BRPI0610339A2 - metódo para preparar trombina bovina recuperada, e, método para a preparação de uma composição de trombina bovina purificada - Google Patents
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Abstract
A invenção refere-se a composições de trombina com reduzidos níveis de impurezas de elevado peso molecular. Em particular, os níveis do fator Va, prions e/ou agentes virais são grandemente reduzidos. Esta invenção também refere-se genericamente a métodos para a preparação de trombina tendo um alto grau de pureza e elevada atividade específica. Mais especificamente, a invenção abrange etapas para excluir impurezas de elevado peso molecular das preparações de trombina por filtragem de exclusão de tamanho. Em formas de realização adicionais, a preparação da trombina adicionalmente inclui uma etapa de filtragem de troca de ions. Os métodos da invenção são particularmente adequados para purificação de larga escala de trombina. Esta invenção também refere-se genericamente a formulações estabilizadas contendo composições de trombina. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a formulações líquidas estabilizadas contendo trombina tendo um alto grau de pureza e alta atividade específica e a métodos de produzir e utilizar tais formulações.
Description
"MÉTODO PARA PREPARAR UMA TROMBINA, COMPOSIÇÃO DETROMBINA, FORMULAÇÃO DE TROMBINA LÍQUIDAESTABILIZADA, MÉTODO PARA ADMINISTRAR A FORMULAÇÃODE TROMBINA ESTABILIZADA, E, KIT"
Este pedido é uma continuação em parte do Pedido de Patentedos Estados Unidos No. 11/140.374, depositado em 26 de maio de 2005,incorporado aqui por referência em sua totalidade. Este pedido incorpora porreferência, em sua totalidade, o Pedido de Patente dos Estados Unidos decontinuação em parte intitulado "Thrombin Purification", depositado em 24de maio de 2006. Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patentedos Estados Unidos No. 11/140.374, depositado em 26 de maio de 2005 epara o Pedido de Patente dos Estados Unidos de continuação em parteintitulado "Thrombin Purification", depositado em 24 de maio de 2006.
1. CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção refere-se genericamente a preparações de trombinapurificada, substancialmente livres de impurezas de grande peso molecular,tais como fator Va, príons e/ou agentes virais, que contribuem para efeitosadversos nos pacientes. Esta invenção também refere-se a métodos para apreparação de trombina substancialmente livre de agentes virais, tendo umalto grau de pureza e alta especificidade específica. Mais particularmente, ainvenção abrange métodos compreendendo a exclusão de impurezas deelevado peso molecular de preparações de trombina. Esta invenção tambémrefere-se genericamente a formulações de preparações de trombina tendo umalto grau de pureza.
2. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A trombina é uma enzima protolítica, que aparece no sangueem seguida à ativação do sistema de coagulação, como resultado da proteóliseda protrombina. A trombina facilita a coagulação do sangue pela catalisadorda conversão do fibrinogênio em flbrina, que forma os coágulos sangüíneos elibera fibrinopeptídeos A e B. Em seguida a uma perturbação do sistemavascular, a produção de trombina é central ao processo de coagulação.
A preparação de trombina foi aprovado pela FDA para seraplicada topicamente como um auxiliar da homeostase, sempre que sanguevertendo ou sangramento menor dos capilares e pequenas vênulas foracessível. A aplicação tópica da trombina comercialmente disponível acelerasignificativamente a coagulação do sangue e significativamente reduz ostempos de coagulação.
Estudos utilizando formulações de trombina de alta purezaindicam que podem ocorrer coagulopatias em pacientes, em resposta àexposição a formulações de trombina tópicas, de baixa pureza. As impurezastipicamente presentes em preparações de trombina comercialmentedisponíveis incluem fator Va, albumina de soro bovino (BSA) e outrasproteínas de elevado peso molecular. A contaminação do Fator Va deformulações de trombina bovina comerciais pode estimular a produção deanticorpos Va de fator anti-bovino do paciente, que pode reagir cruzadamentecom o próprio fator Va do paciente, desse modo resultando em hemostaseprejudicada.
A intensidade de coagulação sangüínea da trombina é medidaem unidades/ml. Quanto mais concentrada a amostra for, maior a potência,mais rápido ela coagulará o sangue (ou criará fibrinogênio). A atividadeespecífica é uma relação da potência de uma amostra, dividida por seu teor deproteína e é expressa em unidades por miligrama de proteína.
A atividade da trombina específica é dependente da pureza datrombina. A trombina altamente purificada apresenta um aumento daatividade específica, quando comparada com uma preparação menos pura.
Anteriormente, a purificação da trombina era genericamentelimitada ao uso de cromatografia por troca de íons convencional. A PatenteU.S. No. 5.397.704 descreve uma preparação bovina da trombina que épreparada utilizando-se uma série de cromatografia por troca de ânion ecátion.
A Patente U.S. No. 5.151.355 descreve uma preparação detrombina bovina, que é preparada reagindo-se uma unidade de protrombinacom menos do que 5 unidades de tromboplastina na presença de cálcio. Atrombina é então aplicada seqüencialmente a uma coluna de agarose de trocade ânions e uma coluna de agarose de troca de cátions.
A Patente U.S. No. 4.965.203 descreve um método depurificar trombina bovina, em que a trombina é passada através de uma sériede colunas de cromatografia por troca de íons e então formulada com umpoliol e tampões. Embora as preparações de trombina acima sejam alegadasterem alta atividade específica, tais esquemas de purificação não fornecemquaisquer meios para efetivamente eliminar impurezas de elevado pesomolecular.
A Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No.2001/0033837 descreve um método de purificar uma preparação de trombinaempregando-se cromatografia por interação hidrofóbica, opcionalmenteseguida por cromatografia por troca de cátions. Embora o método de purificartrombina inclua cromatografia por interação hidrofóbica, o método descritopara purificação e remoção do vírus não é capaz de conseguir a remoção dovírus e a atividade ou pureza específicas abrangidas pela presente invenção.
Desta maneira, há necessidade de métodos que possam serusados para produzir trombina tendo um mais elevado grau de pureza. Atrombina purificada terá níveis mais baixos de impurezas de elevado pesomolecular, tais como fator Va e uma alta margem de depuração dos agentes epríons virais.
Embora a trombina tendo um alto grau de pureza possa ser deuso mais seguro, uma vez que as impurezas tais como fator Va e BSA sãoreduzidos ou eliminados, a trombina altamente purificada é de difícilformulação em formulações estabilizadas. Quanto mais pura for a trombina,menos estável ela é e de mais difícil formulação em formulaçõesestabilizadas. Portanto, permanece a necessidade de formulações estabilizadascontendo trombina tendo um alto grau de pureza e elevada atividadeespecífica.
3. BREVE RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção é dirigida a composições de trombina emétodos de preparar essas composições. Como aqui usados, os termosformulação, composição e preparação podem ser usadas intercambiavelmente.
As formulações, composições e preparações contempladas pela invençãocontêm trombina, preferivelmente trombina tendo aumentada pureza e podemtambém conter excipientes adicionais, em particular aqueles que fornecemestabilidade à formulação, composição ou preparação.
Em uma forma de realização, a presente invenção compreendeum método para preparar uma trombina tendo uma elevada atividadeespecífica, aumentada pureza e é substancialmente livre de impurezas,incluindo partículas virais, fator Va e príons. De acordo com a presenteinvenção, os métodos para a preparação de trombina tendo aumentadaimpureza podem incluir uma ou mais das seguintes etapas: filtragem deexclusão de tamanho, troca de íons ou cromatografia por exclusão detamanho, tratamento térmico, ajuste de pH e radiação eletromagnética. Napresente invenção, a fonte de trombina pode ser bovina ou humana.
Em ainda outra forma de realização, o método da presenteinvenção é capaz de reduzir impurezas na preparação em pelo menos 50%,quando comparada com preparações comercialmente disponíveis, tais comoTrombina-JMI®. Mais preferivelmente, o método da presente invenção écapaz de reduzir impurezas na preparação da trombina em pelo menos 80%,quando comparada com a trombina bovina pré-purificada ou de baixa pureza,como aqui descrito. De acordo com outra forma de realização da presenteinvenção, o método é capaz de aumentar a atividade específica de umapreparação de trombina em pelo menos 1000%, 1200% ou 1500%, quandocomparada com trombina bovina pré-purificada ou de baixa pureza, comodescrito aqui.
De acordo com a presente invenção, a etapa de filtragem deexclusão de tamanho é usada para excluir impurezas que tenham um pesomolecular maior do que 40 kDa. Preferivelmente, o filtro de exclusão detamanho é usado para excluir impurezas que tenham uma pesos molecularesvariando de 40 kDa a 300 kDa. Mais preferivelmente, o filtro de exclusão detamanho tem um corte de peso molecular variando de 50 kDa a 150 kDa. Emoutra forma de realização da invenção, o filtro de exclusão de tamanho temum corte de peso molecular de 50 kDa. Em outra forma de realização, o filtrode exclusão de tamanho tem um peso molecular de 100 kDa.
O método da presente invenção pode também incluir aaplicação de uma preparação de trombina a mais etapas de cromatografia, taiscomo uma cromatografia por troca de íons e/ou cromatografia por exclusão detamanho.
Em outra forma de realização, o método da presente invençãocompreende aplicar um tratamento térmico a uma preparação de trombina.Preferivelmente, o tratamento térmico inclui manter a trombina a 60°C por 10horas.
Em outras forma de realização, o método da presente invençãocompreende baixar o pH de uma preparação de trombina a cerca de 5 oumenos.
Em ainda outra forma de realização, o método da presenteinvenção compreende a aplicação de radiação eletromagnética a umapreparação de trombina. A radiação eletromagnética pode ser radiação gamaou radiação UV.
A presente invenção abrange um método de preparação degrande escala de trombina tendo aumentada pureza, compreendendo aplicarpelo menos 15 L de uma preparação de trombina a um filtro de exclusão. Emuma forma de realização preferida, a presente invenção é dirigida a ummétodo para preparação de larga escala de trombina tendo aumentada pureza,compreendendo aplicar pelo menos 15 L de uma preparação de trombina a umfiltro de exclusão de tamanho em que os 15 L da preparação de trombinacompreende cerca de 300.000.000 unidades de trombina.
A presente invenção é também dirigida a uma composição detrombina. Em uma forma de realização, a composição de trombina ésubstancialmente livre de impurezas. Em outra forma de realização, acomposição de trombina é substancialmente livre de impurezas tendo um pesomolecular maior do que 40 kDa. Preferivelmente, a composição de trombina ésubstancialmente livre de impurezas tendo um peso molecular entre 40 kDa e300 kDa.
Em ainda outra forma de realização, a composição de trombinada presente invenção é substancialmente pura. Preferivelmente, a composiçãode trombina é substancialmente livre do fator Va. Mais preferivelmente, ofator Va está presente a menos do que 0,4 ug/1000 unidades de trombina.
Adicionalmente, a quantidade de fator Va pode ser medida por ensaio deatividade do fator Va, ELISA, ou Western Blot.
