ES2869396T3

ES2869396T3 - Purificación de polipéptidos producidos de manera recombinante

Info

Publication number: ES2869396T3
Application number: ES14797310T
Authority: ES
Inventors: David Gruber; Richard Turner; Jared Bee; Christopher Afdahl; Liu Tie
Original assignee: MedImmune Ltd; MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune Ltd; MedImmune LLC
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2021-10-25
Anticipated expiration: 2034-05-13
Also published as: JP2016519145A; US10259842B2; AU2014265624B2; EP2997036A1; AU2014265624A1; CA2910065A1; EP2997036A4; JP6903092B2; WO2014186350A1; US20160108084A1; EP2997036B1; CA2910065C; JP2019163263A; EP3907233A1

Abstract

Un método para reducir el nivel de proteínas de células hospedadoras (HCP) en una composición que comprende un polipéptido producido de manera recombinante, comprendiendo el método: proporcionar un sobrenadante de cultivo celular clarificado que comprende el polipéptido producido de manera recombinante y una o más HCP; cargar el sobrenadante de cultivo celular clarificado en una columna de cromatografía de proteína A; lavar la columna de cromatografía de proteína A con un tampón de lavado que comprende caprilato de sodio entre 50 mM y 100 mM a un pH entre 8 y 9 para eliminar las HCP.

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de polipéptidos producidos de manera recombinante

1. INTRODUCCIÓN

Reivindicación de prioridad

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos n.° 61/823.520, presentada el 15 de mayo de 2013.

1.1. Referencia a un listado de secuencias

La presente solicitud incorpora por referencia un listado de secuencias enviado con la presente solicitud en forma de un archivo de texto titulado p Ur If 300WO1_SL, creado el 13 de mayo de 2014 y que tiene un tamaño de 8.521 bytes.

1.2. Campo de la invención

La presente invención se refiere a la purificación de polipéptidos producidos de manera recombinante. En una realización más particular, la invención se refiere a métodos de separación de polipéptidos producidos de manera recombinante de las proteínas de células hospedadoras (HCP, siglas del inglés host cellproteins).

1.3. Antecedentes de la invención

Los polipéptidos producidos de manera recombinante, tales como anticuerpos y otras proteínas, se utilizan en una amplia gama de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. El proceso de fabricación de polipéptidos recombinantes generalmente implica la expresión del polipéptido en una célula hospedadora, y la purificación del polipéptido.

La expresión generalmente implica el cultivo de una célula hospedadora procariota o eucariota en condiciones adecuadas para que las células hospedadoras produzcan el polipéptido recombinante. El polipéptido recombinante puede expresarse en diferentes ubicaciones dentro de la célula hospedadora, lo que puede influir en los métodos de aislamiento y purificación del producto utilizados.

Una vez expresado el polipéptido recombinante, las células hospedadoras intactas y los restos celulares se separan del medio de cultivo celular en un proceso denominado "recolección de células". Por ejemplo, las células hospedadoras pueden separarse del medio de cultivo celular por centrifugación o filtración para proporcionar un fluido clarificado (que puede denominarse "sobrenadante de cultivo celular") que incluye el polipéptido recombinante y otras impurezas. Los ejemplos de impurezas que pueden encontrarse en el sobrenadante de cultivo celular clarificado incluyen, pero sin limitación, proteínas de células hospedadoras (HCP), ácidos nucleicos, endotoxinas, virus, variantes de proteínas y agregados de proteínas.

La purificación se refiere a la eliminación de impurezas del sobrenadante de cultivo celular clarificado y normalmente implica una o más etapas de cromatografía. Los procesos típicos incluyen la captura, la purificación intermedia o la eliminación de impurezas, y las etapas finales de eliminación de impurezas. La cromatografía de afinidad, por ejemplo, la cromatografía de proteína A o la cromatografía de intercambio iónico, se utiliza a menudo como etapa de captura. A menudo, la captura va seguida de al menos dos etapas intermedias de purificación o eliminación de impurezas para aumentar la pureza y eliminar los virus contaminantes. Las etapas intermedias de purificación o eliminación de impureza suelen realizarse mediante cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). En muchos procesos, la etapa final de eliminación de impurezas se realiza mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba o filtración en gel. Newcombe et al. Journal of Chromatography B, 814 (2005) 209-215, hace referencia a estudios sobre la idoneidad de la columna de cromatografía de proteína A sintética MAbsorbent(R)A2P como alternativa robusta y económica para la purificación a gran escala de agentes bioterapéuticos derivados de anticuerpos.

Preferentemente, los productos biofarmacéuticos tienen una pureza muy elevada, con la concentración de impurezas, como las proteínas de células hospedadoras, reducida al intervalo de partes por millón en relación con el producto deseado, o inferior. Por lo tanto, sigue siendo necesario que los procesos de purificación optimicen la eliminación de impurezas, en particular, las proteínas de células hospedadoras.

2. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia que quede fuera del ámbito de las reivindicaciones se proporciona solo a título informativo.

En el presente documento se describe un método para separar un polipéptido producido de manera recombinante de las proteínas de células hospedadoras (HCP). En una realización, el método incluye las etapas de: proporcionar un sobrenadante de cultivo celular clarificado que incluye el polipéptido producido de manera recombinante y las HCP; cargar el sobrenadante de cultivo celular clarificado en una columna de cromatografía de proteína A; lavar la columna de cromatografía de proteína A con un tampón de lavado que comprende caprilato de sodio entre 50 mM y 100 mM a un pH entre 8 y 9 para eliminar las HCP; y recuperar el polipéptido producido de manera recombinante. En otra realización, el método incluye las etapas de equilibrar una columna de cromatografía de proteína A con un tampón de equilibrado; cargar el sobrenadante de cultivo celular clarificado en la columna de cromatografía de proteína A; reequilibrar la columna de cromatografía de proteína A cargada con el tampón de equilibrado; lavar la columna de cromatografía de proteína A cargada con un primer tampón de lavado que incluye un ácido graso con una longitud de cadena de al menos aproximadamente 6 átomos de carbono, o una sal de ácido graso del mismo para eliminar las HCP; lavar la columna de cromatografía de proteína A cargada con un segundo tampón de lavado; y eluir el polipéptido producido de manera recombinante con un tampón de elución. En otra realización, se describe un método para reducir la contaminación por proteasas en una formulación que incluye un polipéptido producido de manera recombinante. En otra realización, se describe un método para aumentar la estabilidad de un polipéptido producido de manera recombinante. En otra realización, se proporciona un método para reducir los niveles de HCP, incluidos los niveles de proteasas en una formulación. Los ejemplos de proteasas que pueden eliminarse incluyen, pero sin limitación, serina proteasas, aspartil proteasas, como la catepsina-D, cisteína proteasas, metaloproteasas y aminopeptidasas.

En una realización, la longitud de la cadena del ácido graso o de la sal de ácido graso es de entre 6 y 12 átomos de carbono. En otra realización, la longitud de la cadena del ácido graso o de la sal de ácido graso es de entre 8 y 12 átomos de carbono. En otra realización, la longitud de la cadena del ácido graso o de la sal de ácido graso es de entre 8 y 10 átomos de carbono. En una realización, el ácido graso o la sal de ácido graso se selecciona entre el ácido enántico, el ácido caprílico, el ácido pelargónico, el ácido cáprico, el ácido undecíclico, el ácido láurico y combinaciones de los mismos. En una realización más particular, el tampón de lavado incluye ácido caprílico o una sal del ácido caprílico. En una realización, el tampón de lavado incluye ácido graso de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 200 mM. En otra realización, el tampón de lavado incluye ácido graso de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM. En una realización, el tampón de lavado incluye ácido graso aproximadamente 100 mM.

En una realización, el tampón de lavado incluye cloruro de sodio. En una realización más particular, el tampón de lavado incluye cloruro de sodio a una concentración de entre aproximadamente 1,0 M a aproximadamente 2,5 M. En una realización, el tampón de lavado incluye cloruro de sodio a una concentración de entre aproximadamente 2 M a aproximadamente 2,5 M. En una realización, el tampón de lavado incluye cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 2,5 M.

En una realización, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 9. En otra realización, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9. En otra realización, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 9. En una realización, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 9.

El tampón de lavado de acuerdo con la invención incluye caprilato de sodio entre 50 mM y 100 mM a un pH de entre 8 y 9. En otra realización, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 100 mM a un pH entre aproximadamente 8 y aproximadamente 9 y cloruro de sodio entre aproximadamente 2,0 M y aproximadamente 2,5 M. En otra realización, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio aproximadamente 100 mM en Tris 100 mM a un pH de aproximadamente 9,0. En una realización, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio aproximadamente 100 mM en Tris 100 mM a un pH de aproximadamente 9,0 y cloruro de sodio aproximadamente 2,5 M.

En una realización, el cultivo celular recolectado se clarifica para obtener cultivo celular recolectado clarificado, que se carga en la columna de cromatografía de proteína A. En una realización, la columna de proteína A cargada se reequilibra con un tampón de equilibrado antes de lavar la columna con el tampón de lavado. En una realización, el tampón de equilibrado incluye fosfato de sodio. En una realización, el tampón de equilibrado incluye fosfato de sodio entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM. En una realización, el tampón de equilibrado incluye fosfato de sodio entre aproximadamente 20 mM y aproximadamente 50 mM a un pH entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. En otra realización, el tampón de equilibrado incluye fosfato de sodio aproximadamente 20 mM a un pH de aproximadamente 7.

En una realización, el método incluye una segunda etapa de lavado después de lavar la columna con el tampón de lavado de ácidos grasos. En una realización, el segundo tampón de lavado incluye fosfato de sodio. En una realización, el segundo tampón de lavado incluye fosfato de sodio entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM. En una realización, el segundo tampón de lavado incluye fosfato de sodio entre aproximadamente 20 mM y aproximadamente 50 mM a un pH entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. En una realización, el segundo tampón de lavado incluye fosfato de sodio aproximadamente 20 mM a un pH de aproximadamente 7.

En una realización, la proteína recombinante se recupera eluyendo la proteína recombinante de la columna de proteína A con un tampón de elución. En una realización, el tampón de elución incluye citrato de sodio. En una realización, el tampón de elución incluye entre citrato de sodio entre aproximadamente 25 mM y aproximadamente 200 mM. En una realización, el tampón de elución incluye entre citrato de sodio entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 100 mM. En una realización, el tampón de elución tiene un pH de entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 5,0. En una realización, el tampón de elución tiene un pH de entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 4,0. En una realización, el tampón de elución incluye citrato de sodio aproximadamente 100 mM a un pH de aproximadamente 3,5.

En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante y purificado mediante el método anterior es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo. En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante incluye un anticuerpo monoclonal totalmente humano seleccionado entre el anticuerpo 1 (un anticuerpo humano antiinterleucina (IL)-6) o el anticuerpo 2 (un anticuerpo monoclonal contra la IL-18 humana) (número de registro de la NCIMB 41786).

En otra realización, el polipéptido producido de manera recombinante incluye un anticuerpo que tiene una secuencia variable ácida de cadena ligera del anticuerpo 1 (SEQ ID NO: 8). En otra realización, el polipéptido producido de manera recombinante incluye un anticuerpo que tiene una secuencia variable de cadena pesada del anticuerpo 1 (SEQ ID NO: 7). En otra realización, el polipéptido producido de manera recombinante incluye un anticuerpo que tiene una secuencia variable de cadena ligera del anticuerpo 1 (SEQ ID NO: 8) y una secuencia variable de cadena pesada del anticuerpo 1 (SEQ ID NO: 7).

En otra realización, el polipéptido producido de manera recombinante incluye un anticuerpo que tiene una secuencia variable ácida de cadena ligera del anticuerpo 2 (SEQ ID NO: 18). En otra realización, el polipéptido producido de manera recombinante incluye un anticuerpo que tiene una secuencia variable de cadena pesada del anticuerpo 2 (SEQ ID NO: 16). En otra realización, el polipéptido producido de manera recombinante incluye un anticuerpo que tiene una secuencia variable de cadena ligera del anticuerpo 2 (SEQ ID NO: 18) y una secuencia variable de cadena pesada del anticuerpo 2 (SEQ ID NO: 16).

En una realización, el anticuerpo incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo 1 o del anticuerpo 2. Los términos región CDR o CDR, se refieren a las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina como se definen por Kabat et al. (Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a edición. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington o ediciones posteriores) o Chothia y Lesk (J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Un anticuerpo suele contener 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término CDR se utiliza en el presente documento para indicar, según el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad de estas regiones que contienen la mayoría de los restos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad del anticuerpo al antígeno o al epítopo que reconoce. Entre las seis secuencias de CDR cortas, la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) presenta una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad debida esencialmente a los mecanismos de ordenamiento de los genes que la originan). Puede ser tan corta como de 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es de 26. La longitud de las CDR también puede variar en función de la longitud que pueda acomodar el marco subyacente concreto. Funcionalmente, la HCDR3 desempeña un papel en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo. Un experto en la materia puede determinar las regiones c Dr de un anticuerpo. En general, la HCDR1 tiene una longitud de aproximadamente 5 aminoácidos, y consiste en los restos 31-35 de Kabat; la HCDR2 tiene una longitud de aproximadamente 17 aminoácidos, y consiste en los restos 50-65 de Kabat; la HCDR3 tiene una longitud de aproximadamente 11 o 12 aminoácidos, y consiste en los restos 95-102 de Kabat, e incluye opcionalmente el resto 100D de Kabat; la LCDR1 tiene una longitud de aproximadamente 11 aminoácidos, y consiste en los restos 24-34 de Kabat; la LCDR2 tiene una longitud de aproximadamente 7 aminoácidos, y consiste en los restos 50-56 de Kabat; y la LCDR3 tiene una longitud de unos 8 o 9 aminoácidos, y consiste en los restos 89-97 de Kabat, e incluye opcionalmente el resto 95 de Kabat.

