KR20080019583A - 트롬빈 정제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고분자량의 불순물 수준이 감소된 트롬빈 조성물에 관한 것이다. 특히 인자 Va, 프라이온 및/또는 바이러스성 병원체의 수준이 크게 감소되었다. 본 발명은 또한 일반적으로 고도의 순도와 높은 비활성을 가지는 트롬빈의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 크기 축출 여과에 의해 트롬빈 제제로부터 고분자량 불순물을 축출하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서 트롬빈의 제조는 추가로 이온 교환 여과 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 특히 트롬빈의 대규모 정제에 적당하다. 본 발명은 또한 일반적으로 트롬빈 조성물을 함유하는 안정화된 제형에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 고도의 순도 및 높은 비활성을 가지는 트롬빈을 함유하는 안정화된 액체 제형 및 그러한 제형의 제조 방법에도 관한 것이다.
트롬빈, 프로트롬빈, 크기 축출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 순도, 비활성, 트롬빈 정제.
Description
본 발명은 일반적으로, 실질적으로 큰 분자량의 불순물, 예컨대 환자에게서 역효과의 원인이 될 수 있는 인자 Va, 프라이온 및/또는 바이러스성 병원체가 없는 정제된 트롬빈 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 실질적으로 바이러스성 병원체가 없으며 고도의 순도 및 높은 비활성을 가지는 트롬빈의 제조 방법에도 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 트롬빈 제제로부터 고분자량의 불순물을 축출하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 고도의 순도, 높은 비활성 및 안정성을 가지는 트롬빈 제제의 제형에 관한 것이다.
트롬빈은 양성자이동성(protolytic) 효소로서, 프로트롬빈의 단백질 가수분해의 결과로서 응고 시스템이 활성화된 후에 혈액에 나타난다. 트롬빈은 피브리노겐의 피브린으로의 전환을 촉매함으로써 혈액의 응고를 촉진하며, 그것은 혈액 덩어리를 형성하고 피브리노펩티드 A 및 B를 방출한다. 혈관계에 대한 방해 후에 트롬빈 생성은 응고 과정에 중추적이다.
트롬빈 제제는 모세혈관과 작은 소정맥으로부터 스며나오는 혈액 또는 소량의 출혈을 얻기 쉬울 때는 언제나 항상성 보조제로서 국소적으로 적용될 수 있는 것으로 FDA에 의해 승인되었다. 상업적으로 이용가능한 트롬빈의 국소 적용은 혈액 응고를 상당히 급속하게 진행시키고 응고 시간을 상당히 축소시킨다.
저순도의 트롬빈 제형을 사용한 연구 결과, 응고치료법(coagulopathy)은 저순도의 국소적인 트롬빈 제형에 대한 노출에 반응하는 환자에게서 일어날 수 있는 것으로 나타났다. 전형적으로 상업적으로 이용가능한 트롬빈 제제에 존재하는 불순물은 인자 Va, 소 혈청 알부민 (BSA), 및 기타 고분자량의 단백질을 포함한다. 시판중인 소 트롬빈 제형의 인자 Va 오염은 환자의 항-소 인자 Va 항체의 생성을 자극할 수 있고, 그것은 환자 자신의 인자 Va와 교차반응할 수 있어서 항상성의 손상을 유도할 수 있다.
트롬빈의 혈액 응고 강도는 유닛/ml로 측정된다. 보다 농축된 샘플은 효능이 더 클수록 혈액을 더 빨리 응고시킬 것이다 (또는 피브리노겐을 더 빨리 생성할 것이다). 비활성은 샘플의 효능을 그것의 단백질 함량으로 나눈 비율로, 단백질 밀리그램당 유닛으로 표시된다.
트롬빈 비활성은 트롬빈의 순도에 좌우된다. 고도로 정제된 트롬빈은 덜 순수한 제제와 비교할 때 비활성의 증가를 나타낸다.
이전에 트롬빈의 정제는 대체로 종래의 이온 교환 크로마토그래피의 사용에 한정되어 있었다. 미국 특허 5,397,704호에는 일련의 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 제조되는 트롬빈의 소 제제가 설명되어 있다.
미국 특허 5,151,355호에는 1 유닛의 프로트롬빈을 5 유닛 이하의 트롬보플라스틴과 칼슘의 존재하에 반응시킴으로써 제조된 소 트롬빈 제제가 설명되어 있다. 그런 다음 트롬빈은 음이온 교환 아가로스 칼럼 및 양이온 교환 아가로스 칼럼 에 차례로 적용된다.
미국 특허 4,965,203호에는 트롬빈이 일련의 이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 통과한 후 폴리올과 완충액으로 제형되는 소 트롬빈의 정제 방법이 개시되어 있다. 비록 소 트롬빈 제제가 높은 비활성을 가지는 것으로 증명되었지만, 그러한 정제 계획은 고분자량 불순물을 효과적으로 제거하기 위한 어떠한 수단도 제공하지 못한다.
미국 특허 출원 공보 제 2001/0033837호에는 소수성 상호작용 크로마토그래피와, 임의로 이어지는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 트롬빈 제제를 정제하는 방법이 개시되어 있다. 비록 그 정제 방법이 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하고 있지만, 정제 및 바이러스 제거를 위해 설명된 방법은 바이러스 제거를 이룰 수 없고 본 발명에 포함되는 비활성 또는 순도를 이룰 수 없다.
따라서 고도의 순도를 가지는 트롬빈을 제조하기 위해 사용될 수 있는 방법이 필요하다. 그렇게 정제된 트롬빈은 저수준의 고분자량 불순물, 예컨대 인자 Va와, 바이러스성 병원체 및 프라이온의 높은 정화 마진(clearance margin)을 가질 것이다.
비록 고도의 순도를 가지는 트롬빈이 인자 Va 및 BSA와 같은 불순물이 감소되거나 제거되기 때문에 사용하는 데 더 안전할 수는 있지만, 고도로 정제된 트롬빈은 안정화된 제형으로 제형하기가 어렵다. 보다 순수한 트롬빈은 덜 안정하며 안정화된 제형으로 제형하는 것이 더 어렵다. 그러므로 여전히 고도의 순도 및 높은 비활성을 가지는 트롬빈을 함유하는 안정화된 제형에 대한 필요가 여전히 남아있 다.
발명의 개요
본 발명은 트롬빈 조성물 및 그 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 제형, 조성물, 및 제제는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명에 포함되는 제형, 조성물, 및 제제는 트롬빈, 바람직하게는 순도가 증대된 트롬빈을 함유하며, 또한 추가의 부형제, 특히 제형, 조성물 또는 제제에 안정성을 부여하는 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명은 높은 비활성, 증대된 순도를 가지며 실질적으로 불순물, 이를테면 바이러스 입자, 인자 Va 및 프라이온이 없는 트롬빈의 제조 방법을 포함한다. 본 발명에 따르면 순도가 증대된 트롬빈의 제조 방법은 하나 또는 그 이상의 다음 단계를 포함한다: 크기 축출 여과, 이온 교환 또는 크기 축출 크로마토그래피, 열 처리, pH 조정, 및 전자기 방사선 처리. 본 발명에서 트롬빈의 공급원은 소 또는 사람이다.
다른 구체예에서 본 발명의 방법은 제조시에 시판되어 활용가능한 제제, 예컨대 Thrombin(트롬빈)-JMI®과 비교하여 제제 중의 불순물을 최소한 50% 감소시킬 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 방법은 트롬빈 제제 중의 불순물을 본원에서 설명되는 것과 같이 사전-정제되었거나 저순도의 소 트롬빈과 비교하여 최소한 80% 감소시킬 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 방법은 본원에 설명되는 것과 같이 사전-정제되었거나 저순도의 소 트롬빈과 비교하여 트롬빈 제제의 비활성을 최소한 1000%, 1200% 또는 1500% 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 크기 축출 필터 단계는 분자량이 40kDa보다 큰 불순물을 축출하기 위하여 사용된다. 바람직하게는 크기 축출 필터는 분자량 범위가 40kDa 내지 300kDa인 불순물을 축출하기 위해 사용된다. 보다 바람직하게는, 크기 축출 필터의 분자량 컷-오프 범위는 50kDa 내지 150kDa이다. 발명의 다른 구체예에서, 크기 축출 필터는 50kDa의 분자량 컷-오프를 가진다. 또 다른 구체예에서 크기 축출 필터는 100kDa의 분자량 컷-오프를 가진다.
본 발명의 방법은 또한 트롬빈 제제를 추가의 크로마토그래피 단계, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 크기 축출 크로마토그래피에 적용하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 트롬빈 제제에 대해 열처리를 적용하는 것을 포함한다. 바람직하게는 열처리는 트롬빈을 60℃에서 10시간 동안 유지하는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 트롬빈 제제의 pH를 약 5 또는 그 이하로 감소시키는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 트롬빈 제제에 대하여 전자기 방사선을 적용하는 것을 포함한다. 전자기 방사선은 감마 방사선 또는 UV 방사선일 수 있다.
본 발명은 크기 축출 필터에 최소한 15L의 트롬빈 제제를 적용하는 것을 포함하는, 순도가 증대된 트롬빈의 대규모 제조 방법을 포함한다. 바람직한 구체예에 서 본 발명은 크기 축출 필터에 최소한 15L의 트롬빈 제제를 적용하는 것을 포함하는 순도가 증대된 트롬빈의 대규모 제조 방법에 관한 것으로, 이때 15L의 트롬빈 제제는 약 300,000,000 유닛의 트롬빈을 포함한다.
본 발명은 또한 트롬빈 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서 트롬빈 조성물은 실질적으로 불순물이 없다. 다른 구체예에서 트롬빈 조성물은 실질적으로 40kDa보다 큰 분자량을 가지는 불순물이 없다. 바람직하게도 트롬빈 조성물은 실질적으로 40kDa와 300kDa의 분자량을 가지는 불순물이 없다.
다른 구체예에서 본 발명의 트롬빈 조성물은 실질적으로 순수하다. 바람직하게도, 트롬빈 조성물은 실질적으로 인자 Va가 없다. 보다 구체적으로, 인자 Va는 0.4㎍/트롬빈 1000 유닛 이하로 존재한다. 또한, 인자 Va의 양은 인자 Va 활성 분석, ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 트롬빈 조성물은 1800u/mg 단백질보다 큰 비활성을 가지며, 실질적으로 40kDa보다 큰 분자량을 가지는 불순물이 없다. 본 발명의 트롬빈 조성물은 약 1800 내지 3000u/mg 단백질의 비활성을 가질 수 있다. 바람직하게도, 트롬빈 조성물은 2400 내지 2500u/mg 단백질 또는 약 2500 내지 2600u/mg 단백질, 약 2600 내지 2700u/mg 단백질, 약 2700 내지 2800u/mg 단백질, 약 2800 내지 2900u/mg 단백질 또는 약 2900 내지 3000u/mg 단백질의 비활성을 가질 수 있다. 또한 트롬빈 조성물은 3000u/mg 단백질 이상의 비활성을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 실질적으로 바이러스성 병원체가 없는 트롬빈 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 트롬빈 조성물은 실질적으로 바이러스성 병원체가 없을 수 있으 며, 그때 로그 감소값은 3.5/바이러스보다 크다.
본 발명은 또한 고도의 순도 및 높은 비활성을 가지는 트롬빈을 포함하는 안정화된 제형 및 그러한 제형의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 비록 제형의 안정성이 트롬빈의 순도가 증가함에 따라 감소할 수 있지만, 본 발명자들은 고도의 순도 및 높은 비활성을 가지는 트롬빈을 포함하는 안정화된 제형을 발견하였다.
본 발명의 안정화된 트롬빈 제형은 트롬빈과 최소한 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
본 발명의 안정화된 제형은 그것들에 한정되는 것은 아니지만 소 및 사람 공급원을 포함하여 어떠한 공급원으로부터든지 분리된 트롬빈을 함유할 수 있다. 또한 트롬빈은 본 발명의 정제된 트롬빈 조성물 또는 현재 상업적으로 이용가능한 트롬빈 JMI®와 같은 어떠한 트롬빈 제제 또는 조성물일 수 있다. 바람직한 구체예에서 트롬빈은 고도의 순도 및 높은 비활성을 가진다.
트롬빈 외에, 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형은 부형제를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 제형에 적당한 부형제로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 글리세롤; 폴리에틸렌 글리콜; 염; 수용액, 예컨대 물, 산 및 염기 또는 그것들의 조합을 포함한다.
바람직한 염은 염화나트륨, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨 또는 그것들의 조합을 포함하며, 그것들에 한정되는 것은 아니다.
적당한 산 및 염기로는 염산 또는 수산화나트륨이 있고, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 제형은 5 내지 9의 pH 또는 보다 바람직하게는 6 내지 8의 pH를 가진다.
바람직하게도, 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형은 20 내지 40 부피%의 글리세롤, 1 내지 20 부피%의 폴리에틸렌 글리콜, 0.15 내지 0.3M 농도의 염화나트륨 및 0.025 내지 0.05M 농도의 아세트산 나트륨을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형은 정제된 트롬빈; 글리세롤; 폴리에틸렌 글리콜; 염화나트륨; 아세트산 나트륨을 포함하고 6 내지 8의 pH를 가진다.