Em outra forma de realização da presente invenção, acomposição de trombina tem atividade específica maior do que 1800 u/mg deproteína e é substancialmente livre de impurezas tendo um peso molecularmaior do que 40 kDa. A composição de trombina da presente invenção podeter uma atividade específica entre cerca de 1800 e 3000 u/mg de proteína.Preferivelmente, a composição de trombina pode ter uma atividade específicaentre cerca de 2400 e 2500 u/mg de proteína ou entre cerca de 2500 e 2600u/mg de proteína, entre cerca de 2600 e 2700 u/mg de proteína, entre cerca de2700 e 2800 u/mg de proteína, entre cerca de 2800 e 2900 u/mg de proteínaou entre 2900 e 3000 u/mg de proteína. Adicionalmente, a composição detrombina pode ter uma atividade específica maior do que 3000 u/mg deproteína.
A presente invenção é também dirigida a uma composição detrombina substancialmente livre de agentes virais. A composição de trombinada presente invenção pode ser substancialmente livre de agentes virais, emque o valor de redução em log é maior do que 3,5 por vírus.
A presente invenção é também dirigida a formulaçõesestabilizadas, compreendendo trombina tendo um alto grau de pureza e altaatividade específica e métodos de produzir e utilizar tais formulações. Mesmoembora a estabilidade das formulações possa diminuir à medida que a purezada trombina aumenta, os inventores descobriram formulações estabilizadascompreendendo trombina, tendo um alto grau de pureza e alta atividadeespecífica.
As formulações de trombina estabilizadas da presenteinvenção com compreendem trombina e pelo menos um excipientefarmaceuticamente aceitável.
As formulações estabilizadas da presente invenção podemconter trombina isolada de qualquer fonte, incluindo mas não limitado afontes bovinas e humanas. Adicionalmente, a trombina pode ser qualquerpreparação ou composição de trombina, tal como as composições de trombinapurificadas da presente invenção ou a Thrombin JMI® atualmentecomercialmente disponível. Em uma forma de realização preferida, atrombina tem um alto grau de pureza e alta atividade específica.
Além da trombina, as formulações de trombina estabilizadasda presente invenção incluem um excipiente. Em certas formas de realização,os excipientes adequados para as formulações da presente invenção incluemmas não são limitados a glicerol; polietileno glicol; sais; soluções aquosas,tais como água, ácidos e bases ou uma combinação dos mesmos.Sais preferidos incluem mas não são limitados a cloreto desódio, acetato de sódio, citrato de sódio ou uma combinação dos mesmos.
Ácidos e bases adequados incluem mas não são limitados aácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Preferivelmente, as formulações dapresente invenção têm um pH de 5-9 ou, mais preferivelmente, um pH de 6-8.
Preferivelmente, as formulações de trombina estabilizadas dapresente invenção compreendem 20-40% em volume de glicerol, 1-20% emvolume de polietileno glicol, concentração de 0,15-0,3 M de cloreto de sódioe concentração de 0,025-0,05 M de acetato de sódio.
Em uma forma de realização preferida da presente invenção,as formulações de trombina estabilizadas da presente invenção compreendemtrombina purificada; glicerol; polietileno glicol; cloreto de sódio; acetato desódio e um pH de 6-8.
Em certas formas de realização, as formulações de trombinaestabilizadas da presente invenção são líquidas. Alternativamente, asformulações de trombina estabilizadas da presente invenção podem sersólidas, em que, antes da administração, a formulação de trombina sólida,estabilizada, é dissolvida ou suspensa em um líquido.
Adicionalmente, a presente invenção é também dirigida amétodos de administrar as formulações de trombina estabilizadas da presenteinvenção. Preferivelmente, as formulações de trombina estabilizadas dapresente invenção são administradas topicamente ou à superfície de um lumecorporal.
A presente invenção é também dirigida a kits compreendendoas formulações de trombina estabilizadas da presente invenção. Em certasformas de realização da invenção, os kits compreendem formulação detrombina estabilizada; um frasco capaz de conter a formulação de trombina; eum agulha.
Em outras formas de realização da invenção, os kitscompreendem uma formulação de trombina e um dispositivo que é capaz depulverizar a formulação de trombina. Dispositivos de pulverização adequadosincluem mas não são limitados a uma ponta de spray ou uma bomba de spray.
A presente invenção é dirigida a formulações de trombinaestabilizadas, que mantêm pelo menos 60% de sua potência inicial, por umperíodo de dois anos. Em formas de realização preferida, as formulaçõesmantêm pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de sua potênciainicial. A invenção é particularmente dirigida a formulações que mantenhampelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% da sua potência inicial após 3 meses,pelo menos 70%, 80%, 85%, ou 90%, 95% de sua potência inicial após 6meses, pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de sua potência inicialapós 9 meses, pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95%% de sua potênciainicial após 12 meses, e pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95%% desua potência inicial após 18 meses. A presente invenção é também dirigida aformulações de tablete estabilizadas, que mantenham pelo menos 70%, 75%,80%, 85%, 90%, ou 95% de potência de reivindicação de rótulo inicial porum período de dois anos. A invenção é dirigida a formulações quemantenham pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,ou 95% de sua potênciade rótulo inicial após 3 meses, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou95% de sua potência de rótulo inicial após 6 meses, pelo menos 70%, 75%,80%, 85%, 90% ou 95% de sua potência de rótulo inicial após 9 meses, pelomenos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% of sua potência de rótulo inicialapós 12 meses, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,ou 95% de suapotência de rótulo inicial após 18 meses.
A figura 1 mostra um fluxograma de todas as etapas usadaspara preparar uma preparação de trombina, de acordo com o método dapresente invenção.
A Figura 2 mostra uma comparação de Eletroforese de Gel dePoliacrilamida de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS-PAGE) da Thrombin-JMI®,após a adição do processo de purificação da presente invenção (alamedas, 7, 8e 9) à Thrombina-JMI®, como atualmente manufaturada (alamedas 4 e 5) e aretentiva da filtragem de exclusão de tamanho, mostrando as impurezas deelevado peso molecular (alameda 11).
A Figura 3 mostra um método de produzir as formulações detrombina estabilizadas da presente invenção.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃOr
A presente invenção é baseada na descoberta de que o usoapenas da filtragem de exclusão de tamanho ou, em combinação com outrasetapas de purificação para a purificação da trombina, fornece substanciaisbenefícios em relação aos métodos de purificação de trombina da arteanterior. Os métodos de purificar a trombina da presente invenção fornecemtrombina que é significativamente mais pura e segura, devido à substancialremoção ou eliminação de impurezas de elevado peso molecular. Os métodosda presente invenção também fornecem um alto grau de depuração viral,juntamente com consistência, confiabilidade e facilidade de uso.
A presente invenção abrange a aplicação de etapas depurificação a uma preparação de trombina e recuperação da trombinapurificada. Estas etapas incluem mas não são limitadas a purificaçãocromatográfica; aplicação da preparação de trombina a um filtro de exclusãode tamanho; aplicação da preparação de trombina a um filtro de troca de íons;diminuição do pH; ou irradiação da preparação de trombina com radiaçãoeletromagnética. Embora a invenção seja baseada na descoberta do uso dafiltragem de exclusão de tamanho, tais etapas de purificação podem seraplicadas independentemente ou em combinação.
Além disso, os métodos são receptivo a grande escala,produção comercial e purificação. Os métodos da presente invenção podemproduzir grandes quantidades de trombina substancialmente livres deimpurezas, tendo um peso molecular maior do que 40 kDa e agentes virais.
A presente invenção também contempla a adição de um oumais excipientes à trombina, resultando em uma formulação de trombina queé mais estável do que as formulações de trombina atualmente disponíveis.
Como tal, a presente invenção resolve muitos dos problemas das formulaçõesde trombina da arte anterior. Sem ficarmos presos a qualquer teoria particular,a capacidade de estabilizar as composições de trombina altamente purificadasda presente invenção pode resultar em tratamento consistente e eficaz.
Preferivelmente, as formulações de trombina estabilizadas da presenteinvenção compreendem trombina tendo um alto grau de pureza e atividadeespecífica e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Apresente invenção também abrange formulações de trombina estabilizadas,líquidas.
5.1 FONTE DE TROMBINA
A trombina de qualquer fonte pode ser usada nas composições,formulações e métodos da presente invenção. Exemplos de fontes de trombinaadequada, para uso nas composições, preparações e métodos da presenteinvenção, incluem mas não são limitados a trombina isolada de fontes bovinasou humanas. Fontes comerciais de trombina, tais como Thrombin JMI®,podem também ser usadas na presente invenção.
Também trombina de qualquer nível de pureza ou trombinaresultando de qualquer preparação pode ser usada. Por exemplo, trombinapré-purificada, como aqui descrito, pode ser usada nas composições,formulações e métodos da presente invenção. Adicionalmente, a trombinaresultante de preparações naturais ou recombinantes é adequada para apresente invenção.
5.2 PURIFICAÇÃO DA TROMBINA
A presente invenção inclui métodos para a preparação detrombina com aumentada pureza, aumentada atividade específica e aumentadasegurança, devido aos baixos níveis de impureza, tais como fator Va, príons epartículas virais.
Em certas formas de realização, os métodos da presenteinvenção aumentam a pureza de uma preparação de trombina em mais do que30%, mais do que 50%, mais do que 75% ou mais do que 90%, emcomparação com a Thrombin-JMI® ou outra trombina purificada.
Outra maneira pela qual a pureza é quantificada é medindo-sea atividade específica da trombina. A atividade específica da trombina podeser medida por ensaios padrão conhecidos na arte, incluindo ensaios decoagulação e ensaios cromogênicos (vide, p. ex., Gaffney et al., 1995,Thromb Haemost 74:900-903).
Em uma forma de realização, os métodos da invençãofornecem preparações de trombina em que a atividade específica dapreparação da trombina é aumentada em pelo menos 1000%, pelo menos1200%, pelo menos 1500%, ou pelo menos 1800%, em comparação com atrombina pré-purificada. As composições de trombina da presente invençãotêm uma elevada atividade específica; Preferivelmente, a atividade específicadas composições de trombina da presente invenção é maior do que 1800 u/mgde proteína.
Os métodos da presente invenção fornecem preparações detrombina tendo uma atividade específica variando de cerca de 1800 u/mg e3000 u/mg, mais preferivelmente entre cerca de 1800 u/mg e 2400 u/mg. Emoutras formas de realização, a atividade específica é entre cerca de 2400 u/mge 2500 u/mg, entre cerca de 2500 u/mg e 2600 u/mg, ou entre cerca de 2600u/mg e 2700 u/mg, entre cerca de 2700 e 2800 u/mg de proteína, entre cercade 2800 e 2900 u/mg de proteína ou entre cerca de 2900 e 3000 u/mg deproteína. Em certas formas de realização, a trombina tem uma atividadeespecífica maior do que 3000 u/g.
Empregando-se certos métodos da invenção, os agentes viraise/ou impurezas de elevado peso molecular são reduzidos em pelo menos 50%,pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelomenos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%. Em uma forma derealização preferida, as impurezas de elevado peso molecular e/ou impurezasde partículas virais da preparação de trombina são reduzidas em pelo menos 80%.
A presente invenção também fornece métodos para purificartrombina, compreendendo excluir moléculas tendo um mais elevado pesomolecular do que a trombina. São providos métodos para purificar trombina paraeliminar pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%,pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelomenos 90%, pelo menos 95% e pelo menos 99% de impurezas tendo um maiselevado peso molecular do que a trombina. Ao obter-se a eliminação deimpurezas de mais elevado peso molecular, é desejável obterem-se recuperaçõesde trombina de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99%.
