JP6903092B2 - 組換え産生ポリペプチドの精製 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年5月15日出願の先行米国仮特許出願第61/823,520号明細書(その全体が参照により組み込まれる)に基づく利益を主張する。
本出願には、2014年5月13日に作成された8,521バイトのサイズを有するテキストファイルPURIF300WO1_SLとして本出願と共に提出された配列リストが参照により組み込まれる。
プロテインA精製時に遭遇した一般的な問題は、不純物、たとえば、宿主細胞タンパク質(HCP)、DNA、および他の細胞培養由来の不純物が、カラム樹脂および対象のタンパク質に非特異的に結合することである。たとえば、多量の宿主細胞タンパク質、たとえば、最大で約500ng/mg、600ng/mg、700ng/mg、800ng/mg、900ng/mg、1000ng/mg、1500ng/mg、2000ng/mg、またはそれを超えるHCPを有する、プロテインAカラムからの溶出液が観測されてきた。HCPの存在が問題でありうるのは、組換え抗体産物中の汚染物質の許容レベルに関する保健規則があるからだけでなく、たとえば、プロテアーゼ活性、および目に見える微粒子、フラグメント、または凝集体の経時的形成を含めて、HCPの存在が産物の安定性および/または有効性に悪影響を及ぼしうるからである。
とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる科学技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。さらに、とくに文脈上必要とされないかぎり、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般的には、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションとの関連で用いられる命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野で通常用いられる周知のものである。アミノ酸は、本明細書では、その一般に知られる三文字記号またはIUPAC−IUB生化学命名委員会(IUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commission)により推奨される一文字記号のいずれかにより称されうる。ヌクレオチドも同様に、その一般に受け入れられている一文字コードにより称されうる。
一実施形態では、組換えポリペプチドは、1種以上の対象のポリペプチドを発現可能なベクターを用いて安定的または一過的のいずれかでトランスフェクトされた宿主細胞を用いて産生される。本明細書で用いられる場合、「ベクター」という用語は、対象の核酸を細胞内に配達するために使用可能な物質組成物を意味する。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物に関連付けられたポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含めて、多くのベクターが知られているが、これらに限定されるものではない。「ベクター」という用語は、自律複製するプラスミド、または自律複製しないウイルスもしくはベクターもしくはプラスミドを含みうる。「トランスフェクション」という用語は、遺伝子改変細胞を産生するように外因性遺伝物質を細胞内に導入することを意味する。ベクターは、当技術分野で公知の方法を用いて宿主細胞内に導入可能である。たとえば、ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段により宿主細胞内に移入可能である。ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(正荷電リポソーム媒介トランスフェクションを含む)、粒子照射、マイクロインジェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターを宿主細胞内に導入するための生物学的方法としては、たとえば、ウイルスベクターを含めて、DNAおよびRNAベクターの使用が挙げられ、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、たとえば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含めて、脂質ベースの系が挙げられる。宿主細胞は、組換えポリペプチド、たとえば、商業的または科学的な関心の対象となるポリペプチドを発現するように、遺伝子工学操作が可能である。
細胞培養物から組換え産生ポリペプチド(本明細書では「標的ポリペプチド」または「標的」とも呼ばれる)を回収する際の第1の工程は、他の残留不純物と共に組換え産生ポリペプチドを含有する清澄化細胞培養上清を得るために、培養培地から無傷宿主細胞および宿主細胞デブリを除去することである(「採取」と呼ばれる)。採取は、一般的には、遠心分離、凝集/沈殿、深層濾過、および無菌濾過により達成されるが、他の方法を使用することも可能である。
一実施形態では、精製組換え産生ポリペプチドは、液状製剤で調製される。より特定的な実施形態では、液状製剤中の組換え産生ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントである。一実施形態では、液状製剤は水などの水性担体を含む。一実施形態では、液状製剤は無菌である。他の実施形態では、液状製剤は、均一である。他の実施形態では、製剤は等張性である。一実施形態では、液状製剤は、少なくとも約1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml、または300mg/mlの精製組換え産生ポリペプチドを含む。一実施形態では、製剤は、少なくとも約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、または6.5、かつ最大で約6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.5、8.0、8.5、または9.0のpHを有する。製剤はまた、緩衝剤、糖、塩、界面活性剤、可溶化剤、希釈剤、結合剤、安定化剤、親油性溶媒、アミノ酸、キレート化剤、保存剤、またはそれらの組合せをはじめとする通常の賦形剤および/または添加剤を含みうるが、これらに限定されるものではない。