En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye una o más secuencias de CDR de cadena ligera del anticuerpo 1 seleccionadas entre la LCDR1 (SEQ ID NO: 4); la LCDR2 (SEQ ID NO: 5), la LCDR3 (SEQ ID NO: 6) y combinaciones de las mismas. En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante es un anticuerpo que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que incluye una o más de las secuencias de CDR de cadena pesada del anticuerpo 1 seleccionadas entre la Hc DR1 (Se Q ID No : 1); la HCDR2 (SEQ ID NO: 2), la HCDR3 (SEQ ID NO: 3) y combinaciones de las mismas. En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye la LCDR1 (SEQ ID NO: 4); la LCDR2 (SEQ ID n O: 5) y la LCDR3 (SEQ ID NO: 6) del anticuerpo 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que incluye la HCDR1 (SEQ ID NO: 1); la HCDR2 (SEQ ID NO: 2) y la HCDR3 (SEQ ID NO:3) del anticuerpo 1.

En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye una o más secuencias de CDR de cadena ligera del anticuerpo 2 seleccionadas entre la LCDR1 (SEQ ID NO: 12); la LCDR2 (SEQ ID NO: 13), la LCDR3 (SEQ ID NO: 14) y combinaciones de las mismas. En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante es un anticuerpo que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene una o más de las secuencias de CDR de cadena pesada para el anticuerpo 2 seleccionadas entre la HCDR1 (SEQ ID NO: 9); la HCDR2 (SEQ ID NO: 10), la HCDR3 (SEQ Id NO: 11), y combinaciones de las mismas. En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante es un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye la LCDR1 (SEQ ID NO: 12); la LCDR2 (SEQ ID NO: 13) y la LCDR3 (SEQ ID NO: 14) del anticuerpo 2 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que incluye la HCDR1 (SEQ ID NO: 9); la HCDR2 (SEQ ID NO: 10) y la HCDR3 (SEQ ID NO: 11) del anticuerpo 2.

En otra realización, se proporciona un tampón de lavado para separar un polipéptido producido de manera recombinante de las proteínas de células hospedadoras (HCP) en una columna de cromatografía de proteína A. En una realización, el tampón de lavado incluye un ácido graso o una sal de ácido graso que tiene una longitud de cadena de al menos 6 átomos de carbono. En una realización, la longitud de la cadena del ácido graso o de la sal de ácido graso es de entre 6 y 12 átomos de carbono. En una realización, la longitud de la cadena del ácido graso o de la sal de ácido graso es de entre 8 y 12 átomos de carbono. En una realización, la longitud de la cadena del ácido graso o de la sal de ácido graso es de entre 8 y 10 átomos de carbono. En una realización, el ácido graso o la sal de ácido graso se selecciona entre el ácido enántico, el ácido caprílico, el ácido pelargónico, el ácido cáprico, el ácido undecíclico, el ácido láurico y combinaciones de los mismos. En una realización, el tampón de lavado incluye ácido caprílico o una sal del ácido caprílico. En una realización, el tampón de lavado incluye ácido graso de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 200 mM. En una realización, el tampón de lavado incluye ácido graso de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM. En una realización, el tampón de lavado incluye ácido graso aproximadamente 100 mM. En una realización, el tampón de lavado incluye cloruro de sodio. En una realización, el tampón de lavado incluye cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 1,0 M a aproximadamente 2,5 M. En una realización, el tampón de lavado incluye cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 2 M a aproximadamente 2,5 M. En una realización, el tampón de lavado incluye cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 2,5 M. En una realización, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 9. En una realización, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9. En una realización, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 9. En una realización, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 9. En una realización, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 100 mM a un pH entre aproximadamente 8 y aproximadamente 9. En una realización, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 100 mM a un pH entre aproximadamente 8 y aproximadamente 9 y cloruro de sodio entre aproximadamente 2,0 M y aproximadamente 2,5 M. En una realización, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio aproximadamente 100 mM en Tris 100 mM a un pH de aproximadamente 9,0. En una realización, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio aproximadamente 100 mM en Tris 100 mM a un pH de aproximadamente 9,0 y cloruro de sodio aproximadamente 2,5 M.

3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 es un diagrama de flujo de un proceso de purificación de muestras.

La figura 2 muestra los efectos del pH de lavado, del lavado con cloruro de sodio y del caprilato de sodio en la pureza del eluido.

La figura 3 muestra el efecto de la interacción entre el caprilato de sodio y el cloruro de sodio sobre la pureza del eluido.

La figura 4 muestra el impacto del lavado con cloruro de sodio y caprilato de sodio en la recuperación.

La figura 5 muestra el efecto de la interacción entre el cloruro de sodio y el caprilato de sodio en la recuperación. La figura 6 muestra las interacciones entre el pH de lavado, el lavado con cloruro de sodio y el caprilato de sodio en los niveles de HCP (antes de la filtración).

La figura 7 muestra las interacciones cuadráticas del pH de lavado y el cloruro de sodio en los niveles de HCP (antes de la filtración).

La figura 8 muestra la interacción entre el lavado con cloruro de sodio y el caprilato de sodio en los niveles de HCP (después de la filtración).

La figura 9 muestra los efectos combinados del pH de lavado, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio sobre la pureza, la recuperación y los niveles de HCP antes de la filtración.

Las figuras 10A-C son gráficas que muestran el efecto del pH de lavado, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio, en combinación, sobre los niveles de HCP antes de la filtración.

La figura 11 muestra el efecto del pH de lavado, del cloruro de sodio y del caprilato de sodio sobre los niveles de HCP.

La figura 12 muestra el efecto del pH de lavado, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio sobre la pureza del eluido.

La figura 13 muestra los efectos combinados del pH de lavado, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio sobre la pureza.

La figura 14 muestra el efecto del pH de lavado en la recuperación.

La figura 15 muestra el efecto del caprilato de sodio en los niveles de eluido de HCP.

La figura 16 muestra los efectos del pH de lavado, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio sobre los niveles de eluido de HCP.

La figura 17 muestra la interacción entre el cloruro de sodio y el caprilato de sodio y el efecto de la interacción en los niveles de eluido de HCP.

La figura 18 muestra el efecto del pH de lavado, del cloruro de sodio y del caprilato de sodio sobre la actividad proteasa.

La figura 19 muestra la interacción del pH de lavado, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio y el efecto de la interacción en la actividad proteasa.

Las figuras 20A y B muestran el efecto del pH de lavado y del cloruro de sodio sobre la actividad proteasa sin (A) y con (B) caprilato de sodio.

La figura 21 muestra los efectos combinados del pH, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio sobre la actividad proteasa.

La figura 22 muestra el efecto del pH, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio sobre la actividad proteasa. La figura 23 es una gráfica que muestra los niveles de HCP en el eluido de anti-IL-18 para los ocho desarrollos de tampón de lavado de ácidos grasos del ejemplo 3.

La figura 24 es una especificación de masas que muestra niveles indetectables de HCP en partículas sedimentadas que contienen anticuerpos anti-IL6.

La figura 25 es una gráfica que muestra los índices de pérdida de pureza, agregación y fragmentación (medidos mediante SEC) de varios lotes de anticuerpos anti-IL6 tras su conservación a 40 °C con diferentes niveles de proteínas de células hospedadoras (HCP).

La figura 26 es una gráfica que muestra el efecto de la HCP en la tasa de fragmentación a 40 °C (por RP-HPLC). La figura 27 es una gráfica que muestra el efecto del lavado con caprilato en la actividad proteasa.

La figura 28 es una gráfica que muestra la actividad de aspartil y serina proteasa en un lote formador de partículas.

4. DESCRIPCIÓN DETALLADA

4.1. Introducción

Un problema común que se encuentra durante la purificación con proteína A es la unión no específica de impurezas, como las proteínas de células hospedadoras (HCP), el ADN y otras impurezas procedentes del cultivo celular a la resina de la columna y a la proteína de interés. Por ejemplo, se ha observado que el eluido de una columna de proteína A tiene grandes cantidades de proteínas de células hospedadoras, por ejemplo, hasta aproximadamente 500 ng/mg, 600 ng/mg, 700 ng/mg, 800 ng/mg, 900 ng/mg, 1000 ng/mg, 1500 ng/mg, 2000 ng/mg o más de HCP. La presencia de HCP puede ser problemática, no solo por la normativa sanitaria relativa a los niveles aceptables de contaminantes en los productos de anticuerpos recombinantes, sino también porque la presencia de HCP puede afectar negativamente a la estabilidad y/o eficacia del producto, incluida, por ejemplo, la actividad proteasa y la formación de partículas, fragmentos o agregados visibles con el tiempo.

Los solicitantes han descubierto que la inclusión de un ácido graso en al menos un tampón de lavado de proteína A puede disminuir sustancialmente el nivel de proteínas de células hospedadoras en el eluido de proteína A. En un ejemplo, la inclusión de un ácido graso en al menos un tampón de lavado de proteína A puede disminuir sustancialmente la actividad proteasa en el eluido. Entre los ejemplos de proteasas se encuentran las serina proteasas, las aspartil proteasas, como la catepsina-D, las cisteína proteasas, las metaloproteasas, las aminopeptidasas y combinaciones de las mismas. Además, la inclusión de un ácido graso en un tampón de lavado de proteína A puede reducir la actividad proteasa en una formulación que contenga un polipéptido producido de manera recombinante. Además, la inclusión de un ácido graso en un tampón de lavado de proteína A puede aumentar la estabilidad de un polipéptido producido de manera recombinante, por ejemplo, reduciendo la formulación y/o la fragmentación de partículas.

En el presente documento se describe un proceso de purificación de polipéptidos producidos de manera recombinante. En una realización más particular, se describe un proceso de purificación de anticuerpos producidos de manera recombinante.

4.2. Terminología

A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tendrán los mismos significados comúnmente entendidos por los expertos en la materia. Además, salvo que el contexto exija lo contrario, los términos en singular incluirán los plurales y los términos en plural incluirán el singular. En general, la nomenclatura y las técnicas utilizadas en relación con el cultivo de células y tejidos, la biología molecular y la química e hibridación de proteínas y oligo o polinucleótidos que se describen en el presente documento son las conocidas y habitualmente utilizadas en la técnica. Se puede hacer referencia a los aminoácidos en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Igualmente, los nucleótidos pueden citarse por medio de sus códigos de tres letras comúnmente aceptados.

Como se usa de acuerdo con la presente divulgación, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se emplea para modificar, por ejemplo, la cantidad de un ingrediente en una composición, la concentración, el volumen, la temperatura de proceso, el tiempo de proceso, el rendimiento, el caudal, la presión y los intervalos de los mismos, empleados para describir la invención. El término "aproximadamente" se refiere a la variación de la cantidad numérica que puede producirse, por ejemplo, debido a los procedimientos típicos de medición y manipulación utilizados para producir compuestos, composiciones, concentrados o formulaciones; debido a un error involuntario en estos procedimientos; debido a diferencias en la fabricación, la fuente o la pureza de los materiales de partida o los ingredientes utilizados para llevar a cabo los métodos, y otras consideraciones similares. El término "aproximadamente" también abarca cantidades que difieren debido al envejecimiento de una formulación con una concentración o mezcla inicial particular, y cantidades que difieren debido al mezclado o procesamiento de una formulación con una concentración o mezcla inicial particular.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que incluyen al menos un dominio de unión que se forma a partir del plegado de cadenas polipeptídicas que tienen espacios de unión tridimensionales con formas de superficie interna y distribuciones de carga complementarias a las características de un determinante antigénico de un antígeno. Un anticuerpo suele tener una forma tetramérica, con dos pares de cadenas polipeptídicas, y cada par tiene una cadena "ligera" y una "pesada". Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman un sitio de unión del anticuerpo. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena espaciados de manera regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de una serie de dominios constantes (CH). Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante (CL) en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras se clasifican como cadenas lambda o como cadenas kappa dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera. En el presente documento, el dominio variable de una cadena ligera kappa también puede indicarse en el presente documento como VK.

Los términos "anticuerpo", "anticuerpos" e "inmunoglobulinas", como se usan en el presente documento, abarcan anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos fragmentos de unión a epítopos diferentes (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), con injertos de CDR, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de dominio único, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpo que presentan una actividad biológica deseada (por ejemplo, la porción de unión a antígeno), Fv ligados con disulfuro (dsFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), intracuerpos y fragmentos de unión a epítopos o derivados de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen al menos un sitio de unión a antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), subisotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o alotipo (por ejemplo, Gm, por ejemplo, G1m(f, z, a o x), G2m(n), G3m(g, b o c), Am, Em y Km(1,2 o 3)). Los anticuerpos pueden proceder de cualquier especie de mamífero, incluidos, pero sin limitación, seres humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc. u otros animales, como aves (por ejemplo, pollos). Los anticuerpos pueden fusionarse con una secuencia polipeptídica heteróloga, por ejemplo, un marcador para facilitar la purificación.

El término "unir" o "unión" cuando se analiza la interacción entre una molécula y un material de columna significa exponer la molécula al material de columna en condiciones tales que la molécula se inmoviliza de manera reversible en o sobre el material de la columna.