어떤 구체예에서 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형은 액체이다. 또는 달리 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형은 고체일 수 있으며, 그때 투여 전에 안정화된 고체 트롬빈 제형은 액체에 녹거나 현탁된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형을 투여하는 방법에도 관한 것이다. 바람직하게도, 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형은 국소적으로 또는 체강(body lumen)의 표면에 투여된다.
본 발명은 또한 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형을 포함하는 키트에도 관한 것이다. 발명의 어떤 구체예에서, 키트는 안정화된 트롬빈 제형; 트롬빈 제형을 함유할 수 있는 바이알; 및 주사바늘을 포함한다.
발명의 다른 구체예에서, 키트는 트롬빈 제형과 트롬빈 제형을 분무할 수 있는 장치를 포함한다. 적당한 분무 장치로는 분무 팁 또는 분무 펌프가 있으며, 그것들에 한정되지는 않는다.
본 발명은 2년의 기간 동안 그것들의 초기 효능의 최소한 60%를 유지하는 안정화된 트롬빈 제형에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 제형은 그것의 초기 효능의 최소한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%를 유지한다. 발명은 특히 3개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 6개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 9개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 12개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 18개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 유지하는 제형에 관한 것이다. 본 발명은 또한 2년의 기간 동안 초기의 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 유지하는 안정화된 트롬빈 제형에 관한 것이다. 본 발명은 3개월 후에 그것의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 6개월 후에 그것의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 9개월 후에 그것의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 12개월 후에 그것의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 18개월 후에 그것의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 유지하는 제형에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 방법에 따라, 트롬빈 제제를 제조하기 위해 사용된 모든 단계의 공정도이다.
도 2는 현재 제조되는 바와 같은 트롬빈-JMI®(레인 4 및 5)에 본 발명의 정 제 과정을 첨가한 후에(레인 7, 8 및 9) 비교한 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)와 고분자량 불순물을 보여주는 (레인 11) 크기 축출 여과의 보유를 도시한다.
도 3은 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형의 제조방법을 도시한다.
본 발명은 트롬빈의 정제를 위하여 크기 축출 여과를 단독으로 사용하거나 다른 정제 단계와 조합하여 사용하는 것이 선행 기술의 트롬빈 정제 방법을 뛰어넘는 실질적인 유익을 제공한다는 발견을 토대로 한다. 본 발명의 트롬빈의 정제 방법은 고분자량의 불순물이 실질적으로 제거됨으로 인해 상당히 더 순수하고 안전한 트롬빈을 제공한다. 본 발명의 방법은 또한 일관성, 신뢰성 및 사용의 용이성과 함께 고도의 바이러스 정화(clearance)를 제공한다.
본 발명은 트롬빈 제제에 정제 단계를 적용하는 것과 정제된 트롬빈을 회수하는 것을 포함한다. 이들 단계들은 크로마토그래피적 정제; 크기 축출 필터에 트롬빈 제제를 적용하는 것; 이온 교환 필터에 트롬빈 제제를 적용하는 것; pH를 낮추는 것; 또는 전자기 방사선으로 트롬빈 제제를 조사하는 것을 포함하며, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 비록 발명이 크기 축출 여과의 사용의 발견을 토대로 하지만, 그러한 정제 단계는 독립적으로 또는 조합하여 적용될 수 있다.
나아가 방법들은 대규모의 상업적 제조 및 정제가 쉽다. 본 발명의 방법은 40kDa보다 큰 분자량을 가지는 불순물, 및 바이러스성 병원체가 실질적으로 없는 다량의 트롬빈을 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 트롬빈에 하나 또는 그 이상의 부형제를 첨가하는 것을 포함하며, 그 결과 현재 활용되는 트롬빈 제형보다 더 안정한 트롬빈 제형을 유발한다. 그 자체로서 본 발명은 선행 기술의 트롬빈 제형의 많은 문제점을 해결한다. 어떠한 특정 이론에 의해 구속되지는 않지만, 본 발명의 고도로 정제된 트롬빈 조성물을 안정화하는 능력은 일관되고 효과적인 처리를 유발할 수 있다. 바람직하게도, 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형은 고도의 순도 및 비활성을 가지는 트롬빈과 최소한 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 본 발명은 또한 액체의 안정화된 트롬빈 제형을 포함한다.
1.
트롬빈의
공급원
어떠한 공급원으로부터의 트롬빈이든지 본 발명의 조성물, 제형 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물, 제제 및 방법에 사용하기에 적당한 트롬빈의 공급원의 실례로는 소 또는 사람 공급원으로부터 분리된 트롬빈을 포함하며, 그것들에 한정되지는 않는다. 또한 트롬빈 JMI®과 같은 상업적인 트롬빈 공급원도 본 발명에 사용될 수 있다.
또한 어떠한 순도 수준의 트롬빈 또는 어떠한 제제로부터 유래되는 트롬빈이라도 사용될 수 있다. 예를 들어 본원에서 설명되는 것과 같은 사전-정제된 트롬빈은 본 발명의 조성물, 제형 및 방법에 사용될 수 있다. 추가로 천연 또는 재조합 제제로부터 유발되는 트롬빈이 본 발명에 적당하다.
2.
트롬빈의
정제
본 발명은 순도가 증가되고, 비활성이 증가되며, 또한 인자 Va, 프라이온, 및 바이러스성 병원체와 같은 불순물의 낮은 불순물 수준으로 인해 증가된 안정성을 가지는 트롬빈의 제조 방법을 포함한다.
어떤 구체예에서 본 발명의 방법은 트롬빈-JMI®, 또는 다른 정제된 트롬빈에 비하여 트롬빈 제제의 순도를 30% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 또는 90% 이상 증가시킨다.
순도를 정량하는 다른 방법은 트롬빈의 비활성을 측정하는 것이다. 트롬빈의 비활성은 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 분석법들, 이를테면 응고 분석 및 발색원 분석 (Gaffney et al., 1995, Thromb Haemost 74:900-903)에 의해 측정된 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 사전-정제된 트롬빈에 비교하여 트롬빈 제제의 비활성이 최소한 1000%, 최소한 1200%, 최소한 1500%, 또는 최소한 1800% 증가된 트롬빈 제제를 제공한다. 본 발명의 트롬빈 조성물은 높은 비활성을 갖는다; 바람직하게도 본 발명의 트롬빈 조성물은 1800u/mg 단백질보다 높다.
본 발명의 방법은 약 1800 u/mg 내지 3000 u/mg 범위, 보다 바람직하게는 약 1800 u/mg 내지 2400 u/mg 범위의 비활성을 가지는 트롬빈 제제를 제공한다. 다른 구체예에서, 비활성은 약 2400 u/mg 내지 2500 u/mg, 약 2500 u/mg 내지 2600 u/mg, 또는 약 2600 u/mg 내지 2700 u/mg, 약 2700 u/mg 내지 2800 u/mg의 단백질이다. 어떤 구체예에서 트롬빈은 3000 u/mg보다 큰 비활성을 갖는다. 바람직하게도, 크기 축출 여과 후에 비활성은 약 1500 u/mg 이상 내지 약 2300 u/mg 이상이다.
본 발명의 어떤 방법을 사용하면, 바이러스성 병원체 및/또는 고분자량 불순물은 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 최소한 99% 감소된다. 바람직한 구체예에서 트롬빈 제제 중의 고분자량 불순물 및/또는 바이러스 입자 불순물은 최소한 80% 감소된다.
본 발명은 또한 트롬빈보다 고분자량을 가지는 분자를 축출하는 것을 포함하는 트롬빈의 정제 방법을 제공한다. 트롬빈보다 고분자량을 가지는 불순물의 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95% 및 최소한 99%를 제거하기 위해 트롬빈을 정제하는 방법이 제공된다. 고분자량 불순물을 제거함에 있어서, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95% 또는 최소한 99%의 트롬빈을 회수하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 방법의 어떤 구체예에서, 트롬빈의 회수는 또한 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이다.
본 발명의 방법은 트롬빈 제제에 정제 단계를 적용하는 것과 정제된 트롬빈을 회수하는 것을 포함한다. 본 발명의 정제 단계는 크기 축출 필터에 트롬빈 제제를 적용하는 단계; 크로마토그래피성 정제; 이온 교환 필터에 트롬빈 제제를 적용하는 단계; pH를 낮추는 단계; 또는 전자기 방사선으로 트롬빈 제제를 조사하는 단계를 포함한다. 그러한 단계들은 독립적으로 또는 조합하여 적용될 수 있다.
2.1. 크기 축출 여과 및 크로마토그래피
본 발명의 방법에 따르면, 트롬빈 제제의 회수 및 정제는 분자량을 토대로 한 분리 기법을 포함한 방법을 사용하여 불순물을 축출함으로써 이루어질 수 있다. 일반적으로 분자량을 토대로 한 분리를 포함하는 모든 방법이 사용될 수 있으며, 이를테면 크기 축출 여과 및 크로마토그래피가 포함된다. 본 발명의 방법이 크기 축출 여과를 사용하는 어떤 구체예에서, 필터의 기공은 트롬빈 분자의 통과를 허용할 정도로 충분히 크지만, 단백질 불순물 및 바이러스를 포함하여 많은 불순물이 그대로 남아있기에 충분할 정도로 작다.
트롬빈이 대략 40kDa의 분자량을 가지므로, 어떤 구체예에서, 본 발명의 방법은 상기 트롬빈 제제로부터 크기가 40kDa보다 큰 분자량을 가지는 불순물을 축출할 수 있는 크기 축출 필터에 트롬빈 제제를 적용하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 크기 축출 필터는 40kDa 내지 300kDa 범위의 분자량을 가지는 불순물을 축출할 수 있다.
그러므로 분자량 컷-오프, 즉 축출 한계가 50, 100, 150, 300kDa 또는 그 이상인 크기 축출 필터가 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 크기 축출 필터는 40kDa 내지 300kDa 범위의 분자량 컷-오프를 가진다. 다른 구체예에서, 크기 축출 필터는 50kDa 내지 300kDa 범위의 분자량 컷-오프를 가진다. 또 다른 구체예에서, 크기 축출 필터는 50kDa 내지 150kDa 범위의 분자량 컷-오프를 가진다. 바람직한 구체예에서, 크기 축출 필터는 50kDa의 분자량 컷-오프를 가진다. 보다 바람직한 구체예에서, 크기 축출 필터는 100kDa의 분자량 컷-오프를 가진다. 이 단계는 또한 트롬빈 회수를 최대화하기 위하여 다이아-여과(dia-filtration)를 적용하는 단계를 임의로 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 크기 축출 필터는 100kDa 정도의 분자량 컷-오프를 가지는 기공 크기를 가질 것이다. 바람직하게도, 본 발명에 적당한 크기 축출 필터는 또한 박테리아 병원체와 외독소를 효과적으로 감소시킨다.
어떤 구체예에서, 크기 축출 필터는 고도로 다공성인 폴리올레핀 백킹 상의 변형된 폴리에테르술폰으로 제조된다. 또한 사용된 필터는 접선 흐름 필터일 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 필터의 한 실례는 PALL FILTRON Corporation사에 의해 제작된 OmegaTM 100K VR이다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 크기 축출 필터로는 Millipore Corporation사에 의해 제작된 Viresolve/70, A/G Technology사에 의해 제작된 VirA/Gard 500, 및 Pall Corporation사에 의해 제작된 Ultipor DV20이 있으며, 그것들에 한정되는 것은 아니다.
크기 축출 여과를 사용하면, 바이러스성 불순물을 포함하여 큰 분자들이 막의 기공에 의해 보유된다. 막은 사용 후에 버리거나 또는 다른 경우에는 재사용될 수 있다. 매우 충분한 로그 감소를 유발하는 막이 허용되는 것으로 고려되며, 사용될 수 있다. 각각의 로그 감소는 90%의 감소이다. 다른 시험 또한 필터가 허용되는 기공 크기 범위를 가지는 것을 보장하기 위해 필터 상에서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 어떤 구체예에서, 바이러스 정화는 3.5보다 큰, 바람직하게는 4.0 이상, 보다 바람직하게는 4.5 이상의 로그 감소값 (LRV)에 있다.
발명의 어떤 구체예에서, 50ml, 100ml, 150ml, 200ml, 250ml, 300ml, 350ml, 400ml, 450ml, 500ml, 그것들의 배수, 또는 그 이상의 초기 부피가 크기 축출 필터에 적용된다. 본 발명은 또한 최소한 300ml의 트롬빈 제제를 크기 축출 필터에 적용하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 크기 축출 필터에 최소한 40L의 트롬빈 제제를, 바람직하게는 크기 축출 필터에 최소한 60L의 트롬빈 제제를, 가장 바람직하게는 크기 축출 필터에 최소한 90L의 트롬빈 제제를 적용하는 것을 포함하는 트롬빈의 대규모, 상업적 제조 방법을 포함한다. 어떤 구체예에서 크기 축출 필터에 적용되는 트롬빈 제제의 부피는 사용된 필터의 표면적 및/또는 사용된 필터의 수에 좌우된다. 발명의 바람직한 구체예에서 40L 내지 60L, 60L 내지 80L, 80L 내지 100L, 100L 이상, 또는 그것의 배수의 초기 부피가 크기 축출 필터에 적용된다.
