CN109055321A - 一种轮状病毒的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种轮状病毒的培养方法，涉及病毒培养技术领域。该培养方法包括：细胞培养步骤：在一次性固定床反应器中，接种细胞，进行细胞培养；接种吸附步骤：待细胞培养密度达到2.0×104～3.0×105个/cm2时，往所述一次性固定床反应器中接种含轮状病毒的病毒稀释液，进行吸附；以及病毒培养步骤。采用该培养方法可以提升病毒的收率，降低细胞染菌风险。

Description

一种轮状病毒的培养方法
技术领域
本发明涉及病毒培养技术领域，具体而言，涉及一种轮状病毒的培养方法。
背景技术
轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪－口途径，临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重出现脱水症状。
轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。它是婴儿与幼儿腹泻的单一主因，几乎世界上每个大约五岁的小孩都曾感染过轮状病毒至少一次。然而，每一次感染后人体免疫力会逐渐增强，后续感染的影响就会减轻，因而成人就很少受到其影响。轮状病毒总共有八种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F、G与H。其中，A种是最为常见的一种，而人类轮状病毒感染超过90％的案例也都是该种造成的。
目前，尚无治疗轮状病毒感染的特效药物，常规治疗效果不佳，因此仍以疫苗预防为主。而轮状病毒培养的收率高低是疫苗研制的关键因素之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种轮状病毒的培养方法，采用该培养方法进行轮状病毒的培养，可以降低细胞染菌风险、提高病毒收率。
本发明是这样实现的：
一种轮状病毒的培养方法，其包括：
细胞培养步骤：在一次性固定床反应器中，接种细胞，进行细胞培养；
接种吸附步骤：待细胞培养密度达到2.0×104～3.0×105个/cm2时，往所述一次性固定床反应器中接种含轮状病毒的病毒稀释液；
病毒培养步骤：接种吸附后补加病毒维持液进行病毒培养。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述接种吸附步骤中：待细胞培养密度达到(2.0～3.0)×105个/cm2时，往所述一次性固定床反应器中接种含轮状病毒的病毒稀释液。
更进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述接种吸附步骤中：待细胞培养密度达到2.6×105个/cm2时，往所述一次性固定床反应器中接种含轮状病毒的病毒稀释液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在细胞培养步骤中，细胞培养的条件为：温度30-40℃、溶氧30％-70％、转速0.2-4.0cm/s、pH 6.4～7.8。
更进一步地，在本发明的一些实施方案中，在细胞培养步骤中，细胞培养的条件为：温度36-38℃、溶氧48％-52％、转速0.8-1.2cm/s、pH7.2-7.4。在本发明的一些实施方案中，在所述接种吸附步骤中，吸附条件：吸附0.5-2.5h，转速0.1-3.0cm/s。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述接种吸附步骤中，吸附条件：吸附0.8-1.2h，转速0.7-0.9cm/s。
更进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述接种吸附步骤中，吸附1h，转速为0.8cm/s。
在本发明的一些实施方案中，在病毒培养步骤中，病毒培养的条件为：温度30-40℃、溶氧30％-70％、转速0.2-4.0cm/s、pH6.4～7.8。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在病毒培养步骤中，病毒培养的条件为：温度36-38℃、溶氧48％-52％、转速0.8-1.2cm/s、pH7.2-7.4。
更进一步地，在本发明的一些实施方案中，在病毒培养步骤中，病毒培养的条件为：温度37℃、溶氧50％、转速1cm/s。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述病毒稀释液由稀释液和含轮状病毒的毒种液混合而成。
优选的，所述毒种液的MOI值为0.01～5；
进一步的，作为本发明一些实施例，所述毒种液的MOI值为0.18-0.22；
在本发明的一些实施方案中，所述毒种液的MOI值为0.08。
优选的，所述稀释液按如下方法配制而成：
每750ml MEM溶液对应加入30ml 7.0％的NaHCO3溶液和0.1ml～10ml 0.1％的胰蛋白酶。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述稀释液按如下方法配制而成：每750ml MEM溶液对应加入30ml 7.0％的NaHCO3溶液和0.8m～1.5ml 0.1％的胰蛋白酶。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述维持液按如下方法配制而成：每4000ml MEM溶液中对应加入120ml 7.0％的NaHCO3溶液、0.5ml～50ml 0.1％胰蛋白酶和40ml SPG病毒保护剂。
