JP2021521873A - 改変された宿主細胞タンパク質プロファイルを有する操作された細胞 - Google Patents
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Abstract
特定の宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように遺伝子操作された哺乳動物細胞株、および低レベルの残留宿主細胞タンパク質汚染を有する組換えタンパク質の生産のための操作された哺乳動物細胞株を使用する方法。
Description
本開示は、生物的生産システムにおいて使用するための哺乳動物細胞株であって、従来生産されていた組換え治療用タンパク質を汚染する宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように操作されている、哺乳動物細胞株に関する。
組換えタンパク質生産の間、宿主細胞は、細胞成長、増殖、生存、遺伝子転写、タンパク質合成などの正常な細胞機能に関連する内因性タンパク質を同時生産する。また、内因性宿主細胞タンパク質は、細胞死/アポトーシス/溶解の結果として、細胞培養培地中に放出され得る。組換えタンパク質生産中に同時発現する内因性タンパク質はすべて、宿主細胞タンパク質(HCP)と呼ばれている。HCPは、モノクローナル抗体などの組換え治療用タンパク質中に存在する、プロセス関連不純物の大部分を構成している。これらのHCP不純物は、免疫原性の原因となるだけでなく、治療用タンパク質の有効性や安定性にも大きな影響を与える可能性がある。さらに、治療用タンパク質と同時精製するHCPは、除去することが困難であり、その結果、下流プロセスでの処理が著しくなり、生産コストが増加する可能性がある。例えば、モノクローナル抗体の製造コストの約80%は、下流の精製プロセスに起因すると推定されている。さらに、規制上の要件を満たすために、製造業者は、最終製品中の宿主細胞タンパク質のクリアランスが1から100ppmの範囲内のレベルであることを実証しなければならない。
したがって、治療用タンパク質生産中に特定のHCPを低減または排除するための手段が必要である。例えば、豊富に存在し、下流のプロセス中に除去することが困難であり、および/または製品の品質に影響を与えるHCPの発現を低減または排除するように操作された宿主細胞株が必要である。そのような細胞株は、生物治療剤の生産を単純化し、コストを削減するであろう。
本開示の様々な態様の中で、生物的生産システムにおいて使用するための哺乳動物細胞株が提供され、哺乳動物細胞株は、カルボキシペプチダーゼB1、カルボキシペプチダーゼD、カルボキシペプチダーゼE、カルボキシペプチダーゼM、カテプシンB、カテプシンD、カテプシンL1、カテプシンZ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4、クラスタリン、ジペプチジルペプチダーゼ3、レグマイン、ロイシンアミノペプチダーゼ3、リポタンパク質リパーゼ、リシルオキシダーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤1、中性α−グルコシダーゼ、ナイドジェン1、ペルオキシダシン(peroxidasin)、ホスホリパーゼB様2、プロリルエンドペプチダーゼ、タンパク質アルギニンN−メチルトランスフェラーゼ5、タンパク質ホスファターゼ1G、セリンプロテアーゼ、シアリダーゼ1、チオレドキシン、またはチオレドキシンレダクターゼから選択される、1つまたは複数の宿主細胞タンパク質の発現を低減または排除するように操作される。一般に、1つまたは複数のタンパク質の発現は、タンパク質をコードする染色体配列の少なくとも1つの対立遺伝子の不活性化を介して低減する。染色体配列は、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム改変、例えば、CRISPRリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体またはジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて不活化され得る。
本開示の別の態様は、宿主細胞タンパク質汚染のレベルが低減した組換えタンパク質産物を生産するためのプロセスを包含する。本プロセスは、本明細書で開示された哺乳動物細胞株のいずれかにおいて組換えタンパク質を発現させること、組換えタンパク質を精製して組換えタンパク質産物を形成することであって、組換えタンパク質産物は、操作されていない親哺乳動物細胞株によって生産されるタンパク質産物中のレベルよりも低い残留宿主細胞タンパク質汚染のレベルを有する、形成することを含む。
本開示の他の態様および反復は、以下にさらに詳細に記載される。
本開示は、前記細胞株によって生産される組換えタンパク質が、汚染宿主細胞タンパク質の非常に低いレベルを有するように、特定の宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように操作された哺乳動物細胞株を提供する。前記操作された細胞株を生産するための方法、ならびに前記操作された細胞株を使用して、低レベルの残留宿主細胞タンパク質を有する組換えタンパク質を生産する方法が提供される。
(I)操作された細胞株
本開示の一態様は、1つまたは複数の宿主細胞タンパク質(HCP)の発現が低減または排除されるように操作された哺乳動物細胞株を包含する。したがって、本明細書に開示された操作された細胞株によって生産された組換えタンパク質は、操作されていない親細胞(すなわち、前記HCPの発現が変化していない親細胞)によって生産される組換えタンパク質と比較して、1つまたは複数のHCPのレベルが低減される。
本開示の一態様は、1つまたは複数の宿主細胞タンパク質(HCP)の発現が低減または排除されるように操作された哺乳動物細胞株を包含する。したがって、本明細書に開示された操作された細胞株によって生産された組換えタンパク質は、操作されていない親細胞(すなわち、前記HCPの発現が変化していない親細胞)によって生産される組換えタンパク質と比較して、1つまたは複数のHCPのレベルが低減される。
(a)標的HCP
本明細書に開示された操作された細胞株は、1つまたは複数のHCPの発現が低減または排除される。実施例1において以下に詳述するように、いくつかの宿主細胞株において、HCPのサブセットが同定されている。これらのHCPは、非常に豊富であり、下流の精製プロセス中に除去することが困難であり、および/または製品の品質に影響を与える(例えば、残留プロテアーゼは、生物治療剤製品を劣化させ、それによってその有効性を低下させる可能性がある)。これらの特徴を持つHCPは、「問題のある」HCPと呼ばれている。
本明細書に開示された操作された細胞株は、1つまたは複数のHCPの発現が低減または排除される。実施例1において以下に詳述するように、いくつかの宿主細胞株において、HCPのサブセットが同定されている。これらのHCPは、非常に豊富であり、下流の精製プロセス中に除去することが困難であり、および/または製品の品質に影響を与える(例えば、残留プロテアーゼは、生物治療剤製品を劣化させ、それによってその有効性を低下させる可能性がある)。これらの特徴を持つHCPは、「問題のある」HCPと呼ばれている。
表Aは、操作された組換え細胞株において発現が低減または排除され得る標的HCPを列挙している。一般に、標的HCPは、細胞の生存および/または細胞機能に必須ではないタンパク質である
一部の実施形態では、操作された細胞株は、表Aに記載された1つのタンパク質の発現が低減または排除される。他の実施形態では、操作された細胞株は、表Aに記載された2つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらなる実施形態では、操作された細胞株は、表Aに記載された3つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらに他の実施形態では、操作された細胞株は、表Aに記載された4つのタンパク質の発現が低減または排除される。追加の実施形態では、操作された細胞株は、表Aに記載された5つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらなる実施形態では、操作された細胞株は、表Aに記載された6つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらに他の実施形態では、操作された細胞株は、表Aに記載された7つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらなる実施形態では、操作された細胞株は、表Aに記載された8つのタンパク質の発現が低減または排除される。追加の実施形態では、操作された細胞株は、表Aに記載された8またはそれ以上のタンパク質の発現が低減または排除される。
一実施形態では、操作された細胞株は、カテプシンB、カテプシンD、カテプシンL1、および/またはカテプシンZの発現が低減または排除される。別の実施形態では、操作された細胞株は、ホスホリパーゼB様2および/またはリポタンパク質リパーゼの発現が低減または排除される。さらなる実施形態では、操作された細胞株は、カテプシンB、カテプシンD、カテプシンL1、カテプシンZ、カルボキシペプチダーゼD、カルボキシペプチダーゼM、カルボキシペプチダーゼB1、カルボキシペプチダーゼE、ホスホリパーゼB様2、リポタンパク質リパーゼ、ペルオキシダシン、セリンプロテアーゼ、中性α−グルコシダーゼ、リシルオキシダーゼ、および/またはジペプチジルペプチダーゼ3の発現が低減または排除される。
他の実施形態では、操作された細胞株は、カルボキシペプチダーゼD、カテプシンD、クラスタリン、リポタンパク質リパーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤1、ナイドジェン、ペルオキシダシン、ホスホリパーゼB様2、セリンプロテアーゼ、チオレドキシンおよび/またはチオレドキシンレダクターゼの1つまたは複数の発現が低減または排除される。
本明細書に開示された、目的の1つまたは複数のHCPの発現が低減または排除された細胞株は、目的のHCPをコードする染色体配列を改変するように遺伝学的に操作される。目的の染色体配列は、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集技術を用いて改変することができ、これはセクション(III)で以下に詳述する。例えば、染色体配列は、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組合せを含むように改変することができ、そのため読み枠がシフトされ、タンパク質産物が生産されない(すなわち、染色体配列が不活性化される)。目的のHCPをコードする染色体配列の一方の対立遺伝子の不活性化は、目的のHCPの発現の低減(すなわち、ノックダウン)をもたらす。目的のHCPをコードする染色体配列の両方の対立遺伝子を不活性化すると、目的のHCPの発現がなくなる(すなわち、ノックアウト)。
一部の実施形態では、目的のHCPのレベルは、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または約99%より多く低減され得る。他の実施形態では、目的のHCPのレベルは、当該分野で標準的な技術(例えば、ウェスタン免疫ブロッティングアッセイ、ELISA酵素アッセイ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動など)を使用して、非検出可能なレベルに低減され得る。
一般に、本明細書に開示された操作された細胞株の細胞生存率、生細胞密度、力価、成長率、増殖応答、細胞形態、アポトーシスおよびオートファジーレベル、および/または一般的な細胞の健康状態は、操作されていない親細胞株のものと類似している。
(b)細胞タイプ
本明細書に開示された操作された細胞株は、哺乳動物細胞株である。一部の実施形態では、操作された細胞株は、ヒト細胞株に由来する可能性がある。好適なヒト細胞株の非限定的な例としては、ヒト胎児腎臓細胞(HEK293、HEK293T)、ヒト結合組織細胞(HT−1080)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)、ヒト胎児網膜細胞(PER.C6)、ヒト腎臓細胞(HKB−11)、ヒト肝臓細胞(Huh−7)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(HepG2)、ヒトU2−OS骨肉腫細胞、ヒトA549肺細胞、ヒトA−431表皮細胞、またはヒトK562骨髄細胞が挙げられる。他の実施形態では、操作された細胞株は、非ヒト細胞株に由来する可能性がある。好適な細胞株としては、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、マウス骨髄腫NS0細胞、マウス骨髄腫Sp2/0細胞、マウス乳腺C127細胞、マウス胎児線維芽3T3細胞(NIH3T3)、マウスBリンパ腫A20細胞、マウス黒色腫B16細胞、マウス筋芽細胞C2C12細胞、マウス胎児間葉系C3H−10T1/2細胞、マウス癌CT26細胞、マウス前立腺DuCuP細胞、マウス乳房EMT6細胞、マウス肝細胞癌Hepa1c1c7細胞、マウス骨髄腫J5582細胞、マウス上皮MTD−1A細胞、マウス心筋MyEnd細胞、マウス腎RenCa細胞、マウス膵臓RIN−5F細胞、マウス黒色腫X64細胞、マウスリンパ腫YAC−1細胞、ラット膠芽腫9L細胞、ラットBリンパ腫RBL細胞、ラット神経芽細胞腫B35細胞、ラット肝細胞癌細胞(HTC)、水牛ラット肝臓BRL 3A細胞、イヌ腎臓細胞(MDCK)、イヌ乳腺(CMT)細胞、ラット骨肉腫D17細胞、ラット単球/マクロファージDH82細胞、サル腎臓SV−40形質転換線維芽(COS7)細胞、サル腎臓CVI−76細胞、またはアフリカミドリザル腎臓(VERO、VERO−76)細胞が挙げられる。哺乳動物細胞株の広範なリストは、American Type Culture Collectionカタログ(ATCC、Manassas、VA)に見出される場合がある。一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞株は、マウス細胞株以外のものである。特定の実施形態では、操作された細胞株は、CHO細胞株である。好適なCHO細胞株は、CHO−K1、CHO−K1SV、CHO GS−/−、CHO S、DG44、DuxxB11、およびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
