pawlak; Bradley H Knoll; Abdel Hak Terrab; Gerald Chesmore; Foster Irwin
Original assignee: King Pharmaceuticals Res & Dev
Priority date: 2005-05-26
Filing date: 2006-05-25
Publication date: 2008-02-07
Also published as: NZ564058A; BRPI0610339A2; CA2609520A1; EP1885387A4; AR060686A1; KR20080019583A; IL186790A0; US20060270015A1; JP2008541731A; US20080280343A1; WO2006127990A3; WO2006127990A2; EP1885387A2

Abstract

La invencion se refiere a composiciones de trombina con niveles reducidos de impurezas de peso molecular elevado. En particular, los niveles del factor Va, de los priones y/o de los agentes virales, son ampliamente reducidos. Esta invencion tambien se refiere en general a metodos para la preparacion de trombina que tiene un alto grado de pureza y una actividad especifica elevada. Mas especificamente, la invencion abarca las etapas de exclusion de las impurezas de peso molecular elevado de las preparaciones de trombina por la filtracion pro exclusion de tamano. En las modalidades adicionales, la preparacion de la trombina incluye adicionalmente una etapa de filtracion por intercambio ionico. Los metodos de la invencion son particularmente adecuados para la purificacion a gran escala de la trombina. Esta invencion tambien se refiere en general a formulaciones estabilizadas que contienen composiciones de trombina. Mas especificamente, la presente invencion se refiere a formulaciones liquidas, estabilizadas, que contienen trombina, que tienen un alto grado de pureza y una actividad especifica elevada y a metodos de fabricacion y de uso de tales formulaciones.

Description

PURIFICACIÓN DE TROMBI2S& Campo ge la Invención La invención se refiere en general a la preparación de troijabina purificada, substancialmente libre de impurezas de peso molecular grande, tales como el factor Va, priones y/o agentes virales que pueden contribuir a efectos adversos en los pacientes. Esta invención también se refiere a métodos para la preparación de trombina substancialmente libre de agentes virales, que tiene un alto grado de pureza y actividad específica elevada. Más específicamente, la invención abarca métodos que comprenden excluir impurezas de peso molecular elevado de las preparaciones de trombina. Esta invención también se refiere en general a formulaciones de preparaciones de trombina que tienen un alto grado de pureza, y una actividad y estabilidad específicas elevadas. Antecedentes de la Invención La trombina es una enzima proteolítica, la cual aparece en la sangre después de la activación del sistema de coagulación como un resultado de la proteólisis de la protrombina. La trombina facilita la coagulación de la sangre por la catalización de la conversión del fibrinógeno a fibrina, la cual forma los coágulos sanguíneos, y libera los fibrinopéptidos A y B. Después de una alteración al sistema vascula , la producción de trombina es principal con respecto al procqso de coagulación.

Ref «186785 Las preparaciones de trombina han sido aprobadas por la FDA para que sean aplicadas tópicamente como un adyuvante para la homeostasis ya sea si una supuración de la sangre o una hemorragia menor de los capilares y de las vénulas pequeñas son accesibles. La aplicación tópica de la trombina disponible comercialmente acelera significativamente la coagulación de la sangre y reduce significativamente el punto de coagulación. Los estudios utilizando formulaciones de trombina de pureza baja indican que las coagulopatías pueden ocurrir en pacient;es en respuesta a la exposición a formulaciones de trombina tópicas, de pureza baja. Las impurezas presentes típicamente en las preparaciones de trombina disponibles comercialmente incluyen el factor Va, la albúmina del suero de boviµo (BSA) (por sus siglas en inglés) , y otras proteínas de peso molecular elevado. i La contaminación con el factor Va de las formulaciones de trombina de bovino, comerciales, puede estimular la producción de los anticuerpos del factor Va de antibovi.no del paciente, los cuales reaccionan de manera cruzada con el propio factor Va del paciente, por lo cual conducen a una homeostasis alterada. La fuerza de aglutinación de la sangre de la trombine. es medida en unidades/ml. Mientras más concentrada está la muestra, mayor es su potencia, y más rápido coagulará la sangre (o creará un fibrinógeno) . La actividad específica es una proporción de la potencia de una muestra dividida entre s¡u contenido de proteína y es expresada en unidades por miligrc.mo de proteína. La actividad específica de la trombina depende de la pureza de la trombina. La trombina altamente purificada muestra¡ un incremento en la actividad específica cuando se compara con una preparación menos pura. Previamente, la purificación de la trombina ha sido limitada generalmente al uso de la cromatografía de intercambio iónico convencional. La patente de los Estados Unidos de América No. 5,397,704 describe una preparación de bovino de trombina que es preparada utilizando una serie de cromatografía de intercambio aniónico y catiónico. La patente de los Estados Unidos de América No. 5,151,355 describe una preparación de trombina de bovino que se hace: por la reacción de una unidad de protrombina con menos c.e 5 unidades de tromboplastina en la presencia de calcio. La trombina es aplicada entonces consecutivamente a una columna de agarosa de intercambio aniónico y una columna de agarfsa de intercambio catiónico. La patente de los Estados Unidos de América No. 4,965,203 describe un método de purificación de la trombina de bovino en la cual la trombina se hace pasar a través de una serie de columnas de cromatografía de intercambio iónico y luego es formulada con un poliol y amortiguadores. Aunque las preparaciones de trombina anteriores se alega que tienen una actividad específica elevada, tales esquemas de purificación no proporcionan ningún medio para eliminar efectivamente las impurezas de peso molecular elevado. La solicitud de patente de los Estados Unidos de América No . 2001/0033837 describe un método de purificación de una preparación de trombina utilizando la cromatografía de interacción hidrofóbica, seguido opcionalmente por cromatografía de intercambio catiónico. Aunque el método de purificación de la trombina incluye la cromatografía de interacción hidrofóbica, el método descrito para la purificación y remoción del virus no es capaz de lograr la remoción del virus y la actividad o pureza específica abarcadas por la presente invención. En consecuencia, existe una necesidad de métodos que pueden ser utilizados para producir trombina que tiene un grado de pureza más elevada. Tal trombina purificada tendrá niveles inferiores de impurezas de peso molecular elevado, tales como el factor Va, y un margen de depuración elevado de agentes virales y priones. Aunque la trombina que tiene un alto grado de pureza puede ser más segura para su uso puesto que las impurezas tales cerno el factor Va y BSA son reducidas o eliminadas, la trombinal altamente purificada es difícil de formular en formulaciones estabilizadas. Mientras más pura es la trombina, menos estable es y más difícil de formular en formulaciones estabilizadas. Por lo tanto, subsiste una necesidad de formulaciones estabilizadas que contengan trombir.a que tengan un alto grado de pureza y una actividad específica elevada. Breve Qescripción de la Invención La presente invención está dirigida a composiciones de pr?trombina y a métodos de preparación de estas composi.ciones. Cuando se utilicen aquí, los términos formulación, composición, y preparación pueden ser utilizados intercambiablemente. Las formulaciones, composiciones, y preparaciones contempladas por la invención contienen trombina, preferentemente trombina que tiene una pureza mejorada, y también pueden contener excipientes adicionales, en particular aquellos que imparten estabilidad a la formulación, composición o preparación. En una modalidad, la presente invención comprende un método ?ie preparación de la trombina que tiene una actividad específica elevada, una pureza mejorada y está substancpialmente libre de impurezas, incluyendo partículas virales, el factor Va y priones . De acuerdo con la presente invención, los métodos para las preparaciones de la trombina que tienen impurezas mejoradas pueden incluir una o más de las siguientes etapas: filtración por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico o por exclusión de tamaño, tratamiento térmico, ajuste del pH, y radiación electromagnética. En la presente invención, la fuente de trombina puede ser de bovino o de ser humano, En todavía otra modalidad, el método de la presente invención es capaz de reducir impurezas en la preparación en al menos 50 %, cuando se compara con las preparaciones disponibles comercialmente, tales como, Thrombin-JMl®. Más preferentemente el método de la presente invención es capaz de reducir las impurezas en la preparación de trombina en al menos HO % cuando se compara con una trombina de bovino prepurificada o de pureza baja como se describió aquí. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, el método ss capaz de incrementar la actividad específica de una preparación de trombina en al menos 1000 %, 1200 % o 1500 % cuando se compara con la trombina de bovino prepurificada o de pureza baja como se describió aquí. De acuerdo con la presente invención, la etapa de filtración por exclusión de tamaño es utilizada para excluir las impurezas que tienen un peso molecular mayor que 40 kDa. Preferentemente, el filtro por exclusión de tamaño excluye las impurezas que tienen pesos moleculares que varían desde 40 kDa hasta 300 kDa. Más preferentemente, el filtro por exclusión de tamaño tiene un corte de peso molecular que varía desde 50 kDa hasta 150 kDa. En otra modalidad de la invención, el filtro por exclusión de tamaño tiene un corte de peso molecular de 50 kDa. En otra modalidad, el filtro por exclusión de tamaño tiene un corte de peso molecular de 100 kDa. El método de la presente invención también puede incluir la aplicación de una preparación de trombina para las etapas de cromatografía adicionales, tales como una cromatografía de intercambio iónico y/o una cromatografía por exclusión de tamaño. En otra modalidad, el método de la presente invención comprende la aplicación de un tratamiento térmico a una preparación de trombina. Preferentemente, el tratamiento térmico incluye el mantenimiento de la trombina a 60 aC durante 10 horas. En otra modalidad, el método de la presente invención comprende reducir el pH de una preparación de trombinf. a aproximadamente 5 o un valor inferior. En todavía otra modalidad, el método de la presente invención comprende la aplicación de radiación electromagnética a una preparación de trombina. La radiación electromagnética puede ser radiación gamma o radiación UV. La presente invención abarca un método para la preparacion a gran escala de la trombina que tiene una pureza mejorada que comprende la aplicación de al menos 15 1 de una preparacion de trombina a un filtro por exclusión de tamaño.