La expresión "sobrenadante de cultivo celular" se refiere a una solución que se obtiene cultivando células hospedadoras que producen un polipéptido recombinante de interés. Además del polipéptido recombinante, el sobrenadante del cultivo celular también puede incluir componentes del medio de cultivo celular, subproductos metabólicos secretados por las células hospedadoras, así como otros componentes de las células cultivadas. Como se usa en el presente documento, la expresión "sobrenadante de cultivo celular clarificado" se refiere a una composición de la que se han extraído o recolectado las células hospedadoras, de forma que el sobrenadante de cultivo celular está generalmente libre de restos celulares y/o células intactas.

El término "excipiente", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia inerte que se suele emplear como diluyente, vehículo, conservante, aglutinante o agente estabilizador de fármacos y que confiere una propiedad física beneficiosa a una formulación, como el aumento de la estabilidad de las proteínas, el aumento de la solubilidad de las proteínas y/o la disminución de la viscosidad. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero sin limitación, proteínas (por ejemplo, pero sin limitación, albúmina de suero), aminoácidos (por ejemplo, pero sin limitación, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina), tensioactivos (por ejemplo, pero sin limitación, SDS, Tween 20, Tween 80, polisorbato y tensioactivos no iónicos), sacáridos (por ejemplo, pero sin limitación, glucosa, sacarosa, maltosa y trehalosa), polioles (por ejemplo, pero sin limitación, manitol y sorbitol), ácidos grasos y fosfolípidos (por ejemplo, pero sin limitación, alquilsulfonatos y caprilato).

La expresión "célula hospedadora" o "células hospedadoras" se refiere a células que expresan un polipéptido recombinante. En particular, la expresión "célula hospedadora" se refiere a una célula que puede captar o ha captado un ácido nucleico, tal como un vector y soporta la replicación del ácido nucleico y la producción de uno o más productos codificados. La expresión "célula hospedadora" puede referirse a una variedad de tipos celulares que incluyen células procariotas, tales como Escherichia coli, Lactococcus lactis y especies de Bacillus; células de levadura, como Pichia pastoris, Pichia methanolica y Saccharomyces cerevisiae; células de insectos, tales como baculovirus y células eucariotas. Los ejemplos de células hospedadoras eucariotas incluyen células de mamífero, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK 293), células Vero, células de riñón de cría de hámster (BHK), células HeLa, células de riñón de mono CV1, células de riñón canino Madin-Darby (MDCK), células 3T3, líneas celulares de mieloma, células COS (por ejemplo, COS1 y COS7) y células PC12 y WI38. La expresión célula hospedadora también abarca combinaciones o mezclas de células que incluyen, por ejemplo, cultivos mixtos de diferentes tipos de células o líneas celulares.

El término "impureza" se refiere a cualquier material extraño, en particular una macromolécula biológica como el ADN, el ARN o una proteína, distinta del polipéptido producido de manera recombinante que está presente en una muestra. Los contaminantes pueden incluir proteínas de células hospedadoras distintas del polipéptido recombinante de interés.

El término "purificar" o "purificación" de un polipéptido recombinante a partir de una composición o solución que incluye el polipéptido recombinante y uno o más contaminantes significa aumentar el grado de pureza de la proteína deseada en la composición o solución eliminando (total o parcialmente) al menos un contaminante de la composición o solución.

El término "mAb" se refiere a un anticuerpo monoclonal (por las siglas del inglés monoclonal antibody).

La expresión "farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa cuenta con la aprobación por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal, o que aparece en la Farmacopea de los Estados Unidos, la Farmacopea Europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más concretamente en seres humanos.

Los términos "polipéptido" o "proteína" pueden utilizarse indistintamente para referirse a una molécula que tiene dos o más restos de aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. El término "polipéptido" puede referirse a anticuerpos y a otras proteínas distintas de anticuerpos. Las proteínas que no son anticuerpos incluyen, pero sin limitación, proteínas tales como enzimas, receptores, ligandos de una proteína de la superficie celular, proteínas secretadas y proteínas de fusión o fragmentos de las mismas. El polipéptido puede estar o no fusionado a otro polipéptido. Los polipéptidos también pueden incluir modificaciones tales como, pero sin limitación, glicosilación, unión a lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación. Los polipéptidos pueden ser de interés científico o comercial, incluidos los agentes terapéuticos a base de proteínas.

El término "recombinante" se refiere a un material biológico, por ejemplo, un ácido nucleico o una proteína, que ha sido alterado artificial o sintéticamente (es decir, de forma no natural) mediante intervención humana.

El término "eliminar", cuando se utiliza en el contexto de la eliminación de proteínas de células hospedadoras, se refiere a la reducción de la cantidad de proteínas de células hospedadoras en el producto purificado. La eliminación puede o no resultar en la ausencia de proteínas de células hospedadoras en el producto purificado. En general, la eliminación se refiere a una reducción de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces y hasta 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces o 50 veces las proteínas de células hospedadoras en el producto purificado, en comparación con el nivel de proteínas de células hospedadoras en la composición original.

Los términos "estabilidad" y "estable", como se usan en el presente documento en el contexto de una formulación de un polipéptido producido de manera recombinante, por ejemplo, una formulación farmacéutica que incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido de manera recombinante, se refieren a la resistencia del polipéptido en la formulación a la formación de partículas, agregación, degradación o fragmentación en las condiciones de fabricación, preparación, transporte y conservación. Una formulación "estable" conserva la actividad biológica en las condiciones de fabricación, preparación, transporte y conservación. La estabilidad puede evaluarse por los grados de formación de partículas, agregación, degradación o fragmentación, medidos por HPSEC, dispersión de luz estática (SLS), espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), dicroísmo circular (CD), técnicas de desplegamiento de la urea, fluorescencia intrínseca del triptófano, calorimetría diferencial de barrido y/o técnicas de unión a ANS, en comparación con una formulación de referencia.

Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a un material biológico que es la especie predominante presente (por ejemplo, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En una realización, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que el material biológico incluye al menos aproximadamente el 50 % (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composición sustancialmente pura incluirá más de aproximadamente un 80 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, o más de aproximadamente un 85 %, más de aproximadamente un 90 %, más de aproximadamente un 95 % o más de aproximadamente un 99 %. En una realización, el material biológico se purifica hasta alcanzar una homogeneidad esencial (no pueden detectarse especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales) y la composición incluye esencialmente una única especie macromolecular.

4.3. Producción de polipéptidos recombinantes

En una realización, un polipéptido recombinante se produce utilizando células hospedadoras que han sido transfectadas, de forma estable o transitoria, con un vector capaz de expresar uno o más polipéptidos de interés. Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a la composición de materia que puede utilizarse para suministrar un ácido nucleico de interés al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores que incluyen, pero sin limitación, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados a compuestos iónicos o anfífilos, plásmidos y virus. El término "vector" puede incluir un plásmido de replicación autónoma o un virus o un vector o un plásmido que no sea de replicación autónoma. El término "transfección" se refiere a la introducción de material genético exógeno en las células para producir células genéticamente modificadas. Los vectores pueden introducirse en una célula hospedadora mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un vector puede transferirse a una célula hospedadora por medios físicos, químicos o biológicos. Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen, pero sin limitación, precipitación con fosfato de calcio, lipofección (incluida la transfección mediada por liposomas cargados positivamente), bombardeo de partículas, microinyección, transfección mediada por DEAE-dextrano y electroporación. Los métodos biológicos para introducir un vector en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN, incluidos, por ejemplo, vectores víricos. Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, incluidas emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Las células hospedadoras pueden modificarse genéticamente para expresar un polipéptido recombinante, por ejemplo, un polipéptido de interés comercial o científico.

La expresión "cultivo celular" se refiere al crecimiento y propagación de células fuera de un organismo o tejido multicelular. Las condiciones del cultivo celular, como el pH, la temperatura, la humedad, la atmósfera y la agitación, pueden variarse para mejorar las características de crecimiento y/o productividad del cultivo celular. Las células hospedadoras pueden cultivarse en suspensión o adheridas a un sustrato sólido. Las células hospedadoras pueden cultivarse en cultivos a pequeña escala, por ejemplo, en un entorno de laboratorio en volúmenes tan bajos como de 25 ml y hasta aproximadamente 50 ml, hasta aproximadamente 100 ml, hasta aproximadamente 150 ml o hasta aproximadamente 200 ml. Como alternativa, los cultivos pueden ser a gran escala, por ejemplo, en volúmenes de aproximadamente 300 ml, 500 ml o 1000 ml y hasta aproximadamente 5000 ml, hasta aproximadamente 10.000 ml y hasta aproximadamente 15.000 ml. También se pueden utilizar biorreactores a escala comercial, por ejemplo, con volúmenes de hasta aproximadamente 1.000 l, hasta aproximadamente 5.000 l o hasta aproximadamente 10.000 l de medio. La producción a gran escala de polipéptidos recombinantes mediante células de mamíferos puede incluir sistemas de cultivo continuo, discontinuo y discontinuo alimentado. Las células hospedadoras pueden cultivarse, por ejemplo, en biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibra hueca, botellas rotatorias, matraces de agitación o biorreactores de tanque agitado, con 0 sin microportadores, y operados en modo discontinuo, discontinuo con alimentación, continuo, semicontinuo o de perfusión. Los cultivos celulares a gran escala suelen mantenerse durante días o incluso semanas, mientras las células producen los productos proteicos deseados.

Las células hospedadoras adecuadas para la producción de polipéptidos recombinantes incluyen células tanto procariotas como eucariotas. Los ejemplos de células eucariotas incluyen células de mamífero. Los ejemplos de células de mamífero adecuadas para la producción de polipéptidos recombinantes incluyen, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), de mieloma de ratón (NS0), de riñón embrionario humano (HEK 293), células de riñón de cría de hámster (BHK), células Vero, células HeLa, células de riñón canino Madin-Darby (MDCK), células de riñón de mono CV1, células 3t 3, líneas celulares de mieloma como NS0 y NS1, PC12, células WI38, células COS (incluidas COS-1 y COS-7) y C127. En general, los cultivos de células de mamífero se mantienen a un pH entre aproximadamente 6,5 y 7,5 y a una temperatura entre aproximadamente 36 °C y 38 °C, normalmente a aproximadamente 37 °C y una humedad relativa entre aproximadamente el 80 % y aproximadamente el 95 %. Los medios de cultivo de células de mamífero contienen normalmente sistemas tampón que requieren una atmósfera con dióxido de carbono (CO2) a entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 10 % o entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 6 %.

Las células hospedadoras pueden mantenerse en diversos medios de cultivo celular. La expresión "medio de cultivo celular" se refiere a una solución nutritiva en la que se cultivan las células hospedadoras. Las formulaciones de los medios de cultivo celular son bien conocidas en la técnica. Normalmente, los medios de cultivo celular incluyen tampones, sales, carbohidratos, aminoácidos, vitaminas y oligoelementos esenciales. El medio de cultivo celular puede contener o no suero, peptona y/o proteínas. Los medios de cultivo celular pueden complementarse con concentraciones adicionales o aumentadas de componentes, tales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, tampones, antibióticos, lípidos, oligoelementos y similares, en función de las necesidades de las células que se van a cultivar y/o de los parámetros de cultivo celular deseados. En el comercio se dispone de diversos medios de cultivo, incluidos medios de cultivo aséricos y definidos, e incluyen, pero sin limitación, medio esencial mínimo (MEM, Sigma, St. Louis, Mo.); medio F10 de Ham (Sigma); medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma); medio esencial mínimo (MEM); medio basal Eagle (BME); medio RPMI-1640 (Sigma); medio de cultivo celular HyClone (HyClone, Logan, Utah); y medios químicamente definidos (CD), que se formulan para tipos celulares particulares, por ejemplo, medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Si se desea, se pueden añadir componentes o ingredientes suplementarios a los medios comercialmente disponibles.

La expresión "polipéptido recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido o una proteína modificada genéticamente y producida por una célula hospedadora cultivada. Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" se refiere a un polipéptido recombinante que se produce por una célula hospedadora que normalmente no expresa ese polipéptido. Sin embargo, un polipéptido heterólogo puede incluir polipéptidos que son nativos de un organismo, pero que han sido alterados intencionalmente de alguna manera. Por ejemplo, un polipéptido heterólogo puede incluir un polipéptido que se expresa por una célula hospedadora que ha sido transfectada con un vector que expresa el polipéptido. Los polipéptidos recombinantes expresados por el cultivo celular pueden producirse intracelularmente o secretarse en el medio de cultivo, del que pueden recuperarse y/o recogerse.

En una realización, el polipéptido recombinante es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo. Un anticuerpo puede ser oligoclonal, policlonal, monoclonal, quimérico, camelizado, con injertos de CDR, multiespecífico, biespecífico, catalítico, humanizado, totalmente humano, antiidiotípico y anticuerpos que pueden marcarse en forma soluble o unida, así como fragmentos, incluidos fragmentos de unión a epítopos, variantes o derivados de los mismos, ya sea solos o en combinación con otras secuencias de aminoácidos. Un anticuerpo puede ser de cualquier especie. El término anticuerpo también incluye fragmentos de unión, incluidos, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpos monocatenarios (svFC), regiones variables diméricas (diacuerpos) y regiones variables ligadas por disulfuro (dsFv). Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede fusionarse con una secuencia polipeptídica heteróloga, tal como un marcador de afinidad, para facilitar la purificación. Los ejemplos de marcadores de afinidad incluyen, pero sin limitación, marcadores de polihistidina, marcadores de GFP, marcadores FLAG, marcadores GST, marcadores V5 y marcadores Myc.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-18 o un anticuerpo anti-IL6 o un fragmento del mismo. En otras realizaciones, el anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo que se purifica junto con las proteínas de células hospedadoras.