Também em certas formas de realização dos métodos dapresente invenção, a recuperação da trombina é também maior do que 80%,maior do que 85%, maior do que 90%, ou maior do que 95%.
Os métodos da presente invenção incluem aplicar etapas depurificação a uma preparação de trombina e recuperar a trombina purificada. Asetapas de purificação da presente invenção incluem aplicar uma preparação detrombina a um filtro de exclusão de tamanho; purificação cromatográfica;aplicação da preparação de trombina a um filtro de troca de íons; diminuição dopH; ou irradiação da preparação de trombina com radiação eletromagnética. Taisetapas podem ser aplicadas independentemente ou em combinação.
5.2.1 FILTRAGEM E CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO DETAMANHO
De acordo com os métodos da presente invenção, arecuperação e purificação das preparações de trombina podem serconseguidas excluindo-se as impurezas utilizando-se métodos envolvendotécnicas de separação baseadas no peso molecular. Em geral, qualquer métodoenvolvendo separação baseada em peso molecular pode ser usada, incluindofiltragem e cromatografia por exclusão de tamanho. Em certas formas derealização, em os métodos da presente invenção utilizam filtragem deexclusão de tamanho, é preferível que os poros do filtro sejam grandes obastante para permitir a passagem das moléculas de trombina, porém bastantepequenos para reter muitas impurezas, incluindo impurezas e vírus de grandesproteínas.
Uma vez que a trombina tem um peso molecular deaproximadamente 40 kDa, é preferível que, em certas formas de realização, osmétodos da invenção compreendem aplicar uma preparação de trombina a umfiltro de exclusão de tamanho capaz de excluir impurezas que tenham umpeso molecular maior do que 40 kDa de tamanho de dita preparação detrombina. Em uma forma de realização preferida, o filtro de exclusão detamanho é capaz de excluir impurezas que tenham um peso molecularvariando de 40 kDa a 300 kDa.
Assim, os filtros de exclusão de tamanho de cortes de pesomolecular, isto é, limite de exclusão de 50, 100, 150, 300 kDa ou maior,podem ser usados. Em uma forma de realização, o filtro de exclusão detamanho tem um corte de peso molecular variando de 40 kDa a 300 kDa. Emoutra forma de realização, o filtro de exclusão de tamanho tem um corte depeso molecular variando de 50 kDa a 300 kDa. Em ainda outra forma derealização, o filtro de exclusão de tamanho tern um corte de peso molecularvariando de 50 kDa a 150 kDa. Em uma forma de realização preferida, o filtrode exclusão de tamanho tem um corte de peso molecular de 50 kDa. Em umaforma de realização mais preferida, o filtro de exclusão de tamanho tem umcorte de peso molecular de 100 kDa. Esta etapa pode também opcionalmenteincluir a aplicação de diafiltragem, para maximizar a recuperação datrombina.
Em formas de realização preferidas, os filtros de exclusão detamanho terão tamanhos de poro com um corte de peso molecular em torno de100 kDa. Preferivelmente, o filtro de exclusão de tamanho adequado para apresente invenção também reduz eficazmente os agentes bacterianos eendotoxinas.
Em certas formas de realização, os filtro de exclusão detamanho são feitos de polietersulfona modificada em um suporte depoliolefina altamente poroso. Além disso, o filtro usado pode ser um filtro defluxo tangencial. Um exemplo de um filtro que pode ser usado nesta invençãoé o Ômega™ 100K VR, manufaturado pela PALL FILTRON Corporation.
Outros filtros de exclusão de tamanho que podem ser usadosde acordo com a presente invenção incluem mas não são limitados aoViresolve/70, manufaturado por Millipore Corporation; VirA/Gard 500,manufaturado por A/G Technology, Corporation e Ultipor DV20,manufaturado por Pall Corporation.
Com a filtragem de exclusão de tamanho, as moléculasgrandes, incluindo impurezas virais, são retidas pelos poros da membrana. Amembrana pode ser descartada após uso ou, alternativamente, a membranapode ser reutilizada. As membranas que resultam em uma redução em logbastante elevada são consideradas aceitáveis e podem ser usadas. Cadaredução em log é uma redução de 90%. Outros testes podem também serrealizados no filtro, para assegurar que o filtro tenha uma faixa de tamanho deporo aceitável. Em certas formas de realização dos métodos da presenteinvenção, a depuração viral é em um valor de redução em log (LRV) maior doque 3,5, preferivelmente maior do que 4,0, mais preferivelmente maior do que4,5. Em certas formas de realização, a depuração de príon é em um valor deredução em log (LRV) maior do que 3,5, preferivelmente maior do que 4,0,mais preferivelmente maior do que 4,5.
Em certas formas de realização da invenção, os volumes de 50ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml,seus múltiplos ou mais são aplicados a um filtro de exclusão de tamanho. A invenção também abrange métodos compreendendo aplicar pelo menos 300ml de uma preparação de trombina a um filtro de exclusão de tamanho.
A invenção também abrange métodos para purificação detrombina comercial de larga escala, compreendendo aplicar pelo menos 40 1de uma preparação de trombina a um filtro de exclusão de tamanho,preferivelmente pelo menos 60 1 de uma preparação de trombina a um filtrode exclusão de tamanho, muitíssimo preferivelmente pelo menos 90 1 de umapreparação de trombina a um filtro de exclusão de tamanho. Em certas formasde realização, o volume da preparação de trombina aplicada ao filtro deexclusão de tamanho depende da área de superfície dos filtros usados e/ou donúmero de filtros usados. Em formas de realização preferidas da invenção, osvolumes iniciais de 40 1 a 60 1, 60 1 a 80 1, 80 1 a 100 1, acima de 100 1 ou maise seus múltiplos são aplicados a um filtro de exclusão de tamanho.
Os certos métodos da presente invenção são particularmenteadequados a purificações de larga escala de trombina. Como tal, em formas derealização preferidas da invenção, os volumes iniciais de 15 L a 20 L e seusmúltiplos são aplicados a um filtro de exclusão de tamanho. Em uma forma derealização em que 15 L de preparação de trombina são aplicados ao filtro deexclusão de tamanho, a preparação de trombina compreende 300.000.000unidades de trombina.
5.2.2 CROMATOGRAFIA POR TROCA DE ÍONS
Empregada sozinha ou em conjunto com a filtragem deexclusão de tamanho, a filtragem de exclusão de íons também fornecesubstanciais benefícios à preparação de trombina. A filtragem de exclusão deíons fornece um alto grau de depuração viral, juntamente com consistência,confiabilidade e facilidade de uso.
Em certas formas de realização, os métodos da presenteinvenção podem ainda compreender aplicar a trombina a um filtro de troca deíons. A filtro de troca de íons é um método de separação que filtra solutosbaseados em sua carga eletrônica. Os filtros de troca de íons contêm centrosde carga na membrana de troca de íons. Quando a amostra é passada atravésdo filtro, os compostos carregados na amostra adsorverão nos centros de cargada membrana. E selecionado um filtro que tem uma carga positiva e quefiltrará proteína e impurezas virais carregadas da preparação de trombina. Osvírus com a mesma carga líquida que o filtro não se ligarão à resina e serãoremovidos na penetração.
Os filtros de troca de íons usado de acordo com a presenteinvenção são preferivelmente carregados positivamente, enquanto que asresinas de cromatografia por troca de íons tipicamente usadas para purificaçãoda trombina são carregadas negativamente. Os filtros de troca de íons sãoeficientes para remover ácidos nucléicos. Em uma forma de realizaçãopreferida, um filtro de troca de íons tem grupos amina quaternária pendentes.Um filtro de troca de íons preferido, que pode ser usado com esta invenção, éo filtro Mustang™ Q, manufaturdo pela Pall Corporation. Outro filtro de trocade íons que pode ser usado é o Cuno Zeta Plus VR05.
5.2.3 TRATAMENTO TÉRMICO
A aplicação de moderado calor é também uma etapa adequada,que pode ser usada nos métodos da presente invenção para a purificação datrombina. A aplicação de calor moderado pode também ser usada sozinha ouem conexão com a filtragem ou cromatografia por exclusão de tamanho, bemcomo qualquer uma das outras etapas de purificação examinadas aqui.Qualquer tipo de calor pode ser aplicado à trombina, de qualquer fonte, porqualquer extensão de tempo, contanto que as impurezas virais sejaminativadas e a trombina ainda mantenha uma elevada atividade específica.Em certas formas de realização a trombina pode ser aquecida a40 °C a 100 °C. Em formas de realização preferidas, a trombina é aquecida acerca de 60 °C. O tratamento térmico pode ser aplicado à trombina durantequalquer extensão de tempo. Por exemplo, a trombina pode ser aquecida por 1a 60 minutos ou a trombina pode ser aquecida por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10horas. Em uma forma de realização preferida, um tratamento térmico éaplicado à trombina por 10 horas a 60 °C.
5.2.4 AJUSTE DO PH
Outra etapa de purificação que pode ser usada nos métodos dapresente invenção é o ajuste do pH da trombina. O pH da trombina pode serajustado a qualquer nível, contanto que a composição de trombina resultantetenha baixas quantidades de impurezas virais. Por exemplo, a diminuição dopH da trombina é eficaz na inativação de impurezas virais. Em certas formasde realização, o pH da trombina é ajustado a abaixo de cerca de 5 ou abaixode cerca de 4. Entretanto, o abaixamento do pH da trombina pode resultar emalguma perda da atividade da trombina.
5.2.5 IRRADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
Ainda outra etapa de purificação que pode ser usada nosmétodos da presente invenção é a aplicação de radiação gama oueletromagnética, ou luz UV. A aplicação de radiação à trombina pode tambémser usada sozinha ou em combinação com qualquer uma das outras etapas depurificação aqui descritas.
A invenção da presente invenção constatou que a radiaçãoeletromagnética e gama são ferramentas de inativação de vírus poderosas erobustas. Reiatadarnente, a irradiação gama é eficaz contra uma iargavariedade de vírus. Entretanto, menos do que 70% de recuperação podem serobtidos no caso de trombina comercialmente disponível.
A aplicação da luz UV pode também ser usada sozinha ou emcombinação com as outras etapas de purificação da presente invenção e étambém um procedimento de inativação de vírus eficaz. Entretanto, algumaperda da atividade da trombina é observada com este método também. Osinventores observaram que curtos períodos de exposição podem resultar emmenos perda de atividade.
5.3 PREPARAÇÕES/FORMULAÇÕES DE TROMBINA PURIFICADA
A presente invenção é também dirigida a composições detrombina purificadas pelos métodos acima. Á composição de trombina dapresente invenção têm pureza aumentada, elevada atividade específica ebaixos níveis de impurezas, incluindo baixos níveis de impurezas, tais comofator Va, príons e partículas virais.