En una modalidad preferida, la presente invención está dirigida a un método para la preparación a gran escala de la trombina que tiene una pureza mejorada que comprende la aplicación de al menos 15 1 de una preparación de trombina a un fil:ro por exclusión de tamaño en donde los 15 1 de la prepare.ción de trombina comprenden aproximadamente 300, OOC, 000 unidades de trombina. La presente invención también está dirigida a una composición de trombina. En una modalidad, la composición de trombina está substancialmente libre de impurezas. En otra modalidad, la composición de trombina está substancialmente libre ce impurezas que tienen un peso molecular mayor que 40 kDa. Preferentemente, la composición de trombina está substancialmente libre de impurezas que tienen un peso molecular entre 40 kDa y 300 kDa. En todavía otra modalidad, la composición de trombina de la presente invención está substancialmente pura. Preferentemente, la composición de trombina está substancialmente libre del factor A. Más preferentemente, el factor Va está presente en menos de 0.4 µg/1000 unidades de trombina. Adicionalmente, la cantidad del factor Va puede ser medida por el ensayo de la actividad del factor Va, ELISA, o el ensayo de Western blot. En otra modalidad de la presente invención, la composición de trombina tiene una actividad específica mayor que 1800 u/mg de la proteína y está substancialmente libre de impure?as que tienen un peso molecular mayor que 40 kDa. La composición de trombina de la presente invención puede tener una actividad específica entre aproximadamente 1800 u 3000 u/mg de proteína. Preferentemente, la composición de trombina puede :ener una actividad específica entre aproximadamente 2400 y 2500 u/mg de la proteína o entre aproximadamente 2500 y 2600 u/mg de proteína, entre aproximadamente 2600 y 2700 u/mg d la proteína, entre aproximadamente 2700 y 2800 u/mg de la proteína, entre aproximadamente 2800 y 2900 u/mg de la proteína o entre aproximadamente 2900 y 3000 u/mg de la proteína. Adicionalmente, la composición de trombina puede tener una actividad específica mayor que 3000 u/mg de la proteína. La presente invención también está dirigida a una composición de trombina substancialmente libre de agentes virales. La composición de trombina de la presente invención puede estar substancialmente libre de agentes virales, en donde el valor de reducción logarítmica es mayor que 3.5 por virus La presente invención también está dirigida a fórmulas estabilizadas que comprenden trombina que tienen un alto grado de pureza y una actividad específica elevada y a métodos de f bricación y uso de tales formulaciones . Aún cuando la estabilidad de las formulaciones puede reducirse cuando la pureza de la trombina se incrementa, los inventores han descubierto formulaciones estabilizadas que comprenden trombina que tiene un grado elevado de pureza y una actividad específica elevada. Las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención comprenden trombina y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones estabilizadas de la presente invención pueden contener la trombina aislada de cualquier fuente incluyendo, pero sin estar limitado a, las fuentes de bovino y del ser humano. Adicionalmente, la trombina puede ser cualquier preparación o composición de trombina tales como las composiciones de trombina purificada de la presente invención o la Thrombin JMl® disponible actualmente de manera comercial. En una modalidad preferida, la trombina tiene un alto grado de pureza y una actividad específica elevada. Además de la trombina, las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención incluyen un excipiente. En ciertas modalidades, los excipientes adecuados para las formulaciones de la presente invención incluyen pero no están limitados a, glicerol; polietilenglicol; sales; solucior.es acuosas, tales como agua, ácidos y bases o una combinación de los mismos. Las sales preferidas incluyen, pero no están limitadas a, cloruro de sodio, acetato de sodio, citrato de sodio o una combinación de los mismos . Los ácidos y bases adecuados incluyen, pero no están limitados a, ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Preferentemente, las formulaciones de la presente invención tienen un pH de 5-9 o más preferentemente un pH de 6-8. Preferentemente, las formulaciones de trombina estábil .izadas de la presente invención comprenden 20-40 % de glicerol en volumen, 1-20 % de polietilenglicol en volumen, una concentración 0.15-0.3 M de cloruro de sodio y una concentoración 0.025-0.05 M de acetato de sodio. En una modalidad preferida de la presente invención, las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente -ón comprenden trombina purificada; glicerol; polietilenglicol; cloruro de sodio, acetato de sodio y un pH de 6-8. En ciertas modalidades, las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención son líquidas. Alternativamente, las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención pueden ser sólidas, en donde, previo a la administración, la formulación de trombina sólida, estabilizada, es disuelta o suspendida en un líquido. Adicionalmente, la presente invención también está dirigida a métodos de administración de las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención. Preferentemente, las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención son administradas tópicamente a la superfi|cie de un lumen del cuerpo. La presente invención también está dirigida a kits que comprenden formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención. En ciertas modalidades de la invención, los kits comprenden una formulación de trombina estabilizada; un viall capaz de contener la formulación de trombina; y una agu a, En otras modalidades de la invención, los kits comprenden una formulación de trombina y un dispositivo que es capaz de rociar la formulación de trombina. Los dispositivos de rociado incluyen, pero no están limitados a, una punta rociadora o una bomba rociadora, La presente invención está dirigida a formulaciones de tromoina especializadas que mantienen al menos 60 % de su potencia inicial durante un período de dos años . En las modalidades preferidas, las formulaciones mantienen al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % 95 % de su potencia inicial La invención está dirigida particularmente a formulaciones que mantienen al menos 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencia inicial después de 3 meses, al menos 70 %, 80 %, 85 %, o 90 %, 95 % de su potencia inicial después de 6 meses, al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencia inicial después de 9 meses, al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de su potencia inicial después de 12 meses, y al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de su potencia inicial después; de 18 meses. La presente invención también está dirigida a formulaciones de trombina estabilizadas que contier.en al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la potenci.a reivindicada de la etiqueta durante un período de dos añDs. La invención está dirigida a formulaciones que mantienen al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencia de la etiqueta inicial después de 3 meses, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencia de la etiqueta inicial después de 6 meses, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de su potencia de la etiqueta inicial después de 9 meses, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % dé su potencia de la etiqueta inicial después de 12 meses , al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de su potencia de la etiqueta inicial después de 18 meses. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra un diagrama de flujo de la totalid d de las etapas utilizadas para preparar una preparación de trombina, de acuerdo con el método de la presente invención. La figura 2 muestra una comparación de la electro oresis del gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) (por sus siglas en inglés) de la Thro bin- JMI® después de la adición del proceso de purificación de la presente invención (bandas 7, 8 y 9) hasta Thrombin-JMl® como se fabricó comúnmente (bandas 4 y 5) y la retentiva de la filtración por exclusión de tamaño, que muestra las impurezas de pesq> molecular elevado (banda 11) . La figura 3 muestra un método de fabricación de las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invencion, Descripción Detallada de la Invención La presente invención está basada en el descubrjimiento de que el uso de la filtración por exclusión de tamaño sola o en combinación con otras etapas de purificación, para la purificación de la trombina, proporciona beneficios substanciales sobre los métodos de purificación de la trombina del arte previo. Los métodos de purificación de la trombina de la presente invención proporc.lionan trombina que es significativamente más pura y segura, debido a la remoción substancial o a la eliminación de las impurezas de peso molecular elevado. Los métodos de la present;e invención también proporcionan un alto grado de depuración viral, en compañía de consistencia, confiabilidad, y facilidad de uso. La presente invención abarca la aplicación de etapas de purificación a una preparación de trombina y recuperación de la trombina purificada. Estas etapas incluyen, pero no están limitadas a, purificación cromatográfica; aplicación de una preparación de trombina a un filtro por exclusión de tamaño; la aplicación de la preparación de trombina por exclusión de tamaño; la reducción del pH; o la irradiación de la preparación de trombina con radiación electromagnética.

Aunque la invención está basada en el descubrimiento del uso de la filtración por exclusión de tamaño, tales etapas de purificación pueden ser aplicadas independientemente o en combinación. Además, los métodos son capaces de una producción y purificación comercial, a gran escala. Los métodos de la presente invención también pueden producir cantidades grandes de tropjbina substancialmente libre de impurezas, que tienen un peso molecular mayor que 40 kDa y agentes virales. La presente invención también contempla la adición de uno o más excipientes a la trombina, conduciendo a una formulación de la trombina que es más estable que las formulaciones de trombina disponibles actualmente. Como tal, la presente invención resuelve muchos de los problemas de las formulaciones de trombina en el arte previo. Sin que este limitado por cualquier teoría particular, la capacidad para estabilizar las composiciones de trombina altamente purificadas de la presente invención pueden conducir a un tratamiento consistente y efectivo. Preferentemente, las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención comprenden trombina que tiene un alto grado de pureza y una actividad específica y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. La presente invención también abarca formulaciones de trombina, estabilizadas, líquidas, Fuente de trombina La trombina de cualquier fuente puede ser utilizada en las composiciones, formulaciones y métodos de la presente invención. Los ejemplos de las fuentes de trombina adecuadas para su uso en las composiciones, preparaciones y métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a la trombina aislada de las fuentes de bovino o de ser humano, También, las fuentes comerciales de trombina, tales como Thrombij JMl® pueden ser utilizadas en la presente invención. También la trombina de cualquier nivel de pureza o la trombina que resulta de cualquier preparación pueden ser utilizadas. Por ejemplo, la trombina pre-purificada como se describió aquí, puede ser utilizada en las composiciones, formulaciones y métodos de la presente invención.