본 발명의 어떤 방법은 특히 트롬빈의 대규모 정제에 적당하다. 발명의 바람직한 구체예에서, 15L 내지 20L 및 그것의 배수의 초기 부피가 그 자체로서 크기 축출 필터에 적용된다. 한 구체예에서 15L의 트롬빈 제제가 크기 축출 필터에 적용될 때 트롬빈 제제는 300,000,000 유닛의 트롬빈을 포함한다.
2.2. 이온 교환 크로마토그래피
이온 교환 여과의 사용은 단독으로 또는 크기 축출 여과와 함께 사용될 때 트롬빈 정제에 실질적인 유익을 제공한다. 이온 교환 여과는 일관성, 신뢰성 및 사용의 용이성과 함께 고도의 바이러스 정화를 제공한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 방법은 추가로 이온 교환 필터에 트롬빈을 적용하는 것을 포함할 수 있다. 이온 교환 여과는 그것들의 전기 전하를 토대로 용질을 거르는 분리 방법이다. 이온 교환 필터는 이온 교환 막상에 전하 센터를 함유한다. 샘플이 필터를 통해 지나갈 때 샘플 중의 하전된 화합물은 막에 있는 전하 센터위에 흡착될 것이다. 포지티브 전하를 가지고 하전된 단백질과 바이러스성 불순물을 트롬빈 제제로부터 여과할 필터가 선택된다. 필터와 동일한 순 전하(net charge)를 가지는 바이러스는 수지에 결합하지 않을 것이며 한계치(breakthrough)에서 정화될 것이다.
본 발명에 따라 사용된 이온 교환 필터는 바람직하게는 양으로 하전되는 것이 바람직한 한편, 트롬빈 정제에 전형적으로 사용되는 이온 교환 크로마토그래피 수지는 음으로 하전된다. 이온 교환 필터는 핵산을 제거하는 데 효과적이다. 바람직한 구체예에서, 이온 교환 필터는 4개의 펜던트 아민기를 가진다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 바람직한 이온 교환 필터는 Pall Corporation사에서 제작된 MustangTM Q 필터이다. 사용될 수 있는 다른 이온 교환 필터는 Cuno Zeta Plus VR05이다.
2.3. 열 처리
적절한 열의 적용 또한 트롬빈을 정제하기 위하여 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 적당한 단계이다. 적절한 열의 적용은 또한 단독으로 또는 본원에서 논의되는 다른 정제 단계들 중 어떠한 것뿐만 아니라 크기 축출 여과 또는 크로마토그래피와 함께 사용될 수 있다. 어떠한 공급원으로부터의 어떠한 유형의 열이든지 바이러스 불순물이 비활성화되고 트롬빈이 높은 비활성을 유지하기만 하면 트롬빈에 적용될 수 있다.
어떤 구체예에서 트롬빈은 40℃ 내지 100℃로 가열될 수 있다. 바람직한 구체예에서 트롬빈은 약 60℃로 가열된다. 열처리는 어떠한 길이 또는 시간 동안 트롬빈에 적용될 수 있다. 예를 들어 트롬빈은 1 내지 60분 동안 가열될 수 있거나 또는 트롬빈은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10시간 동안 가열될 수 있다. 바람직한 구체예에서 60℃에서 10시간 동안 트롬빈에 적용되는 열처리가 사용된다.
2.4.
pH
조정
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다른 정제 단계는 트롬빈의 pH를 조정하는 것이다. 트롬빈의 pH는 조정의 결과로 트롬빈 조성물이 소량의 바이러스 불순물을 가질 수 있을 정도의 수준으로 조정될 수 있다. 예를 들어 트롬빈의 pH를 낮추는 것은 바이러스 불순물을 비활성화하는 데 효과적이다. 어떤 구체예에서 트롬빈의 pH는 약 5 이하 또는 약 4 이하로 조정된다. 그러나 트롬빈의 pH를 낮추는 것은 어느 정도 트롬빈 활성의 손실을 유발할 수 있다.
2.5. 전자기 방사선 조사
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 또 다른 정제 단계는 감마 또는 전자기 방사선, 또는 UV 빛을 적용하는 것이다. 트롬빈에 방사선을 적용하는 것은 단독으로 또는 본원에서 설명되는 다른 정제 단계들 중 어느 하나와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 전자기 및 감마 방사선이 강력하고 활력있는 바이러스 비활성화 도구임을 발견하였다. 보고에 의하면 감마 방사선조사는 광범위한 바이러스에 대해 효과적이다. 그러나 시판중인 트롬빈의 경우 70% 미만의 회수가 이루어질 수 있다.
UV 빛의 적용은 또한 단독으로 또는 본 발명의 다른 정제 단계와 함께 사용될 수 있으며 또한 효과적인 바이러스 비활성화 단계이다. 그러나 이 단계 역시 방법으로서 사용될 때 약간의 트롬빈 활성의 손실이 관찰된다. 본 발명자들은 짧은 노출 기간이 활성 손실을 줄일 수 있는 것으로 언급하였다.
3. 정제된
트롬빈
제제/제형
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 정제된 트롬빈 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 트롬빈 조성물은 증가된 순도, 높은 비활성 및 낮은 불순물 수준, 이를테면 저수준의 불순물, 예컨대 인자 Va, 프라리온, 및 바이러스 입자를 가진다.
본 발명의 트롬빈 조성물은 높은 비활성을 가진다; 바람직하게도 본 발명의 트롬빈 조성물의 비활성은 1800 u/mg 단백질보다 크다. 본 발명은 약 1800 u/mg 내지 3000 u/mg 범위, 보다 바람직하게는 약 1800 내지 2400 u/mg 범위의 비활성을 갖는다. 다른 구체예에서, 비활성은 약 2400 u/mg 내지 2500 u/mg, 약 2500 u/mg 내지 2600 u/mg, 또는 약 2600 u/mg 내지 2700 u/mg, 약 2700 u/mg 내지 2800 u/mg 단백질 범위, 약 2800 u/mg 내지 2900 u/mg 단백질 또는 약 2900 u/mg 내지 3000 u/mg 단백질 범위이다. 어떤 구체예에서, 트롬빈은 3000 u/mg보다 큰 비활성을 가진다.
또한 본 발명의 트롬빈 조성물은 실질적으로 인자 Va, 박테리아 병원체, 프라이온 및 바이러스성 병원체를 포함한, 고분자량 불순물이 없다. 본원에서 사용되는 고분자량의 불순물이 "실질적으로 없는" 조성물은 조성물이 약 5 내지 20 중량% 이하, 바람직하게는 약 15 중량% 이하, 보다 바람직하게는 약 10 중량% 이하로 불순물을 함유하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 순수한" 조성물은 5 중량% 이하의 고분자량 불순물, 가장 바람직하게는 약 3 중량%의 고분자량 불순물을 함유한다.
바람직한 구체예에서 본 발명의 트롬빈 조성물은 40kDa 이상의 분자량을 가지는 불순물이 실질적으로 없다. 바람직한 다른 구체예에서 트롬빈은 40kDa 내지 300kDa 범위의 분자량을 가지는 불순물이 실질적으로 없다. 고분자량 불순물의 실례로는 인자 Va (중쇄 (분자량=105kDa) 및 경쇄 (분자량=71kDa/74kDa)) 및 소 혈청 알부민 (BSA; 분자량=66kDa)이 있다.
다른 특수한 구체예에서 본 발명은 바이러스 입자 불순물이 실질적으로 없는 트롬빈 조성물을 제공한다. 바이러스 입자 불순물은 또한 고분자량 불순물이 실례이다. 본 발명의 방법에 의해 제거될 수 있는 바이러스로는 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 위공수병 바이러스 (PRV), 뇌척수심근염 바이러스 (EMCV), 소 파보바이러스 (BPV), 개 파보바이러스 (CPV), 큰가시고기 바이러스 (SBV), 진드기-유래 뇌척수염 바이러스 (TBEV), 말 리노바이러스 1 (ERV-1), 사람 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1), A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스 (HBV), 및 C형 간염 바이러스 (HCV)가 있으며, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 바이러스는 다양한 항체 기초 분석법, 이를테면 ELISA 및 핵산 기초 분석법, 예컨대 PCR 및 혼성화 분석법에 의해 검출될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 인자 Va가 실질적으로 없는 트롬빈 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 인자 Va는 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 최소한 99% 감소된다. 발명의 어떤 구체예에서, 크기 축출 여과 후에 인자 Va는 농축된 샘플 (최종 제형으로 희석되기 전)에서는 거의 검출되지 않으며 전형적으로 최종 제형에서는 전혀 검출되지 않는다.
다른 구체예에서 인자 Va의 양은 1000 유닛의 트롬빈 당 0.4㎍ 이하, 0.35㎍ 이하, 0.3㎍ 이하, 0.25㎍ 이하, 0.2㎍ 이하, 0.15㎍ 이하, 0.1㎍ 이하, 0.02㎍ 이하, 또는 현재로서는 검출할 수 없는 어떠한 다른 양으로 감소된다.
바람직하게는 인자 Va의 감소된 수준 또는 부재는 당해 기술분야에 알려져 있는 기본적인 방법, 예컨대 크로마토그래피적 방법, 이를테면 겔 전기영동, 인자 Va 활성 분석법 및 항체 기초 분석법에 의해 측정된다.
바람직한 구체예에서 본 발명의 트롬빈 조성물은 1800 u/mg 단백질보다 큰 비활성을 가지며 실질적으로 고분자량 불순물이 없다.
본 발명에 의한 방법에 의해 정제된 트롬빈은 또한 임상에 사용하기 위해 제형될 수 있다. 본 발명의 트롬빈 제형은 바람직하게는 현재 활용할 수 있는 트롬빈 제형보다 더 안정하다. 또한 어떤 구체예에서 본 발명의 안정한 트롬빈 제형은 액체이다.
어떤 구체예에서 본 발명의 안정화된 제형은 실질적으로 불순물이 없는 트롬빈; 및 최소한 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 그러한 한 구체예에서 트롬빈은 소의 트롬빈이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 안정화된 제형은 트롬빈, 최소한 하나의 중합체, 최소한 하나의 알코올, 최소한 하나의 염 및 원하는 범위의 pH로 조정하기 위한 적절한 양의 산 및/또는 염기를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 안정화된 제형은 트롬빈, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 아세트산 나트륨 및 염화나트륨 및 pH를 5 내지 8로 조정하기 위한 염산 또는 수산화나트륨 또는 이것들 둘 다를 포함한다.
바람직한 구체예에서 본 발명의 안정화된 제형은 트롬빈, 약 30 부피%의 글리세롤, 약 10 부피%의 폴리에틸렌 글리콜, 0.025 내지 0.05M 농도의 아세트산 나트륨 및 0.15 내지 0.3M 농도의 염화나트륨 및 pH를 6 내지 7로 조정하기 위하여 염산 또는 수산화 나트륨 또는 이것들 두 가지를 포함한다.
본 발명의 정제된 트롬빈은 제형 및/또는 멸균 처리공정 전에 0 내지 10℃에서 48시간까지 보관될 수 있다. 바람직한 구체예에서 본 발명의 제형의 멸균은 0.2 미크론 멸균 필터를 사용하여 이루어진다. 본 발명의 제형은 25℃에서 2년까지 멸균 처리없이도 보관될 수 있다. 본 발명은 2년의 기간 동안 초기 효능의 최소한 60%를 유지하는 안정화된 트롬빈 제형에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서 제형은 그것의 초기 효능의 최소한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%를 유지한다. 발명은 특히 3개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 6개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 9개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 12개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 18개월 후에 그것의 초기 효능의 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 유지하는 제형에 관한 것이다. 본 발명은 또한 2년의 기간 동안 초기의 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 유지하는 안정화된 트롬빈 제형에 관한 것이다. 본 발명은 3개월 후에 그것의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 6개월 후에 그것의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 9개월 후에 그것의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 12개월 후에 그것의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 18개월 후에 그것들의 초기 표지 효능의 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 유지하는 제형에 관한 것이다.
3.1. 부형제
적당한 약제학적으로 허용되는 부형제는 본 발명의 트롬빈 제형의 안정화를 보조하는 어떠한 부형제든지 포함한다. 본 발명에 적당한 약제학적으로 허용되는 부형제는 희석제, 완충제, 안정화제, 계면활성제, 킬레이트화제, 보존제로서 작용할 수 있다.
적당한 약제학적으로 허용되는 부형제는 수성 액체, 예컨대 물, 산 및 염기; 유기 용매, 예컨대 알코올; 중합체; 염 또는 그것들의 조합을 포함하며, 그것들에 한정되지는 않는다.