En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye una o más secuencias de CDR de cadena ligera del anticuerpo 1 seleccionadas entre la LCDR1 (SEQ ID NO: 4); la LCDR2 (SEQ ID NO: 5), la LCDR3 (SEQ ID NO: 6) y combinaciones de las mismas. En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante es un anticuerpo que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que incluye una o más de las secuencias de CDR de cadena pesada del anticuerpo 1 seleccionadas entre la Hc DR1 (SeQ ID No : 1); la HCDR2 (SEQ ID NO: 2), la HCDR3 (SEQ ID NO: 3) y combinaciones de las mismas. En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye la LCDR1 (SEQ ID NO: 4); la LCDR2 (SEQ ID nO: 5) y la LCDR3 (SEQ ID NO: 6) del anticuerpo 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que incluye la HCDR1 (SEQ ID NO: 1); la HCDR2 (SEQ ID NO: 2) y la HCDR3 (SEQ ID NO:3) del anticuerpo 1.

4.4 Purificación

La primera etapa en la recuperación de un polipéptido producido de manera recombinante (también denominado en el presente documento "polipéptido diana" o "diana") a partir de un cultivo celular es la eliminación de las células hospedadoras intactas y de los restos de células hospedadoras del medio de cultivo, lo que se denomina "recolección", para obtener un sobrenadante de cultivo celular clarificado que contiene el polipéptido producido de manera recombinante junto con otras impurezas restantes. La recolección se realiza generalmente por centrifugación, floculación/precipitación, filtración en profundidad y filtración estéril, aunque pueden utilizarse otros métodos.

Los anticuerpos producidos de manera recombinante pueden producirse de manera intracelular, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio. En caso de que el anticuerpo se produzca de manera intracelular, como primera etapa, se eliminan los desechos en partículas, ya sean células hospedadoras o fragmentos listados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes del sistema de expresión pueden concentrarse, por ejemplo, utilizando un filtro de concentración de proteínas comercial, tal como una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Para inhibir la proteólisis, se puede incluir un inhibidor de proteasa o un cóctel de inhibidores de proteasa, que incluye uno o más inhibidores de proteasas, tales como bestatina, aprotinina, pepstatina, leupeptina, clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF) y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF). En otras realizaciones, se pueden incluir uno o más antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes casuales. Los ejemplos de antibióticos adecuados incluyen, pero sin limitación, actinomicina D, ampicilina, carbenicilina, cefotaxima, fosmidomicina, gentamicina, kanamicina, neomicina, penicilina, polimixina B y estreptomicina.

Una vez obtenido el sobrenadante de cultivo celular clarificado, el polipéptido diana puede purificarse aún más mediante la eliminación de otras impurezas en el sobrenadante de cultivo celular que pueden incluir, pero sin limitación, proteínas de células hospedadoras (HCP), ADN, virus casuales y endógenos, endotoxinas, agregados y otras especies. La mayoría de los métodos de purificación implican alguna forma de cromatografía en la que las moléculas diana en solución (fase móvil) se separan basándose en una diferencia de interacción química o física con un material estacionario (fase sólida). Los métodos cromatográficos generales y su uso son conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Se conocen muchos métodos diferentes para la purificación de polipéptidos recombinantes, e incluyen, pero sin limitación, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de hidroxiapatita, la cromatografía de exclusión por tamaños, la electroforesis en gel, la diálisis y combinaciones de las mismas. También pueden incluirse en el proceso de purificación otras técnicas de purificación de proteínas, tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, isoelectroenfoque, HPLC en fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía en heparina, cromatografía en SEPHAROSE o en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio. A menudo, se utiliza una combinación de diferentes procesos de purificación, de manera que los diferentes procesos separan el polipéptido basándose en diferentes principios, como la afinidad, la carga, el grado de hidrofobia y/o el tamaño. Existen muchas resinas cromatográficas diferentes para cada técnica, de modo que se puede adaptar un esquema de purificación al polipéptido recombinante concreto. La cromatografía en columna puede realizarse con sistemas automatizados, como el sistema AKTA AVANT de GE Healthcare, que utiliza una bomba para forzar el paso del disolvente por una columna empaquetada a un caudal determinado o puede realizarse por flujo de gravedad. Tanto los sistemas automatizados como los de flujo por gravedad pueden acoplarse a sistemas automáticos de recogida de fracciones.

En una realización, se emplea una combinación de procesos de purificación como esquema de purificación. En la figura 1 se muestra un ejemplo de un esquema de purificación 100 como un diagrama de flujo. El esquema de purificación 100 de la muestra incluye una primera etapa en la que el polipéptido recombinante se produce, por ejemplo, por expresión en una célula hospedadora y se recolecta 101. Los métodos de producción y recolección de polipéptidos recombinantes se han analizado anteriormente. A continuación, el polipéptido recombinante se captura 102, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad. En una realización, el polipéptido recombinante es un anticuerpo y se utiliza la cromatografía de afinidad con proteína A para la captura 102. El proceso de purificación también puede incluir una o más etapas de cromatografía de eliminación de impurezas 104, 105. Para mejorar la eliminación del virus, también se puede incluir en el esquema de purificación 100 una etapa de inactivación de virus 103 y/o una etapa de filtración de virus 106. Por último, el producto purificado puede concentrarse y diafiltrarse en un tampón de formulación final 107. Obsérvese que el esquema proporcionado en la figura 1 es simplemente un ejemplo, y las variaciones, por ejemplo, en el orden de las etapas, el número de pasos y los métodos de purificación utilizados para cada paso, se encuentran dentro de las capacidades de un experto en la materia.

En una realización, la captura 102 se lleva a cabo mediante cromatografía de afinidad. La cromatografía de afinidad se refiere a un método cromatográfico en el que una biomolécula, como un polipéptido producido de manera recombinante, se separa basándose en una interacción reversible específica entre el polipéptido y un compañero de unión acoplado covalentemente a la fase sólida. Los ejemplos de interacciones de afinidad incluyen, pero sin limitación la interacción reversible entre un antígeno y un anticuerpo, una enzima y un sustrato, o un receptor y un ligando. En una realización, la cromatografía de afinidad implica el uso de proteínas microbianas, como la proteína A o la proteína G. La proteína A es una proteína de la pared celular bacteriana que se une a las IgG de mamíferos principalmente a través de sus regiones Fc. La resina de proteína A es útil para la purificación por afinidad y el aislamiento de una variedad de isotipos de anticuerpos, en particular IgG1, IgG2 e IgG4. Se dispone de muchas resinas de proteína A que son adecuadas para su uso en el proceso de purificación descrito en el presente documento. Las resinas se clasifican generalmente en función de la composición de su cadena principal e incluyen, por ejemplo, resinas a base de vidrio o sílice; resinas a base de agarosa; y resinas a base de polímeros orgánicos.

En una realización, la cromatografía de afinidad de proteína A se utiliza para capturar un anticuerpo producido de manera recombinante. El caudal que atraviesa un soporte de cromatografía de afinidad es un parámetro importante para optimizar la separación. Aunque puede ser deseable un tiempo de separación reducido, un flujo demasiado rápido puede hacer que la fase móvil pase por la fase sólida más rápido que el tiempo de difusión necesario para que alcance el volumen interno de la perla. En general, se utiliza un caudal de al menos aproximadamente 50 cm/h, 100 cm/h, 150 cm/h, 200 cm/h o 250 cm/h y hasta aproximadamente 300 cm/h, 350 cm/h, 400 cm/h, 450 cm/h o 500 cm/h. También pueden variar las dimensiones de la columna. Aunque las columnas a escala de laboratorio suelen tener un diámetro de columna inferior a 1 cm o inferior a 5 cm, las columnas a gran escala o de producción comercial pueden utilizar columnas con diámetros de hasta 1 metro o incluso de hasta 2 metros. Para la producción a gran escala o comercial, la altura del lecho de la columna es generalmente de al menos aproximadamente 10 cm, 15 cm o 20 cm, y hasta aproximadamente 25 cm o 30 cm.

La composición de las soluciones tampón y el volumen de las soluciones tampón utilizadas en relación con la purificación de la proteína A pueden variar. El término "tampón" o la expresión "solución tamponada", se refiere a una solución capaz de resistir los cambios de pH. A menudo, un tampón está formado por un par de ácido-base débil conjugado, por ejemplo, un ácido débil y su base conjugada o una base débil y su ácido conjugado. En algunos tampones, se aplica el agente tampón en forma un ácido o una base cristalina, por ejemplo, Tris se suministra como una base cristalina, que se disuelve en agua para formar una solución tampón. El pH de la solución tampón puede ajustarse con un ácido o una base adecuados. Por ejemplo, el ácido clorhídrico (HCI) puede utilizarse para ajustar el pH de una solución tampón de Tris. Otros tampones se preparan mezclando dos componentes, tal como un ácido o una base libre y una sal correspondiente, en proporciones que permiten alcanzar el pH deseado. Por ejemplo, se puede preparar una solución tampón de citrato de sodio y ajustarla al pH deseado combinando ácido cítrico y citrato trisódico para formar una solución con el pH deseado. Otros tampones se fabrican mezclando un componente tampón y su ácido o base conjugados. Por ejemplo, se puede preparar un tampón fosfato mezclando soluciones de fosfato de sodio monobásico o dibásico en una proporción que permita alcanzar un pH deseado. En otra realización, puede prepararse un sistema tampón de bicarbonato de sodio combinando soluciones de carbonato de sodio y bicarbonato de sodio para formar una solución tampón que tenga un pH deseado.

En una realización, la columna se equilibra con un "tampón de equilibrado" antes de la carga. La expresión "tampón de equilibrado" se refiere a un tampón que puede utilizarse para eliminar los residuos no deseados de la matriz de la columna y para preparar la fase sólida de la matriz de la columna para cargar la proteína diana, por ejemplo, ajustando el pH de la columna. Cuando se utiliza para la purificación de anticuerpos, el pH del tampón de equilibrado es al menos de aproximadamente 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, o 7,9, y hasta de aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, o 9,0. En una realización, el tampón de equilibrado incluye un agente tampón, tal como tris(hidroximetil)aminometano (a menudo denominado "Tris") (intervalo de pH de 5,8-8,0), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (intervalo de pH de 6,8-8,2), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) (intervalo de pH de 6,5-7,9) u otros agentes tampón de fosfato (pH 5,8-8,0) a una concentración de al menos aproximadamente 10 mM, 25 mM, 50 mM o 75 mM y hasta aproximadamente 100 mM, 125 mM o 150 mM. En una realización, el pH de la solución tampón puede ajustarse utilizando un ácido o una base adecuados, tal como ácido clorhídrico (HCI) o hidróxido de sodio/hidróxido de potasio (NaOH/KOH). En una realización, el tampón de equilibrado incluye fosfato de sodio a al menos aproximadamente 10 mM, 15 mM o 20 mM y hasta aproximadamente 25 mM, 30 mM, 50 mM o 100 mM a un pH de al menos aproximadamente 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6.6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, o 7,9, y hasta aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8.7, 8,8, 8,9, o 9,0. Además, el tampón puede incluir uno o más aditivos para aumentar la pureza, la estabilidad y la función de las proteínas, incluidos, pero sin limitación, agentes reductores, tal como 2-mercaptoetanol (BME), ditiotreitol (DDT) o Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para proteger contra el daño oxidativo, inhibidores de proteasas, incluidos, pero sin limitación, leupeptina, pepstatina A y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) para inhibir las proteasas endógenas frente a la degradación del polipéptido diana, quelantes de metales, incluidos, pero sin limitación, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) para inactivar las metaloproteasas, osmolitos, incluidos, pero sin limitación, glicerol, detergentes y azúcares para estabilizar la estructura de la proteína o estabilizadores iónicos, incluidos, pero sin limitación, sales como NaCl, KCI y (NH4)2SO4 para mejorar la solubilidad. En una realización, la columna se equilibra utilizando al menos aproximadamente 5 y hasta aproximadamente 10 o 20 volúmenes de columna del tampón de equilibrado antes de cargar el polipéptido producido de manera recombinante en la columna.

En una realización, se carga en la columna un sobrenadante de cultivo celular clarificado. En una realización, el sobrenadante de cultivo celular clarificado se carga en la columna después de que ésta se haya equilibrado con un tampón de equilibrado. En otra realización, el sobrenadante de cultivo celular clarificado se carga en la columna en combinación con un tampón de carga. La expresión "tampón de carga" se refiere a un tampón que se combina con una composición que incluye el polipéptido diana antes de cargar la diana en una columna. En general, el polipéptido diana se carga a una concentración de al menos aproximadamente 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml o 25 mg/ml y hasta aproximadamente 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml o 100 mg/ml. En una realización, el sobrenadante de cultivo celular clarificado se diluye con un tampón de carga en una proporción de aproximadamente 1:1, 1:2 o 1:3, por ejemplo, para lograr una concentración deseada para el polipéptido diana y/o para ajustar el pH de la solución. En otras realizaciones, el sobrenadante de cultivo celular clarificado se carga directamente en la columna (es decir, el sobrenadante no se diluye con un tampón de carga). En una realización, la columna se reequilibra con un tampón de equilibrado después de cargar el sobrenadante de cultivo celular clarificado. En una realización más particular, la columna se reequilibra con al menos aproximadamente 5 y hasta aproximadamente 10 o 20 volúmenes de columna del tampón de equilibrado o del tampón de carga después de cargar el polipéptido diana en la columna. En general, el polipéptido diana se carga en la columna de proteína A a un pH de al menos aproximadamente 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6.6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, o 7,9, y hasta aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8.7, 8,8, 8,9, o 9,0. En algunas realizaciones, el tampón de carga es el mismo que el tampón de equilibrado. En otras realizaciones, el tampón de carga y el tampón de equilibrado no son iguales. En otras realizaciones, el tampón de carga se utiliza también como tampón de lavado para lavar la columna después de la carga.