本明細書に開示された操作された細胞株は、哺乳動物細胞株である。一部の実施形態では、操作された細胞株は、ヒト細胞株に由来する可能性がある。好適なヒト細胞株の非限定的な例としては、ヒト胎児腎臓細胞(HEK293、HEK293T)、ヒト結合組織細胞(HT−1080)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)、ヒト胎児網膜細胞(PER.C6)、ヒト腎臓細胞(HKB−11)、ヒト肝臓細胞(Huh−7)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(HepG2)、ヒトU2−OS骨肉腫細胞、ヒトA549肺細胞、ヒトA−431表皮細胞、またはヒトK562骨髄細胞が挙げられる。他の実施形態では、操作された細胞株は、非ヒト細胞株に由来する可能性がある。好適な細胞株としては、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、マウス骨髄腫NS0細胞、マウス骨髄腫Sp2/0細胞、マウス乳腺C127細胞、マウス胎児線維芽3T3細胞(NIH3T3)、マウスBリンパ腫A20細胞、マウス黒色腫B16細胞、マウス筋芽細胞C2C12細胞、マウス胎児間葉系C3H−10T1/2細胞、マウス癌CT26細胞、マウス前立腺DuCuP細胞、マウス乳房EMT6細胞、マウス肝細胞癌Hepa1c1c7細胞、マウス骨髄腫J5582細胞、マウス上皮MTD−1A細胞、マウス心筋MyEnd細胞、マウス腎RenCa細胞、マウス膵臓RIN−5F細胞、マウス黒色腫X64細胞、マウスリンパ腫YAC−1細胞、ラット膠芽腫9L細胞、ラットBリンパ腫RBL細胞、ラット神経芽細胞腫B35細胞、ラット肝細胞癌細胞(HTC)、水牛ラット肝臓BRL 3A細胞、イヌ腎臓細胞(MDCK)、イヌ乳腺(CMT)細胞、ラット骨肉腫D17細胞、ラット単球/マクロファージDH82細胞、サル腎臓SV−40形質転換線維芽(COS7)細胞、サル腎臓CVI−76細胞、またはアフリカミドリザル腎臓(VERO、VERO−76)細胞が挙げられる。哺乳動物細胞株の広範なリストは、American Type Culture Collectionカタログ(ATCC、Manassas、VA)に見出される場合がある。一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞株は、マウス細胞株以外のものである。特定の実施形態では、操作された細胞株は、CHO細胞株である。好適なCHO細胞株は、CHO−K1、CHO−K1SV、CHO GS−/−、CHO S、DG44、DuxxB11、およびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
様々な実施形態では、親細胞株は、グルタミンシンターゼ(GS)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、またはそれらの組合せを欠損させることができる。例えば、GS、DHFR、および/またはHPRTをコードする染色体配列を不活性化することができる。特定の実施形態では、GS、DHFR、および/またはHPRTをコードする染色体配列はすべて、親細胞株において不活性化される。
(c)組換えタンパク質をコードする任意の核酸
一部の実施形態では、本明細書に開示された操作された細胞株は、組換えタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸をさらに含むことができる。一般に、組換えタンパク質は異種であり、これは、タンパク質が細胞に対してネイティブではないことを意味する。組換えタンパク質は、限定されないが、抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、IgG分子、IgG重鎖、IgG軽鎖、IgA分子、IgD分子、IgE分子、IgM分子、ワクチン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝固(または凝血)因子、血液成分、酵素、治療用タンパク質、栄養補助タンパク質、前記のいずれかの機能性断片または機能性変異体、または前記のいずれかのタンパク質および/またはその機能性断片または変異体を含む融合タンパク質から選択される治療用タンパク質であってもよい。
一部の実施形態では、本明細書に開示された操作された細胞株は、組換えタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸をさらに含むことができる。一般に、組換えタンパク質は異種であり、これは、タンパク質が細胞に対してネイティブではないことを意味する。組換えタンパク質は、限定されないが、抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、IgG分子、IgG重鎖、IgG軽鎖、IgA分子、IgD分子、IgE分子、IgM分子、ワクチン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝固(または凝血)因子、血液成分、酵素、治療用タンパク質、栄養補助タンパク質、前記のいずれかの機能性断片または機能性変異体、または前記のいずれかのタンパク質および/またはその機能性断片または変異体を含む融合タンパク質から選択される治療用タンパク質であってもよい。
一部の実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸は、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、および/またはグルタミンシンターゼ(GS)をコードする配列に連結することができ、そのようなHPRT、DHFR、および/またはGSを、増幅可能な選択マーカーとして使用してもよい。組換えタンパク質をコードする核酸はまた、少なくとも1つの抗生物質耐性遺伝子をコードする配列および/または蛍光タンパク質などのマーカータンパク質をコードする配列に連結することができる。一部の実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸は、発現コンストラクトの一部であり得る。発現コンストラクトまたはベクターは、追加の発現制御配列(例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終止配列など)、選択マーカー配列、複製開始点などを含むことができる。追加情報は、「Current Protocols in Molecular Biology」 Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003、または「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」 Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001に見出すことができる。
一部の実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸は、染色体外に位置することができる。すなわち、組換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、または別の染色体外コンストラクトから一時的に発現させることができる。他の実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムの染色体に組み込むことができる。組み込みは、ランダムであっても、標的化されていてもよい。その結果、組換えタンパク質は、安定に発現させることができる。本実施形態の一部の反復において、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、適切な異種発現制御配列(すなわち、プロモーター)に作動可能に連結することができる。他の反復では、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、内因性の発現制御配列の制御下に置くことができる。組換えタンパク質をコードする核酸配列は、相同組換え、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集、ウイルスベクター、トランスポゾン、プラスミド、および他の公知の手段を用いて、細胞株のゲノムに組み込むことができる。追加の手引きは、Ausubel et al. 2003、上記、およびSambrook & Russell, 2001、上記、に見出すことができる。
(II)キット
本開示のさらなる態様は、組換えタンパク質の生産のためのキットを提供し、キットは、上記のセクション(I)において詳述したいずれかの操作された細胞株を含む。キットはさらに、細胞増殖培地、トランスフェクション試薬、選択培地、組換えタンパク質精製手段、緩衝剤などを含むことができる。本明細書で提供されるキットは、一般に、細胞株を成長させ、組換えタンパク質を生産するためにそれらを使用するための使用説明書を含む。キットに含まれる使用説明書は、包装材料に貼付されていてもよいし、添付文書として含まれていてもよい。使用説明書は、一般的には文書または印刷された材料であるが、これらに限定されるものではない。そのような使用説明書を保存し、エンドユーザに伝達することが可能な任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体には、電子保存媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD−ROM)などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「使用説明書」という用語は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
本開示のさらなる態様は、組換えタンパク質の生産のためのキットを提供し、キットは、上記のセクション(I)において詳述したいずれかの操作された細胞株を含む。キットはさらに、細胞増殖培地、トランスフェクション試薬、選択培地、組換えタンパク質精製手段、緩衝剤などを含むことができる。本明細書で提供されるキットは、一般に、細胞株を成長させ、組換えタンパク質を生産するためにそれらを使用するための使用説明書を含む。キットに含まれる使用説明書は、包装材料に貼付されていてもよいし、添付文書として含まれていてもよい。使用説明書は、一般的には文書または印刷された材料であるが、これらに限定されるものではない。そのような使用説明書を保存し、エンドユーザに伝達することが可能な任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体には、電子保存媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD−ROM)などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「使用説明書」という用語は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
(III)操作された細胞株の調製方法
本開示のさらに別の態様は、1つまたは複数のHCPの発現が低減または排除された細胞株を調製または操作するための方法を提供し、上記のセクション(I)において詳述されている。目的のHCPをコードする染色体配列は、様々な技術を用いてノックダウンまたはノックアウトされ得る。一般的に、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム改変プロセスを用いて、操作された細胞株が調製される。当業者は、前記操作された細胞株もまた、部位特異的組換えシステム、ランダム突然変異誘発、または当技術分野で公知の他の方法を用いて調製可能であることを理解している。
本開示のさらに別の態様は、1つまたは複数のHCPの発現が低減または排除された細胞株を調製または操作するための方法を提供し、上記のセクション(I)において詳述されている。目的のHCPをコードする染色体配列は、様々な技術を用いてノックダウンまたはノックアウトされ得る。一般的に、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム改変プロセスを用いて、操作された細胞株が調製される。当業者は、前記操作された細胞株もまた、部位特異的組換えシステム、ランダム突然変異誘発、または当技術分野で公知の他の方法を用いて調製可能であることを理解している。
一般に、操作された細胞株は、目的の親細胞株に少なくとも1つの標的エンドヌクレアーゼまたは前記標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入すること含む方法によって調製され、標的エンドヌクレアーゼは目的のHCPをコードする染色体配列を標的とする。標的エンドヌクレアーゼは、特定の染色体配列を認識して結合し、二本鎖切断を導入する。一部の実施形態では、二本鎖切断は、非相同末端結合(NHEJ)修復プロセスによって修復される。NHEJは変異性であるので、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、挿入、および/または置換が起こる場合があり、それにより、タンパク質産物が生産されないような染色体配列の読み枠フレームが破壊される。他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼはまた、標的化された染色体配列の一部と実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチドを同時導入することにより、相同組換え反応を介して染色体配列を変更するために使用することができる。そのような状況では、標的エンドヌクレアーゼによって導入された二本鎖切断は、染色体配列が変化または変更される方法でポリヌクレオチドと交換されるような相同性指向の修復プロセスによって修復される(例えば、外因性配列の組み込みによって)。
(a)標的エンドヌクレアーゼ
様々な標的エンドヌクレアーゼを使用して、目的のHCPをコードする染色体配列を改変することができる。標的エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質または操作されたタンパク質であり得る。好適な標的エンドヌクレアーゼには、限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPRヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター(TALE)ヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、キメラヌクレアーゼ、部位特異的エンドヌクレアーゼ、および人工標的化DNA二本鎖切断誘導剤が含まれる。
様々な標的エンドヌクレアーゼを使用して、目的のHCPをコードする染色体配列を改変することができる。標的エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質または操作されたタンパク質であり得る。好適な標的エンドヌクレアーゼには、限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPRヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター(TALE)ヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、キメラヌクレアーゼ、部位特異的エンドヌクレアーゼ、および人工標的化DNA二本鎖切断誘導剤が含まれる。
(i)ジンクフィンガーヌクレアーゼ
特定の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)であり得る。ZFNは、特定の標的配列に結合し、標的切断部位に二本鎖切断を導入する。一般的に、ZFNは、DNA結合ドメイン(すなわち、ジンクフィンガー)および切断ドメイン(すなわち、ヌクレアーゼ)を含み、それぞれは以下に記載される。
特定の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)であり得る。ZFNは、特定の標的配列に結合し、標的切断部位に二本鎖切断を導入する。一般的に、ZFNは、DNA結合ドメイン(すなわち、ジンクフィンガー)および切断ドメイン(すなわち、ヌクレアーゼ)を含み、それぞれは以下に記載される。