적당한 산으로는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 포름산, 아세트산, 시트르산, 및 인산이 있으며, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 산은 염산이다.
적당한 염기로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 및 수산화암모늄이 있으며, 그것들에 한정되지 않는다. 바람직한 염기는 수산화나트륨이다.
본 발명의 안정화된, 액체 트롬빈 제형에 포함된 산 및 염기는 안정화된 액체 트롬빈 제형의 pH를 조정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 안정화된 액체 트롬빈 제형의 pH는 본 발명의 트롬빈 제형을 안정화하는 어떠한 pH로든지 조정될 수 있다. 어떤 구체예에서 트롬빈 제형의 pH는 4 내지 9이다. 바람직하게는 본 발명의 트롬빈 제형의 pH는 5 내지 8이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 트롬빈 제형의 pH는 5.5 내지 7.7이다. 한 바람직한 구체예에서 본 발명의 트롬빈 제형의 pH는 6.7±0.1이다.
적당한 알코올로는 다가 알코올, 예컨대 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 1,6-헥실렌 글리콜, 네오펜틸 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 트리메틸롤프로판, 및 펜타에리트리톨이 있으며, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 알코올은 글리세롤이다.
본 발명의 안정화된 액체 트롬빈 제형중의 알코올의 양은 0 내지 80 부피%일 수 있다. 어떤 구체예에서 알코올의 양은 예를 들면 글리세롤이 10 내지 15 부피%이다. 바람직한 구체예에서 알코올의 양은 예를 들면 글리세롤이 20 내지 40 부피%, 또는 25 내지 35 부피%, 또는 30 부피%이다.
적당한 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜, 스티렌-이소부틸렌-스티렌, 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌, 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 아크릴계 중합체 및 공중합체, 비닐 할라이드 중합체, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 방향족, 폴리비닐 에스테르, 비닐 단량체의 공중합체, 비닐 단량체와 올레핀의 공중합체, 폴리아미드, 알키드 수지, 폴리카보네이트, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 에폭시 수지, 폴리우레탄, 레이온-트리아세테이트, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 부티레이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 셀로판, 셀룰로스 니트레이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 에테르, 카르복시메틸 셀룰로스, 콜라겐, 키틴, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체 EPDM 고무, 플루오로실리콘, 다당류, 인지질류, 또는 그것들의 조합이 있으며, 그것들에 한정되지는 않는다. 바람직한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 가장 바람직한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 200-400이다.
본 발명의 안정화된 액체 트롬빈 제형 중의 중합체의 양은 0 내지 50 부피%일 수 있다. 어떤 구체예에서 중합체의 양은 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜의 경우 1 내지 30 부피%이다. 바람직한 구체예에서 중합체의 양은, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜의 경우 1 내지 20 부피% 또는 5 내지 15 부피% 또는 10 부피%이다.
적당한 염으로는 염화 칼슘, 칼륨 또는 나트륨, 브롬화 칼슘, 칼륨 또는 나트륨 등; 아세트산 칼슘, 칼륨, 세슘 또는 나트륨; 시트르산 칼륨, 세슘 또는 나트륨; 질산 칼륨, 세슘 또는 나트륨; 및 포름산 칼륨, 세슘 또는 나트륨이 있으며, 그것들에 한정되지는 않는다. 바람직한 염은 아세트산 나트륨 및 염화 나트륨이다.
본 발명의 제형 중의 염의 농도는 0 내지 0.5M일 수 있다. 어떤 구체예에서 염의 농도는 0.01 내지 0.45M이다. 다른 구체예에서 염 농도는 0.3M 이하이다. 바람직한 구체예에서 염은 염화나트륨과 아세트산 나트륨의 조합이며, 그때 염화나트륨의 농도는 0.15 내지 0.3M이고 아세트산 나트륨의 농도는 0.025 내지 0.05M이다. 염화나트륨의 다른 바람직한 범위는 0.28 내지 0.32M이다.
4. 효능 시험
트롬빈은 당해 기술분야에 공지된 분석법을 사용하여 효능에 대해 시험될 수 있거나 또는 활성이 시험될 수 있다. 응고 시간 측정은 ACL7000 응고 타이머를 사용하여 측정될 수 있다. 측정된 응고 시간은 표준 곡선의 응고 시간 대 u/mL의 이중 로그 회귀를 사용하여 u/mL로 전환된다. u/mL 값은 샘플의 실제 효능을 얻기 위하여 희석 인자로 곱해진다. 분석 결과는 피펫 기술, 상이한 ACL 기계, 및 시험된 샘플의 점성을 포함하는 여러 인자의 조합으로 인해 약간의 변수를 가질 수 있다.
5.
키트
및 투여
본 발명은 또한 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형을 포함하는 키트를 포함한다. 키트는 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형을 함유하는 바이알을 포함할 수 있다. 바이알에서는 안정화된 트롬빈 제형이 다음의 제품 명세를 충족해야 한다:
| 명세 | 방출 | 보관 수명 (실온에서 2년) | |
| 효능 | NLT 1,400u/ml | NLT 900u/ml | |
| 충전 부피 | |||
| 5,000u/바이알 | NLT 5.0ml | NLT 5.0ml | |
| 10,000u/바이알 | NLT 10.0ml | NLT 10.0ml | |
| 20,000u/바이알 | NLT 20.0ml | NLT 20.0ml | |
| pH | 5.9 내지 7.5 | 5.9 내지 7.5 | |
| 멸균성 | USP 및 21 CFR 610.12 멸균 시험의 요구조건을 충족함 | ||
| 일반 동물 안전성 | 변형된 21CFR 610.11의 요구조건을 충족함 | ||
어떤 구체예에서 본 발명의 키트는 안정화된 트롬빈 제형; 트롬빈 제형을 함유할 수 있는 바이알; 및 주사바늘을 포함한다. 키트는 또한 최소한 하나의 스폰지를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서 본 발명의 키트는 키트가 안정화된 트롬빈 제형과 트롬빈 제형을 분무할 수 있는 장치를 포함하는 분무 키트이다. 적당한 분무 장치는 분무 팁 또는 분무 펌프와 작동기를 포함한다. 또한 분무 키트는 추가로 주사바늘을 포함한다.
분무 키트와 관련하여 안정화된 트롬빈 제형은 도한 바이알에 함유될 수 있다. 분무 키트에 포함된, 안정화된 액체 트롬빈 제형을 함유하는 바이알은 다음의 제품 명세를 충족해야 한다.
| 명세 | 방출 | 보관 수명 (실온에서 2년) | |
| 효능 | NLT 1,400u/ml | NLT 900u/ml | |
| 충전 부피 | |||
| 5,000u/바이알 | NLT 5.0ml | NLT 5.0ml | |
| 10,000u/바이알 | NLT 10.0ml | NLT 10.0ml | |
| 20,000u/바이알 | NLT 20.0ml | NLT 20.0ml | |
| pH | 5.9 내지 7.5 | 5.9 내지 7.5 | |
| 멸균성 | 에틸렌 옥사이드 멸균 후 USP 및 21 CFR 610.12 멸균 시험의 요구조건을 충족함 | ||
| 일반 동물 안전성 | 에틸렌 옥사이드 멸균 후 변형된 21CFR 610.11의 요구조건을 충족함 | ||
본 발명은 또한 안정화된 트롬빈 제형의 제조 방법에 관한 것이다. 어떤 구체예에서 안정화된 트롬빈 제형을 제조하는 방법은 (a) 트롬빈의 순도를 증진시키는 단계; 그리고 (b) 최소한 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 정제된 트롬빈에 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 안정화된 제형의 제조 방법은 산 또는 염기로 pH를 조정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
도 3은 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형의 제조방법을 설명하는 흐름도이다. 증진된 순도 및 비활성을 가지는 트롬빈 조성물을 제조한 후에, 28 내지 33 부피%의 글리세롤, 및 7 내지 11 부피%의 분자량이 200 내지 600인 폴리에틸렌 글리콜이 정제된 트롬빈에 첨가된다. 염화 나트륨 및 아세트산 나트륨이 염화나트륨의 몰농도가 0.08 내지 0.32M이고 아세트산 나트륨의 몰농도가 0.02 내지 0.06M이 될 때까지 첨가된다. pH는 5.7 내지 7.7로 조정된다. 그런 다음 안정화된 트롬빈 제형은 0 내지 10℃로 냉각된다.
그런 다음 안정화된 트롬빈 제형이 멸균되고 표지된 바이알에 보관될 수 있다.
또한 본 발명은 안정화된 트롬빈 제형을 투여하는 방법에도 관한 것이다. 바람직하게도 본 발명의 안정화된 트롬빈 제형은 국소적으로 투여된다.
어떤 구체예에서 방법은 (a) 주사기에 트롬빈 제형을 넣는 단계; (b) 트롬빈 제형을 주사기를 통해 밀어내는 단계; (c) 트롬빈 제형으로 체강의 표면을 가득차게 하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 방법은 체강의 표면에 국소적으로 트롬빈 제형을 분무하는 것을 포함한다.
ㄸ 다른 구체예에서 방법은 (a) 트롬빈 제형을 스폰지에 포화시키는 단계; 그리고 (b) 그 스폰지를 체강의 표면에 적용하는 단계를 포함한다.
본원에 및 하기의 실시예에 제시된 설명은 예시를 목적으로 하며 제한을 목적으로 하는 것이 아니다. 변화 및 수정이 상세한 설명에 대해 이루어질 수 있으며, 그것 역시 본 발명의 범주 내에 있다. 나아가 명백한 변화, 수정 또는 변형이 당업자들에게 일어날 것이다.
실시예
1 - 사전-정제된
트롬빈의
제조
사전-정제된 또는
저순도의
소
트롬빈
트롬빈의 제조: 종래의 분쇄 장비에서 신선한 소의 폐를 분쇄한다. 분쇄된 소의 폐는 즉시 사용하거나 -15℃ 미만의 다중으로 안을 댄 용기에서 냉동 보관할 수 있다. 분쇄된 폐는 약 0 내지 15℃의 희석된 염화나트륨에 현탁하여 약 12 내지 72시간 동안 추출한다. 폐 현탁액을 거친 직물 및/또는 달리 원심분리에 의해 여과하고, 액체 추출물을 수집한다.
폐 추출물 1 리터당 대략 100ml의 약 50% 현탁액의 수산화 마그네슘 겔을 교반 하에 첨가하고 철저하게 혼합한다. 현탁액을 원심분리하거나 또는 달리 필터 보조제를 사용하여 여과하고, 원심분리물 또는 여과물을 수집한다. 흡착된 폐 추출물을 약 0 내지 15℃에서 용액 1 리터당 대략 1 리터의 저온 포화 황산암모늄을 교반 하에 첨가하고 약 15 내지 480분 동안 혼합함으로써 분획화하였다. 불용성 페이스트를 원심분리 또는 달리 필터 보조제를 사용한 여과에 의해 수득한다.
이 페이스트를 출발 폐 추출물 1 리터당 저온의 희석된 염화 나트륨 0.25 내지 1리터로 재용해하였다. 분획화된 폐 추출물을 약 0 내지 15℃에서 용액 1 리터당 대략 1 리터의 저온 포화 황산암모늄을 교반하에 첨가하고 약 15 내지 480분 동 안 혼합함으로써 재침전시켰다. 두 번째 페이스트를 저온의 희석된 염화나트륨에 재용해하고 여과에 의해 정화한다.
트롬보플라스틴 용액을 원래 부피의 약 10 내지 50%로 적당한 한외여과 시스템에서 농축한 후 검출가능한 황산 암모늄을 제거하기 위해 다이아여과한다. 한외여과는 그것을 통해 수압의 적용에 의해 용매의 분자 크기보다 훨씬 큰 분자 크기의 용질을 포함하는 용액이 용매로부터 분리되는 과정이다. 수압은 용매를 적당한 막을 통해 밀어내고 용질을 농축한다.
다이아여과는 0.05M NaCl의 8 또는 그 이상의 부피를 첨가함으로써 또는 투과물이 염화바륨 시험을 통과할 때까지 수행한다. 다이아여과는 연속적으로 용매를 첨가하면서 한외여과함으로써 보다 큰 분자의 용액으로부터 미소용질을 분리하는 과정이다. 그런 다음 농축물을 추가로 선택적으로 농축하고 한외여과가 완료된다. 한외여과 시스템을 수 리터의 저온 희석 염화나트륨으로 세정하고 이 세척물을 농축물에 첨가한다. 농축물의 pH는 희석된 염산 또는 희석된 수산화나트륨으로 약 7.0으로 조정한다. 그 결과의 트롬보플라스틴은 약 -15℃에서 또는 그 아래의 온도에서 밀봉된 플라스틱 용기 중에 보관한다.