Adicionalmente, la trombina que resulta de las preparaciones naturales o recombinantes, es adecuada para la presente invención. Purificación de trombina La presente invención incluye los métodos para la preparación de la trombina con una pureza incrementada, una actividad específica incrementada, y una seguridad incrementada debido a los niveles de impureza baja de las impurezas, tales como el factor Va, los priones, y las partículas virales. En ciertas modalidades, los métodos de la presente invenci.ón incrementan la pureza de la preparación de trombina en más del 30 %, más del 50 %, más del 75 %, o más del 90 %, cuando se compara con Thrombin-JMl®, u otra trombina purific:lada. Otra forma de la pureza es cuantificada por la medicióh de la actividad específica de la trombina. La actividad específica de la trombina puede ser medida por los ensayos estándares conocidos en el arte, incluyendo los ensayos de coagulación y los ensayos cromogénicos (véase, por e emploi, Gaffney, et al., 1995, Thromb Haemost 74:900-903). En una modalidad, los métodos de la invención proporcionan las preparaciones de trombina en donde la actividad específica de la preparación de trombina es incrementada en al menos 1000 %, al menos 1200 %, al menos 1500 %, o al menos 1800 %, comparado con la trombina pre-purificáda. Las composiciones de trombina de la presente invención tienen una actividad específica elevada; preferentemente la actividad específica de las composiciones de trombina de la presente invención es mayor que 1800 u/mg de la p oteína. La presente invención proporciona métodos de la invención para las preparaciones de trombina que tienen una actividad específica que varía desde aproximadamente 1800 u/mg y 3000 u/mg, más preferentemente entre aproximadamente 1800 u/mg y 2400 u/mg. En otras modalidades, la actividad específica está entre aproximadamente 2400 u/mg y 2500 u/mg, entre aproximadamente 2500 u/mg y 2600 u/mg, o entre aproximadamente 2600 u/mg y 2700 u/mg, entre aproximadamente 2700 y 2800 u/mg de la proteína, entre aproximadamente 2800 y 2900 u/mg de la proteína o entre aproximadamente 2900 y 3000 u/mg de la proteína. En ciertas modalidades, la trombina tiene una actividad específica mayor que 3000 u/mg. Preferentemente, después de la filtración por exclusión de tamaño, la actividad específica se eleva desde > aproxim.adamente 1500 u/mg hasta > aproximadamente 2300 u/mg. Utilizando ciertos métodos de la invención, los agentes virales y/o impurezas de peso molecular elevado son reducidos en al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 9!5 %, o al menos 99 %. En una modalidad preferida, las impurezas de peso molecular elevado y/o las impurezas de las partículas virales en la preparación de tro bina son reducidcts en al menos 80 %. La presente invención también proporciona métodos para la purificación de la trombina que comprenden la exclusión de las moléculas que tienen un peso molecular más elevado que la trombina. Los métodos para la purificación de la tromlina para eliminar al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos SO %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % y al menos S9 % de las impurezas que tienen un peso molecular más elevado que la trombina, son provistos. Para lograr la eliminación de las impurezas de peso molecular más elevado, es deseiable lograr recuperaciones de la trombina de al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, a,l menos 95 %, o al menos 99 %. También en ciertas modalidades de los métodos de la presentje invención, la recuperación de la trombina también es mayor cue 80 %, mayor que 85 %, mayor que 90 % o mayor que 95 %. Los métodos de la presente invención incluyen la aplicadion de etapas de purificación a una preparación de trombina y la recuperación de la trombina purificada. Las etapas de purificación de la presente invención incluyen la aplicac ion de una preparación de trombina a un filtro por exclusión de tamaño; purificación cromatográfica; aplicación de la preparación de trombina a un filtro de intercambio iónico, la reducción del pH; o la irradiación de la preparación de trombina con radiación electromagnética. Tales etapas pueden ser aplicadas independientemente o en combinación Filtradion y cromatografía por exclusión de tamaño De acuerdo con los métodos de la presente invención, la recuperación y purificación de las preparaciones de trombir.a pueden ser logradas excluyendo las impurezas utilizando los métodos que involucran las técnicas de separac ion basadas en el peso molecular. En general, cualquier método que involucra la separación basada en el peso molecular puede ser usado, incluyendo la filtración por exclusilón de tamaño y la cromatografía. En ciertas modalidades en donde los métodos de la presente invención utilizajn la filtración por exclusión de tamaño es preferible que los poros del filtro sean lo suficientemente grandes para permití-r el paso de las moléculas de trombina, pero lo suficientemente pequeñas para retener muchas impurezas, incluyendo las impurezas de proteínas grandes y virus . Puesto que la trombina tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kDa, es preferible, que, en ciertas modalidades, los métodos de la invención comprendan la aplicac:ión de una preparación de trombina a un filtro por exclusi.5n de tamaño capaz de excluir las impurezas que tienen un peso molecular mayor que 40 kDa de tamaño desde la preparación de la trombina. En una modalidad preferida, el filtro i por exclusión de tamaño es capaz de excluir las impurezas que tienen un peso molecular que varía desde 40 kDa hasta 300 kDa. Por consiguiente, los filtros por exclusión de tamaño de los cortes de peso molecular, es decir, con límite de exclusión, de 50, 100, 150, 300 kDa o mayores, pueden ser utilizados. En una modalidad, el filtro por exclusión de tamaño tiene un corte de peso molecular que varía desde 40 kDa hasta 300 kDa. En otra modalidad, el filtro por exclusión de tamajño tiene un corte de peso molecular que varía desde 50 kDa hasta 300 kDa. En todavía otra modalidad, el filtro de exclusión de tamaño tiene un corte de peso molecular que varía desde 50 kDa hasta 150 kDa. En una modalidad preferida, el filtro por exclusión de tamaño tiene un corte de peso molecular de 50 kDa. En una modalidad preferida, el filtro por exclusión de tamaño tiene un corte de peso molecular de 100 kDa. Esta etapa también puede incluir opcionalmente la aplicacion de la diafiltración para maximizar la recuperación de la trombina. En las modalidades preferidas, los filtros por exclusión de tamaño tendrán tamaños de los poros con un corte de peso molecular de aproximadamente 100 kDa.

Preferentemente, un filtro por exclusión de tamaño adecuado para la, presente invención también reduce efectivamente los agentes bacterianos y las endotoxinas . En ciertas modalidades, los filtros por exclusión de tamaño '< se hacen de poliétersulfona modificada sobre un respaldo de poliolefina altamente porosa. También, el filtro utilizado puede ser un filtro de flujo tangencial. Un ejemplo de un filtro que puede ser utilizado en esta invención es el OmegaTM 100K VR fabricado por PALL FILTRON Corporation. Otros filtros por exclusión de tamaño que pueden ser utilizaldoss de acuerdo con esta invención incluyen, pero no están limitados a Viresolve/70 fabricado por Millipore Corporaition; VirA/Grad 500 fabricado por A/G Technology, Corporation, y Ultipor DV20 fabricado por Pall Corporation. Con la filtración por exclusión de tamaño de las moléculas grandes, incluyendo las impurezas virales, las mismas quedan retenidas por los poros en la membrana. La membrana puede ser desechada después de su uso o, en la alternativa, las membranas pueden ser reutilizadas . Las membranas que conducen a una reducción logarítmica sufici<entemente elevada son consideradas aceptables, y pueden ser ut lizadas. Cada reducción logarítmica es una reducción del 90 %. Otras pruebas también pueden ser efectuadas sobre el fil- ro para asegurar que el filtro tenga un intervalo de tamaño de poro aceptable. En ciertas modalidades de los métodos de la presente invención, la depuración viral está en un valfr de reducción log (LVR) (por sus siglas en inglés) mayor que 3.5, preferentemente mayor que 4.0, más preferentemente mayor que 4.5. En ciertas modalidades, la depuracion del prión es a un valor de reducción log (LVR) mayor que 3.5, preferentemente mayor que 4.0, más preferdntemente mayor que 4.5. En ciertas modalidades de la invención, los volúmenes iniciales de 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, los múltiplos de los mismos, o mayores, son aplicados al filtro por exclusión de tamaño. La invención también abarca los métodos que comprenden la aplicación de al menos 300 ml de una preparación de trombina a un filtro por exclusión de tamaño. La invención también abarca métodos para una purificación comercial a gran escala de la trombina, que comprenden aplicar al menos 40 1 de una preparación de trombina a un filtro por exclusión de tamaño, preferentemente al menos 60 1 de una preparación de trombina a un filtro por exclusión de tamaño, más preferentemente al menos 90 1 de una preparación de trombina a un filtro por exclusión de tamaño. En ciertas modalidades, el volumen de la preparación de trombinsí aplicado al filtro por exclusión de tamaño depende del área superficial de los filtros utilizados y/o del número de filtros utilizados. En las modalidades preferidas de la invención, los volúmenes iniciales de 40 1 hasta 60 1, 60 1 hasta 80 1, 80 1 hasta 100 1, arriba de 100 1, o mayores y múltiplos de los mismos, son aplicados a un filtro por exclusión de tamaño. Ciertos métodos de la presente invención son particularmente adecuados para las purificaciones a gran escala de la trombina. Como tales, en las modalidades preferidas de la invención, los volúmenes iniciales de 15 1 hasta 2 O l y los múltiplos de los mismos son aplicados a un filtro por exclusión de tamaño. En una modalidad cuando 15 1 de la preparación de trombina son aplicados al filtro por exclusión de tamaño, la preparación de trombina comprende 300,000 ,000 unidades de trombina. Cromato rafía de intercambio iónico Utilizado solo o en conjunción con la filtración por exclusión de tamaño, el uso de la filtración de intercambio iónico también proporciona beneficios substanciales a la purificación de la trombina. La filtración de intercambio iónico proporciona un alto grado de depuración viral en compañí a de consistencia, confiabilidad y facilidad de uso. En ciertas modalidades, los métodos de la presente invención puede comprender además la aplicación de trombina a un filtlto de intercambio iónico. La filtración de intercambio iónico es un método de separación que filtra los solutos basado en su carga electrónica. Los filtros de intercambio iónico contienen centros de carga sobre la membrana de intercaihbio iónico. Cuando la muestra se hace pasar a través del fi Ltro, los compuestos cargados en la muestra se adsorberán sobre los centros de carga en la membrana. Un filtro es seleccionado que tiene una carga positiva y que retirarái por filtración la proteína cargada y las impurezas virales de la preparación de trombina. Los virus con la misma carga neta que el filtro no se aglutinarán a la resina y serán depurados durante la ruptura. ! Los filtros de intercambio iónico utilizados con esta invención son cargados preferentemente de manera positiva, mientras que las resinas de cromatografía de intercambio iónico utilizadas típicamente para la purificación de la trombina son cargadas negativamente. Los filtros de intercambio iónico son eficientes para remover ácidos nucleicos. En una modalidad preferida, un filtro de intercambio iónico tiene grupos de amina cuaternarios colgantes. Un filtro de intercambio iónico preferido que puede eer utilizado con esta invención es el filtro Mustang™ Q fabricado por Pall Corporation. Otro filtro de intercambio iónico que puede ser utilizado es el Cuno Zeta Plus VR05. Tratamiento térmico La aplicación de calor moderado también es una etapa adecuada que puede ser utilizada en los métodos de la presente invención para la purificación de la trombina. La aplicación de calor moderado también puede ser utilizada sola o de manera relacionada con la filtración o cromatografía por exclusión de tamaño así como con cualquiera de las otras etapas de purificación descritas aquí. Cualquier tipo de calor puede ser aplicado a la trombina, desde cualquier fuente, durante cualquier intervalo de tiempo siempre que las impurezas virales sean inactivadas y la trombina todavía permanezca a una actividad específica elevada.