As composições de trombina da presente invenção têm umaelevada atividade específica; preferivelmente, a atividade específica dascomposições de trombina da presente invenção é maior do que 1800 u/mg deproteína. A presente invenção abrange composições de trombina tendo umaatividade específica variando de cerca de 1800 u/mg e 3000 u/mg, maispreferivelmente entre cerca de 1800 u/mg e 2400 u/mg. Em outras formas derealização, a atividade específica é entre cerca de 2400 u/mg e 2500 u/mg,entre cerca de 2500 u/mg e 2600 u/mg ou entre cerca de 2600 u/mg e 2700u/mg, entre cerca de 2700 e 2800 u/mg de proteína, entre cerca de 2800 e2900 u/mg de proteína ou entre cerca de 2900 e 3000 u/mg de proteína. Emcertas formas de realização, a trombina tem uma atividade específica maior doque 3000 u/mg.
As composições de trombina da presente invenção são tambémsubstancialmente livres de impurezas de elevado peso molecular, incluindofator Va, agentes bacterianos, príons e agentes virais. Como aqui usado, umacomposição que é "substancialmente livre" de impurezas de elevado pesomolecular significa que as composições contêm menos do que cerca de 5-20%em peso, preferivelmente menos do que cerca de 15% em peso, maispreferivelmente menos do que cerca de 10% em peso. Como aqui usado, ascomposições que são "substancialmente puras" contêm menos do que 5% dasimpurezas de elevado peso molecular em peso e, muitíssimo preferivelmente,menos do que cerca de 3% em peso das impurezas de elevado peso molecular.
Em uma forma de realização preferida, as composições detrombina da presente invenção são substancialmente livres de impurezas,tendo um peso molecular maior do que 40 kDa. Em outra forma de realizaçãopreferida, a trombina é substancialmente livres de impurezas tendo um pesomolecular na faixa de 40 kDa a 300 kDa. Exemplos de impurezas de elevadopeso molecular incluem fator Va (cadeia pesada (peso molecular =105 kDa) ecadeia leve (peso molecular — 71 kDa/74 kDa)) e albumina de soro bovino(BSA; peso molecular = 66 kDa).
Em outra forma de realização, a invenção fornece composiçõesde trombina. substancialmente livres de impurezas de partículas virais. Asimpurezas de partículas virais são também exemplos de impurezas de elevadopeso molecular. Os vírus que podem ser removidos pelos métodos da presenteinvenção incluem mas não são limitados a vírus da diarréia viral bovina(BVDV), vírus da pseudo raiva (PRV), vírus da encefalomiocardite (EMCV),parvovírus bovino (BPV), parvovírus canino (CPV), vírus stickleback (SBV),vírus da encefalite transmitida por carrapato (TBEV), rinovírus eqüino 1(ERV-1), vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1), hepatite A (HAV),hepatite B (HBV) e hepatite C (HCV). Os vírus podem ser detectados poruma variedade de ensaios baseados em anticorpo, incluindo ELISAs e ensaiosbaseados em ácido nucléico, incluindo ensaios PCR e de hibridização.
Em uma forma de realização específica, a invenção fornececomposições de trombina substancialmente livres do Fator Va. Em algumasformas de realização, o fator Va é reduzido em pelo menos 50%, pelo menos55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%,pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, oupelo menos 99%. Em certas formas de realização da invenção, após filtragemde exclusão de tamanho, o fator Va pode raramente ser detectado na amostraconcentrada (antes de ser diluído dentro de uma formulação final) e étipicamente não detectado em absoluto na formulação final.
Em outras formas de realização, a quantidade de fator Va éreduzida a menos do que 0,4, menos do que 0,35, menos do que 0,3, menosdo que 0,25, menos do que 0,2, menos do que 0,15, menos do que 0,1, menosdo que 0,02 ug/1000 unidades de trombina ou qualquer outra quantidadeatualmente indetectável.
Preferivelmente, a ausência de níveis reduzidos de fator Va édeterminada por métodos de rotina conhecidos na arte, p. ex., métodoscromatográficos, incluindo eletroforese gel, ensaios de atividade de fator Va eensaios baseados em anticorpo.
Em uma forma de realização preferida, as composições detrombina da presente invenção têm uma atividade específica maior do que2800 u/mg de proteína e são substancialmente livres de impurezas de elevadopeso molecular.
A trombina purificada pelos métodos da presente invençãopodem ainda ser formuladas para uso clínico. As formulações de trombina dapresente invenção preferivelmente são mais estáveis do que as formulações detrombina atualmente disponíveis. Adicionalmente, em certas formas derealização, as formulações de trombina da presente invenção são líquidas.
Em certas formas de realização, as formulações estabilizadasda presente invenção compreendem: trombina, em que a trombina ésubstancialmente livre de impurezas; e pelo menos um excipientefarmaceuticamente aceitável. Em uma tal forma de realização, a trombina étrombina bovina.
Em certas formas de realização, as formulações estabilizadasda presente invenção compreendem trombina, pelo menos um polímero, pelomenos um álcool, pelo menos um sal e uma quantidade apropriada de umácido e/ou base para ajustar o pH à faixa desejada.
Em uma forma de realização, as formulações estabilizadas dapresente invenção compreendem trombina, glicerol, polietileno glicol, acetatode sódio e cloreto de sódio e ácido clorídrico ou hidróxido de sódio ou ambos,para ajustar o pH a entre 5-8.
Em uma forma de realização preferida, as formulaçõesestabilizadas da presente invenção compreendem trombina, cerca de 30% deglicerol em volume, cerca de 10% de polietileno glicol em volume,concentração de 0,025-0,05 M de acetato de sódio e concentração de 0,15-0,3M de cloreto de sódio e ácido clorídrico e hidróxido de sódio ou ambos,para ajustar o pH a uma faixa de 6-7.
A trombina purificada da presente invenção pode serarmazenada a 0-10 °C por 48 horas antes da formulação e/ou processamentoestéril. Em uma forma de realização preferida, a esterilização da formulaçãoda invenção é conseguida utilizando-se um filtro estéril de 0,2 micro. Aformulação da presente invenção pode ser armazenada a 25 °C por até 2 anossem processamento estéril. A presente invenção é dirigida a formulações detrombina estabilizadas, que mantenham pelo menos 60% de sua potênciainicial por um período de dois anos. Em formas de realização preferidas, asformulações mantêm pelo menos 60% de sua potência inicial por um períodode dois anos. Em formas de realização preferidas, as formulações mantêmpelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de sua potência inicial.A invenção é particularmente dirigida a formulações que mantenham pelomenos 80%, 85%, 90%, ou 95% de sua potência inicial após 3 meses, pelomenos 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de sua potência inicial após 6 meses,pelo menos 70%>, 80%), 85%), 90%, ou 95% de sua potência inicial após 9meses, pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%), ou 95%% de sua potência inicialapós 12 meses, e pelo menos 60%, 70%, 80%), 85%, 90%, ou 95%% de suapotência inicial após 18 meses. A presente invenção é também dirigida aformulações de trombina estabilizadas, que mantenham pelo menos 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 95% da potência de acordo com a reivindicação derótulo inicial por um período de dois anos. A invenção é dirigida aformulações que mantenham pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%de sua potência de rótulo inicial após 3 meses, pelo menos 70%, 75%, 80%,85%>, 90%), ou 95% de sua potência de rótulo inicial após 6 meses, pelo menos70%o, 75%, 80%), 85%, 90%,ou 95% de sua potência de rótulo inicial após 9meses, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de sua potência derótulo inicial após 12 meses, pelo menos 70%, 75%, 80%), 85%, 90%, ou 95%de sua potência de rótulo inicial após 18 meses.
5.3.1 EXCIPIENTES
Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluemqualquer excipiente que auxilie na estabilização das formulações de trombinada presente invenção. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis que sãoadequados para a presente invenção podem funcionar como diluentes,tampões, estabilizantes, tensoativos, agentes quelantes, conservantes.
Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluemmas não são limitados a líquidos aquosos, tais como água, ácidos e bases;solventes orgânicos, tais como álcoois; polímeros; sais ou suas combinações.
Ácidos adequados incluem mas não são limitados a ácidoclorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfurico, ácido nítrico, ácido fórmico,ácido acético, ácido cítrico e ácido fosfórico. O ácido preferivelmente é ácidoclorídrico.
Bases adequadas incluem mas não são limitadas a hidróxido desódio, hidróxido de potássio e hidróxido de amônio. A base preferivelmente éhidróxido de sódio.
Os ácidos e bases incluídas nas formulações de trombinalíquidas estabilizadas da presente invenção podem ser usadas para ajustar opH das formulações de trombina líquidas estabilizadas. O pH das formulaçõesde trombina líquidas estabilizadas da presente invenção pode ser ajustado aqualquer pH que estabilize as formulações de trombina da presente invenção.Em certas formas de realização, o pH da formulação de trombina é entre 4 e9. Preferivelmente, o pH das formulações de trombina da presente invenção éentre 5 e 8. Mais preferivelmente, o pH das formulações de trombina dapresente invenção é entre 5,5 e 7,7. Em uma forma de realização preferida opH das formulações de trombina da presente invenção é 6,7 ±0,1.
Álcoois adequados incluem mas não são limitados a álcooispoliídricos, tais como glicerol etileno glicol, propileno glicol, butileno glicol,1,6-hexileno glicol, neopentil glicol, dietileno glicol, trimetilolpropano epentaeritritol. O álcool preferido é glicerol.
A quantidade de álcool nas formulações de trombina líquidasestabilizadas da presente invenção pode ser de 0 a 80% em volume. Em certasformas de realização, a quantidade de álcool, por exemplo, glicerol, é de 10-50% em volume. Em formas de realização preferidas, a quantidade de álcool,por exemplo, glicerol, é de 20-40% ou 25-35% ou 30% em volume.
Polímeros adequados incluem mas não são limitados apolietileno glicol, estireno-isobutileno-estireno, poliuretanos, silicones,poliésteres, poliolefinas, poliisobutileno, copolímeros de etileno-alfaolefina,polímeros e copolímeros acrílicos, polímeros de vinil haleto, polivinil éteres,polivinilideno haletos, poliacrilonitrila, polivinil cetonas, polivinil aromáticos,polivinil ésteres, copolímeros de vinil monômeros, copolímeros de vinilmonômeros e olefinas, poliamidas, resinas alquídicas, policarbonatos,polioximetilenos, poliimidas, poliéteres, resinas epóxi, poliuretanos, triacetatode raiom, acetato de celulose, butirato de celulose, butirato de acetato decelulose, celofane, nitrato de celulose, propionato de celulose, éteres decelulose, carboximetil celulose, colágenos, quitinas, ácido polilático, ácidopoliglicólico, copolímeros de ácido polilático-óxido de polietileno, borrachasde EPDM, fluorossilicones, polissacarídeos, fosfolipídeos ou umacombinação dos mesmos. O polímero preferido é polietileno glicol. Umpolímero muito preferido é polietileno glicol 200-400.
A quantidade de polímero das formulações de trombinalíquidas estabilizadas da presente invenção pode ser de 0 a 50% em peso. Emcertas formas de realização, a quantidade de polímero, por exemplo,polietileno glicol, é de 1-30% em volume. Em formas de realizaçãopreferidas, a quantidade de polímero, por exemplo, polietileno glicol, é de 1-20% ou 5-15% ou 10% em volume.