시트레이트 처리된 신선한 소의 혈장을 탱크 트럭에 넣어 냉동하거나 냉장한다. 만약 냉동한다면, 혈장은 일반적으로 사용을 위해 해동할 때까지 냉동 보관한다. 해동한 혈장은 0 내지 10℃에서 스테인레스 스틸 탱크에서 유지한다. 혈장의 pH는 완충된 아세트산으로 약 6.6 내지 6.8로 조정하고 약 3 내지 30시간 동안 보유한다. 보유시간이 끝날 때에 혈장을 정화한다. 정화된 혈장을 수산화나트륨 용액 으로 약 pH 6.9 내지 7.2로 조정한다.
프로트롬빈의 제조: 교반 하에 및 약 0 내지 10℃의 온도에서, 소 혈장의 리터당 약 1.5 내지 2.5g (건조중량)의 이온 교환 수지를 첨가하고 0.5 내지 6시간 동안 혼합하면서 pH를 약 6.9 내지 7.2로 조정하였다. 그 결과의 현탁액을 여과하거나 원심분리하여 수지를 수득한다. 수지를 0.15 내지 0.2M의 인산염 완충 식염수로 약 pH 6.9 내지 7.2에서 철저하게 세척하고 보관한다.
프로트롬빈을 대략 6.9 내지 7.2의 pH에서, 0.5 내지 1M의 인산염 완충 식염수를 사용하여 세척된 수지로부터 용출하고, 여과한 다음, 그 추출물을 보관하고 나중의 처리를 위하여 모아놓는다. 사용할 수 있는 수지로는, 예를 들면 DEAE-Sephadex A-50, Macro-Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support, Macro-Prep Q Support, UNOsphere Q 이온 교환, Capto Q, DEAE-세파로스 Fast Flow, Q 세파로스TM HP 또는 동등물들이 있으며, 그것들에 한정되지 않는다. 추출물을 조합하여 필요에 따라 한외여과 전에 대충 여과할 수 있다. 사용한 수지는 산으로 처리하여 다음에 재생하기 전에 보관하거나 유사한 프로트롬빈 복합체 제조 공정에서 재사용할 수 있다.
프로트롬빈 복합체 추출물을 적당한 한외여과 시스템에서 원래 부피의 약 10 내지 50%으로 농축한 후 원하지 않는 염을 제거하기 위해 다이아여과한다. 다이아여과는 먼저 투과물을 제거함에 따라 농축물 리터당 대략 2 내지 5 리터의 냉장된 정제수를 첨가한 후, 투과물이 제거되는 대로 농축물의 리터당 대략 2 내지 5 리터 의 냉장된 희석된 염화나트륨을 첨가함으로써 수행한다. 그런 다음 농축물을 추가로 선택적으로 농축하고 한외여과를 완료한다. 한외여과 시스템을 수 리터의 냉장된 희석된 염화나트륨으로 세정하고, 이 세척물을 농축물에 첨가한다. 그 결과의 프로트롬빈 복합체를 약 -15℃에서 또는 더 저온에서 밀봉된 용기중에 보관한다.
프로트롬빈 복합체를 약 35℃ 또는 그 이하의 온도에서 해동한다. 프로트롬빈 복합체를 최종 염화칼슘 농도를 약 0.005 내지 0.03몰로 만들기에 충분한 양의 염화칼슘을 함유하는 정제수를 첨가함으로써 대략 1,000 내지 5,000 u/ml로 희석한다. 트롬보플라스틴 현탁액을 염화칼슘과 동시에 프로트롬빈 복합체에, 부드럽게 교반하면서 첨가한다. pH를 약 7.3으로 조정하고 약 15 내지 60분 동안 혼합한다. 약 15 내지 30℃에서 활성화한 후에 현탁액을 약 10℃ 이하로 냉장한다.
트롬빈의 활성화 및 정제: 활성화된 프로트롬빈 복합체를 대략 500 내지 3,000 u/ml의 pH 약 6.6의 희석된 시트르산 나트륨 완충액으로 희석한다. 그 물질을 필요에 따라 재여과할 수 있다.
상기 설명된 혼합물의 pH를 희석된 염산 또는 희석된 수산화나트륨을 첨가함으로써 약 6.6으로 조정한다. 활성화된 프로트롬빈 복합체를 약 6.6의 pH로 조정해놓은 양이온 교환 수지에 첨가한다. 사용할 수 있는 수지로는 Amberlite CG-50, Macro-Prep CM Support, Macro-Prep High S Support, Macro-Prep S Support, UNOsphere Q 이온 교환, SP 세파로스TM HP, Capto S 수지 또는 동등물들이 있으며, 그것들에 한정되지 않는다.
칼럼을 pH 6.6의 희석된 시트르산 나트륨으로 세척한 후 약 0.1 내지 0.25몰의 염화나트륨으로 세척하여 저친화성 단백질을 제거하여 버린다. 그런 다음 대략 0.5 내지 1몰의 염화나트륨을 적용하여 정제된 트롬빈을 용출한다. 용출물을 분획으로 수집하여 과정내 분석법에 따라 조합한다. 비-멸균 벌크를 과정내에서 0 내지 10℃에서 약 48시간 동안 보관할 수 있다. 비멸균 벌크 트롬빈을 관개를 위한 물, 30%의 글리세롤, 10%의 PEG 및 대략 0.15 내지 0.3M의 염화나트륨을 첨가함으로써 약 1000u/mL 정도로 제형한다. 제형된 트롬빈 용액의 pH는 희석된 염산 또는 수산화나트륨을 사용하여 약 6.7±1.0의 pH로 조정한다. 제형된 비멸균 벌크 트롬빈을 멸균 처리 전에 0 내지 10℃에 대략 48시간 정도 보관할 수 있다.
제형된 비멸균 벌크 트롬빈을 멸균된 박테리아 보유 비-섬유 방출 필터를 통해 적당한 멸균 보유 탱크 안으로 통과시킴으로써 멸균한다. 그 결과의 생성물은 고도로 농축된 α-트롬빈이며, 약 40kDa의 분자량을 가진다. 샘플은 약 1500 u/mg 단백질 이상의 평균 비활성을 가진다.
또한 프라이온 정화 연구를 이온 교환 크로마토그래피 정제 단계를 사용하여 수행하였다. 그 결과 트롬빈 크로마토그래피 정제 단계에 의해 얻어진 프라이온 정화 수준은 3.5 로그와 같은 것으로 나타났다.
사용된 소규모 칼럼의 내부 직경은 1.6cm였고, 수지로 50.2cm의 높이까지 채워졌다. 다라서 칼럼의 베드 부피는 약 101mL과 같다. 충전된 칼럼을 100mL의 1M NaCl로 평형화한 후 pH 6.61의 0.025M Na-시트레이트 100mL로 평형화하였다. 크로마토그래피 시스템의 유속은 3.3mL/분으로 설정하였다.
스파이크 샘플은 8mL의 263K 스트레인 스크라피(Scrapie) 햄스터 뇌 균등물로 구성하였다. 균등물을 20분 동안 음파처리한 후 0.45 0.2 및 0.1㎛ 필터를 통해 여과하였다. 샘플을 스파이크한 후에 총 12mL을 취하여 예비-크로마토그래피로 시험하여 396mL (400+8-12mL)의 예비-칼럼 스파이크된 샘플을 준비하였다.
예비-평형화된 칼럼을 396mL의 스파이크된 미정제 트롬빈을, 용출물의 흡광도가 0.4AU 아래가 될 때까지 144mL의 0.025M의 Na-시트레이트 완충액으로 세척하고, 용출물의 흡광도가 0.2AU 아래로 될 때까지 275mL의 0.2M의 NaCl로 세척하였다. 그런 다음 칼럼을 0.065M의 NaCl로 스트리핑하고 37mL의 정제된 트롬빈을 흡광도가 2AU에 도달하는 시점으로부터 그것이 다시 2AU로 되돌아올 때까지 수집하였다.
수집한 예비- 및 후- 크로마토그래피 샘플을 -60℃ 또는 그 아래의 온도에서 프라이온 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 전에 보관하였다. 그 결과를 아래의 표 1에 나타낸다.
표 1
| 샘플 기록 코드 | 샘플 설명 | 샘플 부피(mL) | 최종 역가 (로그10(PrPRES/mL) | 총 로그10 (PrPRES)* | 로그 감소값 |
| 1 | 스파이크 부하 | 396 | 5.8 | 8.4 | 3.5 |
| 2 | 후 칼럼 | 37 | 3.3 | 4.9 |
*총 로그10(PrPRES) = 최종 역가(로그10(PrpRES/mL)+(로그10(샘플 부피(mL))
실시예
2 - 크기 축출 여과를 사용한 바이러스 정화
본 실시예에서 사용한 막은 OmegaTM 1OOK VR이고, "완성된 막에 강도 및 견 고성을 부여하는 고도로 다공성인 폴리올레핀 후면에 변형된 폴리에테르술폰으로부터 주조된다". 이론적인 분자량 컷-오프 지점은 100kDa이다. 작은 분자의 통과는 접선 흐름 여과 조건하에서만 가능하다. 큰 분자 및 바이러스들은 크기 축출에 의해 재보유된다. 매우 작고 (20nm) 엔벨로프가 없는 바이러스인 소의 파보바이러스(BPV)에 대한 로그 감소값 (LRV)은 약 3.5 로그를 초과하는 것으로 측정되었다.
이 바이러스 정화 연구가 진행되는 동안 평가된 트롬빈 용액은 사전-정제된 트롬빈이다. 샘플은 전형적으로 약 1500 u/mg 단백질보다 큰 비활성을 갖는다. 단백질 농도는 대략 1.2%이고 염농도는 약 0.65M NaCl인 것으로 평가된다. 이 트롬빈 용액의 주요 성분은 활성 약제학적 성분 α-트롬빈이며, 그것은 대략 40kDa의 분자량을 갖는다.
바이러스 정화 연구에 포함될 수 있는 모델 바이러스의 패널을 선택할 때 여러가지 고려사항들이 있다. 그 하나는 출발 물질을 오염시키는 분명한 가능성을 가지는 관련 바이러스를 모델화하는 것이다. 다른 것은 광범위한 물리적 및 화학적 특성을 가지는 바이러스를 모델 바이러스의 패널에 포함시킴으로써 바이러스 정화 연구가 이들 바이러스의 양호한 정화를 나타낸다면, 제조 과정이 예상밖의 바이러스성 병원체를 효과적으로 정화할 수 있다고 보장하는 것이다.
소의 파보바이러스 (BPV)를 고려하는 것이 중요한데, 왜냐하면 출발 물질을 오염시킬 분명한 가능성이 있고, 매우 작으며 엔벨로프가 없고, 물리화학적 처리에 내성이 매우 큰 관련 바이러스이기 때문이다. 숙주 외의 세포에서 증식하는 쥐과의 백혈병 바이러스 (XMuLV), 소의 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 및 위공수병 바 이러스 (PRV)가 또한 BPV와 같이 포함된다. 이런 바이러스 패널은 관련 바이러스들에 대한 모델 바이러스를 제공하고, 이들 바이러스의 정화가 제조 과정이 바람직하지 못한 병원체들을 정화하였을 것임을 시사하는 양호한 물리적 및 화학적 특성 범위를 제공한다. 그런 바이러스 패널의 특성을 아래의 표 2에 나타낸다.
표 2. 4가지의 선택된 바이러스의 특성 요약
| 바이러스 | 게놈 | 엔벨로프 | 과(family) | 크기(nm) | 물리-화학적 병원체들에 대한 내성 |
| BPV | DNA | 없음 | 파보 | 20-25 | 높음 |
| XMuLV | RNA | 있음 | 레트로 | 80-110 | 낮음 |
| PRV | DNA | 있음 | 헤르페스 | 150-200 | 중간 |
| BVDV | RNA | 있음 | 플라비 | 40-70 | 중간 |
고려된 네 가지 바이러스 각각에 대하여, 두 종류의 여과를 수행하였다. 하나는 8psi의 표적 공급 압력에서 수행하고 다른 하나는 12psi의 표적 공급 압력에서 수행하였다. 각각의 작업을 새로운 OmegaTM 100K VR 막을 사용하여 수행한다.
모든 작업을 저온실에서 수행한다. 각각의 작업은 샘플을 5% (v/v)의 네 바이러스 중 하나를 포함한 샘플로 스파이크하고, 0.45㎛의 필터를 통과시켜서 모든 바이러스 응집체를 여과한 후, Pall Omega 100K VR 막을 통하여 여과하는 것으로 이루어진다. 바이러스 시험은 스파이크를 거친 후, 0.45㎛ 여과를 거친 후, Pall Omega 100K VR 막을 통한 여과 후의 샘플에 대해 수행한다.
트롬빈 여과는 약 400mL의 사전-정제된 트롬빈을 0.1ft2의 Omega 100K VR 막을 통하여 여과하는 것으로 이루어진다. 초기 트롬빈 부피의 80% (320mL)가 투과물에 수집된 후에, 나머지 80mL의 리텐테이트(retentate)는 바이러스와 비-트롬빈 불순물 외에 여전히 많은 트롬빈을 함유한다. 이 80mL 용액을 계속해서 다이아여과하 여 트롬빈 투과율을 최대화하기 위해 사용한다. 그것은 80mL을 그 부피의 6배 (480mL)의 NaCl 용액을 사용하여 다이아여과함으로써 이루어진다.