En una realización, el tampón de carga incluye un agente tampón, tal como tris(hidroximetil)aminometano (a menudo denominado "Tris") (intervalo de pH de 5,8-8,0), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (intervalo de pH de 6,8-8,2), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) (intervalo de pH de 6,5-7,9) u otros agentes tampón de fosfato, tal como el fosfato de sodio o los tampones de fosfato-citrato (pH 5,8-8,0) a una concentración de al menos aproximadamente 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM y hasta aproximadamente 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM o 100 mM. En una realización, el pH de la solución tampón puede ajustarse utilizando un ácido o una base adecuados, tal como ácido clorhídrico (HCI) o hidróxido de sodio/hidróxido de potasio (NaOH/KOH). Cuando se utiliza para la purificación de anticuerpos, el pH del tampón de carga se ajusta generalmente a al menos aproximadamente 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6.5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, o 7,9, y hasta aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8.6, 8,7, 8,8, 8,9, o 9,0. En una realización más particular, el tampón de carga incluye fosfato de sodio al menos aproximadamente 10 mM, 15 mM o 20 mM y hasta aproximadamente 25 mM, 30 mM, 50 mM o 100 mM con un pH de al menos 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, o 7,9, y hasta aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, o 9,0. En una realización, la columna se reequilibra después de la carga utilizando al menos aproximadamente 5, y hasta aproximadamente 10 o 20 volúmenes de columna del tampón de equilibrado o de carga. Además, el tampón de equilibrado puede incluir uno o más aditivos para aumentar la pureza, la estabilidad y la función de las proteínas, incluidos, pero sin limitación, agentes reductores, tales como 2-mercaptoetanol (BME) ditiotreitol (DDT) o Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para proteger frente al daño oxidativo, inhibidores de proteasas, incluidos, pero sin limitación, leupeptina, pepstatina A y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) para inhibir las proteasas endógenas frente a la degradación del polipéptido diana, quelantes de metales, incluidos, pero sin limitación, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), para inactivar las metaloproteasas, osmolitos, incluidos, pero sin limitación, glicerol, detergentes y azúcares para estabilizar la estructura de la proteína o estabilizadores iónicos, incluidos, pero sin limitación, sales tales como NaCl, KCI y (NH4)2SO4 para mejorar la solubilidad.

La expresión "tampón de lavado" se refiere a un tampón que se hace pasar sobre el material de la columna después de que la composición diana se haya cargado en la columna y antes de la elución del polipéptido diana producido de manera recombinante. El tampón de lavado puede servir para eliminar uno o más contaminantes, por ejemplo, las proteínas de células hospedadoras, del material de la columna, sin una elución sustancial de la diana. En general, el tampón de lavado tiene un pH de al menos aproximadamente 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7.8, o 7,9, y hasta aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, o 9,0. En una realización, el proceso incluye un tampón de lavado, en donde la columna se lava utilizando al menos aproximadamente 5, o hasta aproximadamente 10 o 20 volúmenes de columna de un único tampón de lavado. En otras realizaciones, el proceso puede incluir más de un tampón de lavado, por ejemplo, el proceso puede incluir dos tampones de lavado diferentes. Por ejemplo, el proceso puede incluir una primera etapa de lavado en la que la columna se lava utilizando al menos aproximadamente 5, o hasta aproximadamente 10 o 20 volúmenes de columna de un primer tampón de lavado y una segunda etapa de lavado en la que la columna se lava utilizando al menos aproximadamente 5, o hasta aproximadamente 10 o 20 volúmenes de columna de un segundo tampón de lavado. En una realización, al menos un tampón de lavado es el mismo que el tampón de equilibrado. En otra realización, al menos un tampón de lavado es diferente del tampón de equilibrado.

En otra realización se describe un proceso de purificación en el que se reducen los niveles residuales de proteínas de células hospedadoras (HCP) en el eluido de una purificación con proteína A. En una realización más particular, los niveles residuales de HCP se reducen mediante la inclusión de un ácido graso en un tampón de lavado utilizado con la columna de proteína A. En una realización, se describe un método para separar un polipéptido producido de manera recombinante de las proteínas de células hospedadoras. En otra realización, se describe un método para mejorar la estabilidad de un polipéptido producido de manera recombinante. En otra realización, se proporciona un método para reducir la contaminación por proteasas en una formulación que contiene un polipéptido producido de manera recombinante.

En general, los ácidos grasos de cadena corta, por ejemplo, los que tienen una longitud de cadena inferior a aproximadamente 6 átomos de carbono, no alteran significativamente el nivel de las HCP en el eluido. Sin embargo, a medida que aumenta la longitud de la cadena de los ácidos grasos, se observa una reducción de la HCP. En particular, la inclusión de ácidos grasos con una longitud de cadena media (es decir, entre aproximadamente 6 átomos de carbono y aproximadamente 12 átomos de carbono) en el tampón de lavado reduce significativamente la cantidad de HCP observadas en el eluido. Los ejemplos de ácidos grasos o sales de ácidos grasos adecuados para su inclusión en un tampón de lavado de proteína A incluyen, pero sin limitación, ácidos grasos con una longitud de cadena de al menos aproximadamente 6, 7, 8 o 9 átomos de carbono y hasta aproximadamente 10, 11 o 12 átomos de carbono, o sales de ácidos grasos de los mismos, incluidos, pero sin limitación, ácido enántico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido cáprico, ácido undecíclico, ácido láurico o combinaciones y sales de los mismos. En una realización, el ácido graso se incluye en un tampón de lavado a una concentración de al menos aproximadamente 25 mM o 50 mM y hasta aproximadamente 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM o 200 mM. En una realización, el tampón de lavado incluye una solución de ácido graso preparada con un agente tampón, tal como tris(hidroximetil)aminometano (a menudo denominado "Tris") (intervalo de pH de 5,8-8,0), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (intervalo de pH de 6,8-8,2), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) (intervalo de pH de 6,5-7,9), en donde el ácido graso tiene una concentración de al menos aproximadamente 25 mM o 50 mM y hasta aproximadamente 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM o 200 mM y el agente tampón tiene una concentración de al menos aproximadamente 10 mM, 25 mM, 50 mM o 75 mM y hasta aproximadamente 100 mM, 125 mM o 150 mM y la solución tiene un pH de al menos aproximadamente 6.0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, o 7,9, y hasta aproximadamente 8,0, 8.1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, o 9,0. En una realización, el pH de la solución tampón puede ajustarse utilizando un ácido o una base adecuados, tal como ácido clorhídrico (HCI) o hidróxido de sodio/hidróxido de potasio (NaOH/KOH).

Sin desear quedar ligados a la teoría, se cree que el ácido graso elimina las HCP al competir con las HCP por los sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, el nivel de proteínas de células hospedadoras puede reducirse hasta el 75 %, 50 %, 25 %, 10 % o incluso a un nivel tan bajo como el 5 % del nivel de proteínas de células hospedadoras en el eluido obtenido de una columna que se lavó con un tampón de control que no incluye un ácido graso. En otra realización, el nivel de proteínas de células hospedadoras puede reducirse al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces y hasta 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces o 50 veces en comparación con el nivel de proteínas de células hospedadoras obtenido utilizando un lavado que no incluye un ácido graso.

En otra realización, la inclusión de un ácido graso en un lavado de proteína A puede aumentar la estabilidad de un polipéptido producido de manera recombinante, como un anticuerpo, obtenido de la purificación con proteína A. En una realización, la inclusión de un ácido graso en un lavado de proteína A reduce la actividad proteasa, lo que puede mejorar la estabilidad del polipéptido producido de manera recombinante, por ejemplo, el anticuerpo producido de manera recombinante. En una realización, la inclusión de un ácido graso en un lavado de Proteína A reduce la actividad de proteasas tales como serina proteasas, aspartil proteasas, tales como catepsina-D, cisteína proteasas, metaloproteasas y aminopeptidasas en el eluido o en una formulación posterior que contenga el polipéptido producido de manera recombinante obtenido de la etapa de purificación de Proteína A. La reducción de la actividad proteasa puede medirse utilizando cualquier ensayo adecuadamente sensible, incluyendo, pero sin limitación, el kit de ensayo de proteasa EnzChek® E6638 de Molecular Probes, Eugene, OR. También puede utilizarse cualquier ensayo que pueda detectar o cuantificar de forma fiable niveles >10 ng/ml para preparaciones de control de proteasas, tales como aspartil proteasa, catepsina-D o la serina proteasa, tripsina.

En otra realización, la inclusión de un ácido graso en un lavado de proteína A da lugar a una reducción de la formación de partículas, que está relacionada con la estabilidad del producto, en el eluido o en una formulación posterior que contenga el polipéptido producido de manera recombinante obtenido en la etapa de purificación de proteína A. En otra realización, la inclusión de un ácido graso en un lavado de proteína A da lugar a una reducción de la formación de partículas de aparición retardada, que está relacionada con la estabilidad del producto, en el eluido o en una formulación posterior que contenga el polipéptido producido de manera recombinante obtenido en la etapa de purificación de proteína A. La formación de partículas puede determinarse mediante inspección visual. Por ejemplo, la inspección visual de las partículas, la limpidez/opalescencia y el color puede realizarse basándose en los procedimientos adaptados de las secciones 2.9.20, 2.2.1 y 2.2.2 de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.), respectivamente. Los niveles de partículas en las muestras pueden compararse con una serie de patrones de partículas visibles de sulfato de bario. A modo de ejemplo, las normas que pueden utilizarse son: "libre de partículas visibles" (0); cuatro gradaciones de "prácticamente libre de partículas visibles" (1 a 4); y tres gradaciones de "contiene partículas visibles" (5, 6 y 7). En una realización, cualquier muestra valorada como 'contiene partículas visibles' se considera 'no acorde'. En una realización, la opalescencia puede evaluarse por comparación con diluciones de un patrón de formazina estabilizada (2660642) obtenido de Hache-Lange (Loveland, CO). El color puede evaluarse por comparación con los patrones (83952) de Sigma-Fluke (St. Louis, MO).

Como se usa en el presente documento, la expresión "de aparición retardada" se refiere a la formación de partículas que, aunque no se observan inicialmente en la formulación, se forman después de un periodo de tiempo, por ejemplo, después de 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses o hasta 12 meses, 18 meses o 24 meses. En una realización, la formación de partículas se reduce cuando una formulación que contiene el polipéptido producido de manera recombinante se almacena a una temperatura de al menos aproximadamente 0 °C, 5 °C o 10 °C y hasta aproximadamente 25 °C o 40 °C.

En otra realización, la inclusión de un ácido graso en un lavado de proteína A da lugar a la reducción de la fragmentación del polipéptido, que también está relacionada con la estabilidad del producto, en el eluido o en una formulación posterior. En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante en una formulación posterior a un proceso de purificación en el que se incluyó un ácido graso en al menos un lavado de proteína A tiene una tasa de fragmentación inferior al 5 %, 4,5 %, 4 %, 3,5 %, 3 %, 2,5 %, 2 %, 1,5 %, 1 %, 0,95 %, 0,90 %, 0,80 % o 0,75 % al mes cuando se almacena a 40 °C. Los métodos para detectar la fragmentación del polipéptido son conocidos e incluyen, por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC).

Además del ácido graso, otros elementos del tampón de lavado pueden influir en el nivel de las HCP detectado en el eluido. En particular, al aumentar el pH del tampón de lavado, puede reducirse el nivel de las HCP. Además, la concentración de sal, tal como cloruro de sodio, en el tampón de lavado también puede influir en el nivel de las HCP detectado en el eluido. En general, a medida que aumenta la concentración de sal o de cloruro de sodio, disminuye el nivel de las HCP en el eluido. En una realización, el tampón de lavado tiene un pH de al menos aproximadamente 6,0, 6.1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, o 7,9, y hasta aproximadamente 8,0, 8,1, 8.2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, o 9,0 e incluye sal a al menos aproximadamente 0,25 M, 0,5 M, 1 M, 1,25 M, 1,5 M, 1,75 M o 2 M, tal como cloruro de sodio y sal hasta a aproximadamente 2,0 M, 2,25 M, 2,5 M, 2,75 M o 3,0 M, tal como cloruro de sodio y un ácido graso a una concentración de al menos aproximadamente 25 mM o 50 mM y hasta aproximadamente 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM o 200 mM. En una realización, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 100 mM a un pH entre aproximadamente 8 y aproximadamente 9. En otra realización, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 100 mM a un pH entre aproximadamente 8 y aproximadamente 9 y cloruro de sodio entre aproximadamente 2,0 M y aproximadamente 2,5 M. En una realización más particular, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 100 mM en Tris 100 mM a un pH entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente 9,0. En una realización más particular, el tampón de lavado incluye caprilato de sodio de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM en Tris 100 mM a un pH entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente 9,0 y cloruro de sodio entre aproximadamente 2,0 M y aproximadamente 2,5 M.

Además, el tampón de lavado puede incluir uno o más aditivos para aumentar la pureza, la estabilidad y la función de las proteínas, incluidos, pero sin limitación, agentes reductores, tales como 2-mercaptoetanol (BME) ditiotreitol (DDT) o T ris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para proteger frente al daño oxidativo, inhibidores de proteasas, incluidos, pero sin limitación, leupeptina, pepstatina A y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) para inhibir las proteasas endógenas frente a la degradación del polipéptido diana, quelantes de metales, incluidos, pero sin limitación, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), para inactivar las metaloproteasas, osmolitos, incluidos, pero sin limitación, glicerol, detergentes y azúcares para estabilizar la estructura de la proteína o estabilizadores iónicos, incluidos, pero sin limitación, sales tales como NaCl, KCI y (NH4)2SO4 para mejorar la solubilidad.