Sais adequados incluem mas não são limitados a cloreto ebrometo de cálcio, potássio ou sódio e similares; acetato de cálcio, potássio,césio ou sódio; citrato de potássio, césio ou sódio; nitrato de potássio, césioou sódio; e formiato de potássio, césio ou sódio. Sais preferidos são acetato desódio e cloreto de sódio.
A concentração dos sais das formulações da presente invençãopodem ser de 0 a 0,5 M. Em certas formas de realização, a concentração desal é de 0,01 a 0,45M. Em outras formas de realização, a concentração de salé menor do que 0,3 M. Em formas de realização preferidas, o sal é umacombinação de cloreto de sódio e acetato de sódio, em que a concentração decloreto de sódio é de 0,15-0,3M e a concentração de acetato de sódio é de0,025-0,05 M. Outra faixa preferida de cloreto de sódio é 0,28 a 0,32 M.
5.4 TESTE DE POTÊNCIA
A trombina pode ser testada quanto à potência ou atividade,podendo ser testada usando-se ensaios conhecidos na arte. Um tal método ébaseado nas medições do tempo de coagulação. As medições do tempo decoagulação podem ser determinadas usando-se um regulador de coagulaçãoACL7000. Os tempos de coagulação medidos são convertidos em u/mlusando-se uma regressão de duplo log do tempo de coagulação de curvapadrão vs. u/ml. O valor u/ml foi multiplicado pelo fator de diluição paraobter-se a atual potência da amostra. Os resultados de ensaio podem teralguma variabilidade devido a uma combinação de fatores, incluindo técnicasde pipetagem, diferentes máquinas ACL e viscosidade da amostra testada.
5.5. KITS E ADMINISTRAÇÃO
A presente invenção também abrange kits compreendendoformulações de trombina estabilizadas da presente invenção. Os kits incluemum frasco que contém as formulações de trombina estabilizadas da presenteinvenção. Enquanto nos frascos a formulação de trombina estabilizada devesatisfazer as seguintes especificações de produto:
<table>table see original document page 27</column></row><table>
Em certas formas de realização, os kits da presente invençãocompreendem as formulações de trombina estabilizadas; um frasco capaz deconter as formulações de trombina; e uma agulha. Os kits podem tambémincluir pelo menos uma esponja.
Em outras formas de realização, os kits da presente invençãosão kits de spray, em que os kits compreendem uma formulação de trombinaestabilizada e um dispositivo que é capaz de pulverizar a formulação detrombina. Dispositivos de pulverização adequados incluem uma ponte despray ou uma bomba de spray e um atuador. Adicionalmente, os kits de spraypodem ainda compreender uma agulha.
Com relação aos kits de spray, a formulação de trombinaestabilizada pode também ser contida em um frasco. Os frascos contendo aformulação de trombina líquida incluída nos kits de spray devem atender àsseguintes especificações de produto:<table>table see original document page 28</column></row><table> A presente invenção também refere-se a métodos de produzirformulações de trombina estabilizadas. Em certas formas de realização, ummétodo para produzir formulações de trombina estabilizadas compreende (a)aumentar a pureza da trombina; e (b) adicionar pelo menos um excipientefarmaceuticamente aceitável à trombina purificada.
Os métodos de produzir as formulações estabilizadas dapresente invenção podem ainda compreender ajustar o pH com um ácido ouuma base.
A Figura 3 é um fluxograma que descreve um método deproduzir formulações de trombina estabilizadas da presente invenção Apóspreparar uma composição de trombina tendo aumentadas pureza e atividadeespecífica, 28-33% em volume de glicerol e 7-11% em volume de umpolietileno glicol, tendo um peso molecular entre 200-600, são adicionados àtrombina purificada. Cloreto de sódio e acetato de sódio são adicionados até aconcentração de cloreto de sódio ser 0,08-0,31 M e a concentração molar deacetato de sódio ser 0,02-0,06 M. O pH é ajustado a 5,7 a 7,7. A formulaçãode trombina estabilizada é então esfriada a 0-10 °C.
A formulação de trombina estabilizada pode então seresterilizada e armazenada em frascos rotulados.
Adicionalmente, a presente invenção é também dirigida amétodos de administrar as formulações de trombina estabilizadas.Preferivelmente, as formulações de trombina estabilizadas da presenteinvenção são administradas topicamente.
Em certas formas de realização, o método compreende (a)puxar a formulação de trombina para dentro de uma seringa; (b) forçar aformulação de trombina através da seringa; e (c) inundar a superfície de umlume corporal com a formulação de trombina.
Em outras formas de realização, o método compreendepulverizar a formulação de trombina tópica sobre a superfície de um lumecorporal.
Em ainda outras formas de realização, o método compreende
(a) saturar uma esponja com a formulação de trombina; e (b) aplicar a esponjaà superfície de um lume humano.
A descrição contida aqui e os seguintes exemplos são para finsde ilustração e não para fins de limitação. Mudanças e modificações podemser feitas às formas de realização da descrição e ainda situarem-se dentro doescopo da invenção. Além disso, mudanças, modificações ou variações óbviasocorrerão par aqueles hábeis na arte.
6. EXEMPLOS
EXEMPLO 1-PREPARAÇÃO DE TROMBINA PRÉ-PURIFICADA
Trombina Boviva pré-purificada ou de baixa pureza
Preparação da Tromboplatina: Pulmão Bovino fresco é moídoem equipamento de moagem convencional. O Pulmão Bovino Moído pode serusado imediatamente ou armazenado congelado em recipientes poli-revestidos a <-15 °C. O pulmão moído é suspenso em cloreto de sódio diluídoa cerca de 0-15 °C e extraído por cerca de 12-72 horas. A suspensão depulmão é filtrada através de tecido grosseiro e/ou, alternativamente, porcentrifugação e o extrato líquido é coletado.
Enquanto sob agitação, aproximadamente 100 ml de umasuspensão de aproximadamente 50% de gel de hidróxido de magnésio sãoadicionados por litro de extrato de pulmão e completamente misturados. Asuspensão é centrifugada ou, alternativamente, filtrada com auxiliares de filtroe o centrifugado ou filtrado coletado. O extrato de pulmão adsorvido éfracionado adicionando-se, sob agitação, a cerca de 0-15 °C,aproximadamente um litro de sulfato de amônio saturado frio por litro deextrato de pulmão e misturados por cerca de 15-480 minutos. A pastainsolúvel é colhida por centrifugação ou, alternativamente, por filtragem comauxiliares de filtro.
A pasta é ressolubilizada em cerca de 0,25 a 1 litro de cloretode sódio diluído por litro de extrato de pulmão de partida. O extrato depulmão fracionado é reprecipitado pela adição sob agitação a cerca de 0-15°C, aproximadamente um litro de sulfato de amônio saturado frio por litro desolução e misturados por cerca de 15-480 minutos. A pasta insolúvel écolhida por centrifugação ou, alternativamente, por filtragem com auxiliaresde filtro. A segunda pasta é ressolubilizada em cloreto de sódio diluído frio eclarificada por filtragem.
A solução de trombina é concentrada em um sistema deultrafiltro adequado a cerca de 10-50% do volume original e então diafiltradopara remover sulfato de amônio detectável. A ultrafiltragem é um processopelo qual uma solução com um soluto de tamanho molecular, que é muitomaior do que aquele do solvente, é separado do solvente pela aplicação depressão hidráulica. A pressão hidráulica força o solvente através de umamembrana adequada e concentra o soluto.
A diafiltragem é conduzida adicionando-se 8 ou mais volumesde NaCl 0,05 M ou até o permeado passado pelo teste de cloreto de bário. Adiafiltragem é um processo de separar microssolutos de uma solução demoléculas maiores por ultrafiltragem com um adição contínua de solvente. Oconcentrado é então ainda opcionalmente concentrado e a ultrafiltragemcompletada. O sistema de ultrafiltragem é enxaguado com diversos litros decloreto de sódio diluído esfriado e esta lavagem é adicionada ao concentrado.O pH do concentrado é ajustado a cerca de 7,0 com ácido clorídrico diluídoou hidróxido de sódio diluído. A tromboplastina resultante é armazenada acerca de -15 °C ou mais frio em recipientes plásticos selados.
Plasma Bovino Fresco, citratado, é recebido congelado ouesfriado em um caminhão tanque. Se recebido congelado, o plasma égeralmente armazenado congelado até descongelado para uso. O plasmadescongelado é mantido a 0-10 °C em tanques de aço inoxidável. O pH doplasma é ajustado com ácido acético tamponado a cerca de 6,5-6,8 e mantidopor cera de 3-30 horas. No final do tempo de retenção, o Plasma é clarificado.O plasma purificado é ajustado com solução de hidróxido de sódio a cerca depH 6,9-7,2.
Preparação de Protrombina: sob agitação e em umatemperatura de cerca de 0-10 °C, cerca de 1,5-2,5 (peso seco) gramas deresina de troca de íons são adicionados por litro de Plasma Bovino emisturados 0,5-6 horas, enquanto controlando o pH a cerca de 6,9-7,2. Asuspensão resultante é filtrada ou centrifugada para colher a resina. A resina élavada completamente com solução salina tamponada com fosfato 0,15-0,2molar a pH de cerca de 6,9-7,2 e guardada.
A Protrombina é eluída da resina lavada usando-se soluçãosalina tamponada com fosfato 0,5-1 molar em um pH de aproximadamente6,9-7,2, filtrada e os extratos separados e reunidos para mais processamento.As resinas que podem ser usadas incluem mas não são limitadas a DEAE-Sephadex A-50, Marco-Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support,Macro-Prep Q Support, UNOsphere Q ion exchange, Capto Q, DEAE-Sepharose Fast Flow, Q Sepharose™ HP ou equivalente. Os extratoscombinados podem ser filtrados grosseiramente se desejado antes daultrafiltragem. A resina gasta pode ser tratada com ácido e armazenada antesda subseqüente regeneração e reutilização em um processo de manufaturaçãode complexo de protrombina similar.
O extrato de Complexo de Protrombina é concentrado em umsistema de ultrafiltro adequado a cerca de 10-50% do volume original e entãodiafiltrado para remover sais indesejados. A diafiltragem é primeiroconduzida adicionando-se aproximadamente dois a cinco litros de águapurificada esfriada por litro de concentrado como permeado, removida eentão, por adição de aproximadamente dois a cinco litros de cloreto de sódiodiluído esfriado por litro de concentrado como permeado, é removida. Oconcentrado é então ainda opcionalmente concentrado e a ultrafiltragemcompletada. O sistema de ultrafiltragem é enxaguado com diversos litros decloreto de sódio diluído esfriado e esta lavagem é adicionada ao concentrado.O Complexo de Protrombina resultante é estocado a cerca de 15 °C ou maisfrio em recipientes selados.
O Complexo de Protrombina é descongelado a cerca de 35 °Cou menos. O Complexo de Protrombina é diluído a aproximadamente 1000-5000 u/ml por adição de água purificada contendo suficiente cloreto de cálciopara produzir a concentração de cloreto de cálcio final de cerca de 0,005-0,03molar. A suspensão de tromboplastina é adicionada concomitantemente com ocomplexo de protrombina com o cloreto de cálcio, sob suave agitação. O pH éajustado a cerca de 7.3 e misturado por cerca de 15-60 minutos. Em seguida àativação a cerca de 15-30 °C, a suspensão é esfriada a cerca de < 10 °C.