그러므로 최종 투과물 부피는 초기 트롬빈 샘플의 2배이다. 그런 다음 10K VR 막 카세트를 통한 이 투과물의 농축을 수행하여 원하는 수준의 부피 및 농도로 되돌린다. 최종 생성물의 순도는 이 여과의 결과로서 훨씬 증가한다. 예를 들어 비활성은 30% 이상 증가하고, 인자 Va 함량은 경합 효소-결합 면역흡착 분석 (cELISA)에 의해 측정되는 것과 같이 최종 생성물에서 검출할 수 없는 수준으로 감소된다.
바이러스 제거 (및 큰 분자 제거)는 크기 축출에 의해 일어난다. 매우 높은 로그 감소값이 고려된 4-바이러스 패널에 대해 관찰된다 (소의 파보바이러스, 소의 바이러스성 설사 바이러스, 숙주 외의 세포에서 증식하는 쥐과의 백혈병 바이러스, 및 소의 위공수병 바이러스). 후-Omega 트롬빈 생성물의 안정성은 증가된 생성물 순도로 인해 손상되지 않았다.
아래의 표 3은 8번의 여과작업의 파라미터 및 조건을 요약한 것이다. 예비-여과 트롬빈 샘플은 400mL이고, 필터 표면적은 0.1ft2이며, 트롬빈 부피의 필터 표면적에 대한 비는 4L/ft2이다. 바이러스 스파이크의 부피는 작업당 20mL이다 (5%v/v). 공급 압력은 첫 번째 작업의 경우 8±2psi로 유지하였고, 두 번째 작업에 대해서는 12±2psi로 유지하였다. 리텐테이트 압력은 모든 작업에 대해 0±2psi이다.
표 3. 8회의 여과 작업의 파라미터 및 조건의 요약
| 바이러스 | PRV | BVD | BPV | XMuLV | ||||
| 작업번호 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| 필터 표면적 (ft) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 초기 트롬빈 부피 (mL) | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
| 초기 스파이크된 트롬빈 부피(mL) | 420 | 420 | 420 | 420 | 420 | 420 | 420 | 420 |
| 후 여과 트롬빈 부피 (mL) | 820 | 820 | 820 | 820 | 820 | 820 | 820 | 820 |
| 초기 교차 흐름 (mL/분) | 41 | 54 | 43 | 54 | 44 | 56 | 43 | 56 |
| 여과 완료시 최종 교차 흐름(mL/분) | 38 | 51.5 | 40 | 50 | 41 | 55 | 40 | 53.5 |
| 공급 압력 (psi) | 8-10 | 12-14 | 8-10 | 12-14 | 8-10 | 12-14 | 8-10 | 12-14 |
| 리텐테이트 압혁 (psi) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 총 여과 시간 (분) | 257 | 214 | 239 | 223 | 236 | 190 | 251 | 204 |
| 사용전 및 사용후 필터 통합성 시험 | 통과 | 통과 | 통과 | 통과 | 통과 | 통과 | 통과 | 통과 |
각각의 작업에 대하여, 420mL의 스파이크된 트롬빈 샘플이 0.1ft2의 OmegaTM 100K VR 막을 통해 여과된다. 340mL의 투과물이 수집될 때 나머지 80mL의 리텐테이트 용액을 그 부피의 6배의 0.65M NaCl 용액으로 다이아여과한다. 그러므로 총 투과 부피는 340+(6×80)=820mL이 된다. 이들 여과 조건으로 트롬빈 순도의 향상뿐 아니라 트롬빈 회수도 허용된다.
8psi 작업을 시작할 때의 교차 흐름 범위는 41 내지 44mL/분이다. 교차 흐름 여과란 보유된 유체가 여과된 물질이 막 위에 쌓이는 것을 막는 방식으로 막 표면 위로 순환되는 작동 방법이다. 12psi의 출발시에 교차 흐름은 54 내지 56 mL/분의 범위이다. 8psi 작업에 대한 처리 시간 범위는 236 내지 257분이다. 12psi에 대한 처리 시간 범위는 190 내지 223분이다. 4가지의 상이한 바이러스의 정화 결과를 아래의 표 4에 요약한다.
표 4. 바이러스 정화 결과의 요약
| 바이러스 | PRV | BVD | BPV | XMuLV | ||||
| 유닛 | 역가+95% CI (로그10PFU/mL) | 역가+95% CI (로그10TCID50/mL) | 역가+95% CI (로그10TCID50/mL) | 역가+95% CI (로그10TCID50/mL) | ||||
| 작업 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| 작업당 LRV | ≥4.92 | ≥4.92 | 4.35 | 4.22 | 3.83 | 3.62 | 3.86 | 4.47 |
| 바이러스당 평균 LRV | ≥4.92 | ≥4.29 | ≥3.74 | ≥4.26 | ||||
모든 바이러스에 대해 수행된 이중 작업 사이에 이루어진 높은 정화값과 얻어진 결과의 유사성은 여과 단계가 확실함을 나타낸다. 평균 로그 감소값은 BPV를 제외한 모든 바이러스에 대해 4 이상이었고, BPV는 3.74±0.39의 로그 감소값을 나타냈다. 이 로그 감소값이 4 로그보다는 약간 낮지만, 여전히 사용된 조건의 환경하에서는 높은 값이다.
또한 프라이온 정화 연구를 크기 축출 여과 단계를 사용하여 수행하였다. 그 결과는 트롬빈 여과 정제 단계에 의해 얻어진 프라이온 정화 수준이 3.6로그임을 나타낸다.
전-스파이크 트롬빈 샘플의 부피는 400mL이었다.
스파이크 샘플은 8mL의 263K 스트레인 스크라피 햄스터 뇌 균등물로 이루어졌다. 균등물을 20분 동안 음파처리한 후, 0.45, 0.2 및 0.1㎛ 필터를 통해 여과한다.
샘플 스파이크 후에, 12mL을 취하여 전-Omega 여과 단계를 수행하고 전-여과 스파이크된 샘플 396mL (400+8-12mL)을 남겼다.
사용한 필터는 표면적이 0.1ft2인 Pall사의 OmegaTM 100K VR 막이었다. 따라 서 필터 표면적에 대한 트롬빈 부피의 비는 4L/ft2이었다.
OmegaTM 199K VR 막을 여과 시스템에 대해 설정하고 500mL의 정제수로 세정하였다. 사용 전 통합성 시험을 수행하였고 허용 기준을 통과하였다. 그런 다음 막을 100mL의 0.65M NaCl을 사용하여 10psi의 공급 압력에서 조건화하였다. 눈금이 새겨진 실린더에서 측정된 투과물 및 교차 흐름 속도는 각각 약 5 및 52mL/분이었다.
스파이크된 샘플의 초기 386mL의 여과를 시작하였다. 315mL의 여과물 (즉 초기 부피의 약 80%)이 수집되었을 때, 나머지 샘플을 총 475mL (즉 리텐테이트 부피의 약 6배)의 0.65M NaCl로 다이아여과하였다. 공급 압력을 약 10psi로 유지하였고, 리텐테이트 압력은 여과 작업 전체를 통하여 0psi로 동일하였다. 이들 여과 조건은 이미 높은 바이러스 정화뿐만이 아니라 허용되는 트롬빈 회수를 유발하는 것으로 나타났다.
최종 후-여과 부피는 790mL이었고, 처리 시간은 172분이었다.
수집된 전- 및 후-Omega 여과 샘플을 프라이온 웨스턴 불롯 분석을 수행하기 전에 -60℃ 또는 그 아래의 온도에서 보관하였다. 그 결과를 아래의 표 5에 요약한다.
표 5
| 샘플 기록 코드 | 샘플 설명 | 샘플 부피 (mL) | 최종 역가 (로그10(PrPRES/mL)) | 총 로그10 (PrPRES)* | 로그 감소값 |
| 1 | 스파이크 부하 | 396 | 5.7 | 8.3 | |
| 2 | 후 Omega | 790 | 1.8 | 4.7 | 3.6 |
* 총 로그10(PrPRES)=최종 역가(로그10(PrPRES/mL))+로그10(샘플 부피(mL))
실시예
3 - 이온 필터를 사용한 바이러스 정화
정제된 트롬빈을 먼저 Pall사의 필터를 사용하여 10K MWCO 및 1ft2 표면적으로 농축한다. 그런 다음 농축한 샘플을 정제수를 사용하여 원하는 염 농도로 희석한다. 총 15배치를 준비한다. 제조된 모든 배치의 결과를 아래의 표 6 및 7에 나타낸다.
표 6. 다양한 작업을 위한 평균 % 회수
| 작업 번호 | 설명 | % 회수 | BPV에 대한 로그 감소 |
| 1, 2 & 3 | 50mM NaCl, 0.8% 만니톨, pH ~5.5 | 74 | ≥5.12±0.24 |
| 11, 12 & 13 | 50mM NaCl, 0.8% 만니톨, pH ~7.0 | 76.9 | NA |
| 8, 9 & 10 | 72mM NaCl, 0.8% 만니톨, pH ~7.0 | 90.8 | NA |
| 14, 15 & 16 | 72mM NACl, 만니톨 없음. pH ~7.0 | 91.7 | 3.60±0.62 |
| 4, 5 & 7 | 108mM NaCl, 0.8% 만니톨, pH ~7.0 | 99.8 | 1.25±0.55 |
표 7. 결과의 요약
| 작업 # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| NaCl 농도 ( mM ) | 50 | 50 | 50 | 108 | 108 | 81 | 108 | 72 |
| 초기 효능 (u/mL) | 30192 | 21332 | 22111 | 32660 | 32660 | 32660 | 27217 | 24107 |
| 초기 부피 (mL) | 600 | 500 | 500 | 400 | 400 | 400 | 400 | 290 |
| 농축량 (mL) | 213 | 175 | 151 | 250 | 350 | 350 | 310 | 150 |
| H2O를 사용한 희석 | 1:13 | 1:13 | 1:13 | 1:6 | 1:6 | 1:8 | 1;6 | 1:9 |
| 제형된 샘플의 최종 부피 (mL) | 2720 | 2245 | 1930 | 1500 | 2100 | 2800 | 1860 | 1350 |
| 제형된 샘플의 최종 효능 (u/mL) | 4650 | 3753 | 4201 | 8562 | 6594 | 4135 | 5559 | 4719 |
| % 회수 | 70 | 79 | 73 | 98.3 | 106 | 88.6 | 95 | 91.1 |
| 만니톨 (% v/v) | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
| pH | 5.49 | 5.51 | 5.53 | 7.04 | 7.05 | 7.02 | 7.03 | 7.10 |
표 7(계속). 결과의 요약
| 작업 # | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| NaCl 농도 ( mM ) | 72 | 72 | 50 | 50 | 50 | 72 | 72 | 72 |
| 초기 효능 (u/mL) | 23950 | 29161 | 22928 | 23836 | 24063 | 26569 | 22474 | 23977 |
| 초기 부피 (mL) | 300 | 300 | 300 | 300 | 300 | 300 | 300 | 300 |
| 농축량 (mL) | 155 | 145 | 117 | 105 | 115 | 140 | 123 | 125 |
| H2O를 사용한 희석 | 1:9 | 1:9 | 1:13 | 1:13 | 1:13 | 1:9 | 1:9 | 1:9 |
| 제형된 샘플의 최종 부피 (mL) | 1395 | 1305 | 1521 | 1365 | 1495 | 1260 | 1107 | 1125 |
| 제형된 샘플의 최종 효능 (u/mL) | 4768 | 5954 | 3288 | 4534 | 3454 | 5806 | 5781 | 5658 |
| % 회수 | 92.6 | 88.8 | 72.7 | 86.5 | 71.5 | 91.8 | 94.9 | 88.5 |
| 만니톨 (% v/v) | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0 | 0 | 0 |
| pH | 7.05 | 7.05 | 7.05 | 7.07 | 7.02 | 6.98 | 6.95 | 7.03 |
작업 1 내지 3의 샘플 (50mM NaCl)은 Mustang Q 필터의 바이러스 정화 확인을 위해 초기에 사용된 것으로 소의 파보바이러스 (BPV)에 대해 매우 높은 로그 감소값을 유발한다. 그러나 트롬빈 회수가 평균적으로 겨우 74%로 낮기 때문에, 바이러스 정화 연구는 작업 4, 5, 및 7 (108mM NaCl)을 사용하여 반복하며, 그 결과 평균 트롬빈 회수는 99.8%이지만, BPV에 대한 로그 감소값은 2보다 적다. 결국, 바이러스 정화 연구는 작업 14, 15 및 16 (72mM NaCl 및 91.7% 회수)을 사용하여 반복하고, BPV에 대한 로그 감소값은 허용적이었다 (3.6±0.62).
또한 프라이온 감소 연구를 이온 교환 필터를 사용하여 수행하였다. 그 결과 트롬빈 여과 정제 단계에 의해 얻어진 프라이온 정화 수준은 3.9 로그보다 큰 것으로 나타났다.