La expresión "tampón de elución" se refiere a un tampón utilizado para eluir (es decir, eliminar) el polipéptido diana de la columna. El pH de elución puede variar en función de la afinidad de unión del polipéptido a la columna. Algunos anticuerpos demuestran una mayor afinidad de unión y pueden requerir un pH de elución más bajo. En general, el pH del tampón de elución es inferior al del tampón de carga. Típicamente, el tampón de elución tiene un pH de al menos aproximadamente 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, o 3,5 y hasta aproximadamente 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,5, 4,7, 4,8, 4,9 o 5,0. Los ejemplos de tampón de elución incluyen tampones que incluyen citrato de sodio, ácido cítrico o ácido acético a una concentración de al menos aproximadamente 25 mM, 50 mM y hasta aproximadamente 100 mM, 150 mM o 200 mM. En una realización, el tampón de elución incluye citrato de sodio a al menos aproximadamente 25 mM, 50 mM y hasta aproximadamente 100 mM, 150 mM o 200 mM y tiene un pH de al menos aproximadamente 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, o 3,5 y hasta aproximadamente 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,5, 4,7, 4,8, 4,9 o 5,0. Además, el tampón de elución puede incluir uno o más aditivos para aumentar la pureza, la estabilidad y la función de las proteínas, incluidos, pero sin limitación, agentes reductores, tal como 2-mercaptoetanol (BME), ditiotreitol (DDT) o Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para proteger contra el daño oxidativo, inhibidores de proteasas, incluidos, pero sin limitación, leupeptina, pepstatina A y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) para inhibir las proteasas endógenas frente a la degradación del polipéptido diana, quelantes de metales, incluidos, pero sin limitación, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) para inactivar las metaloproteasas, osmolitos, incluidos, pero sin limitación, glicerol, detergentes y azúcares para estabilizar la estructura de la proteína o estabilizadores iónicos, incluidos, pero sin limitación, sales como NaCl, KCI y (NH4)2SO4 para mejorar la solubilidad. En una realización, la molécula objetivo se eluye utilizando al menos 5 y hasta 10 o hasta 20 volúmenes de columna de tampón de elución. El eluido puede controlarse mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, controlando la absorbancia con un espectrofotómetro ajustado a una DO280 nm. En una realización, la etapa de purificación de proteína A tiene una tasa de recuperación de al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 % u 85 % y hasta un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % o 95 %. La recuperación puede determinarse, por ejemplo, calculando el porcentaje de proteína en el eluido en relación con la cantidad que se cargó en la columna.

Las etapas 104, 105 de la cromatografía de eliminación de impurezas posibilitan la eliminación adicional de proteínas de células hospedadoras (HCP), endotoxinas y ADN, a la vez que ayuda a la eliminación de agregados, variantes de producto no deseadas y otros contaminantes menores. Las etapas de eliminación de impurezas 104, 105 generalmente incluyen una o más etapas cromatográficas, tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de modo mixto, cromatografía de interacción hidrófoba y combinaciones de las mismas.

En una realización, el proceso de purificación incluye al menos una etapa de cromatografía de intercambio iónico. La expresión "cromatografía de intercambio iónico" se refiere a un proceso cromatográfico que utiliza una matriz inmóvil que porta sustituyentes cargados unidos covalentemente. El "material de intercambio iónico" tiene la capacidad de intercambiar sus contraiones, que no están unidos covalentemente, por compañeros de unión o iones con una carga similar en la solución circundante. Los polipéptidos tienen numerosos grupos funcionales que pueden tener cargas positivas o negativas. La cromatografía de intercambio iónico separa los polipéptidos en función de la carga neta, que depende del pH y/o de la concentración iónica de la fase móvil. Por tanto, los polipéptidos pueden separarse ajustando el pH y/o la concentración iónica de la fase móvil. En algunas realizaciones, el polipéptido diana se captura por la columna y posteriormente se eluye (también denominado modo de "unión y elución"). En otras realizaciones, el polipéptido diana fluye a través de la columna y los contaminantes se unen (también denominado "modo de flujo"). La elución a partir de un material de intercambio iónico se consigue generalmente aumentando la fuerza iónica del tampón para que compita con el polipéptido recombinante por los sitios cargados de la matriz de intercambio iónico. El proceso de elución puede ser gradual (elución en gradiente) o por etapas (elución por etapas) y el eluido puede controlarse utilizando un espectrofotómetro UV ajustado a DO280 nm.

Dependiendo de la carga de los contraiones, la "cromatografía de intercambio iónico" puede denominarse "de intercambio catiónico", "de intercambio aniónico" o "de intercambio iónico de modo mixto". La expresión "intercambio catiónico" se refiere a un método cromatográfico que tiene una fase sólida que está cargada negativamente con cationes libres disponibles para el intercambio con cationes en una solución acuosa que se hace pasar sobre o a través de la columna. La cromatografía de intercambio catiónico puede utilizarse para purificar un polipéptido recombinante si la diana se mantiene en condiciones en las que el polipéptido diana está cargado positivamente. Por ejemplo, la solución puede valorarse de manera que el pH de la solución sea inferior al punto isoeléctrico del polipéptido. Además del polipéptido diana, pueden unirse a la resina de la columna catiónica otras impurezas cargadas positivamente. Como tal, el polipéptido diana puede recuperarse por elución de la columna en condiciones (por ejemplo, pH y concentración de sal) en las que el polipéptido diana eluye mientras las impurezas permanecen unidas a la resina. Las resinas de intercambio catiónico pueden incluir ligandos ácidos fuertes, tales como grupos sulfopropilo, sulfoetilo y sulfoisobutilo o ligandos ácidos débiles, tales como grupos carboxilo. Algunos ejemplos de resinas de intercambio catiónico comúnmente utilizadas son las resinas de carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonato (S).

La expresión "intercambio aniónico" se refiere a un método cromatográfico que tiene una fase sólida que está cargada positivamente con aniones libres disponibles para el intercambio con aniones en una solución acuosa que se hace pasar sobre o a través de la fase sólida. Las columnas de intercambio aniónico suelen funcionar en modo de flujo continuo, de manera que las impurezas cargadas negativamente se unen a la resina mientras que el polipéptido diana cargado positivamente se recupera en el flujo continuo. Sin embargo, las columnas de intercambio aniónico también pueden utilizarse en modo de unión y elución, dependiendo del pI del polipéptido diana y de las impurezas a eliminar. Entre los ejemplos de grupos cargados positivamente que se utilizan en el intercambio aniónico se encuentran grupos débilmente básicos, tales como dietilamino etilo (DEAE) o dimetilamino etilo (DMAE), y grupos fuertemente básicos, tales como grupos amina cuaternaria (Q), etil trimetilamonio (TMAE) o aminoetilo cuaternario (QAE).

En una realización, el eluido obtenido de la etapa de captura de proteína A 102 se somete a una, más de una o dos etapas de separación por intercambio iónico en las que la segunda separación por intercambio iónico implica una separación basada en la carga opuesta a la primera separación por intercambio iónico. Por ejemplo, si se emplea una etapa de intercambio aniónico 104 después de la captura 102, la segunda etapa cromatográfica de intercambio iónico 105 puede ser una etapa de intercambio catiónico. Por el contrario, si a la captura 102 le siguiera una etapa de intercambio catiónico 104, esta etapa iría seguida de una etapa de intercambio aniónico 105. Como alternativa, en otras realizaciones, el esquema de purificación 100 puede incluir solo una etapa de intercambio catiónico o solo una etapa de intercambio aniónico.

En una realización, el esquema de purificación 100 incluye al menos una separación de interacción hidrófoba como paso de eliminación de impurezas 104 o 105. La "cromatografía de interacción hidrófoba" (HIC) se refiere a la separación cromatográfica basada en la interacción reversible entre un polipéptido y un ligando hidrófobo unido a la fase sólida de la resina cromatográfica. La cromatografía de interacción hidrófoba se utiliza a menudo para eliminar agregados de proteínas, como los agregados de anticuerpos, e impurezas relacionadas con el proceso. Durante la HIC, el polipéptido diana se une a la columna a una alta concentración de sal y se eluye disminuyendo la concentración de sal. Dado que la interacción entre el polipéptido diana y el ligando hidrófobo se ve reforzada por el uso de tampones con alta fuerza iónica, la HIC puede ser una etapa de purificación adecuada que puede usarse después de la cromatografía de intercambio iónico. Pueden disponerse varios iones en una serie denominada solúfoba, dependiendo de si promueven las interacciones hidrófobas (efectos precipitación salina) o perturban la estructura del agua (efecto caotrópico) y causan el debilitamiento de la interacción hidrófoba.

En otras realizaciones, el esquema de purificación puede incluir la "cromatografía de inducción de carga hidrófoba" (HCIC) como etapa de eliminación de impurezas 104 o 105. La HCIC se basa en el comportamiento dependiente del pH de los ligandos que se ionizan a bajo pH. La HCIC emplea ligandos heterocíclicos a altas densidades, de manera que la interacción hidrófoba entre el polipéptido diana y el material de la columna es posible sin necesidad de una alta concentración de sal. La elución en la HCIC puede lograrse bajando el pH para producir una repulsión de cargas entre el ligando ionizable y la proteína unida.

En una realización, el esquema de purificación 100 incluye una o más etapas de inactivación de virus 103 y/o eliminación de virus 106, por ejemplo, para eliminar los retrovirus endógenos y los virus casuales. En una realización, se puede incluir una etapa de inactivación de virus 103 después de capturar la molécula diana 102. Las técnicas de inactivación de virus son conocidas e incluyen, por ejemplo, la inactivación por calor (pasteurización), la inactivación por pH, la alteración de la envoltura lipídica usando disolvente/detergente, la irradiación UV y con rayos y y el uso de agentes químicos inactivadores. En una realización, la inactivación de virus incluye una etapa de inactivación de virus a bajo pH, que incluye la incubación de la mezcla durante un periodo de tiempo a bajo pH, la neutralización del pH y la eliminación de las partículas por filtración. En una realización, la inactivación de virus a bajo pH incluye la valoración del polipéptido recombinante a un pH entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5, o entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4 o entre aproximadamente 3,3 y aproximadamente 3,8. El pH de la mezcla de la muestra puede reducirse con cualquier ácido adecuado, incluidos, pero sin limitación, ácido cítrico, ácido acético, ácido caprílico u otros ácidos adecuados. La elección del nivel de pH depende del perfil de estabilidad del polipéptido producido de manera recombinante y de otros componentes del tampón. Normalmente, la solución valorada se incuba durante al menos aproximadamente 30 o 45 minutos y hasta aproximadamente 1, 1,5 horas o 2 horas, normalmente a temperatura ambiente. Después de la inactivación de virus, el pH de la solución de polipéptido recombinante puede ajustarse a un pH más neutro, por ejemplo, entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 8,5 o entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,5 antes de continuar con el proceso de purificación.

En otra realización, se puede incluir en el esquema de purificación una etapa de eliminación de virus 105, tal como una filtración de virus. Se dispone de filtros retenedores de virus comerciales e incluyen ultrafiltros o microfiltros, tales como polietersulfona hidrófila (PES), polivinilideno hidrófilo (PVDF) y filtros de celulosa regenerada. En función del tamaño de los virus que se eliminan, los filtros antivirus pueden clasificarse en filtros para retrovirus y filtros para parvovirus.

En una realización, el esquema de purificación incluye una etapa de ultrafiltración (UF) y/o diafiltración (DF) 107 para purificar y concentrar aún más la muestra de anticuerpos. La UF/DF puede aumentar la concentración del polipéptido diana, así como sustituir las sales tampón por un tampón de formulación particular. La ultrafiltración (UF) es un tipo de filtración por membranas en la que la presión hidrostática fuerza un líquido contra una membrana semipermeable. Los sólidos en suspensión y los solutos de alto peso molecular, como el polipéptido diana, se retienen en el residuo de diálisis, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular pasan a través de la membrana en el filtrado. De esta manera, los anticuerpos diana se concentran como líquido y se eliminan las sales. Generalmente, la composición de bajo peso molecular en el concentrado se mantiene constante, por lo que la fuerza iónica de la solución concentrada permanece relativamente constante. La "diafiltración" se refiere a un método que utiliza membranas de ultrafiltración para eliminar, sustituir o reducir las concentraciones de sales o componentes tampón de soluciones que contienen proteínas, tales como anticuerpos, péptidos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas. La diafiltración continua (también denominada diafiltración de volumen constante) implica el lavado de las sales del tampón original (u otras especies de bajo peso molecular) en el residuo de diálisis añadiendo agua o un nuevo tampón, como un tampón de formulación, al residuo de diálisis para formar una formulación que contenga el polipéptido producido de manera recombinante. Normalmente, el nuevo tampón se añade al mismo ritmo que se genera el filtrado, de forma que el volumen del residuo de diálisis y la concentración del producto no cambian de forma apreciable durante la diafiltración.

4.5. Formulaciones

En una realización, el polipéptido purificado producido de manera recombinante se prepara en una formulación líquida. En una realización más particular, el polipéptido producido de manera recombinante en la formulación líquida es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una realización, la formulación líquida incluye un portador acuoso, tal como agua. En una realización, la formulación líquida es estéril. En otra realización, la formulación líquida es homogénea. En otra realización, la formulación es isotónica. En una realización, la formulación líquida incluye al menos aproximadamente 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml o 300 mg/ml del polipéptido purificado producido de manera recombinante. En una realización, la formulación tiene un pH de al menos aproximadamente 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 o 6,5 y hasta aproximadamente 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, o 9,0. La formulación también puede incluir excipientes y/o aditivos comunes, incluidos, pero sin limitación, agentes tampón, azúcares, sacáridos, sales, tensioactivos, solubilizantes, diluyentes, aglutinantes, estabilizantes, disolventes lipófilos, aminoácidos, quelantes, conservantes o combinaciones de los mismos.