En ciertas modalidades, la trombina puede ser calentajda en el intervalo de 40 aC hasta 100 SC. En las modalidades preferidas, la trombina es calentada hasta aproximadamente 60 2C. El tratamiento térmico puede ser aplicado a la trombina durante cualquier intervalo de tiempo. Por ejemplo, la trombina puede ser calentada durante 1 a 60 minutos o la trombina puede ser calentada durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 horas. En una modalidad preferida, se utiliza un tratamiento térmico que es aplicado a la trombina durante 10 horas a 60 2C. Ajuste del pH Otra etapa específica que puede ser utilizada en los métodos de la presente invención es el ajuste del pH de la trombina. El pH de la trombina puede ser ajustado a cualquier nivel siempre que la composición de trombina resultante tenga cantidades inferiores de impurezas virales. Por ejemplo, la reducción del pH de la trombina es efectiva para la inactivación de las impurezas virales. En ciertas modalidades, el pH de la trombina es ajustado hasta abajo de aproximadamente 5 o abajo de aproximadamente 4. Sin embargo, la reducción del pH de la trombina puede conducir a algo de pérdida de la actividad de la trombina. Irradiación electromagnética Todavía otra etapa de purificación que puede ser utilizada en los métodos de la presente invención es la aplicación de radiación gamma o electromagnética, o luz UV. La aplicación de radiación a la trombina también puede ser utilizada sola o en combinación con cualquiera de las otras etapas de purificación descritas aquí. Los inventores de la presente invención han encontrado que la radiación electromagnética y gamma son herramientas poderosas y robustas de inactivación de los virus . Se ha reportado que la irradiación gamma es efectiva contra una amplia variedad de virus. Sin embargo, menos del 70 % d.e recuperación puede ser obtenida en el caso de la trombina disponible comercialmente. La aplicación de luz UV también puede ser utilizada sola o en combinación con las otras etapas de purificación de la presente invención y también es un procedimiento de inactivación del virus, efectivo. Sin embargo, algo de pérdida de actividad de la trombina es observada también con este método. Los inventores han observado que los períodos cortos de exposición pueden conducir a la reducción de una pérdida de actividad. Preparaciones/formulaciones de trombina purificada La presente invención también está dirigida a composidiones de trombina purificadas por los métodos anteriores . La composición de trombina de la presente invención tiene una pureza incrementada, una actividad específica elevada y niveles bajos de impurezas, incluyendo niveles bajos de impurezas, tales como el factor Va, priones, y partículas virales. Las composiciones de trombina de la presente invención tienen una actividad específica elevada; preferentemente, la actividad específica de las composiciones de trombina de la presente invención es mayor que 1800 u/mg de la proteína. La presente invención abarca las composiciones de la trombina que tienen una actividad específica que varía desde aproximadamente 1800 u/mg hasta 3000 u/mg, más preferentemente entre aproximadamente 1800 u/mg y 2400 u/mg. En otras modalidades, la actividad específica está entre aproximadamente 2400 u/mg y 2500 u/mg, entre aproximadamente 2500 u/mg y 2600 u/mg, o entre aproximadamente 2600 u/mg y 2700 u/mg, entre aproximadamente 2700 y 2800 u/mg de la proteína, entre aproximadamente 2800 y 2900 u/'mg de la proteína o entre aproximadamente 2900 y 3000 u/mg de la proteína. En ciertas modalidades, la trombina tiene µna actividad específica mayor que 3000 u/mg. También, las composiciones de trombina de la presentie invención están substancialmente libres de impurezas de peso molecular elevado, incluyendo, el factor Va, agentes bacterianos, priones y agentes virales. Cuando se utilice aquí, unas composiciones que están "substancialmente libres" de impurezas de peso molecular elevado significa que las composiciones contienen cantidades menores que aproximadamente 5-20 % en peso, preferentemente menores que aproxiiradámente 15 % en peso, más preferentemente menores que aproximadamente 10 % en peso. Cuando se utilicen aquí, las composiciones que son "substancialmente puras" contienen menos ae 5 % de las impurezas de peso molecular elevado en peso, y aún más preferentemente menores que aproximadamente 3 % en p so de las impurezas de peso molecular elevado. En una modalidad preferida, las composiciones de trombina de la presente invención están substancialmente libres de impurezas que tienen un peso molecular mayor que 40 kDa. En otra modalidad preferida, la trombina está substadcialmente libre de impurezas que tienen un peso molecular en el intervalo de 40 kDa hasta 300 kDa. Los ejemplos de las impurezas de peso molecular elevado incluyen el factor Va (de cadena pesada (peso molecular = 105 kDa) y de cadena ligera (peso molecular = 71 kDA/74 kDa) ) y la albúmina del suero de bovino (BSA; peso molecular = 66 kDa) . En otra modalidad específica, la invención proporciona composiciones de trombina substancialmente libres de impurezas de partículas virales. Las impurezas de partículas virales también son ejemplos de impurezas de partículas de peso molecular elevado. Los virus que pueden ser removidos por los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, el virus de la diarrea viral d¡el bovino (BVDV) (por sus siglas en inglés) , virus de seudor abia (PRV) (por sus siglas en inglés) , virus de encefalomiocarditis (EMCV) (por sus siglas en inglés) , parvovirus de bovino (BPV) (por sus siglas en inglés) , parvovirus de canino (CPV) (por sus siglas en inglés) , virus de cría sacciforme (SBV) (por sus siglas en inglés) , virus de encefalitis vector-garrapata (TBEV) (por sus siglas en inglés) , rinovirus 1 de equino (ERV-1) (por sus siglas en inglés) , virus 1 de inmunodeficiencia humana (HIV-1) (por sus siglas en inglés) , hepatitis A (HAV) (por sus siglas en inglés) , hepatitis B (HBV) (por sus siglas en inglés) , y hepatitis C (HCV) (por sus siglas en inglés) . Los virus pueden ser detectados por una variedad de ensayos basados en anticuerpos, incluyendo ELISAs y ensayos a base de ácidos nucleiaos, incluyendo los ensayos de PCR y de hibridación. En una modalidad específica, la invención proporciona composiciones de trombina substancialmente libres del factor Va. En algunas modalidades, el factor Va es reducido en al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80%, al menos 65 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 %. En ciertas modalidades de la invención, después de la filtración por exclusión de tamaño, el factor Va puede ser detectado en la muee tra concentrada (antes que la misma sea diluida en una formulacion final) y típicamente no es detectada en la totalidad de la formulación final.

En otras modalidades, la cantidad del factor Va es reducida hasta menos de 0.4, menos de 0.35, menos de 0.3, menos c.e 0.25, menos de 0.20, menos de 0.15, menos de 0.1, menos c.e 0.02 µg/1000 unidades de trombina o cualquier otra cantidad indetectable habitualmente Preferentemente, la ausencia o los niveles reducidos del nivel del factor Va es determinado por los métodos de rutina conocidos en el arte, por ejemplo, los métodos cromatográficos, incluyendo la electrofóresis con un gel, los ensayos de actividad del factor Va y los ensayos basados en anticuerpos En una modalidad preferida, las composiciones de trombina de la presente invención tienen una actividad específ :ica mayor que 1800 u/mg y están substancialmente libres de impurezas de peso molecular elevado, La trombina purificada por los métodos de la presente invención puede ser formulada adicionalmente para uso clínico. Las formulaciones de trombina de la presente invenci.ón preferentemente son más estables que las formulaciones de trombina disponibles actualmente, Adicionálmente, en ciertas modalidades las formulaciones de trombina estables de la presente invención son líquidas. En ciertas modalidades, las formulaciones estábilizadas de la presente invención comprenden: trombina, en donde la trombina está substancialmente libre de impurezas, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una de tales modalidades, la trombina es la trombina de bovino . En ciertas modalidades, las formulaciones estábil .izadas de la presente invención comprenden trombina, al mencs un polímero, al menos un alcohol, al menos una sal y una car.tidad apropiada de un ácido y/o una base para ajustar el pH a,l intervalo deseado. En una modalidad, las formulaciones estabilizadas de la presente invención comprenden trombina, glicerol, polieti. lenglicol, acetato de sodio y cloruro de sodio y ya sea ác:|ido clorhídrico o hidróxido de sodio o ambos para ajustar el pH a entre 5-8. En una modalidad preferida, las formulaciones estábil izadas de la presente invención comprenden trombina, aproximadamente 30 % de glicerol en volumen, aproximadamente 10 % e polietilenglicol en volumen, una concentración de 0.025-0.05 M de acetato de sodio y una concentración 0.15-0.3 M de c .oruro de sodio y ya sea ácido clorhídrico o hidróxido de sodijo o ambos para ajustar el pH a un intervalo de 6-7. La trombina purificada de la presente invención puede áer almacenada a 0-10 eC durante hasta 48 horas previo la formulación y/o al procesamiento estéril. En una modalidad preferida, la esterilización de la formulación de la invención es lograda utilizando un filtro estéril de 0.2 micrones. La formulación de la presente invención puede ser almacenada a 25 aC durante hasta 2 años sin el procesamiento en condiciones estériles. La presente invención está dirigida a formulaciones de trombina estabilizadas las cuales mantieren al menos 60 % de su potencia inicial durante un períodc de dos años. En las modalidades preferidas, las formulaciones mantienen al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencia inicial. La invención está dirigida particularmente a formulaciones que mantienen al menos 8 0 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencia inicial después de 3 meses, al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencia inicial después de 6 meses, al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 fc, o 95 % de su potencia inicial después de 9 meses, al menos rj 0 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de su potencial inicial después de 12 meses, y al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencia inicial después de 18 meses. La presente invención también está dirigida a formulaciones de trombina estábilizadas que mantienen al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de la potencia indicada en la etiqueta, inicial, durante; un período de dos años. La invención está dirigida a formuliciones que mantienen al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencia de la etiqueta inicial después de 3 meses, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de su potencial de la etiqueta inicial después de 6 meses, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de su potencia de la etiqueta inicial después de 9 meses, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 fc , 90 % o 95 % de su potencia de la etiqueta inicial después de 12 meses, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % ae su potencia de la etiqueta inicial después de 18 meses Excipiejntes Los excipientes farmacéuticamente aceptables, adecuados , incluyen cualesquiera excipientes que ayudan en la estábilización de las formulaciones de trombina de la presente invención. Los excipientes farmacéuticamente aceptabµes que son adecuados para la presente invención pueden funcionar como diluyentes, amortiguadores, estábilizadores, agentes tensioactivos, agentes quelantes, conservadores Los excipientes farmacéuticamente aceptables, adecuados, incluyen, pero no están limitados a, líquidos acuosos tales como agua, ácidos y bases; solventes orgánicos , tales como alcoholes; polímeros; sales o una combinacion de los mismos. Los ácidos adecuados incluyen, pero no están limítacos a, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fórmico, ácido acético, ácido cítricc , y ácido fosfórico. El ácido preferentemente es el ácido clorhídrico . Las bases adecuadas incluyen, pero no están limitadas a hidróxido de sodio, hidróxido de potasio e hidróxido de amonio. Preferentemente la base es el hidróxido de sodio , Los ácidos y bases incluidos en las formulaciones de trombina líquida, estabilizadas, de la presente invención, pueden ser utilizados para ajustar el pH de las formulaciones de trombina líquida, estabilizadas. El pH de las formulaciones de trombina líquida, estabilizadas, de la presente invención, pueden ser ajustadas a cualquier pH que estábil .ice las formulaciones de trombina de la presente invenci .