전-스파이크 트롬빈 샘플의 부피는 91mL이었다.
스파이크 샘플은 1.6mL의 263K 스트레인 스크라피 햄스터 뇌 균등물로 이루어진다. 균등물을 20분 동안 음파처리한 후 0.45, 0.2 및 0.1㎛ 필터를 통과하여 여과하였다.
12mL을 취하여 전-Mustang Q 여과 시험을 하고, 80.6mL (91+1.6-12mL)의 전- 여과 스파이크 샘플을 남겼다.
사용한 필터는 Pall사의 Mustang Q 필터로 표면적이 0.35mL이었다. 따라서 필터 표면적에 대한 트롬빈 부피의 비는 필터 mL당 샘플 230mL이었다.
필터 홀더를 필터 코인 없이 20mL의 1N NaOH를 사용하여 20분 보유함으로써 살균하였다. Mustang Q 필터를 홀더 안에 놓고, 20mL의 1N NaOH로 세척한 후 1M의 NaCl로 용출액의 pH가 중성이 될 때까지 세척하였다.
그런 다음 80.6mL의 스파이크 샘플을 실제 여과하기 전에 필터를 25mL의 72mM NaCl로 약 3mL/분의 유속으로 조건화하였다.
최종 후-여과 부피는 77mL이었고, 처리 시간은 49분이었다.
수집한 전- 및 후-이온 여과 샘플을 -60℃ 또는 그 아래의 온도에서 프라이온 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 전에 보관하였다. 그 결과를 아래의 표 8에 나타낸다.
표 8
| 샘플 기록 카드 | 샘플 설명 | 샘플 부피 (mL) | 최종 역가 (로그10(PrPRES/mL)) | 총 로그10 (PrPRES)* | 로그 감소값 |
| 1 | 스파이크 부하 | 80.6 | 4.8 | 6.7 | >3.9 |
| 2 | 출력 | 77 | <0.9 | <2.8 |
실시예
4 - 다양한 조건 하에서의 크기 축출 여과
본 실시예는 또한 Pall Omega 100K VR 필터를 사용하는 크기 축출 여과를 사용한다. 8psi의 공급 압력에서 3회의 작업을 수행하고, 12psi의 공급 압력에서 3회의 작업을 수행한다. 규모가 축소된 필터의 파라미터를 필터 표면적을 일정하게 유지하고, 명시된 공급 압력 범위의 조작을 확실하게 하기 위해 선택한다.
각각의 작업을 새로운 0.1ft2의 Pall Omega 100K VR 필터를 사용하여 수행하고 모든 작업을 저온실 (≤약 8℃)에서 수행한다. 시스템에는 유량계가 포함되어 여과하는 동안 교차-흐름을 더 잘 모니터할 수 있다. 유량계는 사용 전에 저온실에서 보정한다.
아래의 표 9는 6회의 여과 작업의 조건 및 파라미터를 요약한다. 8psi 작업에 대해 출발 물질의 트롬빈 활성은 평균 22,091 u/mL이고, 최종 여과물 풀에 대해서는 평균 11,130 u/mL이다. 그 결과 6회의 다이아여과 작업 사이클 후에 트롬빈 회수의 %는 평균 86%이다. 8psi의 공급 압력에서 수행한 작업은 12psi에서의 트롬빈 회수보다 약간 더 많은 것으로 나타났다.
표 9. 트롬빈 여과 및 회수 결과의 요약
| 작업 #1 | 작업 #2 | 작업 #3 | 작업 #4 | 작업 #5 | 작업 #6 | |
| 표적 공급 압력 | 8 | 8 | 8 | 12 | 12 | 12 |
| 트롬빈 부피 (mL) | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
| 스파이크 부피 (mL) | 20 | 20 | 20 | NA | NA | NA |
| 총 부피 전-여과 샘플 (mL) | 420 | 420 | 420 | 400 | 400 | 400 |
| 활성 전-여과 샘플 (mL) | 22,696 | 24,177 | 19,399 | 21,559 | 21,559 | 20,747 |
| 총 활성 전-여과 샘플 (u) | 9532320 | 10154340 | 8147580 | 8623600 | 8623600 | 8298800 |
| 총 부피 후-여과 샘플 (mL) | 820 | 820 | 820 | 800 | 800 | 800 |
| 활성 후-여과 샘플 (u/mL) | 10,045 | 13,210 | 9,776 | 8,631 | 9,940 | 8,923 |
| 총 활성 후 여과 샘플 (u) | 8532100 | 10832200 | 8016320 | 6904800 | 7952000 | 7138400 |
| % 트롬빈 회수 | 89.5 | 106.7 | 98.4 | 80.0 | 92 | 86 |
| 총 처리 시간 | 206 | 219 | 215 | 155 | 173.5 | 166 |
한 가지 차이는 12psi의 공급 압력에서 교차 흐름은 더 높을수록 더 빠른 트롬빈의 통과를 초래하고, 그로써 처리 시간을 단축시킨다.
아래의 표 10은 여과 단계가 8psi 작업에 대해 트롬빈 순도 또는 비활성을 36.4% 증가시키고, 12psi 작업의 경우 37.1% 증가시키는 결과를 초래하는 것을 보여준다. 비활성은 사전여과 샘플에서 1688.4 내지 1986.0 트롬빈/mg 단백질의 범위 로부터 후여과 샘플에서 2324.6 내지 2690.1 트롬빈/mg 단백질의 범위로 증가한다.
표 10. 전- 대 후-Omega 100 여과 샘플의 비활성
| 작업#1 | 작업#2 | 작업#3 | 평균 | 작업#4 | 작업#5 | 작업#6 | 평균 | ||
| 표적 공급 압력(psi) | 8 | 8 | 8 | 8 | 12 | 12 | 12 | 12 | |
| 전-Omega 100 필터 | 활성 (u/mL) | 22,696 | 24,177 | 19,399 | 21,559 | 21,559 | 20,747 | ||
| 단백질 (mg/mL) | 13.056 | 12.576 | 11.1406 | 10.8554 | 11.7673 | 12.2881 | |||
| 비활성 (u/mg) | 1738.4 | 1922.5 | 1741.3 | 1800.7 | 1986.0 | 1832.1 | 1688.4 | 1835.5 | |
| 후 Omega 100 필터 | 활성 (u/mL) | 10,405 | 13,210 | 9,776 | 8,631 | 9,940 | 8,923 | ||
| 단백질 (mg/mL) | 4.236 | 5.108 | 4.2055 | 3.5337 | 3.695 | 3.7365 | |||
| 비활성 (u/mg) | 2456.3 | 2586.1 | 2324.6 | 2455.7 | 2442.5 | 2690.1 | 2338.1 | 2490.2 | |
| 나노여과로 인한 비활성의 %증가 | 41.3 | 34.5 | 33.5 | 36.4 | 23.0 | 46.8 | 41.4 | 37.1 | |
투과물 분획은 도 2에 도시된 바와 같이 각각의 초기 출발 트롬빈 샘플보다 훨씬 더 깨끗하다. 출발 물질에서 관찰된 거의 모든 고분자량의 불순물은 리텐테이트에 필터에 의해 보유된다.
아래의 표 11은 여과 단계가 또한 인자 Va 함량의 실질적인 감소를 유발하는 것을 보여준다. 두 가지의 공급 압력에서 수행된 작업 사이의 평균 감소는 비교할만하다: 8psi 작업에서 88.5%이고, 12psi 작업에서 89.3%이다. 인자 V/Va는 국소적인 소 트롬빈에 대한 수술적 노출에 대한 반응으로 환자에게서 발생할 수 있는 응고학과 관련된다. 현재의 지식으로는 소 트롬빈의 인자 V/Va 오염이 환자 자신의 인자 Va와 교차반응할 수 있고, 그로써 손상된 항상성을 유도할 수 있는 환자의 항소 인자 Va의 생성을 자극한다는 것을 시사한다. 이 여과 단계는 경합 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 측정되는 바와 같이, 최종 트롬빈-JMI®의 인자 Va 함량을 검출할 수 없는 수준으로 실질적으로 감소시키는 장점의 유익을 제공한다.
표 11. ELISA에 의한 전- 대 후-Omega 100 여과 샘플의 인자 Va 함량
| 작업#1 | 작업#2 | 작업#3 | 평균 | 작업#4 | 작업#5 | 작업#6 | 평균 | ||
| 표적 공급 압력(psi) | 8 | 8 | 8 | 8 | 12 | 12 | 12 | 12 | |
| 전-Omega | ㎍/mL | 44.993 | 45.566 | 40.879 | 43.813 | 22.954 | 22.954 | 37.163 | 27.690 |
| ㎍/1000u | 1.982 | 1.885 | 2.107 | 1.991 | 1.065 | 1.065 | 1.791 | 1.307 | |
| 후-Omega | ㎍/mL | 3.625 | 2.017 | 1.801 | 2.481 | 0.741 | 0.708 | 2.357 | 1.269 |
| ㎍/1000u | 0.348 | 0.153 | 0.184 | 0.228 | 0.086 | 0.071 | 0.264 | 0.140 | |
| Omega 필터로 인한 인자 Va 의 % 증가 | 82.4 | 91.9 | 91.3 | 88.5 | 91.9 | 93.3 | 85.3 | 89.3 | |
실시예
5 - 안정화된
트롬빈
제형
아래의 표 12는 본 발명에 따르는 안정화된 정제된 트롬빈 제형을 나타낸다.
표 12. 안정화된 트롬빈 제형
| 안정화된 트롬빈 제형 | |
| 트롬빈 조성물 | NLT 1,400 유닛/ml |
| 글리세롤 | 30 부피% |
| 폴리에틸렌 글리콜 | 10 부피% |
| 염화나트륨 | 0.15 내지 0.3M 농도 |
| 아세트산 나트륨 | 0.025 내지 0.05M 농도 |
| pH | 6.7±0.1 |
안정화된 트롬빈 제형을 위한 트롬빈은 도 3의 과정에 따라 생성되었다. 방사선 조사를 위한 물의 첨가에 의해 1,400 유닛/ml보다 적지 않도록 비-멸균 벌크 트롬빈 조성물을 제형하였다. 그런 다음 글리세롤을 대략 30 부피%의 농도로 첨가하였다. 폴리에틸렌 글리콜 200-400 MW을 대략 10 부피% 농도가 되도록 첨가하였다. 염화나트륨을 염화나트륨의 농도가 대략 0.15 내지 0.3M이 될 때까지 첨가하고, 아세트산 나트륨을 그것의 농도가 대략 0.025 내지 0.05M이 될 때까지 첨가하였다. 트롬빈 용액의 pH는 희석된 염산 또는 수산화 나트륨을 사용하여 6.7±0.1의 pH로 조정하였다.
그런 다음 안정화되고 비-멸균된 트롬빈 제형을 실온 (23℃±2℃)에서 안정성 시험을 수행하고, 샘플을 다양한 시간점에서 시험하였다. 샘플을 3개 한 벌로 시험하였다. 트롬빈 효능 또는 활성을 분석하기 위하여 사용한 시험 방법을 응고 시간 측정을 토대로 하였다. 응고 시간을 측정하기 위해 사용한 기계는 ACL 7000 응고 타이머였다. 샘플을 표준 곡선 범위 내에 있는 농도로 희석하고 기계의 로터에 놓았다. 사람 혈장을 또한 기계의 컵에 놓고 혈장과 희석된 트롬빈 샘플을 둘 다 37℃에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 혈장과 희석된 트롬빈 각각의 명시된 부피를 동시에 펌프하여 혼합하였다. 혼합한 후 빛을 혈장/트롬빈 혼합물을 통하여 통과시키고, 응고가 형성되었을 때 빛을 산란시켰다. 검출기로 산란된 빛을 측정하고 그 결과를 응고 시간(초)로 변형시켰다. 그런 다음 응고 시간을 표준 곡선의 응고 시간 대 u/mL의 이중 로그 회귀를 사용하여 u/mL로 전환시켰다. 마지막으로 u/mL 값을 희석 인자로 곱하여 샘플의 실제 효능을 구하였다.
하기의 표 13은 본 발명의 제형에 대해 실온 (23℃±2℃)에서 6개월에 걸쳐 수행한 안정성 시험 결과를 나타낸다.
표 13. 안정화된 트롬빈 제형
| 샘플 | 청구되는 표지 | 부피 | 초기 효능 | 3개월 | 6개월 |
| u/바이알 | mL/바이알 | u/mL | u/mL | u/mL | |
| 1 | 5,000 | 5 | 1,661 | 1,613 | 1,611 |
| 2 | 20,000 | 20 | 1,661 | 1,727 | 1,672 |
| 3 | 5,000 | 5 | 1,486 | 1,451 | 1,327 |
| 4 | 20,000 | 20 | 1,486 | 1,483 | 1,492 |
하기의 표 14는 본 발명의 정제 방법에 대해 수행되지 않은, 개선된 안정성 을 위해 제형된 트롬빈 제형을 나타낸다.