DNA結合ドメイン。DNA結合ドメインまたはジンクフィンガーは、選択された任意の核酸配列を認識して結合するように操作され得る。例えば、Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135−141、Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313−340、Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656−660、Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632−637、Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411−416、Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850−33860、Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702−708、およびSantiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809−5814を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有していてもよい。工学的方法には、これらに限定されないが、合理的設計および様々なタイプの選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、ダブレット、トリプレット、および/またはクアドラプレットヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーのアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各ダブレット、トリプレット、またはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列を結合するジンクフィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と関連している。例えば、米国特許第6,453,242号および第6,534,261号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例として、米国特許第6,453,242号に記載のアルゴリズムを使用して、予め選択された配列を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる。非縮重(nondegenerate)認識コードテーブルを用いた合理的設計などの代替的な方法もまた、特定の配列を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを設計するために使用することができる(Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074−7081)。ジンクフィンガー結合ドメインの設計と同様に、DNA配列中の潜在的な標的部位を同定するための一般に入手可能なウェブベースのツールは、当技術分野で公知である。例えば、DNA配列中の潜在的な標的部位を同定するためのツールは、zincfingertools.orgに見い出される。ジンクフィンガー結合ドメインを設計するためのツールは、zifit.partners.org/ZiFiTに見出すことができる。(Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res. 34:W516−W523、Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599−W605も参照されたい。)
ジンクフィンガー結合ドメインは、長さが約3ヌクレオチドから約21ヌクレオチドまでの範囲のDNA配列を認識して結合するように設計することができる。一実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、長さが約9から約18ヌクレオチドまでの範囲のDNA配列を認識して結合するように設計することができる。一般に、本明細書で使用されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも3つのジンクフィンガー認識領域またはジンクフィンガーを含み、各ジンクフィンガーは3つのヌクレオチドを結合する。一実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、4つのジンクフィンガー認識領域を含む。別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、5つのジンクフィンガー認識領域を含む。さらに別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、6つのジンクフィンガー認識領域を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の好適な標的DNA配列に結合するように設計することができる。例えば、米国特許第6,607,882号、米国特許第6,534,261号および米国特許第6,453,242号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ジンクフィンガー認識領域を選択する例となる方法には、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムが含まれ、このことは米国特許第5,789,538号、米国特許第5,925,523号、米国特許第6,007,988号、米国特許第6,013,453号、米国特許第6,410,248号、米国特許第6,140,466号、米国特許第6,200,759号、および米国特許第6,242,568号、ならびにWO98/37186、WO98/53057、WO00/27878、WO01/88197およびGB2,338,237に記載され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、WO02/077227に記載されており、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ジンクフィンガー結合ドメインおよび融合タンパク質(およびそれをコードするポリヌクレオチド)の設計および構築のための方法は、当業者公知であり、例えば、米国特許第7,888,121号に詳細に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ジンクフィンガー認識領域および/またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが5個またはそれを超えるアミノ酸のリンカーを含む、好適なリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。長さ6個またはそれを超えるアミノ酸のリンカー配列の非限定的な例については、米国特許第6,479,626号、米国特許第6,903,185号、および米国特許第7,153,949号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの組合せを含んでもよい。
切断ドメイン。ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、切断ドメインを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、これらに限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、New England BiolabsカタログまたはBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379−3388を参照されたい。DNAを切断する追加の酵素が知られている(例えば、S1ヌクレアーゼ、緑豆ヌクレアーゼ、膵臓DNaseI、小球菌ヌクレアーゼ、酵母HOエンドヌクレアーゼ)。Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照されたい。これらの酵素(またはその機能性断片)のうちの1つまたは複数を、切断ドメインの供給源として使用することができる。
切断ドメインはまた、上述のように、切断活性のために二量体形成を必要とする酵素またはその一部に由来するものでもよい。各ヌクレアーゼが活性酵素二量体の単量体を含むため、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼが切断に必要とされ得る。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性酵素二量体を生成するために両方の単量体を含むことができる。本明細書で使用される場合、「活性酵素二量体」とは、核酸分子を切断することができる酵素二量体である。2つの切断単量体は、同じエンドヌクレアーゼ(またはその機能性断片)に由来するものでもよく、または各単量体は、異なるエンドヌクレアーゼ(またはその機能性断片)に由来するものでもよい。
2つの切断単量体を使用して活性酵素二量体を形成する場合、2つのジンクフィンガーのそれぞれの認識部位への結合が、切断単量体を互いに空間的に配向するように配置し、このことが例えば二量体化することによって、切断単量体が活性酵素二量体を形成することを可能にするように、2つのジンクフィンガーの認識部位は、好ましくは、配置される。その結果、認識部位の端近傍は、約5から約18ヌクレオチドで分離することができる。例えば、端近傍は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18ヌクレオチドによって分離することができる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、2つの認識部位の間に介在し得る(例えば、約2から約50ヌクレオチド対またはそれを超える)ことが理解されるであろう。例えば、本明細書に詳細に記載されるようなジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の端近傍は、6ヌクレオチドによって分離することができる。一般に、切断部位は、認識部位の間にある。
制限エンドヌクレアーゼ(制限酵素)は多くの種に存在し、(認識部位での)DNAへの配列特異的な結合、および結合部位またはその近傍でのDNAの切断が可能である。ある種の制限酵素(例えば、タイプIIS)は、認識部位から離れた部位でDNAを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、タイプIIS酵素FokIは、一方の鎖上の認識部位から9ヌクレオチド、および他方の鎖上の認識部位から13ヌクレオチドの位置で、DNAの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第5,356,802号、米国特許第5,436,150号、および米国特許第5,487,994号、ならびにLi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275−4279、Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764−2768、Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883−887、Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31978−31982を参照されたい。したがって、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも1つのタイプIIS制限酵素からの切断ドメインと、1つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含むことができるが、これらのドメインは、操作されていても、操作されていなくてもよい。例となるタイプIIS制限酵素は、例えば国際公開WO07/014,275に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。追加の制限酵素もまた、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含み、これらもまた、本開示によって企図される。例えば、Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418−420を参照されたい。
切断ドメインが結合ドメインから分離可能なタイプIIS制限酵素の例として、FokIが挙げられる。この特定の酵素は、二量体として活性である(Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570−10,575)。その結果、本開示の目的のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼで使用されるFokI酵素の部分は、切断単量体であると考えられる。したがって、FokI切断ドメインを使用した標的化二本鎖切断のために、FokI切断単量体を含む2つのジンクフィンガーヌクレアーゼをそれぞれ使用して、活性酵素二量体を再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインと2つのFokI切断単量体を含む単一のポリペプチド分子を使用することもできる。
特定の実施形態では、切断ドメインは、ホモ二量体化を最小化するかまたは防止する1つまたは複数の操作された切断単量体を含む。非限定的な例として、FokIの位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、および538のアミノ酸残基は、FokI切断ハーフドメインの二量化に影響を与えるためのすべての標的である。絶対ヘテロ二量体を形成するFokIの例となる操作された切断単量体は、第1の切断単量体がFokIのアミノ酸残基位置490および538における突然変異を含む対と、第2の切断単量体がアミノ酸残基位置486および499における突然変異を含む対とを含む。
したがって、操作された切断単量体の一実施形態では、アミノ酸位置490における突然変異は、Glu(E)をLys(K)に置換し、アミノ酸残基538における突然変異は、Iso(I)をLys(K)に置換し、アミノ酸残基486における突然変異は、Gln(Q)をGlu(E)に置換し、および位置499における突然変異は、Iso(I)をLys(K)に置換する。具体的には、ある切断単量体において、位置490でEからKへ、および位置538でIからKへ突然変異させて「E490K:I538K」と指定された操作された切断単量体を生成することにより、および別の切断単量体において、位置486でQからEへ、および位置499でIからKへ突然変異させて「Q486E:I499K」と指定された操作された切断単量体を生成することにより、操作された切断単量体を調製することができる。上記の操作された切断単量体は、異常切断が最小化されるかまたは廃止される絶対ヘテロ二量体突然変異体である。操作された切断単量体は、好適な方法、例えば、米国特許第7,888,121号に記載され、その全体が本明細書に組み込まれる、野生型切断単量体(FokI)の部位特異的変異誘発により調製することができる。