更进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述维持液按如下方法配制而成：每4000ml MEM溶液中对应加入120ml 7.0％的NaHCO3溶液、4ml 0.1％胰蛋白酶和40ml SPG病毒保护剂。
本发明中，SPG病毒保护剂含有的成分为：1％谷氨酸钠(质量体积比：g：ml)+65％蔗糖(质量体积比：g：ml)+PBS。
NaHCO3溶液的作用在于调节MEM溶液pH至6.4～7.8，其用量体积通常为MEM溶液体积的1.5％-3.0％的范围内。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，NaHCO3溶液的作用在于调节MEM溶液pH至7.2-7.4。
在本发明的一些实施方案中，在病毒培养步骤中，在接种病毒第48-50小时，在转速为2.0-8.0cm/s的条件下循环0.5-3.0h。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在病毒培养步骤中，在接种病毒第48-50小时，在转速为3.8-4.2cm/s的条件下循环0.9-1.1h。
优选的，在本发明的一些实施方案中，在病毒培养步骤中，在接种病毒后第48-50小时，在转速为4cm/s的条件下循环1h。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在细胞培养步骤中，所用的细胞为FRhL-2细胞。
优选的，在本发明的一些实施方案中，所述的FRhL-2细胞为P40代的FRhL-2细胞。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在接种吸附步骤中，所接种的病毒为轮状病毒G3。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的轮状病毒的培养方法，在一次性固定床反应器中进行细胞培养、接毒、病毒培养等步骤，可以提升病毒的收率，降低细胞染菌风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中细胞悬液接入固定床反应器后细胞培养过程情况；
图2为本发明实施例中接种病毒后病毒维持培养过程情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
下述实施例中，SPG(病毒保护剂)的成分为：1％谷氨酸钠+65％蔗糖+PBS
实施例1
本实施例中，Cassettle即固定床反应器，购自PALL公司，型号为iCELLis nano。
本实施例提供的轮状病毒的培养方法，其包括如下步骤：
1.细胞培养
1.1cassettle准备，校准电极，管道清洗灭菌：900ml反应罐，分别用pH为4.01和7.00的校准液校准pH电极，灭菌条件为121℃，60分钟；按仪器说明，组装线路与管路。装培养基(90％MEM+10％FBS，用浓度为7.0％的NaHCO3调节pH 7.2-7.4)空转2d。分别在空转第1d取样Y1和空转第2d取样Y2，进行无菌检测，结果见表1。
1.2细胞准备，收集细胞：将培养至P40代的FRhL-2细胞用0.25％胰酶处理后收集，共850ml细胞悬液，后续备用。
1.3将步骤1.2收集的细胞悬液上样入cassettle，细胞培养参数设置为pH 7.0，温度37.0℃，溶氧(Do)50％，开培养基循环(此时记为第0h)后转速控制为1.0cm/s；换液时停止转动。开启循坏后第4h取样Y3，进行无菌检测，结果见表1。
1.4培养24h后，取部分细胞培养液样品用显微镜观察细胞是否染菌，结果见图1，并排尽液体，并用Earle’s液清洗3次，排尽Earle’s液，上新的培养基(90％MEM+10％FBS，用7.0％NaHCO3调节pH 7.2-7.4)，开循环，在第23h取样Y4，进行无菌检测，结果见表1，此时细胞密度为：2×10^4个/cm2；在第48h取样Y5，进行无菌检测，结果见表1，此时细胞密度为：7×10^4个/cm2。
图1中：A为细胞培养液的镜检结果，B为细胞载体片上细胞染色后的镜检结果，C为细胞培养液的肉眼观察结果。
图1A，图1C反映了细胞培养上清情况，图1C可见上清清澈未有染菌迹象；图1A可见无菌体，并且上清中细胞十分稀少，绝大部分已经贴附到载体片上，图1B中染成紫色部分即细胞，可大体反映出细胞量及贴壁状况。
1.5在第72h，取样Y6，进行无菌检测，结果见表1，此时细胞密度为：1.35×10^5个/cm2。
1.7在第90h，取样Y7，进行无菌检测，结果见表1，此时细胞密度为：2.6×10^5个/cm2。
表1在细胞培养阶段各取样样品的无菌检查结果
从表1中可以看出，在整个细胞培养阶段，细胞培养液中未感染杂菌。
2.接种吸附
2.1病毒稀释液准备：用1.5ml 0.1％胰蛋白酶激活80ml轮状病毒G3毒种液(恒河猴轮状病毒(G3)，由美国国立卫生院提供)，然后取激活后的76ml G3毒种液与800ml稀释液混合，制得病毒稀释液。毒种液的MOI值为0.08。
其中，所用稀释液由如下成分混合配制而成：每750ml MEM溶液对应加入30ml7.0％NaHCO3溶液和1.5ml 0.1％胰蛋白酶。