Ativação e purificação da trombina: o Complexo deProtrombina ativado é diluído a aproximadamente 500-3000 u/ml comtampão de citrato de sódio diluído, pH de cerca de 6,6. O material pode serrefiltrado como necessário.
O pH da mistura acima descrita é ajustado a cerca de 6,6 pelaadição de ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio diluído. O Complexode Protrombina ativado é adicionado a uma resina de troca de cátions, que foiajustada a um pH de cerca de 6,6. As resinas que podem ser usadas incluemmas não são limitadas a Amberlite CG-50, Macro-Prep CM Support, Macro-Prep High S Support, Macro-Prep S Support, UNOsphere S ion exchange, SPSepharose™ HP, resina Capto S ou equivalente.
A coluna é lavada com citrato de sódio diluído pH 6,6 e entãolavada com cloreto de sódio de cerca de 0,1 a 0,25 molar, para removerproteínas de baixa afinidade, que são descartadas. Isto é seguido pelaaplicação de cloreto de sódio aproximadamente 0,5-1 molar para eluir atrombina purificada. O eluato é coletado em frações que são combinadas deacordo com um ensaio em-processo. A massa não-estéril pode ser armazenadaa cerca de 0-10 °C por até cerca de 48 horas enquanto em processo. Atrombina de massa não-estéril é formulada a não menos do que cerca de 1000u/ml por adição de água para irrigação, 30% glicerol, 10% PEG e cloreto desódio de aproximadamente 0,15-0,3 M. O pH da solução de trombinaformulada é ajustado a pH de cerca de 6,7 ± 1,00 com ácido clorídrico diluídoou hidróxido de sódio. A trombina de massa não-estéril formulada pode serarmazenada a cerca de 0-10 °C por até aproximadamente 48 horas antes doprocessamento estéril.
A trombina de massa não-estéril formulada é esterilizada porpassagem através de filtros de liberação não-fibrosos retentores bacterianosestéreis para dentro de um tanque de retenção estéril adequado. O produtoresultante é uma a-trombina altamente concentrada, que tem um MW decerca de 40 kDa. As amostras têm uma atividade específica média de > acerca de 1500 u/mg de proteína.
Além disso, estudos de depuração de príon foram realizadosusando-se uma etapa de purificação cromatográfica de troca de íons. Osresultados indicam que o nível de depuração de príon, obtido pela etapa depurificação cromatográfica de trombina é igual a 3,5 log.
A coluna de pequena escala usada tinha um diâmetro internode 1,6 cm e foi embalada a uma altura de 50,2 cm com resina. Assim, ovolume de leito da coluna foi igual a cerca de 101 ml. A coluna guarnecida foiequilibrada com 100 ml de NaCl 1M, seguido por 100 ml de Na-citrato-0,025M pH 6,61. A taxa de fluxo do sistema de cromatografia foi ajustada a3,3 ml/min.
A amostra reforçada consistiu de 8 ml de homogeneizado decérebro de hamster Scarpie cepa 263K. O homogeneizado foi sonicado por 20minutos, então filtrado através de filtros de 0,45, 0,2 e 0,1 um. Após o reforçode amostra, um total de 12 ml foi retirado para os testes de pré-cromatografia,deixando uma amostra reforçada de pré-coluna de 396 ml (400 + 8-12 ml).
A coluna pré-equilibrada foi carregada com os 396 ml detrombina bruta, lavada com 144 ml de tampão de Na-citrato 0,025M, atéabsorvência de eluente ficasse abaixo de 0,4AU, e lavada com 275 ml deNaCl 0,2M, até a absorvência de eluente ficasse abaixo de 0,2 AU. A colunafoi então extraída com NaCl 0,65 M e 37 ml de trombina purificada foramcoletados do tempo em que a absorvência alcançou 2AU até o tempo em queela caiu para 2AU.
As amostras de pré e pós cromatografia coletadas foramarmazenadas a -60°C ou abaixo antes de realizar o ensaio Western Blot depríon. Os resultados são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 34</column></row><table>
EXEMPLO 2-DEPURACÃO VIRAL UTILIZANDO FILTRAGEM DEEXCLUSÃO DE TAMANHO
As membranas usadas neste exemplo são Ômega™ (100K VR esão "moldadas de polietersulfona modificada em um suporte de poliolefinaaltamente porosa, que concede resistência e rigidez à membrana acabada". Oponto de corte de peso molecular teórico é 100 kDa. A passagem de pequenasmoléculas é possível somente sob condições de filtragem de fluxo tangencial. Asgrandes moléculas e vírus são retidos por exclusão de tamanho. O valor deredução em log (LRV) para Parvovírus bovino (BPV), que é um muito pequenovírus (20 nm) não-envelopado, foi determinado exceder cerca de 3,5 log.
A solução de trombina avaliada durante este estudo dedepuração viral é uma trombina pré-purificada. As amostras tipicamente têmuma atividade específica maior do que cerca de 1500 u/mg de proteína. Aconcentração de proteína é estimada a aproximadamente 1,2% e aconcentração de sal a cerca de 0,65 M NaCl. O componente principal destasolução de trombina é o Ingrediente Farmacêutico Ativo ot-trombina, que temum peso molecular de aproximadamente 40 kDa.
Há diversas considerações quando escolhendo-se um painel devírus modelo a ser incluído em um estudo de depuração viral. Uma é modelarvírus importante que têm um claro potencial de contaminar os materiais departida. Outra é incluir vírus que têm uma larga faixa de características físicas equímicas, no painel de vírus modelo, de modo que, se o estudo de depuração devírus apresentar boa depuração destes vírus, então tem-se certeza de que oprocedimento de manufatura pode efetivamente limpar agentes virais inesperados.
E importante considerar o parvo vírus Bovino (BPV) porqueele é um vírus importante, que tem um claro potencial de contaminar osmateriais de partida e também é extremamente pequeno, não-envelopado emuito resistente a tratamentos físico-químicos. O vírus da leucemia murinaxenotrópica (XMuLV), vírus da diarréia viral bovina (BVDV) e o vírus dapseudo-raiva (PRV) são também incluídos bem como BPV. Este painel devírus fornece vírus modelo para os vírus importantes e fornece uma boa faixade características físicas e químicas, de modo que a depuração destes vírussugeriria que o procedimento de manufatura poderia limpar os agentesinesperados. As características do painel de vírus são indicadas na Tabela 2.Tabela 2 Resumo das características dos quadro vírus escolhidos
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Para cada um dos quatro vírus considerados, duas filtragens sãorealizadas: uma em uma pressão de alimentação alvo de 8 psi (0,56 kg/cm ) e aoutra em uma pressão de alimentação alvo de 0,84 kg/cm . Cada filtragem érealizada empregando-se uma nova membrana Omega 100 K VR.
Todas as filtragens são realizadas em um recinto frio. Cadafiltragem consiste em reforçar a amostra com 5% (v/v) de um dos quatrovírus, filtrar através de um filtro de 0,45 um para remover quaisqueragregados de vírus, em seguida filtrar através da membrana Pall Ômega 100K VR. O teste dos vírus é realizado em amostras retiradas pós reforço, pósfiltragem de 0,45 um e pós filtragem por membrana Omega 100K VR.
A filtragem da trombina consiste de filtrar cerca de 400 ml detrombina pré-purificada através de uma membrana de 0,1 pé (0,929 dm )Omega 100K VR. Após 80% (320 ml) do volume de trombina inicial sercoletado no permeado, o retido de 80 ml restante ainda continha muitatrombina, além dos vírus e impurezas de não-trombina. Diafiltragem contínuadesta solução de 80 ml é usada a fim de maximizar a transmitância datrombina. Isto é conseguido por diafiltragem dos 80 ml com 6x aquele volume(480 ml) com uma solução de NaCl.
O volume de permeado final é assim duas vezes o volume daamostra de trombina inicial. A concentração deste permeado através de umcassete de membrana 10K VR é então realizada para trazer de volta o volumee concentração ao nível desejado. A pureza do produto final é muitoaumentada, como resultado desta filtragem. Por exemplo, a atividadeespecífica é aumentada em mais do que 30% e o teor de fator Va é reduzido aníveis indetectáveis no produto final, conforme medido por ensaioimunossorvente ligado por enzima competitiva (cELISA).
A remoção do vírus (e remoção de molécula grande) ocorrepor exclusão de tamanho. Valores de redução em log muito elevados sãoobservados para o painel de 4-vírus considerados (Parvo Vírus Bovino, Vírusda Diarréia Viral Bovina, Vírus de Leucemia de Murino Xenotrópica e Vírusda Pseudo-raiva Bovina). A estabilidade do produto de trombina pós-Omeganão é comprometida devido à aumentada pureza do produto aumentada.
A Tabela 3 resume os parâmetros e condições de 8 filtragens.Uma vez que a amostra de trombina da pré-filtragem é igual a 400 ml e a área desuperfície do filtro é igual a 0,1 pé (0,929 dm ), a relação do volume detrombina para a área da superfície do filtro é de 41/pé (4 1/9,29 dm ). O volumede reforço de vírus é igual a 20 ml por filtragem (5% v/v). A pressão dealimentação é mantida a 8 ± 2 psi (8 ± 0,141 kg/cm para todas as filtragens.
Tabela 3-Resumo dos parâmetros e condições das 8 filtragens
<table>table see original document page 37</column></row><table>Para cada filtragem, um amostra de trombina reforçada de 420ml é filtrada através de uma membrana de 0,1 pé (9,29 dm ) Omega 100KVR. Quando 340 ml de permeado são coletados, os restantes 80 ml de soluçãode retido são diafiltrados com 6 vezes aquele volume, empregando-se umasolução de NaCl 0,65 M. Portanto, o volume de permeado total é igual a 340+ (6 x 80) = 820 ml. Estas condições de filtragem produzem recuperaçãoaceitável de trombina, bem como aumentado grau de pureza de trombina.
A fluxo cruzado no início das filtragens de 8 psi (9,29 cm )varia de 41-44 ml/ml. A filtragem de fluxo cruzado é um método de operaçãoem que o fluido retido é circulado através da superfície da membrana, o queevita acúmulo do material filtrado na membrana. O fluxo cruzado no iníciodas filtragens de 12 psi (0,84 kg/cm ) varia de 54-56 ml/min. O tempo doprocesso para as filtragens de 8 psi (0,84 kg/cm ) varia de 236-257 min. Otempo do processo para as filtragens de 12 psi (0,84 kg/cm ) varia de 190-223min). Os resultados da depuração dos quatro diferentes vírus são resumidos naTabela 4.
Tabela 4-Resumo dos resultados da depuração viral
<table>table see original document page 34</column></row><table>
Os elevados valores de depuração conseguidos e asimilaridade dos resultados obtidos entre as filtragens em duplicata para todosos vírus indicam que a etapa de filtragem é robusta. Os valores de redução emlog médios foram acima de 4 para todos os vírus, exceto BPV, que tinha umvalor de redução em log de 3,74 ± 0,39. Mesmo embora este valor de reduçãoem log fosse ligeiramente abaixo de 4 log, é ainda muito elevado sob oconjunto de condições empregadas.