追加のドメイン。一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも1つの核局在化配列(NLS)をさらに含む。NLSは、染色体中の標的配列に二本鎖切断を導入するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核内に標的化することを容易にするアミノ酸配列である。核局在化シグナルは、当技術分野で公知である(例えば、Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101−5105を参照されたい)。核局在化シグナルの非限定的な例としては、PKKKRKV(配列番号1)、PKKKRRV(配列番号2)、KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号3)、YGRKKRRQRRR(配列番号4)、RKKRRQRRR(配列番号5)、PAAKRVKLD(配列番号6)、RQRRNELKRSP(配列番号7)、VSRKRPRP(配列番号8)、PPKKARED(配列番号9)、PQPKKKPL(配列番号10)、SALIKKKKKMAP(配列番号11)、PKQKKRK(配列番号12)、RKLKKKIKKL(配列番号13)、REKKKFLKRR(配列番号14)、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号15)、RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号16)、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号17)、およびRMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号18)が挙げられる。NLSは、N末端、C末端、またはジンクフィンガーヌクレアーゼの内部位置に位置し得る。
さらなる実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、少なくとも1つの細胞貫通ドメインを含むことができる。好適な細胞貫通ドメインの例としては、限定されないが、GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV(配列番号19)、PLSSIFSRIGDPPKKKRKV(配列番号20)、GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV(配列番号21)、GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV(配列番号22)、KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(配列番号23)、YARAAARQARA(配列番号24)、THRLPRRRRRR(配列番号25)、GGRRARRRRRR(配列番号26)、RRQRRTSKLMKR(配列番号27)、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(配列番号28)、KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(配列番号29)、およびRQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号30)が挙げられる。細胞貫通ドメインは、N末端、C末端、またはジンクフィンガーヌクレアーゼの内部位置に位置し得る。
さらに他の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも1つのマーカードメインをさらに含むことができる。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、およびエピトープタグが挙げられる。一実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であり得る。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質(例えば、GFP、GFP−2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色蛍光タンパク質(例えば、YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、青色蛍光タンパク質(例えば、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T−sapphire)、シアン蛍光タンパク質(例えばECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi−Cyan)、赤色蛍光タンパク質(例えば、mKate、mKate2、mPlum、DsRed単量体、mCherry、mRFP1、DsRed−Express、DsRed2、DsRed−Monomer、HcRed−Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)、およびオレンジ蛍光タンパク質(mOrange、mKO、Kusabira−Orange、Monomeric Kusabira−Orange、mTangerine、tdTomato)、または任意の他の好適な蛍光タンパク質、が挙げられる。別の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび/またはエピトープタグであり得る。好適なタグとしては、これらに限定されないがポリ(His)タグ、FLAG(またはDDK)タグ、Haloタグ、AcV5タグ、AU1タグ、AU5タグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、キチン結合ドメイン(CBD)、Eタグ、E2タグ、ECSタグ、eXactタグ、Glu−Gluタグ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、HAタグ、HSVタグ、KT3タグ、マルトース結合タンパク質(MBP)、MAPタグ、Mycタグ、NEタグ、NusAタグ、PDZタグ、Sタグ、S1タグ、SBPタグ、Softag 1タグ、Softag 3タグ、Spotタグ、Strepタグ、SUMOタグ、T7タグ、タンデムアフィニティー精製(TAP)タグ、チオレドキシン(TRX)、V5タグ、VSV−Gタグ、およびXaタグ、が挙げられる。マーカードメインは、N末端、C末端、またはジンクフィンガーヌクレアーゼの内部位置に位置することができる。
少なくとも1つの核局在化シグナル、少なくとも1つの細胞貫通ドメイン、および/または少なくとも1つのマーカードメインは、1つまたは複数の化学結合(例えば、共有結合)を介してジンクフィンガーヌクレアーゼに直接連結することができる。あるいは、少なくとも1つの核局在シグナル、少なくとも1つの細胞貫通ドメイン、および/または少なくとも1つのマーカードメインは、1つまたは複数のリンカーを介して、ジンクフィンガーヌクレアーゼに間接的に連結することができる。好適なリンカーは、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子(例えば、マレイミド誘導体、N−エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル−3,4’,5−トリカルボン酸、p−アミノベンジルオキシカルボニルなど)、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー(例えば、PEG)を含む。リンカーは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニルなどを含むがこれらに限定されない、1つまたは複数のスペーシング基を含むことができる。リンカーは、中性であってもよく、正または負の電荷を担持していてもよい。さらに、リンカーは、リンカーを別の化学基に連結するリンカーの共有結合が、pH、温度、塩濃度、光、触媒、または酵素を含む特定の条件下で破断または切断されるように、切断可能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーは、可動性アミノ酸リンカーまたは剛性アミノ酸リンカーであり得る。好適なリンカーの追加の例は、当技術分野で周知であり、リンカーを設計するためのプログラムは、容易に入手可能である(Crasto et al., Protein Eng., 2000, 13(5):309−312)。
(ii)CRISPRリボヌクレオタンパク質(RNP)
他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat(CRISPR)ヌクレアーゼであり得る。CRISPRヌクレアーゼは、細菌または古細菌のCRISPR/CRISPR関連(Cas)システムに由来するRNAガイドヌクレアーゼである。CRISPR RNPシステムは、CRISPRヌクレアーゼおよびガイドRNAを含む。
他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat(CRISPR)ヌクレアーゼであり得る。CRISPRヌクレアーゼは、細菌または古細菌のCRISPR/CRISPR関連(Cas)システムに由来するRNAガイドヌクレアーゼである。CRISPR RNPシステムは、CRISPRヌクレアーゼおよびガイドRNAを含む。
ヌクレアーゼ。CRISPRヌクレアーゼは、タイプI(すなわち、IA、IB、IC、ID、IE、またはIF)、タイプII(すなわち、IIA、IIB、またはIIC)、タイプIII(すなわち、IIIAまたはIIIB)、タイプV、またはタイプVIのCRISPRシステムに由来するものでもよく、様々な細菌および古細菌に存在する。例えば、CRISPRヌクレアーゼは、Streptococcus sp.(例えば、S.pyogenes、S.thermophilus、S.pasteurianus)、Campylobacter sp.(例えば、Campylobacter jejuni)、Francisella sp.(例えば、Francisella novicida)、Acaryochloris sp.、Acetohalobium sp.、Acidaminococcus sp.、Acidithiobacillus sp.、Alicyclobacillus sp.、Allochromatium sp.、Ammonifex sp.、Anabaena sp.、Arthrospira sp.、Bacillus sp.、Burkholderiales sp.、Caldicelulosiruptor sp.、Candidatus sp.、Clostridium sp.、Crocosphaera sp.、Cyanothece sp.、Exiguobacterium sp.、Finegoldia sp.、Ktedonobacter sp.、Lachnospiraceae sp.、Lactobacillus sp.、Lyngbya sp.、Marinobacter sp.、Methanohalobium sp.、Microscilla sp.、Microcoleus sp.、Microcystis sp.、Natranaerobius sp.、Neisseria sp.、Nitrosococcus sp.、Nocardiopsis sp.、Nodularia sp.、Nostoc sp.、Oscillatoria sp.、Polaromonas sp.、Pelotomaculum sp.、Pseudoalteromonas sp.、Petrotoga sp.、Prevotella sp.、Staphylococcus sp.、Streptomyces sp.、Streptosporangium sp.、Synechococcus sp.、Thermosipho sp.、またはVerrucomicrobia sp.に由来するものでもよい。他の実施形態では、CRISPRヌクレアーゼは、古細菌CRISPRシステム、CRISPR/CasXシステム、またはCRISPR/CasYシステムに由来すものでもよい(Burstein et al., Nature, 2017, 542(7640):237−241)。
一部の実施形態では、CRISPRヌクレアーゼは、タイプII CRISPRヌクレアーゼに由来するものでもよい。例えば、タイプII CRISPRヌクレアーゼは、Cas9タンパク質であり得る。好適なCas9ヌクレアーゼには、Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)、Francisella novicida Cas9(FnCas9)、Staphylococcus aureus(SaCas9)、Streptococcus thermophilus Cas9(StCas9)、Streptococcus pasteurianus(SpaCas9)、Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9)、Neisseria meningitis Cas9(NmCas9)、またはNeisseria cinerea Cas9(NcCas9)が含まれる。他の実施形態では、CRISPRヌクレアーゼは、Cpf1ヌクレアーゼのようなタイプVのCRISPRヌクレアーゼに由来するものでもよい。好適なCpf1ヌクレアーゼには、Francisella novicida Cpf1(FnCpf1)、Acidaminococcus sp. Cpf1(AsCpf1)、またはLachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1(LbCpf1)が含まれる。さらに別の実施形態では、CRISPRヌクレアーゼは、タイプVI CRISPRヌクレアーゼ、例えば、Leptotrichia wadei Cas13a(LwaCas13a)またはLeptotrichia shahii Cas13a(LshCas13a)に由来するものでもよい。
CRISPRヌクレアーゼは、野生型CRISPRヌクレアーゼ、改変CRISPRヌクレアーゼ、または野生型もしくは改変CRISPRヌクレアーゼの断片であり得る。CRISPRヌクレアーゼは、核酸結合親和性および/または特異性を増加させ、酵素活性を変化させ、および/またはタンパク質の別の性質を変化させるように改変することができる。例えば、CRISPRヌクレアーゼのヌクレアーゼ(すなわち、DNase、RNase)ドメインは、改変、削除、または不活性化することができる。CRISPRヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの機能に必須ではないドメインを除去するために切断され得る。
CRISPRヌクレアーゼは、2つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Cas9ヌクレアーゼは、ガイドRNA相補鎖を切断するHNHドメインおよび非相補鎖を切断するRuvCドメインを含み、Cpf1ヌクレアーゼはRuvCドメインおよびNUCドメインを含み、Cas13aヌクレアーゼは2つのHNEPNドメインを含む。両方のヌクレアーゼドメインが機能している場合、CRISPRヌクレアーゼは二本鎖切断を導入する。いずれかのヌクレアーゼドメインは、1つまたは複数の突然変異および/または欠失によって不活性化され得、それによって、二本鎖配列の1つの鎖に一本鎖切断を導入する変異体を生成する。例えば、Cas9ヌクレアーゼのRubCドメインにおける1つまたは複数の突然変異(例えば、D10A、D8A、E762A、および/またはD986A)は、ガイドRNA相補鎖に切れ目を入れるHNHニッカーゼをもたらし、およびCas9ヌクレアーゼのHNHドメインにおける1つまたは複数の突然変異(例えば、H840A、H559A、N854A、N856A、および/またはN863A)は、ガイドRNA非相補鎖に切れ目を入れるRuvCニッカーゼをもたらす。同等の突然変異は、Cpf1およびCas13aヌクレアーゼをニッカーゼに変換することができる。染色体配列の反対側の鎖に標的化された2つのCRISPRニッカーゼを(一対のオフセットガイドRNAを介して)組み合わせて使用して、染色体配列に二本鎖切断を生じさせることができる。デュアルCRISPRニッカーゼRNPは、標的特異性を高め、オフターゲット効果を低下することができる。