宿主細胞タンパク質(HCP)濃度の残留レベルを決定する方法は、公知であり、たとえば、一次抗体が、組換えポリペプチドを生成するために使用された特定の宿主細胞、たとえば、CHO細胞およびE.コリ(E.coli)細胞から産生されるHCPに特異的である、免疫アッセイ、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などを用いて、残留HCPレベルを検出することを含む。一次抗体は、当業者に公知の従来の方法に従って産生されうる。たとえば、一次抗体は、抗体産生に使用された宿主細胞の細胞溶解物に対して生成されうる。HCP免疫アッセイプラットフォームの1つは、Gyros(Warren,NJ)から市販されている。
EnzChek(登録商標)プロテアーゼアッセイキット(E6638、Molecular Probes,Eugene,OR)を用いて、サンプルのプロテアーゼ活性を評価することが可能である。単一のpHまたは複数のpHでサンプルを読み取って、プロテアーゼ活性対pHのプロファイルを作成することが可能である。異なるプロテアーゼは、異なる活性対pHプロファイルを有するので、異なるpHレベルで測定すれば、サンプル中の多種多様なタイプのプロテアーゼを検出する能力が向上する。
ヒトIL−18に特異的に結合するヒトIgG1モノクローナル抗体(NCIMB受託番号41786)の標準的精製プロセスでは、多量のHCP(すなわち、630ng/mg)が観測され、プロテインA精製でも他のプロセス工程でも排除されなかった。HCPレベルを低減する能力に関して、追加の洗浄液工程を評価した。特定的には、HCPクリアランス、回収率、および産物に及ぼす洗浄pH、洗浄塩化ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、およびそれらの組合せの影響を調べた。実験は、16の実験ランと標準的洗浄緩衝液を用いた追加のラン(実験17)とを含んでいた。実験洗浄液の組成は、表1に示される。表1の実験洗浄緩衝液はすべて、100mMトリス中に作製され、pHは、濃HClを用いて調整された。プロテインAクロマトグラフィー緩衝液は、表2に示されるように調製された。ランはすべて、20cmの床高さおよび3.93mLのカラム体積を有するMabSelect SuReカラム(C11−032 TRICORN、GE Healthcare)を用いて行われ、かつ表3に概説されるプロセスに従ってAKTA AVANTシステム(GE Healthcare)を用いて350cm/時(1.17mL/分)で一晩行われた。
この実験の目的は、ヒトインターロイキン−6(IL−6)に特異的に結合する第2のモノクローナル抗体を対象として、HCP除去に及ぼす3つの因子(pH、塩化ナトリウム、およびカプリル酸ナトリウム)およびそれらの組合せの有効性を、プロテインA洗浄緩衝液に組み込まれる場合について、評価することであった。手順は、実施例1に対して以上に記載したものと同一であった。結果は表9に示される。
この実験の目的は、実施例1で使用したモノクローナル抗体[抗IL−18抗体]を対象として、HCP除去に及ぼすプロテインA洗浄緩衝液の成分としてのカプリル酸ナトリウム以外の脂肪酸の有効性を評価することであった。実施例1で抗IL−18抗体に対して決定された最適条件である9.0の洗浄pHおよび2.5Mの塩化ナトリウムを用いて、実験を行った。すべての実験洗浄緩衝液を100mMトリス中に作製し、9.0の最終pHが達成されるようにHClまたはトリスを用いてpH調整した。溶解性に基づいて、緩衝液のいくつかは、2.5M塩化ナトリウムを含んでいたが、他のものは、2.5M塩化ナトリウムを用いずに作製された(表16参照)。実施例1に記載されるように、プロテインAクロマトグラフィー緩衝液を調製し、手順は、実施例1に記載のものと同一であった。表15は、不飽和脂肪酸のリストを提供し、表16は、実験洗浄緩衝液に関する詳細を提供する。
この実験の目的は、抗IL−18抗体(NCIMB受託番号41786)を対象としてプロテインAクロマトグラフィー時に宿主細胞タンパク質(HCP)を除去するためのカプリル酸塩洗浄緩衝液の有効性を試験することであった。2.5M塩化ナトリウムを含有する100mMトリス緩衝液、pH9.0中、50mMの濃度で、カプリル酸の2つの形態、すなわち、カプリル酸ナトリウムおよびカプリル酸を試験した。MabSelect SurReマトリックス(GE Healthcare)を用いて、20cmの床高さおよび3.98mLのカラム体積を有するTricorn 0.5mmカラムにより、350cm/時の線流速で、4つのクロマトグラフィーランを行った。使用前、カラムを2カラム体積の0.5M水酸化ナトリウムで殺菌し、続いて、15分間保持した。プロセス緩衝液およびカラム体積は、表20に示される。使用後、カラムを2カラム体積の0.5M水酸化ナトリウムで殺菌し、続いて、15分間保持した。溶出液ピーク捕集では、ODは、100mAUで開始し、100mAUで終了した(0.5OD)。すべての画分をタンパク質濃度に関してA280でアッセイし、実施例1に記載のGyros HCPアッセイを用いてHCPを定量した。