Além disso, estudos de depuração de príon foram realizados,empregando-se a etapa de filtragem de exclusão de tamanho. Os resultadosindicam que o nível de depuração de príon obtido pela etapa de purificação defiltragem de trombina é igual a 3,6 log.
O volume da amostra de trombina pré-reforço era igual a 400 ml.
A amostra de reforço consistiu de 8 ml de Homogeneizado deCérebro de Hamster Scrapie Cepa 263 K. O homogeneizado foi sonicado por20 minutos, em seguida filtrado através de filtros de 0,45, 0,2 e 0,1 fim.
Após reforço da amostra, 12 ml foram retirados para os testesde filtragem pré-Omega, deixando uma amostra reforçada pré-filtragem de396 ml (400+ 8-12 ml).
O filtro usado foi membrana Pall's Ômega™ 100K VR, comuma área de superfície de 0,1 pé (9,29 dm ). Assim, a relação de volume detrombina para área de superfície de filtro foi de 4 l/pé .
A membrana Ômega™ 100K VR foi instalada no sistema defiltragem e enxaguada com 500 ml de água purificada. O teste de integridadede pré-uso foi realizado e foi aprovado pelos critérios de aceitação. Amembrana foi então condicionada com 100 ml de NaCl 0,65 M em umapressão de alimentação de 10 psi (0,703 kg/cm ). As taxas de permeado efluxo cruzado, medidas em cilindros graduados, foram de cerca de 5 e 52ml/min respectivamente.
A filtragem dos 396 ml iniciais de amostra reforçada foiiniciada. Quando 325 ml do filtrado (isto é, cerca de 80% do volume inicial)foram coletados, a amostra restante foi diafiltrada com um total de 475 ml deNaCl 0,65 M (isto é, cerca de 6 vezes o volume do retido). A pressão dealimentação foi mantida a cerca de 10 psi (0,703 kg/cm ) e a pressão do retidofoi igual a 0 psi do princípio ao fim da realização de filtragem. As condiçõesde filtragem mostraram previamente produzirem recuperação de trombinaaceitável, bem como alta pureza de vírus.O volume pós-filtragem final foi igual a 790 ml e o tempo doprocesso foi igual a 172 minutos.
As amostras de filtragem pré e pós Omega coletadas foramarmazenadas a-60°C ou abaixo antes da realização do ensaio Wester Blot. Osresultados são resumidos na Tabela 5.
Tabela 5
<table>table see original document page 40</column></row><table>
* logi0(PrPKb!>) total = Título Final (log^CPrP^/ml)) + logio (Volumeamostra (ml))
EXEMPLO 3-DEPURACÂO VIRAL EMPREGANDO-SE FILTROS DE ÍON
Trombina purificada é primeiro concentrada usando-se umfiltro Pall com 10 K MWCO e área de superfície de 1 pé2 (9,29 dm2). Emseguida, as amostras concentradas são diluídas com água purificada àconcentração de sal desejada. Um total de 15 bateladas é preparado. Osresultados de todas as bateladas preparadas são resumidos nas Tabela 6 e 7.
Tabela 6-Recuperação percentual média para várias filtragens
<table>table see original document page 40</column></row><table>Tabela 7-Resumo dos resultados
<table>table see original document page 41</column></row><table>
As amostras das filtragem 1-3 (NaCl 50 mM) são inicialmenteusadas para validação de depuração viral do filtro Mustang Q e resultam emvalor de redução em log muito elevado para Parvo Vírus Bovino (BPV).
Entretanto, uma vez que a recuperação da trombina é baixa, com a média desomente 74%, o estudo de depuração viral é repetido usando-se amostras dasfiltragens 4, 5 e 7 (NaCl 108 mM), que produz uma recuperação de trombinamédia de 99,8%, porém menos do que valores de redução de 2 log para BPV.
Finalmente, o estudo de depuração viral é repetido usando-se amostras dasfiltragens 14, 14 e 16 (72 mM NaCl e 91,7% de recuperação) e o valor deredução em log para BPV foi aceitável (3,6 ± 0,62).
Além disso, estudos de redução de príon foram realizadosusando-se um filtro de troca de íon. Os resultados indicam que o nível dedepuração de príon, obtido pela etapa de purificação de filtragem de trombina,é igual a mais do que 3,9 log.
O volume da amostra de trombina pré-reforço foi igual a 91 ml.
A amostra de reforço consistiu de 1,6 ml de Homogeneizadode Cérebro de Hamster Scrapie Cepa 236K. O homogeneizado foi sonicadopor 20 minutos, em seguida filtrado através de filtros de 0,45, 0,2 e 0,1 um.
12 ml foram retirados para os testes de filtragem pré-MustangQ deixando uma amostra reforçada de pré-filtragem de 80,6 ml (91 + 1,6-12ml).
O filtro usado foi Filtro Pall's Mustang Q, com uma área desuperfície de 0,35 ml. Assim a relação de volume de trombina para área desuperfície de filtro foi de 230 ml de amostra por ml de filtro.
O retentor de filtro foi sanitizado sem disco de filtro com 20ml de NaOH IN com uma retenção de 20 min. O filtro Mustang Q foicolocado no retentor, lavado com 20 ml de NaOH IN, seguido com lavagemde NaCl 1M, até o pH do eluente ficar neutro.
Em seguida, o filtro foi condicionado com 25 ml de NaCl 72mM em uma taxa de fluxo de cerca de 3 ml/min antes da filtragem real daamostra reforçada com 80,6 ml.
O volume de pós-filtragem final foi igual a 77 ml e o tempo doprocesso foi igual a 49 minutos.
As amostras de pré e pós filtragem de íon coletadas foramarmazenadas a -60°C ou abaixo, antes de realizar o ensaio Western Blot. Osresultados são mostrados na Tabela 8.
Tabela 8
<table>table see original document page 42</column></row><table>EXEMPLO 4-FILTRAGEM DE EXCLUSÃO DE TAMANHO SOBVÁRIAS CONDIÇÕES
Este exemplo também utiliza filtragem de exclusão detamanho empregando-se filtros Pall Ômega 100K VR. Três filtragens sãorealizadas em uma pressão de alimentação de 8 psi (0,56 kg/cm2) e três sãorealizadas em uma pressão de alimentação de 12 psi (0,84 kg/cm ). Osparâmetros do filtro diminuídos proporcionalmente são escolhidos paramanter o volume para área de superfície de filtro constante e asseguraroperação na faixa de pressão de alimentação especificada.
Cada filtragem é realizada com um novo filtro Pall Ômega100K VR de 0,1 pé (0,929 dm ) e todas as filtragens são realizadas em umambiente frio (< cerca de 80°C). Um medidor de fluxo é incluído no sistemapara melhorar a monitorar o fluxo cruzado durante a filtragem. O fluxômetroé calibrado no recinto frio antes do uso.
A Tabela 9 resume as condições e parâmetros das seisfiltragens. Para as filtragens de 8 psi (0,56 kg/cm ), a atividade da trombinado material de partida medeia 22,091 u/ml e para o pool de filtrado finalmedeia 11,130 u/ml. A percentagem resultante de recuperação de trombinaapós 6 ciclos de realização de diafiltragem medeia 86%. As filtragensrealizadas em uma pressão de alimentação de 8 psi (0,56 kg/cm ) mostramligeiramente mais recuperação de trombina do que a 12 psi (0,84 kg/cm ).
Tabela 9-Resumo de resultados de filtragem e recuperação de trombina
<table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table>
Uma diferença é que em uma pressão de alimentação de 12 psi(0,84 kg/cm ), o fluxo cruzado é mais elevado, resultando em uma passagemmais rápida de trombina, desse modo encurtando o tempo de processamento.
A Tabela 10 mostra que a etapa de filtragem resulta em umaumento de 36,4% em pureza da trombina ou atividade específica para asfiltragem de 8 psi (0,56 kg/cm ) e um aumento de 37,1% para as filtragens de12 psi (0,84 kg/cm ). A atividade específica aumenta de uma faixa de 1688,4a 1986,0 de trombina/mg proteína nas amostras de pré-filtragem, a uma faixade 2324,6 e 2690,1 de trombina/mg proteína nas amostras de pós-filtragem.
Tabela 10. Atividade específica das amostras de filtragem pré vs. pós-ômega 100
<table>table see original document page 44</column></row><table>
As frações de permeado são muito mais limpas do que arespectiva amostra de trombina de partida inicial, como mostrado na Figura 2.
Quase todas as impurezas de elevado peso molecular, observadas no materialde partida, são retidas pelo filtro no retido.A Tabela 11 mostra que a etapa de filtragem também resultaem uma substancial redução do teor de Fator Va. A redução média entre asfiltragens realizadas nas duas pressões de alimentação é comparável: 88,5%em filtragens 8 psi (0,56 kg/cm ) e 89,3% nas filtragens de 12 psi (0,84kg/cm ). O fator V/Va é associado com coagulopatias que podem ocorrer empacientes em resposta a exposição cirúrgica a trombina bovina tópica. Oconhecimento atual sugere que a contaminação pelo fator V/Va da trombinabovina estimula a produção de anticorpos de Fator Va antibovinos depaciente, que pode reagir cruzadamente com o próprio fator Va do paciente,desse modo resultando em hemostase prejudicada. Esta etapa de filtragemfornece os benefícios do benefício de substancialmente reduzir o teor do fatorVa a níveis indetectáveis na Thrombin-JMI® final, conforme medido porensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA) competitiva.
Tabela 11. Teor do fator VA de amostras de filtragem pré- vs. pós-ômega100 por elisa
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EXEMPLO 5-FORMULACÃO DE TROMBINA ESTABILIZADA A Tabela 12 mostra uma formulação de trombina purificadaestabilizada, de acordo com a presente invenção.
Tabela 12-Formulações de trombina estabilizadasFormulações de trombina estabilizadas
<table>table see original document page 45</column></row><table>A trombina para a formulação de trombina estabilizada foicriada de acordo com o processo da Figura 3. A composição de trombina demassa não-estéril foi formulada a não menos do que 1400 unidades/ml, pelaadição de água para irrigação. Glicerol foi então adicionado a umaconcentração aproximada de 30% em volume. Polietileno glicol 200-400 MWfoi adicionado a uma concentração aproximada de 10% em volume. Cloretode sódio foi adicionado até a concentração do cloreto de sódio ser deaproximadamente 0,15-0,3M e acetato de sódio foi adicionado até aconcentração do acetato de sódio ser de aproximadamente 0,025-0,05 M. OpH da solução de trombina foi ajustada a um pH de 6,7 ±0,1 com ácidoclorídrico diluído ou hidróxido de sódio.
A formulação de trombina não esterilizada, estabilizada, foientão colocada em teste de estabilidade em temperatura ambiente (23 °C ± 2°C) e as amostras foram testadas em vários pontos do tempo. As amostrasforam testadas em triplicata. O método de teste usado para ensaiar a potênciaou atividade da trombina foi baseado em medições de tempo de coagulação.
A máquina usada para determinar os tempos de coagulação foi o regulador decoagulação ACL 7000. As amostras foram diluídas a uma concentração quese situava dentro da faixa de curva padrão e colocada sobre o rotor damáquina. Plasma humano foi também colocado no copo da máquina eamostras tanto de plasma como de trombina diluída foram incubadas a 37 °C.