ón. En ciertas modalidades, el pH de la formulación de trombira está entre 4 y 9. Preferentemente, el pH de las formulaciones de trombina de la presente invención está entre 5 y 8. Más preferentemente, el pH de las formulaciones de trombina de la presente invención está entre 5.5 y 7.7. En una modalidad preferida, el pH de las formulaciones de trombir.a de la presente invención es 6.7+0.1. Los alcoholes adecuados incluyen, pero no están limitados a alcoholes polihídricos, tales como glicerol, etilenglicol, propilenglicol, butilenglicol, 1/6-hexile?glicol, neopentilglicol , dietilenglicol, trimetillolpropano, y pentaeritritol. El alcohol preferido es el gli?erol. La cantidad del alcohol en las formulaciones de trombina líquida, estabilizadas, de la presente invención, puede ser de O a 80 % en volumen. En ciertas modalidades, la cantidad de alcohol, por ejemplo, glicerol, es de 10-50 % en volumen En las modalidades preferidas, la cantidad de alcohol , por ejemplo, glicerol, es de 20-40 % o 25-35 % o 30 % en vo>lumen. Los polímeros adecuados incluyen, pero no están limitadlos a, polietilenglicol, estireno-isobutileno-estireno, poliureátanos, siliconas, poliésteres, poliolefinas, poliisqbutileno, copolímeros de etileno-alfa-olefina, polímeros y copolímeros acrílicos, polímeros de haluro de vinilo, éteres de polivinilo, haluros de polivinilideno, poliacrjilotrilo, polivinil cetonas, substancias aromáticas de polivinilo, esteres de polivinilo, copolímeros de monómeros de vinji-lo, copolímeros de monómeros de vinilo y olefinas, poliami.das, resinas alquídicas, policarbonatos, polioximetilenos, poliimidas, poliéteres, resinas de epoxi, poliure taños, rayón-triacetato, celulosa, acetato de celulosa, butirato de celulosa, butirato-acetato de celulosa, celofár., nitrato de celulosa, propionato de celulosa, éteres de celulosa, carboximetilcelulosa, colágenos, quitinas, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-óxido de polietileno, cauchos de EPDM, fluoroe iliconas, polisacáridos, fosfolípidos, o una combinación de los mismos. El polímero preferido es de polietilenglicol. Un polímero muy preferido es el polietilenglicol 200-400. La cantidad del polímero en las formulaciones de trombina líquida, estabilizadas, de la presente invención, puede ser de 0 a 50 % en volumen. En ciertas modalidades, la cantidad del polímero, por ejemplo polietilenglicol, es de 1-30 % en volumen. En las modalidades preferidas, la cantidad del polímero, por ejemplo, polietilenglicol, es de 1-20 %, o 5-15 % o 10 % en volumen. Las sales adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, calcio, cloruro de potasio o sodio, bromuro, y semejantes; acetato de calcio, potasio, cesio o sodio; citrato de potasio, cesio o sodio; nitrato de potasio, cesio o sodio; y formiato de potasio, cesio o sodio. Las sales preferidas son el acetato de sodio y el cloruro de sodio. La concentración de las sales en las formulaciones de la ¡presente invención puede ser desde 0 hasta 0.5 M. en ciertas modalidades, la concentración de la sal es de 0.01 hasta 0.45 M. En otras modalidades, la concentración de la sal es menor que 0.3 M. En las modalidades preferidas, la sal es una combinación de cloruro de sodio y acetato de sodio, en donde üla concentración del cloruro de sodio es de 0.15-0.3 M y la concentración de acetato de sodio es de 0.025-0.05 M. Otro intervalo preferido de cloruro de sodio es de 0.28 hasta 0.32 M.

Prueba ¡de la potencia La trombina fue probada para verificar la potencia o actividad utilizando los ensayos conocidos en el arte. Uno de tales métodos está basado en las mediciones del tiempo de coagulación. Las mediciones del tiempo de coagulación pueden ser determinadas utilizando un temporizador de la coagulación de ACL7000. Los tiempos de coagulación medidos están convertidos en u/ml utilizando una regresión de log al doble del tiempo de coagulación de la curva estándar contra u/ml. El valor de u/ml fue multiplicado por el factor de dilución para obtener la potencia real de la muestra. Los resultados del ensayo pueden tener alguna variabi Lidad que se puede deber a una combinación de factores incluyendo las técnicas de transferencia con una pipeta, las diferentes máquinas de ACL y la viscosidad de la muestra probada . Kits y administración La presente invención también abarca los kits que comprenden las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención. Los kits pueden incluir un vial que contiene las formulaciones de trombinf estabilizadas de las presentes invenciones. Aunque en los viales la formulación de trombina estabilizada debe ¡ atisfacer las siguientes especificaciones del producto En ciertas modalidades, los kits de la presente invenc ón comprenden la concentración estabilizada del clorurf de sodio que es de 0.08-0.32 M y la concentración molar del acetato de sodio es de 0.02-0.06 M. El pH es ajustado en el intervalo de 5.7 a 7.7. La formulación de trombüía estabilizada es enfriada entonces a 0-10 2C. La formulación de trombina estabilizada puede ser estén!.izada y almacenada entonces en los viales etiquetados. Adicionalmente, la presente invención también está dirigida a los métodos de administración de las formulaciones de troínbina estabilizadas. Preferentemente las formulaciones de trombina estabilizadas de la presente invención son admini tradas tópicamente. En ciertas modalidades el método comprende: (a) extraer la formulación de trombina dentro de una jeringa; (b) forzar la formulación de trombina a través de la jeringa; y (c) inundar la superficie del un lumen del cuerpo con la formulación de trombina. En otras modalidades, el método comprende rociar la formulación de trombina tópica sobre la superficie de un lumen d|el cuerpo. En todavía otras modalidades, el método comprende: (a) sat|urar una esponja con la formulación de trombina; y (b) aplicar la esponja a la superficie de un lumen del cuerpo. La descripción contenida aquí y los siguientes ejemplos son para propósitos de ilustración y no para proposi.tos de limitación. Los cambios y modificaciones se pueden hacer a las modalidades de la descripción y todavía estarán dentro del alcance de la invención. Además, los cambios , modificaciones y variaciones obvias se les ocurrirán a aquellos expertos en el arte. Ejemploß Ejemplo| 1 - Preparación de trombina prepurificada Trombinp. de bovino prepurificada o de pureza baja Preparación de trombina: el pulmón de bovino fresco es molido en un equipo de molienda convencional. El pulmón de bovino :t?olido puede ser utilizado inmediatamente o almacenado congelado en los recipientes poli-recubiertos a < -15 eC. El pulmón molido es suspendido en cloruro de sodio diluido a aproximadamente 0-15 SC y extraído durante aproximadamente 12-72 horas. La suspensión del pulmón es filtrada a través de una tela burda y/o alternativamente, por centrifugación, y el extracto líquido es colectado. Mientras está bajo agitación, aproximadamente 100 ml de una suspensión aproximadamente al 50 % del gel de hidróxido de magnesio es agregada por litro del extracto del pulmón y mezclado totalmente. La suspensión es centrifugada o, altsrnativamente, filtrada con los adyuvantes para la filtracion y el material centrifugado registrado es colectado. El extracto del pulmón absorbido es fraccionado por la adición, bajo agitación a aproximadamente 0-15 2C, de aproximadamente un litro del sulfato de amonio saturado por litro del extracto del pulmón y mezclado durante aproximadamente 15-480 minutos. La parte insoluble es colectada por centrifugación o, alternativamente, por filtracjión con los adyuvantes de la filtración. La pasta es resolubilizada en aproximadamente 0.25 hasta 1 litro del cloruro de sodio diluido por litro del extract ;o del pulmón de partida. El extracto de pulmón fraccionado es reprecipitado por la adición bajo agitación a aproximadamente 0-15 SC, aproximadamente un litro del substrato de amonio saturado, frío, por litro de la solución, y mezclado durante aproximadamente 15-480 minutos. La pasta insoluble es colectada por centrifugación o, alternativamente, por filtración con los adyuvantes de la filtración. La segunda pasta es resolubilizada en cloruro de sodio diluido frío y aclarada por filtración. La solución de tromboplastina es concentrada en un sistema de ultrafiltración adecuado hasta aproximadamente 10-50 % del volumen original y luego diafiltrada para remover el sulfato de amonio detectable. La ultrafiltración es un proceso por el cual una solución con un soluto de tamaño molecular que es mucho más grande que aquel del solvente, es separada del solvente por la aplicación de una presión hidrául .ica. La presión hidráulica fuerza el solvente a través de una membrana adecuada y concentra el soluto. La diafiltración es llevada a cabo por la adición de 8 o máiS volúmenes de NaCl 0.05 M o hasta que el material permeac.o ha pasado la prueba del cloruro de bario. La diafilt ración es un proceso de separación de los microsolutos desde una solución de moléculas más grandes por ultrafilltración con una adición continua del solvente. El concentrado es concentrado entonces opcionalmente de manera adicional y la ultrafiltración es complementada. El sistema de ultrafiltración es enjuagado con varios litros del cloruro de sodio diluido enfriado y este lavado es agregado al concentrado. El pH del concentrado es ajustado a aproximadamente 7.0 con ácido clorhídrico diluido o hidróxido de sodio diluido. La tromboplastina resultante es almacenada aproximadamente a -15 SC o más fría en recipientes de plástico sellados.