追加のドメイン。CRISPRヌクレアーゼは、少なくとも1つの核局在化配列(NLS)をさらに含むことができる。NLSは、染色体中の標的配列に二本鎖切断を導入するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核内に標的化することを容易にするアミノ酸配列である。核局在化シグナルは、当技術分野で公知である(例えば、Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101−5105を参照されたい)。核局在化シグナルの非限定的な例としては、PKKKRKV(配列番号1)、PKKKRRV(配列番号2)、KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号3)、YGRKKRRQRRR(配列番号4)、RKKRRQRRR(配列番号5)、PAAKRVKLD(配列番号6)、RQRRNELKRSP(配列番号7)、VSRKRPRP(配列番号8)、PPKKARED(配列番号9)、PQPKKKPL(配列番号10)、SALIKKKKKMAP(配列番号11)、PKQKKRK(配列番号12)、RKLKKKIKKL(配列番号13)、REKKKFLKRR(配列番号14)、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号15)、RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号16)、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号17)、およびRMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号18)が挙げられる。NLSは、N末端、C末端、またはCRISPRヌクレアーゼの内部位置に位置し得る。
さらなる実施形態では、CRISPRヌクレアーゼはまた、少なくとも1つの細胞貫通ドメインを含むことができる。好適な細胞貫通ドメインの例としては、限定されないが、GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV(配列番号19)、PLSSIFSRIGDPPKKKRKV(配列番号20)、GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV(配列番号21)、GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV(配列番号22)、KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(配列番号23)、YARAAARQARA(配列番号24)、THRLPRRRRRR(配列番号25)、GGRRARRRRRR(配列番号26)、RRQRRTSKLMKR(配列番号27)、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(配列番号28)、KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(配列番号29)、およびRQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号30)が挙げられる。細胞貫通ドメインは、N末端、C末端、またはCRISPRタンパク質の内部位置に位置し得る。
さらに他の実施形態では、CRISPRヌクレアーゼは、少なくとも1つのマーカードメインをさらに含むことができる。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、およびエピトープタグが挙げられる。一実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であり得る。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質(例えば、GFP、GFP−2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色蛍光タンパク質(例えば、YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、青色蛍光タンパク質(例えば、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T−sapphire)、シアン蛍光タンパク質(例えばECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi−Cyan)、赤色蛍光タンパク質(例えば、mKate、mKate2、mPlum、DsRed単量体、mCherry、mRFP1、DsRed−Express、DsRed2、DsRed−Monomer、HcRed−Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)、およびオレンジ蛍光タンパク質(mOrange、mKO、Kusabira−Orange、Monomeric Kusabira−Orange、mTangerine、tdTomato)、または任意の他の好適な蛍光タンパク質、が挙げられる。別の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび/またはエピトープタグであり得る。好適なタグとしては、これらに限定されないがポリ(His)タグ、FLAG(またはDDK)タグ、Haloタグ、AcV5タグ、AU1タグ、AU5タグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、キチン結合ドメイン(CBD)、Eタグ、E2タグ、ECSタグ、eXactタグ、Glu−Gluタグ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、HAタグ、HSVタグ、KT3タグ、マルトース結合タンパク質(MBP)、MAPタグ、Mycタグ、NEタグ、NusAタグ、PDZタグ、Sタグ、S1タグ、SBPタグ、Softag 1タグ、Softag 3タグ、Spotタグ、Strepタグ、SUMOタグ、T7タグ、タンデムアフィニティー精製(TAP)タグ、チオレドキシン(TRX)、V5タグ、VSV−Gタグ、およびXaタグ、が挙げられる。マーカードメインは、N末端、C末端、またはCRISPRヌクレアーゼの内部位置に位置することができる。
少なくとも1つの核局在化シグナル、少なくとも1つの細胞貫通ドメイン、および/または少なくとも1つのマーカードメインは、1つまたは複数の化学結合(例えば、共有結合)を介してCRISPRヌクレアーゼに直接連結することができる。あるいは、少なくとも1つの核局在シグナル、少なくとも1つの細胞貫通ドメイン、および/または少なくとも1つのマーカードメインは、1つまたは複数のリンカーを介して、CRISPRヌクレアーゼに間接的に連結することができる。好適なリンカーは、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子(例えば、マレイミド誘導体、N−エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル−3,4’,5−トリカルボン酸、p−アミノベンジルオキシカルボニルなど)、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー(例えば、PEG)を含む。リンカーは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニルなどを含むがこれらに限定されない、1つまたは複数のスペーシング基を含むことができる。リンカーは、中性であってもよく、正または負の電荷を担持していてもよい。さらに、リンカーは、リンカーを別の化学基に連結するリンカーの共有結合が、pH、温度、塩濃度、光、触媒、または酵素を含む特定の条件下で破断または切断されるように、切断可能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーは、可動性アミノ酸リンカーまたは剛性アミノ酸リンカーであり得る。好適なリンカーの追加の例は、当技術分野で周知であり、リンカーを設計するためのプログラムは、当技術分野で容易である。
ガイドRNA。CRISPRヌクレアーゼは、ガイドRNAによって標的部位に誘導される。ガイドRNAは標的部位にハイブリダイズし、CRISPRヌクレアーゼと相互作用して、CRISPRヌクレアーゼを染色体配列中の標的部位に誘導する。標的部位は、配列がプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)によって縁取られていることを除いて、配列の制限を持たない。異なる細菌種由来のCRISPRタンパク質は、異なるPAM配列を認識する。例えば、PAM配列としては、5’−NGG(SpCas9、FnCAs9)、5’−NGRRT(SaCas9)、5’−NNAGAAW(StCas9)、5’−NNNNGATT(NmCas9)、5−NNNNRYAC(CjCas9)、および5’−TTTV(Cpf1)が挙げられ、ここで、Nは任意のヌクレオチドとして定義され、RはGまたはAのいずれかとして定義され、WはAまたはTのいずれかとして定義され、YはCまたはTのいずれかとして定義され、VはA、CまたはGとして定義される。Cas9 PAMは標的部位の3’に位置し、cpf1 PAMは標的部位の5’に位置する。
ガイドRNAは、3つの領域:標的部位の配列に相補的な5’末端の第1の領域、ステムループ構造を形成する第2の内部領域、および本質的に一本鎖のままの第3の3’領域、を含む。各ガイドRNAの第1の領域は、各ガイドRNAがCRISPRヌクレアーゼを特定の標的部位に誘導するように異なる。各ガイドRNAの第2および第3の領域(足場領域とも呼ばれる)は、すべてのガイドRNAにおいて同じであり得る。
ガイドRNAの第1の領域は、ガイドRNAの第1の領域が標的部位の配列と塩基対をなすことができるように、標的部位の配列(すなわち、プロトスペーサー配列)と相補的である。ガイドRNAの第1の領域(すなわち、crRNA)と標的配列との間の相補性は、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または95%超であり得る。一般に、ガイドRNAの第1の領域の配列と標的部位の配列との間にはミスマッチは存在しない(すなわち、相補性は完全である)。様々な実施形態では、ガイドRNAの第1の領域は、約10ヌクレオチドから約25ヌクレオチド超までを含むことができる。例えば、ガイドRNAの第1の領域と染色体配列中の標的部位との間の塩基対の領域は、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、または25ヌクレオチド超の長さであり得る。例となる実施形態では、ガイドRNAの第1の領域は、長さが約19、20、または21ヌクレオチドである。
ガイドRNAはまた、二次構造を形成する第2の領域を含む。一部の実施形態では、二次構造は、ステム(またはヘアピン)およびループを含む。ループおよびステムの長さは、変化し得る。例えば、ループは、長さが約3から約10ヌクレオチドの範囲であり得、ステムは、長さが約6から約20塩基対の範囲であり得る。ステムは、約1から約10ヌクレオチドの1つまたは複数のバルジを含むことができる。したがって、第2の領域の全長は、長さが約16から約60ヌクレオチドの範囲であり得る。例となる実施形態では、ループは約4ヌクレオチドの長さであり、ステムは約12塩基対を含む。
ガイドRNAはまた、本質的に一本鎖のままの3’末端の第3の領域を含む。したがって、第3の領域は、目的の細胞内のいかなる染色体配列に対しても相補性を持たず、ガイドRNAの残りの部分に対しても相補性を持たない。第3の領域の長さは、変化し得る。一般に、第3の領域の長さは、約4ヌクレオチド超である。例えば、第3の領域の長さは、約5から約60ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。
ガイドRNAの第2および第3の領域(または足場)の合計した長さは、約30から約120ヌクレオチドまでの長さの範囲であり得る。一態様では、ガイドRNAの第2および第3の領域の合計した長さは、約70から約100ヌクレオチドまでの長さの範囲である。
一部の実施形態では、ガイドRNAは、3つの領域すべてを含む1つの分子を含む。他の実施形態では、ガイドRNAは、2つの別々の分子を含むことができる。第1のRNA分子は、ガイドRNAの第1の(5’)領域、およびガイドRNAの第2の領域の「ステム」の1/2を含むことができる。第2のRNA分子は、ガイドRNAの第2の領域の「ステム」の他の半分、およびガイドRNAの第3の領域を含むことができる。したがって、本実施形態では、第1および第2のRNA分子は、それぞれ、互いに相補的なヌクレオチドの配列を含む。例えば、一実施形態では、第1および第2のRNA分子は、それぞれ、機能的ガイドRNAを形成するために他の配列に塩基対をなす配列(約6から約20ヌクレオチド)を含む。
(iii)その他の標的エンドヌクレアーゼ
さらなる実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼは、長い認識配列、すなわち、認識配列は、一般に約12塩基対から約40塩基対までの範囲であることを特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。この必要条件の結果として、認識配列は一般に、どのゲノムにも一度しか存在しない。メガヌクレアーゼの中でも、LAGLIDADGと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノムの研究およびゲノム工学のための貴重なツールとなっている(例えば、Arnould et al., 2011, Protein Eng Des Sel, 24(1−2):27−31を参照されたい)。他の好適なメガヌクレアーゼとしては、I−CreIおよびI−DmoIが挙げられる。メガヌクレアーゼは、当業者周知の技術を用いて認識配列を改変することにより、特定の染色体配列に標的化することができる。
さらなる実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼは、長い認識配列、すなわち、認識配列は、一般に約12塩基対から約40塩基対までの範囲であることを特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。この必要条件の結果として、認識配列は一般に、どのゲノムにも一度しか存在しない。メガヌクレアーゼの中でも、LAGLIDADGと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノムの研究およびゲノム工学のための貴重なツールとなっている(例えば、Arnould et al., 2011, Protein Eng Des Sel, 24(1−2):27−31を参照されたい)。他の好適なメガヌクレアーゼとしては、I−CreIおよびI−DmoIが挙げられる。メガヌクレアーゼは、当業者周知の技術を用いて認識配列を改変することにより、特定の染色体配列に標的化することができる。