この実験の目的は、抗IL6抗体を対象として遅延発生粒子形成を研究することであった。遅延発生粒子形成は、5℃で6ヶ月後、50mg/mLの抗IL6抗体を含有する製剤で観測された。生物汚染度は、0cfu/mLであったことから、細菌汚染は示唆されない。粒子の質量スペクトル分析から、粒子は、抗IL6抗体および上昇レベルのフラグメントを含有することが判明した。重元素は、SEMにより検出されなかった。HCPは、2D SDS PAGEにより検出されなかった(図24)。
この実施例では、抗IL6精製プロセスのいくつかの工程で、宿主細胞タンパク質(HCP)およびプロテアーゼ活性の高スループット診断の検査および同定を行った。細胞培養培地からのサンプル、次いで、標準的プロセスおよびカプリル酸塩プロセスの両方でプロテインAインプロセス生成物のサンプル、ならびに標準的洗浄およびカプリル酸塩洗浄の両方でプロテインA工程からの洗浄画分のサンプル、を分析した。
本発明の様々な態様を以下に示す。
1.宿主細胞タンパク質(HCP)から組換え産生ポリペプチドを分離する方法であって、
前記HCPと前記組換え産生ポリペプチドとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインAクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約6炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインAクロマトグラフィーカラムを洗浄してHCPを除去することと、
前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、
を含む、方法。
2.宿主細胞タンパク質(HCP)から組換え産生ポリペプチドを分離する方法であって、 プロテインAクロマトグラフィーカラムを平衡化緩衝液で平衡化することと、
前記プロテインAクロマトグラフィーカラム上に清澄化細胞培養上清を充填することと、
充填された前記プロテインAクロマトグラフィーカラムを前記平衡化緩衝液で再平衡化することと、
充填された前記プロテインAクロマトグラフィーカラムを、少なくとも約6炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む第1の洗浄緩衝液で洗浄して、HCPを除去することと
充填された前記プロテインAクロマトグラフィーカラムを第2の洗浄緩衝液で洗浄することと、
前記組換え産生ポリペプチドを溶出緩衝液で溶出させることと、
を含む、方法。
3.組換え産生ポリペプチドを含む製剤中のプロテアーゼ汚染を低減する方法であって、 HCPと前記組換え産生ポリペプチドとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、 前記清澄化細胞培養上清をプロテインAクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約6炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインAクロマトグラフィーカラムを洗浄してHCPを除去することと、
前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、
前記製剤を調製することと、
を含む、方法。
4.組換え産生ポリペプチドの安定性を向上させる方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドと1種以上の宿主細胞タンパク質(HCP)とを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインAクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約6炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインAクロマトグラフィーカラムを洗浄してHCPを除去することと、
前記組換え産生ポリペプチドを回収することと、
回収された前記組換え産生ポリペプチドを含む製剤を調製することと、
を含む、方法。
5.組換え産生ポリペプチドを含む組成物中の宿主細胞タンパク質レベルを低減する方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドと1種以上の宿主細胞タンパク質(HCP)とを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインAクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約6炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインAクロマトグラフィーカラムを洗浄してHCPを除去することと、
を含む、方法。
6.前記HCPが1種以上のプロテアーゼを含む、上記5に記載の方法。
7.前記HCPが、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、およびそれらの組合せから選択される1種以上のプロテアーゼを含む、上記5に記載の方法。
8.前記HCPがカテプシンDを含む、上記5に記載の方法。
9.組換え産生ポリペプチドを含む組成物中のカテプシンDを低減する方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドとカテプシンDとを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインAクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
少なくとも約6炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはその脂肪酸塩を含む洗浄緩衝液で前記プロテインAクロマトグラフィーカラムを洗浄してカテプシンDを除去することと、を含む、方法。