El plasma de bovino fresco, tratado con citrato, es recibido ya sea congelado o enfriado en un carro tanque. Si es recibido congelado, el plasma es almacenado generalmente congelado hasta que se descongela para su uso. El plasma descongelado es mantenido a 0-10 aC en tanques de acero inoxidable. El pH del plasma es ajustado con ácido acético amortiguado hasta aproximadamente 6.6-6.8 y mantenido durante aproximadamente 3-30 horas. Al final del tiempo de contención, el plasma es aclarado. El plasma aclarado es ajustado con una solución de hidróxido de sodio hasta un pH de aprcximadamente 6.9-7.2. Preparación de protrombina: bajo agitación y a una tempera.tura de aproximadamente 0-10 aC, aproximadamente 1.5-2.5 greimos (peso seco) de la resina de intercambio iónico son agregados por litro del plasma de bovino y se mezclan 0.5-6 horas mientras que se controla el pH a aproximadamente 6.9-7.2. La suspensión resultante es filtrada o centrifugada para colecteír la resina. La resina es lavada totalmente con una solución salina amortiguada con fosfato 0.15-0.2 molar a un pH de aproximadamente 6.9-7.2 y guardada. La protrombina es eluida de la resina lavada utilizando una solución salina amortiguada con fosfato 0.5-1 molar a un pH de aproximadamente 6.9-7.2, filtrada, y los extractos guardados y agrupados para procesamiento adicional . Las resinas que pueden ser utilizadas incluyen, pero no están limitadlas a, DEAE-Sephadex A-50, Macro-Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support, Macro-Prep Q Support, de intercajmbio iónico UNOsphere Q, Capto Q, DEAE-Sepharose Fast Flow, Q¡ Sepharose™ HP o equivalente. Los extractos combinados pueden ser filtrados de manera preliminar si se desea previo a la ul|trafiltración. La resina agotada puede ser tratada con ácido y almacenada previo a la regeneración subsiguiente y reutilizada en un proceso de fabricación del complejo de protrombina semejante. El extracto del complejo de protrombina es concentrado en un sistema de ultrafiltración adecuado hasta aproximadamente 10-50 % del volumen original y luego diafiltrado para remover las sales indeseables. La diafiltración es llevada a cabo primero agregando aproximadamente dos a cinco litros de agua purificada enfriada por litro del concentrado cuando el material permeac.o es removido, y luego agregando aproximadamente dos a cinco litros del cloruro de sodio diluido, enfriado, por litro del concentrado como el material permeado que es removicLo . El concentrado es concentrado entonces opcioneilmente de manera adicional y la ultrafiltración es complementada. El sistema de ultrafiltración es enjuagado con varios litros de cloruro de sodio diluido enfriado y este lavado es agregado al concentrado. El complejo de protrombina resultante es almacenado a aproximadamente 15 aC o a una temperatura más fría en los recipientes sellados. El complejo de protrombina es descongelado a aproximadamente 35 aC o a una temperatura inferior. El complejo de protrombina es diluido hasta aproximadamente 1,000-5 ,000 por la adición de agua purificada que contiene suficiente cloruro de calcio para fabricar la concentración de cloruro de calcio de aproximadamente 0.005-0.03 molar. La suspens;ión de tromboplastina es agregada concurrentemente al complej:) de protrombina con el cloruro de calcio, bajo agitación suave. El pH es ajustado hasta aproximadamente 7.3 y mezclado durante aproximadamente 15-60 minutos. Después de la activación a aproximadamente 15-30 2C, la suspensión es enfriada hasta aproximadamente < 10 9C. Activación y purificación de la trombina: el complejo de protrombina activado es diluido hasta aproximadamente 500-3,000 u/ml con un amortiguador de citrato de sodio diluido, pH de aproximadamente 6.6. El material puede ser refiltrado cuando sea necesario. El pH de la mezcla descrita anteriormente es ajustado hasta aproximadamente 6.6 por la adición de ácido clorhídrico diluido o hidróxido de sodio diluido. El complejo de protrombina activado es agregado a una resina de interca:nbio catiónico la cual ha sido ajustada a un pH de aproximadamente 6.6. Las resinas que pueden ser utilizadas incluyen, pero no están limitadas a Amberlite CG-50, Macro- 4 Prep C Support, Macro-Prep High S Support, Macro-Prep S Support ., de intercambio iónico UNOSphere S, SP Sepharose™ HP, una resjjlna Capto S o equivalente. La columna es lavada con citrato de sodio diluido de pH 6.6 y luego se lava con aproximadamente 0.1 hasta 0.25 molar Ae cloruro de sodio para remover las proteínas de afinidad baja las cuales son desechadas. Esto es seguido por la apii .cación de cloruro de sodio aproximadamente 0.5-1 molar para e-.uir la trombina purificada. El material eluido es colectado en fracciones que son combinadas de acuerdo con un ensayo en el proceso. El volumen no estéril puede ser almacen do en aproximadamente 0-10 2C durante hasta aproximadamente 48 horas mientras está en el proceso. La trombina voluminosa no estéril es formulada hasta no menos de aproximadamente 1000 u/ml por la adición de agua para irrigación, 30 % de glicerol, 10% de PEG y cloruro de sodio aproximadamente 0.15-0.3 M. El pH de la solución de trombina formulada es ajustado a pH de aproximadamente 6.7+1.0 con el ácido clorhídrico diluido o hidróxido de sodio. La trombina en volumen no estéril, formulada, puede ser almacenada a aproximadamente 0-10 2C durante hasta aproximadamente 48 horas previo al procesamiento en condiciones estériles. La trombina en volumen no estéril, formulada, es esterilizada por el paso a través de filtros de liberación que no I son de fibra, de retención bacteriana, estériles, en ml) . La columna pre-equilibrada fue cargada con 396 ml de la troijibina sin refinar preparada, lavada con 144 ml del amortiguador de citrato de Na 0.025 M hasta que la absorbereia del eluyente estuvo abajo de 0.4 AU, y se lavó con 27 ml de NaCl 0.2 M hasta que la absorbencia del eluyente estuvo abajo de 0.2 AU. La columna fue enjuagada entonees con NaCl 0.65 M y 37 ml de la trombina purificada fueron colectados desde el instante que la absorbancia alcanzó 2 AU hasta el tiempo que la misma se redujo hasta 2 AU. Las muestras para la pre y post cromatografía coledtadas fueron almacenadas a -60 aC o abajo de este valor previo a efectuar el ensayo de Western blot del prión. Los resulitaldos son mostrados en la tabla 1. Tabla 1 Cód ligó Descripción de Volumen de la Concentración logio total Valor de registro fie la muestra muestra (ml) final (PrpRES). reducción la muestra (log.oCPrP^/ml)) log 1 Carga 396 5.8 8.4 preparada 3.5 Post-columna 37 3.3 4.9 *log?o t idtal (PrP ***) = concentración final (log.0(PrP ""/ml)) + log.0( volumen de la muestra (mi)) Ej emplq 2 - Depuración viral utilizando la filtración por exclusijón de tamaño Las membranas utilizadas en este ejemplo son Omega' TM 100K VR y son "moldeadas a partir de una poliétersulfona modificada sobre un respaldo de poliolefina altamente porosa que imparte resistencia y rigidez a la membrana terminada" . El punto de corte de peso molecular teórico es de 100 kDa. El paso de moléculas pequeñas es posible solo bajo condiciones de filtlración de flujo tangencial. Las moléculas grandes y los virus son retenidos por la exclusión de tamaño. El valor de reducción log (LRV) para el parvovirus de bovino (BPV) (por sus siglas en inglés) , el cual es un virus no envuelto muy pequeño (20 nm) , ha sido determinado para exceder aproximadamente 3.5 logs . La solución de trombina evaluada durante este estudio de depuración viral es la trombina prepurificada. Las muestras típicamente tienen una actividad específica mayor que ap oximadamente 1500 u/mg de proteína. La concentración de la proteína es estimada en aproximadamente 1.2 % y la concentración de la sal en aproximadamente 0.65 M de NaCl . El componente principal de esta solución de trombina es el ingredi.ente farmacéutico activo de la a-trombina, que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kDa. Existen varias consideraciones cuando se elige un panel de virus modelo que van a ser incluidos en un estudio de depuración viral. Uno es un modelo relevante para los virus que tienen un potencial de depuración de la contaminación de las materias primas. Otro es incluir los virus que tienen una amplia gama de características físicas y químicas en el panel de los virus modelo, de modo que si el estudio de depuración del virus muestra una buena depuración de estos virus, entonces existe la seguridad de que el procedimiento de fabricación puede depurar efectivamente los agentes virales inesperados. Es importante considerar el parvovirus de bovino (BPV) a causa de que el mismo es un virus relevante que tiene un potencial claro de contaminación de las materias primas, y también es extremadamente pequeño, no envuelto, y muy resistente a los tratamientos fisicoquímicos. El virus de la leucemia del murino xenotrópico (XMuLV) (por sus siglas en inglés) , el virus de la diarrea viral (BVDV) (por sus siglas en inglés) , y el virus de la seudorr bia (ERV) (por sus siglas en inglés) también están incluidos como el BPV. Este panel de virus proporciona virus modelo para los virus relevantes, y proporciona una buena gama de características físicas y químicas de tal modo que la depuración de estos virus podría sugerir que el procedimiento de fabricación podría depurar los agentes inesperados. Las características del paneL de virus están indicadas en la tabla 2. Tabla 2 - Resumen de las características de los cuatro virus elegidos Vihis Genoma Envoltura Familia Tamaño Resistencia a los (nm) agentes físicoquímicos BPV ADN ?o Parvo 20-25 Elevada XMÜLV ARN Si Retro 81-1 10 Baja PFtV ADN Si Herpes 150-200 Media BVDV ARN Flavi 40-70 Media diafiltración de los 80 ml con 6x este volumen (480 ml) con una solución de NaCl . El volumen permeado final es así dos veces el volumen de la muestra de trombina inicial. La concentración de este material permeado, a través de un cásete de la membrana de VR de 10 K es efectuado entonces para llevar de regreso el volumen y la concentración hasta el nivel deseado. La pureza del producto final es muy mejorada como resultado de esta filtración. Por ejemplo, la actividad específica es incrementada en más del 30 % y el contenido del factor Va es reducido a niveles no detectables en el producto final cuando se mide por el ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima, competitivo (ELlSAc) . La remoción del virus (y la remoción de moléculas grandes; ocurre por exclusión de tamaño. Los valores de reducción log muy elevados, son observados para el panel de 4 virus considerados (Parvovirus de bovino, virus de la diarrea viral del bovino, virus de la leucemia del murino xenotrópico, y virus de la seudorrabia de bovino) . La El filtro utilizado fue la membrana 100K VR de Omega,TM de Pall con un área superficial de 0.0093 m2 (0.1 ft ) . De modo que la relación del volumen de trombina con respecto al área superficial del filtro fue de 4 1/ft2. La membrana 100K VR de Omega™ fue fijada sobre el sistema de filtración y enjuagada con 500 ml de agua purificada. La prueba de integridad preutilización fue efectuada y pasó el criterio de aceptación. La membrana fue acondicionada entonces con 100 ml de NaCl 0.65 M a una presión de alimentación de 0.703 Kg/cm2 (10 psi). Las velocidades del material permeado y del flujo transversal, medidos en cilindros graduados, fueron de aproximadamente 5 y 52 ml/minuto respectivamente. La filtración de los 396 ml iniciales de la muestra preparada fue empezada. Cuando 315 ml del material filtrado (es decir, aproximadamente 80 % del volumen inicial) fueron colectados, la muestra restante fue diafiltrada con un total de 475 ml de NaCl 0.65 M (es decir, aproximadamente 6 veces el volumen del material retenido) . La presión de la alimen ación fue mantenida en aproximadamente 0.703 Kg/cm (10 psi) y la presión del material retenido fue igual a 0 kg/cm (0 psi) en toda la corrida de la filtración. Estas condiciones de filtración se mostró previamente que proporcionan una recuperación de trombina aceptable así como una depuración elevada del virus .