追加の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター(TALE)ヌクレアーゼであり得る。TALEは、新しいDNA標的に結合するように容易に操作することができる植物病原体Xanthomonas由来の転写因子である。TALEヌクレアーゼまたはTALENと呼ばれる標的エンドヌクレアーゼを作成するために、FokIなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインにTALEまたはその切断されたバージョンを連結してもよい(Sanjana et al., 2012, Nat Protoc, 7(1):171−192)、およびArnould et al., 2011, Protein Engineering, Design & Selection, 24(1−2):27−31)。
代替の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、キメラヌクレアーゼであり得る。キメラヌクレアーゼの非限定的な例としては、ZF−メガヌクレアーゼ、TAL−メガヌクレアーゼ、Cas9−FokI融合体、ZF−Cas9融合体、TAL−Cas9融合体などが挙げられる。当業者は、そのようなキメラヌクレアーゼ融合体を生成するための手段に精通している。
さらに他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、部位特異的エンドヌクレアーゼであり得る。特に、部位特異的エンドヌクレアーゼは、認識配列がゲノム中に稀に存在する「レアカッター」エンドヌクレアーゼであり得る。あるいは、部位特異的エンドヌクレアーゼは、目的の部位を切断するように操作され得る(Friedhoff et al., 2007, Methods Mol Biol 352:1110123)。一般に、部位特異的エンドヌクレアーゼの認識配列は、ゲノム中に一度だけ存在する。代替のさらなる実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、人工標的化DNA二本鎖切断誘導剤であり得る。
(b)標的エンドヌクレアーゼの細胞へのデリバリー
方法は、標的エンドヌクレアーゼを目的の親細胞株に導入することを含む。標的エンドヌクレアーゼは、精製単離されたタンパク質として、または標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に導入することができる。核酸は、DNAまたはRNAであり得る。コードする核酸がmRNAである実施形態では、mRNAは、5’キャッピングおよび/または3’ポリアデニル化されていてもよい。コードする核酸がDNAである実施形態では、DNAは、直鎖状または環状であり得る。核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターの一部であり得、コードするDNAは、好適なプロモーターに作動可能に連結され得る。当業者は、適切なベクター、プロモーター、他の制御要素、およびベクターを目的の細胞に導入するための手段に精通している。標的エンドヌクレアーゼがCRISPRヌクレアーゼである実施形態では、CRISPRヌクレアーゼシステムは、gRNA−タンパク質複合体として細胞内に導入することができる。
方法は、標的エンドヌクレアーゼを目的の親細胞株に導入することを含む。標的エンドヌクレアーゼは、精製単離されたタンパク質として、または標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に導入することができる。核酸は、DNAまたはRNAであり得る。コードする核酸がmRNAである実施形態では、mRNAは、5’キャッピングおよび/または3’ポリアデニル化されていてもよい。コードする核酸がDNAである実施形態では、DNAは、直鎖状または環状であり得る。核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターの一部であり得、コードするDNAは、好適なプロモーターに作動可能に連結され得る。当業者は、適切なベクター、プロモーター、他の制御要素、およびベクターを目的の細胞に導入するための手段に精通している。標的エンドヌクレアーゼがCRISPRヌクレアーゼである実施形態では、CRISPRヌクレアーゼシステムは、gRNA−タンパク質複合体として細胞内に導入することができる。
標的エンドヌクレアーゼ分子は、様々な手段で細胞内に導入することができる。好適なデリバリー手段としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション(sonoporation)、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション(impalefection)、光学的トランスフェクション、核酸の固有の薬剤促進取り込み、ならびにリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、もしくは人工ビリオンを介したデリバリーが挙げられる。特定の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼ分子は、ヌクレオフェクションによって細胞内に導入される。
任意選択のドナーポリヌクレオチド。標的ゲノム改変または操作のための方法は、標的染色体配列に対して少なくとも1つのヌクレオチド変化を有する配列を含む少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することをさらに含むことができる。標的エンドヌクレアーゼによって導入された二本鎖切断を相同性指向の修復プロセスによって修復することができ、ドナーポリヌクレオチドの配列を染色体配列に挿入または交換することができ、それによって染色体配列を改変することができるように、ドナーポリヌクレオチドは、染色体配列中の標的部位またはその近傍の配列と実質的な配列同一性を有する。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、標的部位の一方の側の配列に対して実質的な配列同一性を有する第1の配列、および標的部位の他方の側の配列に対して実質的な配列同一性を有する第2の配列を含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、標的染色体配列に組み込むためのドナー配列をさらに含むことができる。例えば、外因性配列の統合がリーディングフレームを破壊し、標的染色体配列を不活性化するように、ドナー配列は、外因性配列(例えば、マーカー配列)であり得る。
染色体配列中の標的部位またはその近傍の配列と実質的な配列同一性を有するドナーポリヌクレオチド中の第1および第2の配列の長さは、変化し得るし、また変化するであろう。一般に、ドナーポリヌクレオチド中の第1および第2の配列のそれぞれは、少なくとも約10ヌクレオチドの長さである。様々な実施形態では、染色体配列と実質的な配列同一性を有するドナーポリヌクレオチド配列は、約15ヌクレオチド、約20ヌクレオチド、約25ヌクレオチド、約30ヌクレオチド、約40ヌクレオチド、約50ヌクレオチド、約100ヌクレオチド、または約100ヌクレオチド超の長さであり得る。
「実質的な配列同一性」という表現は、ポリヌクレオチド中の配列が、目的の染色体配列と少なくとも約75%の配列同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド中の配列は、目的の染色体配列と約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する。
ドナーポリヌクレオチドの長さは、変化し得るし、また変化するであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、長さが約20ヌクレオチドから約200,000ヌクレオチドまでの範囲であり得る。様々な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで、長さが約100ヌクレオチドから約1000ヌクレオチドまで、長さが約1000ヌクレオチドから約10000ヌクレオチドまで、長さが約10000ヌクレオチドから約100,000ヌクレオチドまで、または長さが約100,000ヌクレオチドから約200,000ヌクレオチドまでの範囲であり得る。
一般的に、ドナーポリヌクレオチドはDNAである。DNAは、一本鎖または二本鎖であり得る。DNAは、直鎖状または環状であり得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、約200未満のヌクレオチドを含む一本鎖の直鎖状オリゴヌクレオチドであり得る。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドはベクターの一部であり得る。好適なベクターは、DNAプラスミド、ウイルスベクター、細菌人工染色体(BAC)、および酵母人工染色体(YAC)を含む。さらに他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、リポソームまたはポロキサマーなどのデリバリー媒体と複合化したPCR断片または核酸であり得る。
ドナーポリヌクレオチドは、標的エンドヌクレアーゼ分子と同時に細胞に導入することができる。あるいは、ドナーポリヌクレオチドと標的エンドヌクレアーゼ分子を逐次細胞内に導入することができる。ドナーポリヌクレオチドに対する標的エンドヌクレアーゼ分子の比は、変化し得るし、また変化するであろう。一般に、ドナーポリヌクレオチドに対する標的エンドヌクレアーゼ分子の比は、約1:10から約10:1の範囲である。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドに対する標的エンドヌクレアーゼ分子の比は、約1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、または10:1の範囲であり得る。一実施形態では、比は約1:1である。
(c)細胞の培養
方法はさらに、標的エンドヌクレアーゼによって導入された二本鎖切断が、(i)少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、挿入および/または置換によって染色体配列が改変されるような非相同末端結合修復プロセス、または適宜、(ii)染色体配列が改変されるように染色体配列がポリヌクレオチド配列と交換されるような相同性指向修復プロセス、によって修復されるように、適切な条件下で細胞を維持することを含む。標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入する実施形態では、方法は、細胞が標的エンドヌクレアーゼを発現するように適切な条件下で細胞を維持することを含む。
方法はさらに、標的エンドヌクレアーゼによって導入された二本鎖切断が、(i)少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、挿入および/または置換によって染色体配列が改変されるような非相同末端結合修復プロセス、または適宜、(ii)染色体配列が改変されるように染色体配列がポリヌクレオチド配列と交換されるような相同性指向修復プロセス、によって修復されるように、適切な条件下で細胞を維持することを含む。標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入する実施形態では、方法は、細胞が標的エンドヌクレアーゼを発現するように適切な条件下で細胞を維持することを含む。
一般に、細胞は、細胞増殖および/または維持のために適切な条件で維持される。好適な細胞培養条件は当技術分野で周知であり、例えば、Santiago et al. (2008) PNAS 105:5809−5814、Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055−3060、Urnov et al. (2005) Nature 435:646−651、およびLombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298−1306に記載される。当業者は、細胞を培養するための方法が当技術分野で公知であり、細胞タイプに応じて異なることができ、また異なるであろうことを理解する。日常業務最適化を使用して、すべての場合において、特定の細胞タイプに対する最良の技術を決定してもよい。
プロセスのこのステップの間に、標的エンドヌクレアーゼは、染色体配列中の標的切断部位で二本鎖切断を認識、結合、および作成し、二本鎖切断の修復の間に、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、挿入、および/または置換が標的染色体配列に導入される。特定の実施形態では、標的染色体配列は不活性化される。
目的の染色体配列が改変されていることが確認された後、単一細胞クローンを単離し、(DNA配列決定および/またはタンパク質解析を介して)遺伝子型を決定することができる。1つの改変された染色体配列を含む細胞は、追加の染色体配列を改変するために、1回または複数回の追加の標的ゲノム改変を受けることができ、それにより、ダブルノックアウト、トリプルノックアウトなどを作成することができる。
(IV)低レベルの残留HCPを有する組換えタンパク質の生産
本開示の別の態様は、残留HCPのレベルを低減した組換えタンパク質を生産する方法、または生物学的生産システムで生産される組換えタンパク質中のHCP汚染のレベルを低減する方法を包含する。好適な組換えタンパク質は、セクション(I)(c)に記載されている。方法は、上記セクション(I)に記載のいずれかの操作された細胞株で目的の組換えタンパク質を発現させること、および発現された組換えタンパク質を精製すること、を含む。組換えタンパク質を生産または製造するための手段は、当該分野で周知である(例えば、「Biopharmaceutical Production Technology」, Subramanian (ed), 2012, Wiley−VCH; ISBN:978−3−527−33029−4を参照されたい)。
本開示の別の態様は、残留HCPのレベルを低減した組換えタンパク質を生産する方法、または生物学的生産システムで生産される組換えタンパク質中のHCP汚染のレベルを低減する方法を包含する。好適な組換えタンパク質は、セクション(I)(c)に記載されている。方法は、上記セクション(I)に記載のいずれかの操作された細胞株で目的の組換えタンパク質を発現させること、および発現された組換えタンパク質を精製すること、を含む。組換えタンパク質を生産または製造するための手段は、当該分野で周知である(例えば、「Biopharmaceutical Production Technology」, Subramanian (ed), 2012, Wiley−VCH; ISBN:978−3−527−33029−4を参照されたい)。
組換えタンパク質は、清澄化、例えば、濾過、およびクロマトグラフィー、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、プロテインA(またはG)クロマトグラフィー、イオン交換(すなわち、カチオンおよび/またはアニオン)クロマトグラフィーの1つまたは複数のステップを含むプロセスを介して精製することができる。当業者であれば、追加の精製プロセスとしては、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、超遠心分離、沈殿、免疫沈降、抽出、相分離などが使用され得ることを理解するであろう。一般に、本明細書に開示された哺乳動物細胞株によって発現された組換えタンパク質の精製は、宿主細胞タンパク質の汚染レベルが低いため、より少ない精製ステップを含むことができる。したがって、従来の発現系と比較して、精製時間およびコストを低減することができる。