10.前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が6〜12炭素原子である、上記1〜9のいずれかに記載の方法。
11.前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が8〜12炭素原子である、上記1〜9のいずれかに記載の方法。
12.前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が8〜10炭素原子である、上記1〜9のいずれかに記載の方法。
13.前記脂肪酸または脂肪酸塩が、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、およびそれらの組合せから選択される、上記1〜10のいずれかに記載の方法。
14.前記洗浄緩衝液がカプリル酸またはカプリル酸塩を含む、上記13に記載の方法。15.前記洗浄緩衝液が約25mM〜約200mMの脂肪酸を含む、上記1〜14のいずれかに記載の方法。
16.前記洗浄緩衝液が約50mM〜約100mMの脂肪酸を含む、上記1〜15のいずれかに記載の方法。
17.前記洗浄緩衝液が塩化ナトリウムを含む、上記1〜16のいずれかに記載の方法。18.前記洗浄緩衝液が約1.0M〜約2.5Mの濃度で前記塩化ナトリウムを含む、上記17に記載の方法。
19.前記洗浄緩衝液が約2M〜約2.5Mの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記17に記載の方法。
20.前記洗浄緩衝液が約2.5Mの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記17に記載の方法。
21.前記洗浄緩衝液が約7〜約9のpHを有する、上記1〜20のいずれかに記載の方法。
22.前記洗浄緩衝液が約8〜約9のpHを有する、上記1〜21のいずれかに記載の方法。
23.前記洗浄緩衝液が約8.5〜約9のpHを有する、上記1〜22のいずれかに記載の方法。
24.前記洗浄緩衝液が約9のpHを有する、上記1〜23のいずれかに記載の方法。
25.前記洗浄緩衝液が約8〜約9のpHで約50mM〜約100mMのカプリル酸ナトリウムを含む、上記1〜24のいずれかに記載の方法。
26.前記洗浄緩衝液が、約8〜約9のpHで約50mM〜約100mMのカプリル酸ナトリウムと約2.0M〜約2.5Mの塩化ナトリウムとを含む、上記1〜25のいずれかに記載の方法。
27.前記洗浄緩衝液が、約9.0のpHで100mMのトリス中に約100mMのカプリル酸ナトリウムを含む、上記1〜26のいずれかに記載の方法。
28.前記洗浄緩衝液が、約9.0のpHで100mMのトリス中に約100mMのカプリル酸ナトリウムと約2.5Mの塩化ナトリウムとを含む、上記1〜27のいずれかに記載の方法。
29.前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、上記1〜28のいずれかに記載の方法。
30.前記抗体が抗IL−18抗体または抗IL6抗体またはそれらのフラグメントである、上記29に記載の方法。
31.細胞培養採取物を清澄化して清澄化細胞培養採取物を取得し、前記清澄化細胞培養採取物を前記プロテインAクロマトグラフィーカラムに充填する工程を含む、上記1〜30のいずれかに記載の方法。
32.前記カラムを前記洗浄緩衝液で洗浄する前に、充填された前記プロテインAカラムを平衡化緩衝液で平衡化することをさらに含む、上記1〜31のいずれかに記載の方法。33.前記平衡化緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、上記32に記載の方法。
34.前記平衡化緩衝液が約10mM〜約100mMのリン酸ナトリウムを含む、上記33に記載の方法。
35.前記平衡化緩衝液が約6〜約8のpHで約20mM〜約50mMのリン酸ナトリウムを含む、上記34に記載の方法。
36.前記平衡化緩衝液が約7のpHで約20mMのリン酸ナトリウムを含む、上記35に記載の方法。
37.前記カラムを前記脂肪酸洗浄緩衝液で洗浄した後、第2の洗浄工程をさらに含む、上記1および3〜9のいずれかに記載の方法。
38.前記第2の洗浄緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、上記37に記載の方法。
39.前記第2の洗浄緩衝液が約10mM〜約100mMのリン酸ナトリウムを含む、上記38に記載の方法。
40.前記第2の洗浄緩衝液が約6〜約8のpHで約20mM〜約50mMのリン酸ナトリウムを含む、上記38に記載の方法。
41.前記第2の洗浄緩衝液が約7のpHで約20mMのリン酸ナトリウムを含む、上記37に記載の方法。
42.前記組換えタンパク質を回収することが、前記組換えタンパク質を前記プロテインAカラムから溶出緩衝液で溶出させることを含む、上記1〜41のいずれかに記載の方法。
43.前記溶出緩衝液がクエン酸ナトリウムを含む、上記42に記載の方法。
44.前記溶出緩衝液が約25mM〜約200mMのクエン酸ナトリウムを含む、上記43に記載の方法。
45.前記溶出緩衝液が約50mM〜約100mMのクエン酸ナトリウムを含む、上記43に記載の方法。
46.前記溶出緩衝液が約2.0〜約5.0のpHを有する、上記42に記載の方法。
47.前記溶出緩衝液が約3.0〜約4.0のpHを有する、上記46に記載の方法。
48.前記溶出緩衝液が約3.5のpHで約100mMのクエン酸ナトリウムを含む、上記42に記載の方法。
49.上記1〜48のいずれかに記載の方法により精製された組換え産生ポリペプチド。50.前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントを含む、上記49に記載の組換え産生ポリペプチド。