Em seguida, um volume especificado de cada um do plasma e trombinadiluída foram concomitantemente bombeados e misturados. Após mistura, luzfoi passada através da mistura de plasma/trombina e, quando um coaguloformou-se a luz foi dispersa. Um detector mediu a luz dispersa e transformouo resultado em tempo de coagulação (segundos). O tempo de coagulação foientão convertido em u/ml, usando-se uma regressão em log dupla do tempode coagulação da curva padrão vs. u/ml. Finalmente, o valor u/ml foimultiplicado pelo ator de diluição, para obter-se a potência real da amostra.A Tabela 13 mostra os resultados da estabilidade durante 6meses em temperatura ambiente (23 °C ± 2 °C) para a formulação da atualinvenção.
Tabela 13-FormuIações de trombina estabilizadas
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A Tabela 14 mostra uma formulação de trombina, formuladapara estabilidade melhorada, que não foi submetida aos métodos depurificação da atual invenção.
Tabela 14-Formulações de trombina estabilizadas
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A composição de trombina de massa não-estéril foi formuladaa não menos do que 1400 unidades/ml pela adição de água para irrigação.Glicerol foi então adicionado a uma concentração aproximada de 30% emvolume. Polietileno glicol 200-400 MW foi adicionado a uma concentraçãoaproximada de 10% em volume. Cloreto de sódio foi adicionado até aconcentração do cloreto de sódio ser de aproximadamente 0,15-0,3M eacetato de sódio foi adicionado, até a concentração do acetato de sódio seraproximadamente de 0,025-0,05M. O pH da solução de trombina foi ajustadoa um pH de 6,7 ±0,1 com ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio. Aformulação foi então colocada em teste de estabilidade a (23 °C ± 2 °C) etestada quanto a potência em intervalos de tempo regulares. As amostrasforam testadas em triplicata.
A Tabela 15 mostra os resultados da estabilidade durante 24meses em temperatura ambiente (23 °C ± 2 °C).
Tabela 15-Formulações de trombina estabilizadas
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NA-não disponível
Embora exemplos específicos tenham sido dados, estes sãoformas de realização preferidas somente e pretendem explicar e descrevermais a invenção. Eles não destinados a definir o completo escopo destainvenção.
Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui porreferência em sua totalidade e para todas as finalidades na mesma extensãocomo se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosseespecifica e individualmente para ser incorporado por referência em suatotalidade para todas as finalidades.
Claims (70)
1. Método para preparar uma trombina purificada,caracterizado pelo fato de compreender:(a) aplicar uma preparação de trombina a um filtro deexclusão de tamanho capaz de excluir impurezas que tenham um pesomolecular maior do que 40 kDa; e(b) recuperar a trombina purificada.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de a fonte de trombina ser bovina.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de a fonte de trombina ser Thrombin-JMI®.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de o filtro de exclusão de tamanho ser capaz de excluir impurezas quetenham pesos moleculares variando de 40 kDa e 300 kDa.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de o filtro de exclusão de tamanho ser selecionado de um capaz deexcluir impurezas tendo peso molecular de 50 kDa, 100 kDa ou 150 kDa.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de o filtro de exclusão de tamanho ser selecionado de um capaz deexcluir impurezas tendo peso molecular de 50 kDa.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de o filtro de exclusão de tamanho ser selecionado de um capaz deexcluir impurezas tendo peso molecular de 100 kDa.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de as impurezas da trombina purificada recuperada serem reduzidas empelo menos 50%.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de as impurezas na trombina purificada recuperada serem reduzidas empelo menos 80%.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a atividade específica da trombina purificada recuperada seraumentada em pelo menos 1000%.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a atividade específica da trombina purificada recuperada seraumentada em pelo menos 1200%.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a atividade específica da trombina purificada recuperada seraumentada em pelo menos 1500%.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a trombina purificada recuperada ser substancialmente livre deimpurezas.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a trombina purificada recuperada ser substancialmente livre defator Va.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a trombina purificada recuperada ser substancialmente livre depríons.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a trombina purificada recuperada ter uma redução de príon iguala pelo menos 3,5 log.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a trombina purificada recuperada ser substancialmente livre deagentes virais.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a trombina purificada recuperada ser substancialmente pura.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender ainda aplicar a trombina purificada recuperada a umfiltro de troca de íons.
20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender ainda aplicar a trombina purificada recuperada auma etapa de purificação cromatográfica.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de a etapa de purificação cromatográfica compreender uma colunade cromatografia por troca de íons.
22. Composição de trombina, caracterizada pelo fato de sersubstancialmente livre de impurezas e ter um peso molecular maior do que 40kDa.
23. Composição de trombina de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de ser substancialmente livre de impurezas tendoum peso molecular entre 50 kDa e 300 kDa.
24. Composição de trombina, caracterizada pelo fato de sersubstancialmente livre de impurezas.
25. Composição de trombina, caracterizada pelo fato de sersubstancialmente pura.
26. Composição de trombina, caracterizada pelo fato de sersubstancialmente livre de fator Va.
27. Composição de trombina de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de o fator Va ser medido pelo ensaio de atividadedo fator Va, ELISA, ou Western Blot.
28. Composição de trombina de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de o fator Va ser menor do que 0,5 ug/1000unidades de trombina.
29. Composição de trombina, caracterizada pelo fato de sersubstancialmente livre de agentes virais e seu valor de redução em log sermaior do que 3,5 por vírus.
30. Composição de trombina, caracterizada pelo fato de teruma atividade específica entre cerca de 1800 e 3000 u/mg de proteína.
31. Composição de trombina de acordo com a reivindicação-30, caracterizada pelo fato de a atividade específica ser entre cerca de 1800 e-2400 u/mg de proteína.
32. Composição de trombina de acordo com a reivindicação- 30, caracterizada pelo fato de a atividade específica ser entre cera de 2400 e-2500 u/mg de proteína.
33. Composição de trombina de acordo com a reivindicação-30, caracterizada pelo fato de a atividade específica ser entre cerca de 2500 e-2600 u/mg de proteína.
34. Composição de trombina de acordo com a reivindicação-30, caracterizada pelo fato de a atividade específica ser entre cerca de 2600 e-2700 u/mg de proteína.
35. Composição de trombina de acordo com a reivindicação-28, caracterizada pelo fato de compreender ainda um excipiente.
36. Composição de trombina de acordo com a reivindicação-30, caracterizada pelo fato de compreender ainda um excipiente.
37. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender ainda aplicar a preparação de trombina a um filtrode troca de íons.
38. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender ainda aplicar um tratamento térmico à preparaçãode trombina.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de o tratamento térmico incluir manter a trombina a 60°C por 10horas.
40. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender abaixar o pH abaixo de cerca de 5 da preparação detrombina.
41. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender ainda aplicar radiação eletromagnética à preparaçãode trombina.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de a radiação eletromagnética ser radiação gama.
43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de a radiação eletromagnética ser radiação UV.
44. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a quantidade de preparação de trombina aplicada ao filtro deexclusão de tamanho ser de pelo menos 15 L.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de a preparação de trombina compreender pelo menos 300.000.000unidades de trombina.
46. Método para preparar uma trombina tendo aumentadapureza, caracterizado pelo fato de compreender:(a) aplicar a preparação de trombina a uma etapa depurificação cromatográfica;(b) aplicar a preparação de trombina a um filtro de exclusãode tamanho;(c) aplicar a preparação de trombina a um filtro de troca deíons; e(d) recuperar a trombina purificada.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizadopelo fato de a etapa de purificação cromatográfica compreender uma colunade cromatografia por troca de íons ou uma coluna de cromatografia porexclusão de tamanho.
48. Formulação de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de ser líquida.
49. Formulação de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de o excipiente farmaceuticamente aceitável ser água,glicerol, polietileno glicol ou um combinação dos mesmos.
50. Formulação de acordo com a reivindicação 49,caracterizado pelo fato de o glicerol ser entre 20-40% em volume.
51. Formulação de acordo com a reivindicação 49,caracterizado pelo fato de o polietileno glicol ser entre 1-20% em volume.
52. Formulação de acordo com a reivindicação 49,caracterizado pelo fato de o excipiente ser cloreto de sódio, acetato de sódio,citrato de sódio ou combinação dos mesmos.
53. Formulação de acordo com a reivindicação 49,caracterizada pelo fato de compreender ainda um ácido ou uma base.
54. Formulação de acordo com a reivindicação 53,caracterizada pelo fato de o ácido ou base ser ácido clorídrico ou hidróxido desódio.
55. Formulação de acordo com a reivindicação 53,caracterizada pelo fato de as formulações terem um pH entre 5-9.
56. Formulação de acordo com a reivindicação 53,caracterizada pelo fato de as formulações terem um pH entre 6-8.
57. Formulação de trombina líquida estabilizada, caracterizadapelo fato de compreender uma composição de trombina que ésubstancialmente livre de impurezas e pelo menos um excipiente.
58. Formulação de trombina líquida estabilizada de acordocom a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de na formulação manter pelomenos 60% de sua potência inicial por até dois anos.
59. Formulação de trombina líquida estabilizada de acordocom a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de na formulação manter pelomenos 70% de sua potência de reivindicação de rótulo por até dois anos.
60. Formulação de trombina líquida estabilizada, caracterizadapelo fato de compreender:uma composição de trombina em que a composição detrombina é substancialmente livre de impurezas;glicerol;polietileno glicol;cloreto de sódio;acetato de sódio; eem que a formulação tem um pH entre 6-8.
61. Método para administrar a formulação de trombinaestabilizada como definida na reivindicação 57, caracterizado pelo fato decompreender administrar a formulação de trombina estabilizada topicamente.estabilizada como definida na reivindicação 57, caracterizado pelo fato decompreender:puxar a formulação de trombina para dentro de uma seringa;forçar a formulação de trombina através da seringa; etrombina.
62. Método para administrar a formulação de trombinaestabilizada como definida na reivindicação 57, caracterizado pelo fato decompreender pulverizar a formulação de trombina sobre a superfície de umlume corporal.
63. Método para administrar a formulação de trombinaestabilizada como definida na reivindicação 57, caracterizado pelo fato decompreender:
64. Método para administrar a formulação de trombinainundar a superfície de um lume de corpo com a formulação desaturar uma esponja com a formulação de trombina; eaplicar a esponja à superfície de um lume corporal.
65. Kit, caracterizado pelo fato de compreender:a formulação de trombina estabilizada como definido nareivindicação 57;um frasco capaz de conter a formulação de trombina; euma agulha.
66. Kit, caracterizado pelo fato de compreender:a formulação de trombina estabilizada como definida nareivindicação 57; eum dispositivo que é capaz de pulverizar a formulação detrombina.
67. Kit de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelofato de o dispositivo ser uma ponta de spray ou uma bomba de spray.
68. Formulação de trombina líquida estabilizada, caracterizadapelo fato de compreender:trombina;glicerol;polietileno glicol;cloreto de sódio;acetato de sódio; eem que a formulação tem um pH entre 6-8
69. Formulação de trombina líquida estabilizada de acordocom a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de na formulação manter pelomenos 60% de sua potência inicial por até dois anos.
70. Formulação de trombina líquida estabilizada de acordocom a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de na formulação manter pelomenos 70% de sua potência rótulo inicial por até dois anos.
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