本明細書に開示された操作された細胞株によって生産された組換えタンパク質は、操作されていない親細胞株によって生産された組換えタンパク質と比較して、HCPのレベルが低下している。一般に、本明細書に開示された細胞株によって生産された組換えタンパク質中のHCPの残留レベルは、International Conferenceon Harmonization(ICG)ガイドラインに従った認証された方法を用いて測定した場合、100ppm未満、30ppm未満、10ppm未満、3ppm未満、1ppm未満、0.3ppm未満、0.1ppm未満、0.03ppm未満、0.01ppm未満、0.003ppm未満、または0.001ppm未満である。好適な方法としては、ウェスタン免疫ブロッティングアッセイ、ELISA酵素アッセイ、一次元または二次元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)、二次元ディファレンシャルゲル電気泳動(DIGE)、キャピラリーゾーン電気泳動−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法(CZE−ESI−MS/MS)、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法(LC−MS/MS)、二次元−液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法(2D−LC−MS/MS)などが挙げられる。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)、The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)、The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)、およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特別の定めのない限り、それらに付随する意味を有する。
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)、The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)、The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)、およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特別の定めのない限り、それらに付随する意味を有する。
本開示の要素またはその好ましい実施形態を導入する場合、「a」、「an」、「the」および「said」という冠詞は、1つまたは複数の要素が存在することを意味することが意図されている。「含む(comprising)」、「含む(including)」および「有する(having)」という用語は、包括的であることが意図されており、記載された要素以外の追加の要素が存在してもよいことを意味する。
本明細書で使用される場合、「内因性配列」という用語は、細胞に固有の染色体配列を表す。
「外因性配列」という用語は、細胞に固有ではない染色体配列、または異なる染色体位置に移動した染色体配列を表す。
「操作された」または「遺伝子改変された」細胞とは、ゲノムが改変または操作された細胞を表し、すなわち、その細胞は、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、および/または少なくとも1つのヌクレオチドの置換を含むように操作された染色体配列を少なくとも含む。
「ゲノム改変」および「ゲノム編集」という用語は、それによって染色体配列が改変されるように特定の染色体配列が変えられるプロセスを表す。染色体配列は、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、および/または少なくとも1つのヌクレオチドの置換を含むように改変されてもよい。改変された染色体配列は、産物が作られないように不活性化される。あるいは、変更された産物が作られるように、染色体配列を改変することもできる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」とは、遺伝子産物をコードするDNA領域(エクソンおよびイントロンを含む)、ならびにそのような調節配列がコード配列および/または転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の生産を調節するすべてのDNA領域を表す。その結果、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製開始点、マトリックス付着部位、および遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
「異種」という用語は、目的の細胞または種に固有ではない実体を表す。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、直鎖状または環状の立体配座のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを表す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。用語は、天然ヌクレオチドの既知のアナログ、ならびに塩基、糖および/またはリン酸部分で改変されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同一の塩基対特異性を有する、すなわち、AのアナログはTと塩基対をなす。核酸またはポリヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、ホスホチオエート結合、ホスホラミダイト結合、ホスホロジアミダイト結合、またはそれらの組合せによって連結されていてもよい。
「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを表す。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド(すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン)またはヌクレオチドアナログであってもよい。ヌクレオチドアナログとは、改変されたプリンもしくはピリミジン塩基または改変されたリボース部分を有するヌクレオチドを表す。ヌクレオチドアナログは、天然に存在するヌクレオチド(例えば、イノシン)または非天然に存在するヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分の改変の非限定的な例としては、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加(または除去)、ならびに塩基の炭素原子および窒素原子を他の原子(例えば、7−デアザプリン)で置換することが挙げられる。ヌクレオチドアナログはまた、ジデオキシヌクレオチド、2’−O−メチルヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、およびモルホリノを含む。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを表すために同じ意味で使用される。
「問題のある宿主細胞タンパク質」という用語は、(i)非常に豊富であり、(ii)下流プロセスで除去することが困難であり、および/または(iii)製品の品質に影響を与える宿主細胞タンパク質を表す。
本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、改変または編集されるべき染色体配列の一部を定義する核酸配列を表し、結合のための十分な条件が存在する場合には、標的エンドヌクレアーゼが認識および結合するように操作された核酸配列を表す。
「上流」および「下流」という用語は、固定位置に対する核酸配列中の位置を表す。上流とは、位置に対して5’(すなわち、鎖の5’末端付近)である領域を表し、下流とは、位置に対して3’(すなわち、鎖の3’末端付近)である領域を表す。
核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は、当技術分野で公知である。一般的に、そのような技術は、遺伝子に対するmRNAのヌクレオチド配列を決定し、および/またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第2のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もまた、このような方法で決定され、比較され得る。一般に、同一性とは、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれの正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を表す。2つまたはそれ以上の配列(ポリヌクレオチドまたはアミノ酸)は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較することができる。核酸配列であれアミノ酸配列であれ、2つの配列のパーセント同一性は、2つのアラインメントされた配列間の完全一致の数を短い方の配列の長さで割ったものを100倍したものである。核酸配列に対する近似的なアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482−489 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353−358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745−6763(1986)によって正規化されたスコアリングマトリックスを用いて、アミノ酸配列に適用され得る。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例となる実装は、Genetics Computer Group(Madison, Wis.)によって「Best Fit」ユーティリティアプリケーションで提供されている。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、一般に当技術分野で公知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトのパラメータで使用されるBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる:遺伝コード=標準、フィルタ=なし、鎖=両方、カットオフ=60;期待値=10、マトリクス=BLOSUM62、記載=50配列、ソート=ハイスコア、データベース=冗長性なし、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、GenBankのウエブサイトに見出すことができる。本明細書に記載の配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、約80%から100%、およびその間の任意の整数値である。一般的に、配列間のパーセント同一性は、少なくとも70から75%、好ましくは80から82%、より好ましくは85から90%、さらにいっそう好ましくは92%、さらにいっそう好ましくは95%、最も好ましくは98%の配列同一性である。
本発明の範囲を逸脱することなく、上記の細胞および方法に様々な変更を加えることができるので、上述した説明および以下に示す実施例に含まれるすべての事項は、例示的なものとして解釈されることが意図されており、限定的な意味で解釈されるものではない。
以下の実施例は、本発明の特定の態様を示す。
実施例1
汚染宿主細胞タンパク質の同定
質量分析法を用いて、いくつかのCHO親細胞株によって生産されたHCPを同定した。異なる親細胞株からフェッドバッチ上清を回収し、LC−MS/MSで分析した。同様に、Pro Aキャプチャーステップ後のサンプル溶出物を分析し、カラムに付いたタンパク質を同定した。第2の方法では、HCPプロファイルを、下流の精製ステップによって組換え発現クローンから追跡した。「問題のあるHCP」は、(i)非常に豊富であり、(ii)下流プロセスで除去することが困難であり、および/または(iii)製品の品質に影響を与える宿主細胞タンパク質として特徴付けられた。各サンプルから同定されたタンパク質の数が多いことを考えると、主成分分析(PCA)を実施し、ばらつきを強調してデータパターンを抽出した。表1は、同定された「問題のある」HCPのいくつかとそれらの特徴を示す。
汚染宿主細胞タンパク質の同定
質量分析法を用いて、いくつかのCHO親細胞株によって生産されたHCPを同定した。異なる親細胞株からフェッドバッチ上清を回収し、LC−MS/MSで分析した。同様に、Pro Aキャプチャーステップ後のサンプル溶出物を分析し、カラムに付いたタンパク質を同定した。第2の方法では、HCPプロファイルを、下流の精製ステップによって組換え発現クローンから追跡した。「問題のあるHCP」は、(i)非常に豊富であり、(ii)下流プロセスで除去することが困難であり、および/または(iii)製品の品質に影響を与える宿主細胞タンパク質として特徴付けられた。各サンプルから同定されたタンパク質の数が多いことを考えると、主成分分析(PCA)を実施し、ばらつきを強調してデータパターンを抽出した。表1は、同定された「問題のある」HCPのいくつかとそれらの特徴を示す。
いくつかのプロテアーゼが遺伝子編集の候補として同定された。宿主細胞に由来するプロテアーゼは、細胞培養液中で活性であり、製品の品質に影響を与えることができる。これらのタンパク質分解活性は、組換え発現したポリペプチドを分解する場合があり、「クリッピング」とも呼ばれ、それによって潜在的に免疫原性を有し、変更された、例えば、非機能性または機能性の低い治療用タンパク質にする。同定されたHCPは、宿主細胞の増殖および生産性に必須または非必須としてさらに分類された。
実施例2
ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたリポタンパク質リパーゼおよびホスホリパーゼB様2遺伝子のノックアウト
CHO細胞を、リポタンパク質リパーゼ(LPL)またはホスホリパーゼB様2(PLBL2)遺伝子を標的としたジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)の対をコードする核酸でトランスフェクトした。それぞれの標的部位を以下に示す(ZFN結合部位は大文字で示し、切断部位は小文字で示す)。
リポタンパク質リパーゼ
CCTGACTCCAACGTCATTgtggtGGACTGGCTGTATCGGGC(対13、14)(配列番号31)
GGCTGTATCGGGCCCAGCaacactATCCAGTGTCGGCTGGCT(対15、16)(配列番号32)
ホスホリパーゼB様2
GGCCTATGCAGCTGGtgtggtGGAGGCTTCTGTGTCTGAG(配列番号33)
ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたリポタンパク質リパーゼおよびホスホリパーゼB様2遺伝子のノックアウト
CHO細胞を、リポタンパク質リパーゼ(LPL)またはホスホリパーゼB様2(PLBL2)遺伝子を標的としたジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)の対をコードする核酸でトランスフェクトした。それぞれの標的部位を以下に示す(ZFN結合部位は大文字で示し、切断部位は小文字で示す)。
リポタンパク質リパーゼ
CCTGACTCCAACGTCATTgtggtGGACTGGCTGTATCGGGC(対13、14)(配列番号31)