51.前記組換え産生ポリペプチドが抗IL−18抗体または抗IL6抗体である、上記49に記載の組換え産生ポリペプチド。
52.プロテインAクロマトグラフィーカラムで宿主細胞タンパク質(HCP)から組換え産生ポリペプチドを分離するための洗浄緩衝液であって、少なくとも6炭素原子の鎖長を有する脂肪酸または脂肪酸塩を含む、洗浄緩衝液。
53.前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が6〜12炭素原子である、上記52に記載の洗浄緩衝液。
54.前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が8〜12炭素原子である、上記52に記載の洗浄緩衝液。
55.前記脂肪酸または脂肪酸塩の鎖長が8〜10炭素原子である、上記52に記載の洗浄緩衝液。
56.前記脂肪酸または脂肪酸塩が、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、およびそれらの組合せから選択される、上記52または53に記載の洗浄緩衝液。
57.前記洗浄緩衝液がカプリル酸またはカプリル酸塩を含む、上記56に記載の洗浄緩衝液。
58.前記洗浄緩衝液が約25mM〜約200mMの脂肪酸を含む、上記52〜57のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
59.前記洗浄緩衝液が約50mM〜約100mMの脂肪酸を含む、上記52〜58のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
60.前記洗浄緩衝液が塩化ナトリウムを含む、上記52〜59のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
61.前記洗浄緩衝液が約1.0M〜約2.5Mの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記60に記載の洗浄緩衝液。
62.前記洗浄緩衝液が約2M〜約2.5Mの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記61に記載の洗浄緩衝液。
63.前記洗浄緩衝液が約2.5Mの濃度で塩化ナトリウムを含む、上記62に記載の洗浄緩衝液。
64.前記洗浄緩衝液が約7〜約9のpHを有する、上記52〜63のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
65.前記洗浄緩衝液が約8〜約9のpHを有する、上記52〜64のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
66.前記洗浄緩衝液が約8.5〜約9のpHを有する、上記52〜65のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
67.前記洗浄緩衝液が約9のpHを有する、上記52〜66のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
68.前記洗浄緩衝液が約8〜約9のpHで約50mM〜約100mMのカプリル酸ナトリウムを含む、上記52〜67のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
69.前記洗浄緩衝液が、約8〜約9のpHで約50mM〜約100mMのカプリル酸ナトリウムと約2.0M〜約2.5Mの塩化ナトリウムとを含む、上記52〜68のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
70.前記洗浄緩衝液が約9.0のpHで100mMのトリス中に約100mMのカプリル酸ナトリウムを含む、上記52〜69のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
71.前記洗浄緩衝液が、約9.0のpHで100mMのトリス中に約100mMのカプリル酸ナトリウムと約2.5Mの塩化ナトリウムとを含む、上記52〜70のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
72.前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、上記52〜71のいずれかに記載の洗浄緩衝液。
Claims (36)
- 組換え産生ポリペプチドを含む組成物中の宿主細胞タンパク質レベルを低減する方法であって、
前記組換え産生ポリペプチドと1種以上の宿主細胞タンパク質(HCP)とを含む清澄化細胞培養上清を提供することと、
前記清澄化細胞培養上清をプロテインAクロマトグラフィーカラム上に充填することと、
8〜9のpHで50mM〜100mMのカプリル酸ナトリウムを含む洗浄緩衝液で前記プロテインAクロマトグラフィーカラムを洗浄してHCPを除去することと、
を含み、前記洗浄緩衝液が2.0M〜2.5Mの濃度で塩化ナトリウムをさらに含む、方法。 - 前記HCPが1種以上のプロテアーゼを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記HCPが、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、およびそれらの組合せから選択される1種以上のプロテアーゼを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記HCPがカテプシンDを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記洗浄緩衝液が8.5〜9のpHを有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄緩衝液が9のpHを有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄緩衝液が、9.0のpHで100mMのトリス中に100mMのカプリル酸ナトリウムを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄緩衝液が、9.0のpHで100mMのトリス中に100mMのカプリル酸ナトリウムと2.5Mの塩化ナトリウムとを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が抗IL−18抗体または抗IL6抗体またはそれらのフラグメントである、請求項9に記載の方法。