El filtro utilizado fue el filtro Mustang Q de Pall con un área superficial de 0.35 ml . Así, la relación del volumen de trombina con respecto al área superficial del filtro jEue de 230 ml de la muestra por ml del filtro El sujetador del filtro fue limpiado sin la placa de filtro bon 20 ml de NaOH 1 N con una retención de 20 minutos El filtro de Mustang Q fue colocado en el sujetador, lavado con 20 :ttl de NaOH 1 N seguido con un lavado de NaCl 1 M hasta que el ;?H del eluyente fue neutral Luego el filtro fue acondicionado con 25 ml de NaCl 72 mM a una velocidad de flujo de aproximadamente 3 ml/min antes de la filtración real de la muestra estimulada de 80.6 ml. El volumen post-filtración final fue igual a 77 ml y el tieifo del proceso fue igual a 49 minutos. Las muestras de filtración pre y post iónicas colectadas fueron almacenadas a -60 aC o abajo de este valor previo a efectuar el ensayo de Western blot del prión. Los resultaldos son mostrados en la tabla 8. Tabla 8 Códig? Descripción de Volumen de la Concentración logio total Valor de registro de la muestra muestra (ml) final (PrpREs reducción la muestra (log.oíPrP^/ml)) log Carga 80.6 4.8 6.1 preparada > 3.9 Salida 77 < 0.9 <2.8 Ejempl)o 4 - Filtración por exclusión de tamaño bajo varias condiciones Este ejemplo también utiliza la filtración por exclusión de tamaño utilizando los filtros 100K VR de Pall Omeg , Tres corridas fueron efectuadas a una presión de alimentación de 0.562 Kg/cm2 (8 psi) y tres son efectuadas a una presión de alimentación de 0.844 Kg/cm2 (12 psi). Los parámetros del filtro de escala reducida son elegidos para mantenejr el volumen con respecto al área superficial del filtro constante, y para asegurar la operación en el intervalo de presión de alimentación especificado. Cada corrida es efectuada con un nuevo filtro 100 K VR de Pall Omega de 0.0093 m2 (0.1 ft2) y todas las corridas fueron efectuadas en una habitación fría (< aproximadamente 8 2C) . Un flujómetro está incluido en el sistema para verificar mejor el flujo cruzado durante la filtración. El flujómetro es calibrado en la habitación fría previo al uso. La tabla 9 resume las condiciones y parámetros de las seis corridas de la filtración. Para las corridas de 0.562 Kg/cm2 (8 psi), la actividad de la trombina del material de partida promedio 22,091 u/ml y para el grupo del material filtrado, el mismo promedia 11,130 u/ml. El porcentaje resultante de la recuperación de la trombina después de 6 ciclos de las corridas de diafiltración promedió 86 %. Las corridas efectuadas a una presión de alimentación de 0.562 Kg/cm2 (8 psi) muestran una recuperación de la trombina ligeramente mayor que a 0.844 Kg/cm2 (12 psi). Tabla 9 - Resumen de la filtración de la trombina y resultados de la recuperación Copida # l Canda #2 Cánida #3 Coptda #4 C?pida #5 Conida #6 Presión de 8 12 12 12 alimentación objetivo Volu lien de la 400 400 400 400 400 400 trombina (ml) Volumen 20 20 20 NA NA NA preparado (ml) Volumen total de la 420 420 420 400 400 400 muestra pre- filtr cida (ml) Acth idad de la 22,696 24,177 19,399 21 ,559 21 ,559 20,747 muestr; pre-filtrada (mi) Mué: tra de pre- 9,532,320 10,154,340 8,147,580 8,623,600 8,623,600 8,298,800 filtp ción de la actividad total (u) Mue?tra de pre820 820 820 800 800 800 fijación del volumen total (ml) Muestra post10,405 13,210 9,776 8,631 9,940 8,923 filtración de la activ dad (u/ml) Activ dad total de 8,532, 100 10,832,200 8,016,320 6,904,800 7,952,000 7,138,400 la muestra post- filtración % de Recuperación 89.5 106.7 98.4 80.0 92 86 de lá trombina Tiempo del 206 219 215 155 173.5 166 proceso total Las fracciones del material permeado son mucho más limpias que la muestra de trombina de partida, inicial, respectiva, como se ilustra en la figura 2. Casi la totalidad de las impurezas de peso molecular elevado observadas en la materia prima son retenidas por el filtro en el material retenido. La tabla 11 muestra que la etapa de filtración también condujo a una reducción substancial en el contenido del factor Va. La reducción promedio entre las corridas efectuadas a las dos presiones de la alimentación es comparable: 88.5 % en las corridas de 0.562 Kg/cm2 (8 psi), y 89.3 % en las corridas de 0.844 Kg/cm2 (12 psi). El factor V/Va eetá asociado con las coagulopatías que pueden ocurrir en pacientes en respuesta a la exposición quirúrgica a la trombina del bovino típica. El conocimiento actual sugiere que la contaminación con el factor V/Va de la trombina de bovino estimula la producción de los anticuerpos del factor Va de .antibovino del paciente, los cuales pueden reaccionar de manera cruzada con el propio factor Va del paciente, por lo cus.l conducen a hemostasis alterada. Esta etapa de filtración proporciona los beneficios de reducir substar.cialmente el contenido del factor Va a niveles indeteotables en el Thrombin-JMI® final cuando se mide por el ensayo de inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) competitivo. pjemplo 5 - Formulación de trombina estabilizada La tabla 12 muestra una formulación de trombina purificada, estabilizada, de acuerdo con la presente invención. Tabla 12 - Formulaciones de trombina estabilizadas Formulación de trombina estabilizada Composición de trombina NLT 1,400 unidades/ml Glicerol 30 % en volumen Polietilenglicol 10 % en volumen Cloruro de sodio Concentración de 0.15-0.3 M Acetato de sodio Concentración de 0.025-0.05 M pH 6.7+0.1 La trombina para la formulación de trombina estabilizada fue creada de acuerdo con el proceso de la figura 3. La composición de la trombina volumétrica no estéril fue formulada para no menos de 1,400 unidades/ml por la adic:-ón de agua para irrigación. El glicerol fue agregado entonces a una concentración aproximada de 30 % en volumen. El polletilenglicol de 200-400 PM fue agregado a una concentración aproximada del 10 % en volumen. Se agregó cloruro de sodio hasta que la concentración del cloruro de sodio es de aproximadamente 0.15-0.3 M y el acetato de sodio fue agregado hasta que la concentración del acetato de sodio es de aproximadamente 0.025-0.05 M. El pH de la solución de trombina fue ajustado a un pH de 6.7+0.1 con el ácido clorhídrico o hidróxido de sodio diluido. La formulación de trombina estabilizada, no estéril.izada, fue colocada entonces sobre la prueba de estábil.idad a temperatura ambiente (23 aC + 2 aC) y las muestras fueron probadas en varios instantes de tiempo. Las muestras fueron probadas por triplicado. El método de prueba utilizado para ensayar la potencia de la trombina o la actividad de la trombina, estuvo basado en las mediciones del tiempo de coagulación. La máquina utilizada para determinar los tiempos de coagulación fue el temporizador de coagulación ACL7000. Las muestras fueron diluidas a una concentración que estuvo dentro del intervalo de la curva estándar y se colocaron sobre el rotor de la máquina. El plasma humano también | fue colocado sobre la taza de la máquina y tanto el plasma como las muestras de trombina diluidas fueron incubados a 37 aC. Luego un volumen específico de cada uno del plasma y la trombina diluida fueron bombeados y mezclados concomí':antemente. Después del mezclado, la luz se hizo pasar a través de la mezcla de plasma/trombina y cuando un coágulo se formó, la luz fue dispersada. Un detector midió la luz dispersada y transformó el resultado en el tiempo de coagulación (segundos) . El tiempo de coagulación fue convertido entonces en u/ml utilizando una doble regresión log de tiempo de coagulación de la curva estándar contra u/ml. Iinalmente, el valor de u/ml fue multiplicado por el factor de dilución para obtener la potencia real de la muestra. La tabla 13 muestra los resultados de la estabilidad durant 6 meses a temperatura ambiente (23 SC +2 2C) para la formule.ción de la presente invención. Tabla 13 - Formulaciones de trombina estabilizadas s r u ormu c e r na, formulada para una estabilidad mejorada, la cual ha sido el objeto de los métodos de purificación de la presente invencíón. Tabla 14 - Formulaciones de trombina estabilizadas Formulaciones de trombina estabilizadas Composición de trombina NLT 1,400 unidades/ml Glicero) 30 % en volumen Polietilenglicol 10 % en volumen Cloruro de sodio Concentración de 0.15-0.3 M Acetato de sodio Concentración de 0.025-0.05 M PH 6.7+0.1 La composición de trombina volumétrica, no estéril, fue foirmulada hasta no menos de 1,400 unidades/ml por la adición de agua para irrigación. El glicerol fue agregado entonces a una concentración aproximada del 30% en volumen. El polietilenglicol de 200-400 PM fue agregado a una concentración aproximadamente del 10 % en volumen. Se agregó cloruro de sodio hasta que la concentración del cloruro de sodio es de aproximadamente 0.15-0.3 M y el acetato de sodio fue agregado hasta que la concentración del acetato de sodio fue de aproximadamente 0.025-0.05 M. El pH de la solución de trombina fue ajustado hasta un pH de 6 . 1 + 0 . 1 con ácido clorhídrico diluido o hidróxido de sodio. La formulación fue colocada entonces para verificar la prueba de estabilidad a (23 2C + 2 aC) y fue probada para verificar la potencia a intervalos de tiempos regulares . Las muestras fueron probadas por triplicado. La tabla 15 muestra los resultados de la estabilidad durante 24 meses a temperatura ambiente (23 2C + 2 I Aunque los ejemplos específicos han sido provistos, estos eon solamente modalidades preferidas, y se entiende que explican y describen adicionalmente la invención. Las mismas no están propuestas para definir el alcance de esta invención. I Todas las referencias citadas aquí son incorporadas para referencia en su totalidad y para todos los propósitos para que las mismas se extiendan como si cada una de las publicaciones, patentes o solicitudes de patente individuales fueran indicadas específica e individualmente que van a ser incorporadas para referencia en su totalidad para todos los propósitos . Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama) como propiedad lo contenido en las siguientes reivindlicaciones . 