표 14. 안정화된 트롬빈 제형
| 안정화된 트롬빈 제형 | |
| 트롬빈 조성물 | NLT 1,400 유닛/ml |
| 글리세롤 | 30 부피% |
| 폴리에틸렌 글리콜 | 10 부피% |
| 염화나트륨 | 0.15 내지 0.3M 농도 |
| 아세트산 나트륨 | 0.025 내지 0.05M 농도 |
| pH | 6.7±0.1 |
방사선 조사를 위한 물의 첨가에 의해 1,400 유닛/ml보다 적지 않도록 비-멸균 벌크 트롬빈 조성물을 제형하였다. 그런 다음 글리세롤을 대략 30 부피%의 농도로 첨가하였다. 폴리에틸렌 글리콜 200-400 MW을 대략 10 부피% 농도가 되도록 첨가하였다. 염화나트륨을 염화나트륨의 농도가 대략 0.15 내지 0.3M이 될 때까지 첨가하고, 아세트산 나트륨을 그것의 농도가 대략 0.025 내지 0.05M이 될 때까지 첨가하였다. 트롬빈 용액의 pH는 희석된 염산 또는 수산화 나트륨을 사용하여 6.7±0.1의 pH로 조정하였다. 그런 다음 제형을 안정성에 대해 23℃±2℃에서 수행하고 규칙적인 시간 간격으로 효능에 대해 시험하였다. 샘플을 3개 한 벌로 시험하였다.
하기의 표 15는 실온에서 (23℃±2℃) 24개월에 걸쳐 안정성에 대해 시험한 결과를 나타낸다.
표 15. 안정화된 트롬빈 제형
| 샘플 | 청구된 표지 | 부피 | 초기 효능 | 3개월 | 6개월 | 9개월 | 12개월 | 24개월 | 24개월 |
| u/바이알 | mL/바이알 | u/mL | u/mL | u/mL | u/mL | u/mL | u/mL | 초기 효능의 % | |
| 1 | 5,000 | 5 | 1,397 | 1,506 | 1,425 | 1,306 | 1,267 | 1,078 | 77.2 |
| 2 | 10,000 | 10 | 1,484 | 1,592 | 1,357 | 1,346 | 1,288 | 1,068 | 72.0 |
| 3 | 20,000 | 20 | 1,355 | 1,510 | 1,379 | 1,309 | 1,280 | 1,178 | 86.9 |
| 4 | 5,000 | 5 | 1,900 | NA | 1,717 | 1,644 | 1,768 | 1,502 | 79.1 |
| 5 | 5,000 | 5 | 1,765 | NA | 1,433 | 1,471 | 1,564 | 1,258 | 71.3 |
| 6 | 5,000 | 5 | 1,664 | 1,711 | 1,610 | 1,544 | 1,613 | 1,289 | 77.5 |
| 7 | 5,000 | 5 | 1,860 | 1,939 | 1,700 | 1,734 | 1,522 | 1,406 | 75.6 |
| 8 | 5,000 | 5 | 1,451 | 1,480 | 1,347 | 1,348 | 1,229 | 1,106 | 76.2 |
NA=활용할 수 없음
특정 실시예를 제시했지만, 그것들은 바람직한 구체예일 뿐이며, 본 발명을 추가로 설명하고 예시하는 것을 의미한다. 실시예는 본 발명의 전체 범주를 규정하는 것으로 의도된 것은 아니다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 그것의 전체 내용이 참고로 삽입된 것으로 각각의 개별적인 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 전체가 삽입되는 것을 나타내는 것과 동일한 정도의 목적으로 삽입된다.
본 발명에 의하면, 현재 활용되는 트롬빈 제형보다 더 안정한 트롬빈 제형을 제조할 수 있다.
Claims (70)
- 정제된 트롬빈의 제조 방법에 있어서, 그 방법이(a) 40kDa보다 큰 분자량을 가지는 불순물을 축출할 수 있는 크기 축출 필터에 트롬빈 제제를 적용하는 단계; 그리고(b) 정제된 트롬빈을 회수하는 단계로 이루어지는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 트롬빈의 공급원이 소인 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 트롬빈의 공급원이 트롬빈-JMI®인 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 크기 축출 필터가 40kDa 내지 300kDa 범위의 분자량을 가지는 불순물을 축출할 수 있는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 크기 축출 필터가 50kDa, 100kDa, 또는 150kDa의 분자량을 가지는 불순물을 축출할 수 있는 것으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 크기 축출 필터가 50kDa의 분자량을 가지는 불순물을 축출할 수 있는 것으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 크기 축출 필터가 100kDa의 분자량을 가지는 불순물을 축출할 수 있는 것으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈 중의 불순물이 최소한 50% 감소되는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈 중의 불순물이 최소한 80% 감소되는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈의 비활성이 최소한 1000% 증가하는 것인 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈의 비활성이 최소한 1200% 증가 하는 것인 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈의 비활성이 최소한 1500% 증가하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈이 실질적으로 불순물이 없는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈이 실질적으로 인자 Va가 없는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈이 실질적으로 프라이온이 없는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈이 최소한 3.5로그와 동등하게 프라이온이 감소된 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈이 실질적으로 바이러스성 병원체가 없는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 회수된 정제된 트롬빈이 실질적으로 순수한 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 이온 교환 필터에 회수된 정제된 트롬빈을 적용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 크로마토그래피 정제 단계에 회수된 정제된 트롬빈을 적용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 제 20항에 있어서, 상기 크로마토그래피 정제 단계가 이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조 방법.
- 실질적으로 40kDa보다 큰 분자량을 가지는 불순물이 없는 트롬빈 조성물.
- 제 22항에 있어서, 상기 트롬빈 조성물이 실질적으로 50kDa 내지 300kDa 범위의 분자량을 가지는 불순물이 없는 것을 특징으로 하는 트롬빈 조성물.
- 실질적으로 불순물이 없는 트롬빈 조성물.
- 실질적으로 순수한 트롬빈 조성물.
- 실질적으로 인자 Va가 없는 트롬빈 조성물.
- 제 27항에 있어서, 상기 인자 Va가 인자 Va 활성 분석법, ELISA, 또는 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 트롬빈 조성물.
- 제 27항에 있어서, 상기 인자 Va가 0.4 ㎍/트롬빈 1000유니트보다 적은 것을 특징으로 하는 트롬빈 조성물.
- 실질적으로 바이러스성 병원체가 없으며, 이때 로그 감소값이 바이러스당 3.5보다 큰 트롬빈 조성물.
- 약 1800 내지 3000 u/mg 단백질의 트롬빈 비활성을 가지는 트롬빈 조성물.
- 제 30항에 있어서, 상기 비활성이 약 1800 내지 2400 u/mg 단백질인 것을 특징으로 하는 트롬빈 조성물.
- 제 30항에 있어서, 상기 비활성이 약 2400 내지 2500 u/mg 단백질인 것을 특징으로 하는 트롬빈 조성물.
- 제 30항에 있어서, 상기 비활성이 약 2500 내지 2600 u/mg 단백질인 것을 특징으로 하는 트롬빈 조성물.
- 제 30항에 있어서, 상기 비활성이 약 2600 내지 2700 u/mg 단백질인 것을 특징으로 하는 트롬빈 조성물.
- 제 28항에 있어서, 상기 조성물이 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 트롬빈 조성물.
- 제 30항에 있어서, 상기 조성물이 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 트롬빈 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 트롬빈 제제를 이온 교환 필터에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 트롬빈 제제에 열처리를 적용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조방법.
- 제 38항에 있어서, 상기 열처리가 트롬빈을 60℃에서 10시간 동안 보유하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 트롬빈 제제의 pH를 약 5 이하로 낮추는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 트롬빈 제제에 대해 전자기 방사선을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조방법.
- 제 41항에 있어서, 상기 전자기 방사선이 감마 방사선인 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조방법.
- 제 41항에 있어서, 상기 전자기 방사선이 UV 방사선인 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 크기 축출 필터에 적용된 트롬빈 제제의 양이 최소한 15L인 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조방법.
- 제 44항에 있어서, 상기 트롬빈 제제가 최소한 300,000,000유닛의 트롬빈을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 트롬빈의 제조방법.
- 순도가 증대된 트롬빈의 제조방법에 있어서, 상기 방법이(a) 크로마토그래피 정제 단계에 트롬빈 제제를 적용하는 단계;(b) 크기 축출 필터에 트롬빈 제제를 적용하는 단계;(c) 이온 교환 필터에 트롬빈 제제를 적용하는 단계; 그리고(d) 정제된 트롬빈을 회수하는 단계로 이루어지는 방법.
- 제 46항에 있어서, 상기 크로마토그래피 정제 단계가 이온 교환 크로마토그래피 칼럼 또는 크기 축출 크로마토그래피 칼럼을 포함하는 것을 특징으로 하는 순도가 증대된 트롬빈의 제조방법.
- 제 36항에 있어서, 상기 제형이 액체인 것을 특징으로 하는 제형.
- 제 36항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제가 물, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 제형.
- 제 49항에 있어서, 상기 글리세롤이 20 내지 40 부피%인 것을 특징으로 하는 제형.
- 제 49항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 1 내지 20 부피%인 것을 특징으로 하는 제형.
- 제 49항에 있어서, 상기 부형제가 염화나트륨, 아세트산 나트륨, 시트레이트 나트륨 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 제형.
- 제 49항에 있어서, 상기 제형이 추가로 산 또는 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
- 제 53항에 있어서, 상기 산 또는 염기가 염산 또는 수산화나트륨인 것을 특징으로 하는 제형.
- 제 53항에 있어서, 상기 제형이 5 내지 9의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 제형.
- 제 53항에 있어서, 상기 제형이 6 내지 8의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 제형.
- 트롬빈 조성물을 포함하는 안정화된 액체 트롬빈 제형으로서, 상기 트롬빈 조성물이 실질적으로 불순물이 없고 최소한 하나의 부형제를 가지는 안정화된 액체 트롬빈 제형.
- 제 57항에 있어서, 상기 제형이 2년까지 그것의 초기 효능의 최소한 60%를 유지하는 것을 특징으로 하는 안정화된 액체 트롬빈 제형.
- 제 57항에 있어서, 상기 제형이 2년까지 그것의 초기 효능의 최소한 70%를 유지하는 것을 특징으로 하는 안정화된 액체 트롬빈 제형.
- 안정화된 액체 트롬빈 제형에 있어서, 상기 제형이트롬빈 조성물에 실질적으로 불순물이 없는 트롬빈 조성물;글리세롤;폴리에틸렌 글리콜;염화나트륨;아세트산 나트륨을 포함하고, 상기 제형의 pH가 6 내지 8인 안정화된 액체 트롬빈 조성물.
- 제 57항의 안정화된 트롬빈 제형을 투여하는 방법에 있어서, 상기 방법이 안정화된 트롬빈 제형을 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 안정화된 트롬빈 제형의 투여 방법.
- 제57항의 안정화된 트롬빈 제형을 투여하는 방법에 있어서, 상기 방법이트롬빈 제형을 주사기 안에 채우는 단계;트롬빈 제형을 주사기를 통해 밀어내는 단계; 그리고체강의 표면을 트롬빈 제형으로 넘치게 하는 단계로 이루어지는 안정화된 트롬빈 제형의 투여 방법.
- 제 57항의 안정화된 트롬빈 제형을 투여하는 방법에 있어서, 상기 방법이 체강의 표면에 트롬빈 제형을 적용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 안정화된 트롬빈 제형의 투여방법.
- 제 57항의 안정화된 트롬빈 제형을 투여하는 방법에 있어서, 상기 방법이수폰지를 트롬빈 제형으로 포화시키는 단계; 그리고체강 표면에 스폰지를 적용하는 단계로 이루어지는, 안정화된 트롬빈 제형의 투여방법.
- 키트에 있어서, 상기 키트가제 57항의 안정화된 트롬빈 제형;트롬빈 제형을 함유할 수 있는 바이알; 및주사바늘을 포함하는 키트.
- 키트에 있어서, 상기 키트가제 57항의 안정화된 트롬빈 제형;트롬빈 제형을 분무할 수 있는 장치를 포함하는 키트.
- 제 65항에 있어서, 상기 장치가 분무 팁 또는 분무 펌프인 것을 특징으로 하는 키트.
- 안정화된 액체 트롬빈 제형에 있어서, 상기 제형이트롬빈;글리세롤;폴리에틸렌 글리콜;염화나트륨;아세트산 나트륨을 포함하고, 상기 제형의 pH가 6 내지 8인 안정화된 액체 트롬빈 제형.
- 제 69항에 있어서, 상기 제형이 2년까지 그것의 초기 효능의 최소한 60%를 유지하는 것을 특징으로 하는 안정화된 액체 트롬빈 제형.
- 제 69항에 있어서, 상기 제형이 2년까지 그것의 초기 효능의 최소한 70%를 유지하는 것을 특징으로 하는 안정화된 액체 트롬빈 제형.
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