2.2待细胞培养密度达到2.6×10^5个/cm2时，往一次性固定床反应器中接种含轮状病毒的病毒稀释液(880ml左右)，以0.8cm/s的转速吸附1h，此后将转速设置为1cm/s，其他培养参数设置为：pH 7.0，温度37.0℃，溶氧(Do)50％。
3维持培养
接种病毒吸附1小时后，往与一次性固定床反应器连接的循环罐中加入5L维持液，开动循环泵。
反应器转速设置为1cm/s，循环48h，维持培养阶段的其他参数设置为：温度37℃、溶氧50％、pH7.2-7.4；
维持液由如下成分混合配制而成：每4000ml MEM溶液中加入120ml 7.0％NaHCO3溶液、8ml 0.1％胰蛋白酶和40ml SPG。
NaHCO3的作用在于调节溶液pH至7.2-7.4，其用量体积一般为培养基总体积的1.5％-3.0％的范围内。
接种病毒培养24h后，取病毒维持液用显微镜观察是否染菌，结果见图2。图2中：A是接毒后24h病毒维持培养液显微镜下观察结果，可见些许病毒裂解细胞产生的细胞碎片；B为接毒40h载体片染色后的显微镜观察结果，可见依然有少许细胞贴附于载体片上；C是接毒48h载体片染色后的显微镜观察结果，可见只有极少细胞仍贴附于载体片上。此三个过程均未见染菌迹象。
4病毒收获
维持培养结束后，即接种病毒后培养至第50小时，收获循环罐及Cassettle里的病毒液至无菌容器。按V:V＝1：10，将SPG添加至收获液中，充分混匀，取样送检及冻存。
5裂解细胞后收获
将600ml裂解液加入Cassettle，4cm/s转速循环20分钟，使裂解液充分接触载体片，并利用较高的转速冲击载体片上残留的细胞，充分裂解细胞并释放病毒。
所用裂解液含有：0.5mol/L NaCl、10mmol/L Tris以及1％蔗糖，pH7.5。
裂解结束后，将cassettle中的细胞裂解液全部收集。按V:V＝1：10，将SPG添加至细胞裂解液中，充分混匀，取样送检(送样编号B1)及冻存。
在病毒培养至病毒收获阶段不同时间点取样检测，结果见表2。
表2取样表
样品编号C1为对比例1收获的病毒收获液。
对比例1
采用T225细胞培养瓶进行细胞培养及接毒等过程，所用试剂、培养温度及接毒过程等步骤与实施例1相同。
结果显示，收获的病毒液(对应于表2中的样品编号C1)滴度为1×106.7PFU/ml。
根据表1数据可以看出，本发明实施例1在接毒培养后的第18-50h病毒滴度值大于对比例1，固定床反应器的单位面积病毒产量是T225细胞培养瓶的3倍。说明本发明实施例提供的轮状病毒的方法能够提高病毒收率。固定床反应器相对于传统的T瓶以及细胞工厂培养可以实时监控培养体系的参数，如溶氧、pH等。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种轮状病毒的培养方法，其特征在于，其包括：
细胞培养步骤：在一次性固定床反应器中，接种细胞，进行细胞培养；
接种吸附步骤：待细胞培养密度达到2.0×104～3.0×105个/cm2时，往所述一次性固定床反应器中接种含轮状病毒的病毒稀释液；
病毒培养步骤：接种吸附后，加入病毒维持液进行病毒培养。
2.根据权利要求1所述的轮状病毒的培养方法，其特征在于，在细胞培养步骤中，细胞培养的条件为：温度30-40℃、溶氧30％-70％、转速0.2-4.0cm/s、pH6.4～7.8。
3.根据权利要求1所述的轮状病毒的培养方法，其特征在于，
在所述接种吸附步骤中，吸附条件：吸附0.5-2.5h，转速0.1-3.0cm/s。
4.根据权利要求1所述的轮状病毒的培养方法，其特征在于，在病毒培养步骤中，病毒培养的条件为：温度30-40℃、溶氧30％-70％、转速0.2-4.0cm/s、pH 6.4～7.8。
5.根据权利要求1所述的轮状病毒的培养方法，其特征在于，所述病毒稀释液由稀释液和含轮状病毒的毒种液混合而成；
优选的，所述毒种液的MOI值为0.01～5；进一步优选地，所述毒种液的MOI值为0.18-0.22；
优选的，所述稀释液按如下方法配制而成：每750ml MEM溶液对应加入30ml 7.0％的NaHCO3溶液和0.1ml～10ml 0.1％的胰蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的轮状病毒的培养方法，其特征在于，所述维持液按如下方法配制而成：
每4000ml MEM溶液中对应加入120ml 7.0％的NaHCO3溶液、0.5ml～50ml 0.1％胰蛋白酶和40ml SPG病毒保护剂；SPG病毒保护剂含有的成分为：1％谷氨酸钠+65％蔗糖+PBS。
7.根据权利要求6所述的轮状病毒的培养方法，其特征在于，在病毒培养步骤中，在接种病毒第48-50小时，在转速为2.0-8.0cm/s的条件下循环0.5-3.0h。
8.根据权利要求7所述的轮状病毒的培养方法，其特征在于，在病毒培养步骤中，在接种病毒后第48-50小时，在转速为4cm/s的条件下循环1h。
9.根据权利要求1-8任一项所述的轮状病毒的培养方法，其特征在于，在细胞培养步骤中，所用的细胞为FRhL-2细胞。
10.根据权利要求1-8任一项所述的轮状病毒的培养方法，其特征在于，在接种吸附步骤中，所接种的病毒为轮状病毒G3。
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