1. Un método para la preparación de trombina purificada, caracterizado porque comprende: (a) aplicar una preparación de trombina a un filtro por exclusión de tamaño capaz de excluir las impurezas que tienen un peso molecular mayor que 40 kDa; y (b) recuperar la trombina purificada. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de la trombina es el bovino, 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de la trombina es Thrombin-JMl®. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caract rizado porque el filtro por exclusión de tamaño es capaz de excluir las impurezas que tienen pesos moleculares que varían desde 40 kDa hasta 300 kDa. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el filtro por exclusión de tamaño es seleccionado de uno que es capaz de excluir las impurezas que tienen un peso molecular de 50 kDa, 100 kDa o 150 kDa. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caract rizado porque el filtro por exclusión de tamaño es 1, care.eterizado porque la trombina purificada, recuperada, está su stancialmente libre de impurezas. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la trombina purificada, recuperada, está substancialmente libre del factor Va. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la trombina purificada, recuperada, está sujbstancialmente libre de priones. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1, car cterizado porque la trombina purificada, recuperada, tiene una reducción de los priones igual a al menos 3.5 logs . 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, car cterizado porque la trombina purificada, recuperada, está si-.bstancialmente libre de agentes virales. 18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la trombina purificada, recuperada, está sµbstancialmente pura. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende aplicar la trombina purificada recuperada a un filtro de intercambio iónico. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende aplicar la trombina purificada, recuperada, a una etapa de purificación cromatográfica . 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la etapa de purificación cromatográfica comprende una columna de cromatografía por intercambio iónico, 22. Una composición de trombina, caracterizada porque substancialmente está libre de impurezas que tienen un peso mqlecular mayor que 40 kDa. 23. La composición de trombina de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la composición de trombi?a está substancialmente libre de impurezas que tienen un pese molecular entre 50 kDa y 300 kDa. 24. Una composición de trombina, caracterizada porque substancialmente está libre de impurezas. 25. Una composición de trombina, cauterizada porque es substancialmente pura. 26. Una composición de trombina, caracterizada porque está substancialmente libre del factor Va. 27. La composición de trombina de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el factor Va es medido por el ensayo de la actividad del factor Va, ELISA, o el ensayo de Western blot. 28. La composición de trombina de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el factor Va es menor que 0. fl µg/1000 unidades de trombina, 29. Una composición de trombina, caracterizada porque está substancialmente libre de agentes virales, en donde ql valor de reducción log es mayor que 3.5 por virus 30. Una composición de trombina, caracterizada porque tiene una actividad específica de la trombina entre aproximadamente 1800 y 3000 u/mg de proteína, 31. Una composición de trombina de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la actividad específica está entre aproximadamente 1800 y 2400 u/mg de la proteic . 32. Una composición de trombina de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la actividad específica está entre aproximadamente 2400 y 2500 u/mg de proteírjia, 33. Una composición de trombina de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la actividad específica está entre aproximadamente 2500 y 2600 u/mg de proteí?a. 34. Una composición de trombina de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la actividad específica está entre aproximadamente 2600 y 2700 u/mg de proteica, 35. Una composición de trombina de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque además comprende un excipiente . 36. Una composición de trombina de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque además comprende un excipiente. 37. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende aplicar la preparajción de la trombina a un filtro de intercambio iónico. 38. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende aplicar un tratami|ento térmico a la preparación de trombina. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, ce racterizado porque el tratamiento térmico incluye mantener la trombina a 60 aC durante 10 horas. 40. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende reducir el pH abajo de aproximadamente 5 de la preparación de trombina. 41. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende aplicar la radiación electromagnética a la preparación de trombina, 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la radiación electromagnética es la radiación gamma, 43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la radiación electromagnética es la radiación UV. 44. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de la preparación de trombina aplicada al filtro por exclusión de tamaño es de al menos 1¡5 litros 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la preparación de trombina comprende al menos 300,000,000 unidades de trombina. 46. Un método para la preparación de una trombina que tiene una pureza mejorada, caracterizado porque comprende : (a) aplicar la preparación de trombina a una etapa de purificación cromatográfica; (b) aplicar la preparación de trombina a un filtro por exdlusión de tamaño; (c) aplicar la preparación de trombina a un filtro de intercambio iónico; y (d) recuperar la trombina purificada, 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, taracterizado porque la etapa de purificación cromatográfica comprende una columna de cromatografía de intercambio iónico o una columna de cromatografía por exclusión de tamaño. 48. La formulación de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la formulación es líquida. 49. La formulación de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el excipiente farmacéuticamente aceptable es el agua, glicerol, polietiflenglicol o una combinación de los mismos. 50. La formulación de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque el glicerol está entre 20-40 % en volumen. 51. La formulación de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque el polietilenglicol está e?tre aproximadamente 1-20 % en volumen. 52. La formulación de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque el excipiente es clorure de sodio, acetato de sodio, citrato de sodio o una combinación de los mismos. 53. La formulación de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque además comprende un ácido o una base. 54. La formulación de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el ácido o la base es el ácido clorhídrico o el hidróxido de sodio. 55. La formulación de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque las formulaciones tienen un pH de entre 5-9. 56. La formulación de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque las formulaciones tienen un pH de entre 6-8. 57. Una formulación de trombina líquida, estabilizada, caracterizada porque comprende una composición impurezas y el método de tratamiento está caracterizado porque comprende administrar la formulación de trombina estábil izada típicamente. 62. El uso de un compuesto formulado para la manufac tura de un medicamento para su uso en el tratamiento del es urrimiento de la sangre o la hemorragia menor de los capilaifes y las vénulas pequeñas, en donde el medicamento es una composición de trombina substancialmente libre de impure as y el método de tratamiento está caracterizado porque comprende: extraer la formulación de trombina hacia una jeringa forzar la formulación de trombina a través de la jering ; e inundar la superficie de un lumen del cuerpo con la formulación de trombina. 63. El uso de un compuesto formulado para la manufactura de un medicamento para su uso en el tratamiento del escurrimiento de la sangre o la hemorragia menor de los capilares y las vénulas pequeñas, en donde el medicamento es una composición de trombina substancialmente libre de impurezas y el método de tratamiento está caracterizado porque comprende rociar la formulación de trombina sobre la superficie de un lumen del cuerpo. 64. El uso de un compuesto formulado para la manufac :ura de un medicamento para su uso en el tratamiento del escurrimiento de la sangre o la hemorragia menor de los capilar s y las vénulas pequeñas, en donde el medicamento es una composición de trombina substancialmente libre de impurez as y el método de tratamiento está caracterizado porque comprende : saturar una esponja con la formulación de trombina; aplicar la esponja a la superficie de un lumen del cuerpo. 65. Un kit, caracterizado porque comprende: la formulación de trombina estabilizada de conformidad con la reivindicación 57; un vial capaz de contener la formulación de trombi?a; y una aguja. 66. Un kit, caracterizado porque comprende: la formulación de trombina estabilizada de conformidad con la reivindicación 57; y un dispositivo que es capaz de rociar la formulación de troi?bina . 67. El kit de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el dispositivo es una punta rociadora o una bomba rociadora, 68. Una formulación de trombina líquida, estabilizada, caracterizada porque comprende: trombina; glicerol; polietilenglicol ; cloruro de sodio; acetato de sodio; y en donde la formulación tiene un pH de entre 6-8. 69. La formulación de trombina líquida, estabilizada, de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la formulación mantiene al menos 60 % de la potencia inicial durante hasta dos años. 70. La formulación de trombina líquida, estabilizada, de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque la formulación mantiene al menos 70 % de su potencia de la etiqueta inicial durante hasta dos años.