En otra realización, el polipéptido purificado producido de manera recombinante se prepara en forma de una formulación liofilizada. En una realización más particular, el polipéptido producido de manera recombinante en la formulación liofilizada es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el término "liofilizado" se refiere a una formulación que ha sido sometida a un procedimiento de secado, como la liofilización, en el que se ha eliminado al menos el 50% de la humedad. En una realización, la formulación liofilizada incluye un lioprotector. El término "lioprotector" se refiere a una molécula que, cuando se combina con un polipéptido de interés producido de manera recombinante, previene o reduce significativamente la inestabilidad química y/o física del polipéptido tras su liofilización y posterior conservación. Los lioprotectores incluyen, pero sin limitación, azúcares y sus correspondientes alcoholes de azúcar; un aminoácido, tal como glutamato monosódico, arginina o histidina; una metilamina, tal como betaína; una sal liotrópica, tal como sulfato de magnesio; un poliol, tal como alcoholes de azúcar trihídricos o de mayor peso molecular, por ejemplo, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; Pluronics®; y combinaciones de los mismos. Otros ejemplos de lioprotectores son, pero sin limitación, glicerina y gelatina, y los azúcares melibiosa, melecitosa, rafinosa, manotriosa y estaquiosa. Los ejemplos de azúcares reductores incluyen, pero sin limitación, glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, isomaltulosa y lactulosa. Los ejemplos de azúcares no reductores incluyen, pero sin limitación, glucósidos no reductores de compuestos polihidroxi seleccionados entre alcoholes de azúcar y otros polialcoholes de cadena lineal. Entre los ejemplos de alcoholes de azúcar se incluyen, pero sin limitación, monoglucósidos, compuestos obtenidos por reducción de disacáridos, tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo lateral glicosídico puede ser glucosídico o galactosídico. Otros ejemplos de alcoholes de azúcar son, pero sin limitación, glucitol, maltitol, lactitol e isomaltulosa. En determinadas realizaciones, se utiliza trehalosa o sacarosa como lioprotector. En una realización, el lioprotector se añade a la formulación en una "cantidad lioprotectora", lo que significa que, tras la liofilización de la proteína en presencia de la cantidad lioprotectora del lioprotector, la proteína conserva esencialmente su estabilidad e integridad física y química tras la liofilización y la conservación. Una formulación "reconstituida" es aquella que ha sido preparada disolviendo una formulación liofilizada en un diluyente, de manera que el polipéptido producido de manera recombinante se dispersa en la formulación reconstituida. La formulación reconstituida es adecuada para su administración a un paciente. Los "diluyentes" incluyen diluyentes farmacéuticamente aceptables, incluidos, pero sin limitación, agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución con pH tamponado (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución glucosada. En una realización alternativa, los diluyentes pueden incluir soluciones acuosas de sales y/o tampones. En una realización, el polipéptido recombinante se incluye en una formulación liofilizada a una concentración de al menos aproximadamente 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml o 50 mg/ml y hasta aproximadamente 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml o 100 mg/ml. En una realización más particular, la formulación liofilizada incluye un aminoácido, tal como histidina, arginina o ácido glutámico como tampón en una concentración de al menos aproximadamente 10 mM, 15 mM, 20 mM o 25 mM y hasta aproximadamente 30 mM, 40 mM o 50 mM. En una realización, la formulación liofilizada incluye un azúcar, tal como trehalosa o sacarosa, en una concentración de al menos aproximadamente 50 mM, 100 mM, 150 mM, 175 mM, 200 mM o 225 mM y hasta aproximadamente 250 mM o 300 mM. En una realización, la formulación liofilizada incluye al menos aproximadamente un 0,01 %, un 0,02 %, un 0,03 %, un 0,04 % o un 0,05 % (p/v) y hasta aproximadamente un 0,06 %, un 0,07 %, un 0,08 %, un 0,09 % o un 0,1 % (p/v) de un tensioactivo, tal como polisorbato 80. En una realización, la formulación liofilizada tiene un pH de al menos aproximadamente 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, o 7,9, y hasta aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, o 9,0.

En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante está formulado para su administración parenteral. En una realización, la formulación es inyectable. En una realización, el polipéptido producido de manera recombinante está formulado para su administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.

Las formulaciones preparadas con un polipéptido producido de manera recombinante y purificado como se describe en el presente documento presentan estabilidad, niveles de bajos a indetectables de fragmentación de anticuerpos, niveles de bajos a indetectables de formación de partículas (es decir, permanecen libres o prácticamente libres de partículas visibles y de límpidos a ligeramente opalescentes), niveles de bajos a indetectables de actividad proteasa y muy poca o ninguna pérdida de las actividades biológicas del polipéptido producido de manera recombinante durante la fabricación, la preparación, el transporte y la conservación.

La expresión "niveles de fragmentación de bajos a indetectables", como se utiliza en el presente documento, se refiere a muestras que contienen menos de aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % del polipéptido de longitud completa, por ejemplo, en un solo pico determinado por cromatografía de exclusión por tamaños de alto rendimiento (HPSEC), que representa el polipéptido no degradado, y que no contiene otros picos individuales que tengan más de aproximadamente un 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o 0,5 % del polipéptido en cada uno. En otra realización, la formulación presenta una fragmentación reducida del polipéptido producido de manera recombinante. En una realización, una formulación que incluye un polipéptido producido de manera recombinante en el que se ha incluido un ácido graso en un tampón de lavado de proteína A incluye menos del 5 % de polipéptidos fragmentados según se determina por RP-HPLC tras la conservación a aproximadamente 40 °C durante al menos aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días; o al menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas. En otra realización, una formulación que incluye un polipéptido producido de manera recombinante en el que se ha incluido un ácido graso en un tampón de lavado de proteína A incluye menos del 5 % de polipéptidos fragmentados según se determina mediante RP-HPLA tras la conservación a aproximadamente 4 °C o aproximadamente 5 °C durante al menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas; o al menos durante aproximadamente 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses.

La expresión "niveles de formación de partículas de bajos a indetectables", como se usa en el presente documento, se refiere a muestras que "se mantienen libres o prácticamente libres de partículas visibles y de límpidas a ligeramente opalescentes" tras la inspección visual de las partículas y de la limpidez/opalescencia siguiendo los procedimientos adaptados de un método farmacopeico adecuado, como las secciones 2.9.20, 2.2.1 y 2.2.2 de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) o las muestras en las que no se detectan partículas (es decir, la formulación permanece límpida e incolora) tras la inspección visual. En una realización, una formulación preparada con un polipéptido producido de manera recombinante y purificado como se describe en el presente documento es límpida e incolora, según se determina por inspección visual, tras la conservación a aproximadamente 40 °C durante al menos aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días; o al menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas. En otra realización, la formulación es límpida e incolora, según se determina por inspección visual, tras la conservación a aproximadamente 4 °C o aproximadamente 5 °C durante al menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas; o al menos aproximadamente 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses.

La expresión "actividad proteasa de baja a indetectable", como se usa en el presente documento, se refiere a las muestras en las que la actividad proteasa se encuentra por debajo del límite de detección (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 ng/ml), por ejemplo, utilizando un ensayo de proteasa fluorescente como el kit de ensayo de proteasa EnzChek® (E6638, Molecular Probes, Eugene, OR). En una realización, una formulación preparada con un polipéptido producido de manera recombinante y purificado como se describe en el presente documento muestra una actividad proteasa de baja a indetectable tras la conservación a aproximadamente 40 °C durante al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días; o al menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas. En otra realización, la formulación muestra una actividad proteasa de baja a indetectable tras la conservación a aproximadamente 4 °C o aproximadamente 5 °C durante al menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas; o al menos aproximadamente 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses.

En una realización, la formulación presenta una estabilidad mejorada del polipéptido producido de manera recombinante. En particular, la inclusión de un ácido graso en el tampón de lavado de proteína A da como resultado una formulación de anticuerpos que tiene una estabilidad mejorada en comparación con una formulación preparada utilizando un tampón de lavado de proteína A que no incluye un ácido graso. En una realización, una formulación preparada con un polipéptido producido de manera recombinante y purificado como se describe en el presente documento es estable tras su conservación a aproximadamente 40 °C durante al menos aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días 0 7 días; o al menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas; o al menos aproximadamente 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En otra realización, una formulación preparada con un polipéptido producido de manera recombinante y purificado como se describe en el presente documento es estable tras la conservación a aproximadamente 4 °C o aproximadamente 5 °C durante al menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas; o al menos aproximadamente 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses; o al menos aproximadamente 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años, 10 años, 11 años o 12 años.

4.6. Detección de proteínas de células hospedadoras

Los métodos para determinar los niveles residuales de la concentración de proteínas de células hospedadoras (HCP) son conocidos e incluyen, por ejemplo, la detección de los niveles residuales de HCP mediante un inmunoensayo, tal como un ensayo inmunoenzimático (ELISA), por ejemplo, en el que el anticuerpo primario es específico para las HCP producidas por una célula hospedadora concreta, por ejemplo, células CHO o células de E. coli, utilizadas para generar el polipéptido recombinante. El anticuerpo primario puede producirse de acuerdo con métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo primario puede generarse contra un lisado celular de las células hospedadoras utilizadas para la producción de anticuerpos. Se dispone de una plataforma de inmunoensayo HCP comercial de Gyros (Warren, NJ).

4.5. Detección de proteasas

El kit de ensayo de proteasas EnzChek® (E6638, Molecular Probes, Eugene, OR) puede utilizarse para evaluar la actividad proteasa en las muestras. Las muestras pueden analizarse a un solo pH o a múltiples pH para generar un perfil de actividad proteasa frente al pH. Las diferentes proteasas tienen diferentes perfiles de actividad frente al pH y las mediciones a diferentes niveles de pH aumentan, por tanto, la capacidad de detectar proteasas de muchos tipos diferentes en una muestra.

En otra realización, puede usarse el ensayo de fluorescencia BODIPY en un intervalo de pH de 4-9 con un error inferior a aproximadamente el 10 %. El sustrato de detección del kit es el conjugado BODIPY®-caseína. Cuando los fragmentos marcados con colorante del sustrato de caseína digerido se liberan por las proteasas activas en las muestras, puede producirse un aumento de la intensidad de la fluorescencia debido a la disminución de la autoextinción del colorante. Las muestras de proteínas pueden diluirse 10 veces en un tampón de citrato-fosfato 20 mM a valores de pH que suelen oscilar entre 4 y 8. Se pueden preparar placebos correspondientes. El tampón citrato-fosfato puede prepararse mezclando ácido cítrico 20 mM y fosfato de sodio dibásico 20 mM para alcanzar los valores de pH deseados. El sustrato de detección del conjugado BODIPY®-caseína puede diluirse en el tampón adecuado para generar un reactivo de trabajo a cada pH de 4 a 8 a aproximadamente 10 |jg/ml. Se puede añadir un volumen igual (normalmente 100 |jl) de muestra y reactivo de trabajo a los pocillos de una microplaca blanca para generar muestras de ensayo por triplicado y placebos coincidentes en el intervalo de pH de 4 a 8. Las muestras pueden sellarse e incubarse a 40 °C durante una duración típica de 3 a 5 horas. La fluorescencia del colorante puede excitarse a 485 nm y la intensidad de emisión a 530 nm puede registrarse utilizando un filtro de corte de 495 nm en un lector de placas de fluorescencia SpectraMax® de Molecular Devices (Sunnyvale, CA). A continuación, se puede registrar la intensidad frente al pH de las muestras. Los aumentos de intensidad de la muestra en comparación con el blanco de menos de aproximadamente un 20 % pueden considerarse negativos para la actividad proteasa según las directrices del fabricante, dependiendo de la variabilidad del método. Pueden restarse los resultados del tampón de los de las muestras y representarse frente al pH y esto puede usarse para determinar la presencia de actividad proteasa en las muestras. Se pueden realizar múltiples copias para evaluar la variabilidad de las lecturas bajas. Para la cuantificación relativa, se pueden utilizar preparaciones de control de proteasas conocidas, tales como catepsina-D o tripsina como comparadores. Para confirmar la presencia de proteasas, se pueden añadir inhibidores de proteasas a las muestras, lo que provoca una disminución relativa o la eliminación de la actividad proteasa detectada como confirmación de los resultados. Los ejemplos de inhibidores de proteasas utilizados para determinar la presencia de proteasas en las muestras pueden incluir el amplio cóctel de inhibidores de proteasas (n.° de catálogo P2714, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) que contiene AEBSF, aprotinina, bestatina-HCI, E-64, e Dt A, Leupeptina, usados a 1 * la concentración sugerida. Cada inhibidor individual puede utilizarse también para confirmar la actividad proteasa. Se dispone de inhibidores de proteasas comerciales y pueden obtenerse de un proveedor adecuado, como ThermoScientific, Rockford, IL: AEBSF-HCI (inhibe las serina proteasas), n.° de catálogo 78431; aprotinina (inhibe las serina proteasas), n.° de catálogo 78432; bestatina (inhibe las aminopeptidasas), n.° de catálogo 78433; E-64 (inhibe las cisteína proteasas), n.° de catálogo 78434; leupeptina (inhibe las serina y cisteína proteasas), n.° de catálogo 78435; pepstatina-A (inhibe las aspartil proteasas), n.° de catálogo 78436; EDTA (ácido etilendiaminotetraacético, inhibe las metaloproteasas).