GGCTGTATCGGGCCCAGCaacactATCCAGTGTCGGCTGGCT(対15、16)(配列番号32)
ホスホリパーゼB様2
GGCCTATGCAGCTGGtgtggtGGAGGCTTCTGTGTCTGAG(配列番号33)
トランスフェクション後の所望のインキュベーション期間の後、細胞を採取し、ゲノムDNAを単離した。ZFN誘導DNA二本鎖切断の非相同末端結合(NHEJ)媒介不完全修復の結果として、野生型から逸脱する標的遺伝子座の対立遺伝子を検出するCel−1ヌクレアーゼアッセイを用いて、ZFN誘導切断を検証した。ZFNのLLP 13/14対およびPLBL2対は、偽処理した細胞には存在しなかった切断断片を生成した(図1)ことから、標的遺伝子に挿入/欠失(インデル)が導入されていることが示唆された。
実施例3
Cas9 RNPを用いたカテプシンBおよびカテプシンD遺伝子ノックアウト
CHO細胞を、カテプシンBまたはカテプシンDを標的とするように設計された遺伝子特異的gRNAを含むCas9コンストラクトでトランスフェクトした。gRNAのプロトスペーサー配列を以下に示す。
カテプシンB
CCCACTGTCGGATGACCTGATT(配列番号34)
CCACTGTCGGATGACCTGATTA(配列番号35)
CAACAAACGGAATACGACATGG(配列番号36)
カテプシンD
CCCCCTGCGCAAGTTCACGTCT(配列番号37)
CAAGTTCACGTCTATCCGTCGG(配列番号38)
CCTTAAGGGTCCCATAACCACG(配列番号39)
Cas9 RNPを用いたカテプシンBおよびカテプシンD遺伝子ノックアウト
CHO細胞を、カテプシンBまたはカテプシンDを標的とするように設計された遺伝子特異的gRNAを含むCas9コンストラクトでトランスフェクトした。gRNAのプロトスペーサー配列を以下に示す。
カテプシンB
CCCACTGTCGGATGACCTGATT(配列番号34)
CCACTGTCGGATGACCTGATTA(配列番号35)
CAACAAACGGAATACGACATGG(配列番号36)
カテプシンD
CCCCCTGCGCAAGTTCACGTCT(配列番号37)
CAAGTTCACGTCTATCCGTCGG(配列番号38)
CCTTAAGGGTCCCATAACCACG(配列番号39)
トランスフェクション後7日目と15日目に細胞を採取し、ゲノムDNAを単離し、Cel−1ヌクレアーゼアッセイを行った。切断断片は、Cas9 RNP処理細胞において検出された(図2)。
単一細胞ノックアウトクローンを単離した。生産性と成長プロファイルを、カテプシンBノックアウトサブクローン(図3A)、カテプシンDノックアウトサブクローン、野生型細胞(図3B)で比較した。ノックアウトサブクローンは多少の変動性を示したが、力価と生細胞密度はノックアウトクローンと野生型細胞の間で類似していた。
実施例4
Cas9 RNPを用いたクラスタリン遺伝子ノックアウト
細胞を、クラスタリンを標的とするように設計された遺伝子特異的gRNAを含むCas9コンストラクトでトランスフェクトした。gRNAのプロトスペーサー配列を以下に示す。
GTCTCCGACAATGAGCTCAAGG(配列番号40)
CCACTCAAGGGAGTAGGTACAT(配列番号41)
GGGAGTAGGTACATTAATAAGG(配列番号42)
Cas9 RNPを用いたクラスタリン遺伝子ノックアウト
細胞を、クラスタリンを標的とするように設計された遺伝子特異的gRNAを含むCas9コンストラクトでトランスフェクトした。gRNAのプロトスペーサー配列を以下に示す。
GTCTCCGACAATGAGCTCAAGG(配列番号40)
CCACTCAAGGGAGTAGGTACAT(配列番号41)
GGGAGTAGGTACATTAATAAGG(配列番号42)
細胞を採取し、ゲノムDNAを単離し、Cel−1ヌクレアーゼアッセイを行った。切断断片は、Cas9 RNP処理細胞において検出された(図4、レーン5〜7)。野生型およびクラスタリンノックアウトクローンを単離した。生産性と成長プロファイルを、野生型サブクローン(図5A)とクラスタリンノックアウトサブクローン(図5B)の間で比較した。野生型サブクローンとノックアウトサブクローンの間には変動性があったが、力価と細胞密度は野生型とノックアウト細胞の間で類似していた。
野生型とクラスタリンノックアウトクローン間で製品の品質を比較した。モデル融合タンパク質を、野生型およびククラスタリンノックアウトクローンで発現させた。タンパク質産物のサイズの不均一性を、UPLC SECを用いて分析し、非常に高い分子量(例えば、下流の追加の精製ステップにつながり得る融合タンパク質の二量体または凝集体)、融合タンパク質単量体、および低分子量種を特徴付けた。結果を表1に示す。一般に、クラスタリンノックアウトクローンは、野生型クローンと同様のプロファイルを有する。
実施例5
Cas9 RNPを用いたチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼ遺伝子ノックアウト
細胞を、チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼを標的とするように設計された遺伝子特異的gRNAを含むCas9コンストラクトでトランスフェクトした。gRNAのプロトスペーサー配列を以下に示す。
チオレドキシン
GAAGCTTTTCAGGAGGCCCTGG(配列番号43)
GCTTTTCAGGAGGCCCTGGCGG(配列番号44)
CCCTGGCGGCTGCGGGAGACAA(配列番号45)
CCACATGGTGTGGACCATGCAA(配列番号46)
チオレドキシンレダクターゼ
AACTCCTCTCGGAACTAGATGG(配列番号47)
GGAGGAACGTGTGTGAACGTGG(配列番号48)
CCAGGCGGCTTTGTTAGGACAA(配列番号49)
CCTTGAAAGACTCTCGAAACTA(配列番号50)
Cas9 RNPを用いたチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼ遺伝子ノックアウト
細胞を、チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼを標的とするように設計された遺伝子特異的gRNAを含むCas9コンストラクトでトランスフェクトした。gRNAのプロトスペーサー配列を以下に示す。
チオレドキシン
GAAGCTTTTCAGGAGGCCCTGG(配列番号43)
GCTTTTCAGGAGGCCCTGGCGG(配列番号44)
CCCTGGCGGCTGCGGGAGACAA(配列番号45)
CCACATGGTGTGGACCATGCAA(配列番号46)
チオレドキシンレダクターゼ
AACTCCTCTCGGAACTAGATGG(配列番号47)
GGAGGAACGTGTGTGAACGTGG(配列番号48)
CCAGGCGGCTTTGTTAGGACAA(配列番号49)
CCTTGAAAGACTCTCGAAACTA(配列番号50)
好適な期間のインキュベーション後、細胞を採取し、ゲノムDNAを単離し、Cel−1ヌクレアーゼアッセイを行った。切断断片は、Cas9 RNP処理細胞において検出された(図6、レーン2〜5および7〜10)。
Claims (28)
- 宿主細胞タンパク質汚染のレベルが低減した組換えタンパク質産物を生産するプロセスであって、
(a)少なくとも1つの宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように操作された哺乳動物細胞株において、組換えタンパク質を発現させること、および
(b)組換えタンパク質を精製して組換えタンパク質産物を形成することであって、組換えタンパク質産物は、操作されていない親の哺乳動物細胞株によって生産されたタンパク質産物中のレベルよりも低い残留宿主細胞タンパク質のレベルを有する、形成すること
を含むプロセス。 - 少なくとも1つの宿主細胞タンパク質が、カルボキシペプチダーゼB1、カルボキシペプチダーゼD、カルボキシペプチダーゼE、カルボキシペプチダーゼM、カテプシンB、カテプシンD、カテプシンL1、カテプシンZ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4、クラスタリン、ジペプチジルペプチダーゼ3、レグマイン、ロイシンアミノペプチダーゼ3、リポタンパク質リパーゼ、リシルオキシダーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤1、中性α−グルコシダーゼ、ナイドジェン1、ペルオキシダシン、ホスホリパーゼB様2、プロリルエンドペプチダーゼ、タンパク質アルギニンN−メチルトランスフェラーゼ5、タンパク質ホスファターゼ1G、セリンプロテアーゼ、シアリダーゼ1、チオレドキシン、またはチオレドキシンレダクターゼから選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 哺乳動物細胞株が、カルボキシペプチダーゼD、カテプシンB、カテプシンD、クラスタリン、リポタンパク質リパーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤1、ナイドジェン1、ペルオキシダシン、セリンプロテアーゼ、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、またはそれらの組合せの発現が低減または排除される、請求項1に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの宿主細胞タンパク質の発現が、少なくとも1つの宿主細胞タンパク質をコードする染色体配列の少なくとも1つの対立遺伝子の不活性化を介して低減または排除される、請求項1から3のいずれか1項に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの宿主細胞タンパク質をコードする染色体配列の両方の対立遺伝子が不活性化されている、請求項4に記載のプロセス。
- 染色体配列が、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム改変技術を用いて不活性化される、請求項4または5に記載のプロセス。
- 標的エンドヌクレアーゼが、CRISPRリボヌクレオタンパク質複合体または一対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項6に記載のプロセス。
- 細胞株がヒト細胞株である、請求項1から7のいずれか1項に記載のプロセス。
- ヒト細胞株が、ヒト胎児腎臓細胞293(HEK293)細胞株、HT−1080ヒト結合組織株、またはPER.C6ヒト胎児網膜細胞株である、請求項8に記載のプロセス。
- 細胞株が非ヒト細胞株である、請求項1から7のいずれか1項に記載のプロセス。
- 非ヒト細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞株、NS0マウス骨髄腫細胞株、Sp2/0マウス骨髄腫細胞株、C127マウス乳腺細胞株、またはベロアフリカミドリザル腎臓細胞株である、請求項10に記載のプロセス。
- 細胞株がCHO細胞株である、請求項1から7のいずれか1項に記載のプロセス。
- ステップ(b)における精製が、清澄化ステップおよび1つまたは複数のクロマトグラフィーステップを含む、請求項1から12のいずれか1項に記載のプロセス。
- 組換えタンパク質産物中の残留宿主細胞タンパク質のレベルが100ppm未満である、請求項1から13のいずれか1項に記載のプロセス。
- 組換えタンパク質産物が、抗体、抗体断片、ワクチン、成長因子、サイトカイン、ホルモン、または凝固因子から選択される、請求項1から14のいずれか1項に記載のプロセス。
- 生物的生産システムにおいて使用するための哺乳動物細胞株であって、哺乳動物細胞株は、カルボキシペプチダーゼB1、カルボキシペプチダーゼD、カルボキシペプチダーゼE、カルボキシペプチダーゼM、カテプシンB、カテプシンD、カテプシンL1、カテプシンZ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4、クラスタリン、ジペプチジルペプチダーゼ3、レグマイン、ロイシンアミノペプチダーゼ3、リポタンパク質リパーゼ、リシルオキシダーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤1、中性α−グルコシダーゼ、ナイドジェン1、ペルオキシダシン、ホスホリパーゼB様2、プロリルエンドペプチダーゼ、タンパク質アルギニンN−メチルトランスフェラーゼ5、タンパク質ホスファターゼ1G、セリンプロテアーゼ、シアリダーゼ1、チオレドキシン、またはチオレドキシンレダクターゼから選択される、1つまたは複数の宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように操作された哺乳動物細胞株。
- 1つまたは複数の宿主タンパク質が、カルボキシペプチダーゼD、カテプシンB、カテプシンD、クラスタリン、リポタンパク質リパーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤1、ナイドジェン1、ペルオキシダシン、セリンプロテアーゼ、チオレドキシン、またはチオレドキシンレダクターゼから選択される、請求項16に記載の哺乳動物細胞株。
- 少なくとも1つの宿主細胞タンパク質の発現が、少なくとも1つの宿主細胞タンパク質をコードする染色体配列の少なくとも1つの対立遺伝子の不活性化を介して低減または排除される、請求項16または17に記載の哺乳動物細胞株。
- 少なくとも1つの宿主細胞タンパク質をコードする染色体配列の両方の対立遺伝子が不活性化されている、請求項18に記載の哺乳動物細胞株。
- 染色体配列が、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム改変技術を用いて不活性化される、請求項18または19に記載の哺乳動物細胞株。
- 標的エンドヌクレアーゼが、リボヌクレオタンパク質複合体または一対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項20に記載の哺乳動物細胞株。
- 細胞株がヒト細胞株である、請求項16から21のいずれか1項に記載の哺乳動物細胞株。
- ヒト細胞株が、ヒト胎児腎臓細胞293(HEK293)細胞株、HT−1080ヒト結合組織株、またはPER.C6ヒト胎児網膜細胞株である、請求項22に記載の哺乳動物細胞株。
- 細胞株が非ヒト細胞株である、請求項16から21のいずれか1項に記載の哺乳動物細胞株。
- 非ヒト細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞株、NS0マウス骨髄腫細胞株、Sp2/0マウス骨髄腫細胞株、C127マウス乳腺細胞株、またはベロアフリカミドリザル腎臓細胞株である、請求項24に記載の哺乳動物細胞株。
- 細胞株がCHO細胞株である、請求項16から21のいずれか1項に記載の哺乳動物細胞株。
- 細胞生存率、生細胞密度、力価、成長率、増殖応答、細胞形態、および/または一般的な細胞の健康状態が、操作されていない親哺乳動物細胞株のものと同等である、請求項16から26のいずれか1項に記載の哺乳動物細胞株。
- 抗体、抗体断片、ワクチン、成長因子、サイトカイン、ホルモン、または凝固因子から選択される組換えタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸をさらに含む、請求項16から27のいずれか1項に記載の哺乳動物細胞株。
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