- 細胞培養採取物を清澄化して清澄化細胞培養採取物を取得し、前記清澄化細胞培養採取物を前記プロテインAクロマトグラフィーカラムに充填する工程を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カラムを前記洗浄緩衝液で洗浄する前に、充填された前記プロテインAカラムを平衡化緩衝液で平衡化することをさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記平衡化緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記平衡化緩衝液が10mM〜100mMのリン酸ナトリウムを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記平衡化緩衝液が6〜8のpHで20mM〜50mMのリン酸ナトリウムを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記平衡化緩衝液が7のpHで20mMのリン酸ナトリウムを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記カラムを前記洗浄緩衝液で洗浄した後、第2の洗浄工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の洗浄緩衝液がリン酸ナトリウムを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の洗浄緩衝液が10mM〜100mMのリン酸ナトリウムを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記第2の洗浄緩衝液が6〜8のpHで20mM〜50mMのリン酸ナトリウムを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記第2の洗浄緩衝液が7のpHで20mMのリン酸ナトリウムを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質を回収することが、前記組換えタンパク質を前記プロテインAカラムから溶出緩衝液で溶出させることを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液がクエン酸ナトリウムを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液が25mM〜200mMのクエン酸ナトリウムを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液が50mM〜100mMのクエン酸ナトリウムを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液が2.0〜5.0のpHを有する、請求項22に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液が3.0〜4.0のpHを有する、請求項26に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液が3.5のpHで100mMのクエン酸ナトリウムを含む、請求項22に記載の方法。
- プロテインAクロマトグラフィーカラムで宿主細胞タンパク質(HCP)から組換え産生ポリペプチドを分離するための洗浄緩衝液であって、8〜9のpHで50mM〜100mMのカプリル酸ナトリウム、及び2.0M〜2.5Mの塩化ナトリウムを含む、洗浄緩衝液。
- 前記洗浄緩衝液が2.5Mの濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項29に記載の洗浄緩衝液。
- 前記洗浄緩衝液が8.5〜9のpHを有する、請求項29または30に記載の洗浄緩衝液。
- 前記洗浄緩衝液が9のpHを有する、請求項29〜31のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
- 前記洗浄緩衝液が、8〜9のpHで50mM〜100mMのカプリル酸ナトリウムと2.0M〜2.5Mの塩化ナトリウムとを含む、請求項29〜32のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
- 前記洗浄緩衝液が9.0のpHで100mMのトリス中に100mMのカプリル酸ナトリウムを含む、請求項29〜33のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
- 前記洗浄緩衝液が、9.0のpHで100mMのトリス中に100mMのカプリル酸ナトリウム2.5Mの塩化ナトリウムとを含む、請求項29〜34のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
- 前記組換え産生ポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである、請求項29〜35のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液。
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