5. EJEMPLOS

Los ejemplos que se presentan a continuación sirven para ilustrar la práctica de la presente invención.

Información de las secuencias:

Los reactivos empleados en los ejemplos se encuentran disponibles en el mercado o pueden prepararse utilizando instrumentos, métodos o reactivos comerciales conocidos en la técnica. Los ejemplos ilustran diversos aspectos de la invención y la puesta en práctica de los métodos de la invención. Los ejemplos no pretenden proporcionar una descripción exhaustiva de las diversas realizaciones de la invención.

Ejemplo 1: El efecto del pH, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio en los niveles de HCP

Se observaron grandes cantidades de HCP (es decir, 630 ng/mg) en un proceso de purificación convencional para un anticuerpo monoclonal IgG1 humano que se une específicamente a IL-18 humana (número de registro de la NCIMB 41786), que no se eliminó mediante la purificación con proteína A u otras etapas del proceso de fabricación. Se evaluó la capacidad de otras etapas de lavado para reducir los niveles de HCP. En particular, se examinaron los efectos del pH de lavado, del lavado con cloruro de sodio, del caprilato de sodio y de sus combinaciones sobre el aclaramiento de las HCP, la recuperación y el producto. El experimento incluyó 16 desarrollos experimentales más un desarrollo adicional usando un tampón de lavado convencional (desarrollo 17). Las composiciones de los lavados experimentales se muestran en la tabla 1. Todos los tampones de lavado experimentales de la tabla 1 se prepararon en Tris 100 mM y se ajustó el pH con HCl concentrado. Los tampones de cromatografía de proteína A se prepararon como se indica en la tabla 2. Todos los desarrollos se realizaron utilizando una columna MabSelect SuRe (C11-032 TRICORN, GE Healthcare) con una altura de lecho de 20 cm y un volumen de columna de 3,93 ml, y se realizaron durante la noche a 350 cm/h (1,17 ml/min) utilizando el sistema AKTA AVANT (GE Healthcare) según el proceso descrito en la tabla 3.

Tabla 1: Lavados experimentales

Tabla 2: Tam n r m r fí r ín A

Tabla 3: C n i i n l r

Tras la elución de la columna de proteína A, los eluidos se neutralizaron a pH 5,0 con Tris 0,1 M y se tomó una muestra de 1 ml para el análisis de las HCP. El eluido se filtró utilizando un Millipore Steriflip (n.° de producto SCGP00525) para eliminar un precipitado asociado con altos niveles de HCP. La eliminación de este precipitado por filtración puede ayudar a reducir los niveles de HCP. Tras la filtración, se tomaron más muestras del eluido neutralizado para determinar la concentración, el ensayo de HCP (después de la filtración) y la HPSEC. La concentración de cada muestra se determinó mediante la adsorción a 280 nm. Dado que todas las muestras se diluyeron a 1:20, el valor se multiplicó por 20 (para tener en cuenta la dilución) y se dividió por el coeficiente de extinción de 1,55 (determinado experimentalmente). El análisis por cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) se realizó en un sistema HPLC Agilent con TSK-Gel G3000. Se inyectaron 250 |jg diluyendo la formulación a aproximadamente 10 mg/ml en PBS e inyectando 25 jl. Se analizaron las proteínas de células hospedadoras de la muestra utilizando una plataforma de inmunoensayo abierta (Gyros) con antisueros de oveja purificados por afinidad para detectar las HCP de las células CHO. Se utilizó un kit de detección de proteasas fluorescentes (23266 de Pierce Biotechnology) para medir la actividad proteolítica de las muestras utilizando FTC-caseína como sustrato. Se siguieron los procedimientos incluidos en las instrucciones del kit y los resultados se notificaron como unidades calculadas como el valor equivalente a ng/ml para una curva patrón de tripsina. Los resultados se muestran en la tabla 4.

Tabla 4: R r i n r z H P

Como puede observarse en la tabla 4, la pureza se vio afectada de forma significativa por cada factor (pH, cloruro de sodio y caprilato de sodio) por separado. Además, los resultados indican una interacción entre el caprilato de sodio y el cloruro de sodio.

La tabla 5 muestra la significación del efecto (los valores de Prob>F mayores que 0,05 se determinarán como no significativos).

Tabla 5: Pureza

En la figura 2 se muestran los efectos de los tres factores (pH de lavado, lavado con cloruro de sodio y caprilato de sodio) sobre la pureza del eluido. El aumento del pH fue el que más afectó a la pureza del eluido, con un descenso del 0,6 % al aumentar el pH de 7,0 a 9,0 cuando tanto el lavado con cloruro de sodio como el caprilato de sodio se encontraban en los valores intermedios (mostrados en la esquina superior izquierda). La figura 3 muestra una reducción de la pureza del eluido a medida que se aumenta el lavado con cloruro de sodio en ausencia de caprilato de sodio (línea gris). Sin embargo, en presencia de caprilato de sodio, este efecto se invirtió y la pureza aumentó al aumentar el lavado con cloruro de sodio (línea negra). Además, los resultados indican que los factores individuales (lavado con cloruro de sodio y caprilato de sodio) tuvieron un efecto significativo en la recuperación, mostrándose de nuevo como una interacción entre el caprilato de sodio y el lavado con cloruro de sodio, como puede verse por la interacción cuadrática entre el lavado con cloruro de sodio y el lavado con cloruro de sodio. La última columna de la tabla 6 muestra la importancia del efecto.

Tabla 6: Recuperación

En la figura 4 se muestran los efectos del cloruro de sodio y del caprilato de sodio en la recuperación. El lavado con cloruro de sodio está representado por una línea curva, una representación de la interacción cuadrática del lavado con cloruro de sodio y el caprilato de sodio. Los resultados de la figura 4 muestran que el aumento del cloruro de sodio y del caprilato de sodio en el lavado redujo la recuperación global en un 2-4 % cada uno. La figura 5 muestra que, al aumentar el lavado con cloruro de sodio en ausencia de caprilato de sodio (abajo a la izquierda), se produjo un ligero aumento de la recuperación (línea gris). Sin embargo, en presencia de caprilato de sodio, se produjo una reducción de la recuperación (línea negra). El efecto del caprilato de sodio y del lavado con cloruro de sodio se demuestra en la esquina superior derecha: sin lavado con cloruro de sodio, se produjo un aumento de la recuperación al aumentar el caprilato de sodio (línea gris). Sin embargo, hubo una disminución de la recuperación en presencia lavado con alto cloruro de sodio (línea negra).

El análisis de la prefiltración de las HCP identificó un efecto significativo de todos los factores individuales (pH de lavado, cloruro de sodio de lavado y caprilato de sodio), así como una interacción entre el caprilato de sodio y el pH de lavado y un pH de lavado con lavado con cloruro de sodio. La última columna de la tabla 7 muestra la importancia del efecto.

Tabla 7 : Prefiltración de las HCP

El aumento de los tres factores de valores bajos a altos dio lugar a una disminución de los niveles de HCP en el eluido, lo que sugiere que un tampón de lavado a pH 9,0, con cloruro de sodio 2,5 M y caprilato de sodio 100 mM mejoró la eliminación de las HCP. Esto se confirmó experimentalmente. Los niveles más bajos de HCP alcanzados durante el experimento fueron los del desarrollo 7 (105,7 mg/mg). Por el contrario, el nivel más alto de HCP se observó con valores bajos para los tres factores en el desarrollo 8 (1618 ng/mg).

Además, se identificaron dos interacciones, que pueden verse en la figura 6. La interacción entre el pH de lavado y el lavado con cloruro de sodio puede verse en el recuadro de la izquierda, que muestra que solo hubo un pequeño efecto en los niveles de HCP antes de la filtración cuando se aumentó el lavado con cloruro de sodio a pH 9 (línea negra), pero muestra un efecto mayor cuando el pH se redujo a 7 (línea gris). El efecto fue el mismo para el caprilato de sodio: mientras que los niveles de HCP antes de la filtración eran más bajos a pH 9 con y sin caprilato de sodio (línea negra), el nivel de reducción era mayor a medida que aumentaban los niveles de caprilato de sodio a pH 7 (línea gris).

El análisis identificó un efecto significativo para todos los factores individuales (pH de lavado, lavado con cloruro de sodio y caprilato de sodio) para los niveles de h Cp después de la filtración, así como interacciones entre el caprilato de sodio y el pH de lavado, el caprilato de sodio y el lavado con cloruro de sodio y dos interacciones cuadráticas, una con el pH de lavado y otra con el lavado con cloruro de sodio. La última columna de la tabla 8 muestra la importancia de los efectos.

Tabla 8: HCP después de la filtración

La figura 7 muestra los niveles de HCP después de la filtración con las dos interacciones cuadráticas representadas por líneas curvas para el pH de lavado y el lavado con cloruro de sodio. El resultado del lavado con cloruro de sodio es interesante porque los niveles más bajos de HCP se alcanzaron con niveles altos y bajos de lavado con cloruro de sodio. Esto podría deberse a que las muestras con baja concentración de cloruro de sodio en el lavado tenían altos niveles de HCP, lo que puede haber dado lugar a una mayor turbidez y precipitación que luego fue eliminada por la filtración de 0,2 |jm, reduciendo así el nivel de las HCP después de la filtración.

La figura 8 muestra la interacción entre el lavado con cloruro de sodio y el caprilato de sodio. En ausencia de lavado con cloruro de sodio (línea gris), se observó una menor reducción de las h Cp tras la filtración que en presencia de cloruro de sodio 2,5 M (línea negra).

El efecto combinado de cada factor (pH de lavado, lavado con cloruro de sodio y caprilato de sodio) sobre cada respuesta (pureza, recuperación, HCP antes de la filtración y HCP después de la filtración) se muestra en la figura 9. Las columnas de la derecha muestran que, al aumentar el pH de lavado, los niveles de HCP disminuyen, lo que indica que un pH más alto es mejor para la eliminación de las HCP. Sin embargo, la pureza disminuía a medida que aumentaba el pH, un rasgo que generalmente no es deseable. La figura 9 muestra que el pH no tiene ningún efecto sobre la recuperación, porque el pH no se incluyó en el modelo de recuperación. La columna de la izquierda muestra que el aumento del cloruro de sodio en el lavado redujo las HCP. Sin embargo, también muestra que el aumento del cloruro de sodio en el lavado redujo ligeramente la recuperación y no afectó a la pureza. La columna intermedia muestra que el aumento del caprilato de sodio redujo el HCP y aumentó la pureza. Sin embargo, el aumento del caprilato de sodio también redujo la recuperación. En el eje de la izquierda se pueden ver los valores previstos usando estas condiciones.

Las figuras 10A-C muestran los efectos combinados de los tres factores sobre los niveles de HCP antes de la filtración. Las tres gráficas muestran que los niveles más bajos de HCP se alcanzaron cuando los factores estaban en su punto más alto, como indica la cuadrícula de contorno. Esto indica que, para la eliminación de HCP, el aumento de las concentraciones puede dar lugar a una eliminación adicional de HCP. Sin embargo, puede que no sea deseable eliminar todas las HCP a expensas de una recuperación del 50 % del producto. Para optimizar las condiciones de todas las respuestas, se añadió al modelo una función de deseabilidad y se establecieron intervalos para cada respuesta y se les asignó una importancia. Se dio la máxima importancia a la eliminación de las HCP, ya que este era el objetivo de la etapa de lavado. A la recuperación se le asignó mayor importancia que a la pureza, ya que se trata de una etapa de captura y los agregados podrían eliminarse mediante etapas del proceso adicionales.

En la figura 11, la condición óptima se muestra en el eje X, en la que tanto el lavado con cloruro de sodio como el caprilato de sodio siguen en los valores máximos (es decir, 2,5 M y 100 mM, respectivamente), con un pH de lavado fijado en pH 8,45. El aumento adicional del pH no aumentó la recuperación o la eliminación de las HCP, pero tuvo un impacto negativo en la pureza. También es importante señalar que se observó una recuperación razonablemente baja (81 %) en estas condiciones. Para la proteína A, se espera una recuperación de >90 %. Sin embargo, el lavado con cloruro de sodio se redujo para aumentar la recuperación, lo que a su vez aumentó los niveles de HCP. Esto sugiere que los altos niveles lavado con cloruro de sodio pueden haber arrastrado el producto.

El experimento demostró que el caprilato de sodio y el pH pueden afectar a la pureza del eluido. Aunque el aumento del pH dio lugar a una menor pureza (lo que no es deseable), esta es la etapa de lavado en una columna de captura y hay etapas de cromatografía adicionales en el proceso para la eliminación de los agregados. Además, los resultados indican que la adición de caprilato de sodio al tampón de lavado aumentó la pureza. Sin desear quedar ligados a la teoría, se cree que el caprilato de sodio eliminó las HCP al competir con los sitios de unión en el anticuerpo. Si este es el caso, también explicaría por qué aumentó la pureza. Aunque los efectos del caprilato de sodio y del lavado con cloruro de sodio sobre la recuperación no fueron del todo deseables, esto puede verse compensado por la reducción de los niveles de HCP.

Los resultados de la prefiltración de las HCP muestran que los tres factores tienen la capacidad de reducir los niveles de HCP cuando se utilizan en un tampón de lavado de proteína A. Además, los resultados mostraron una interacción sinérgica entre el pH de lavado y el caprilato de sodio que aumentó el aclaramiento de las HCP. Aunque los niveles de HCP después de la filtración contradicen en cierto modo las conclusiones de la prefiltración de las HCP, el resultado de la prefiltración de las HCP tuvo más peso que los niveles después de la filtración porque, aunque las HCP pueden eliminarse por filtración, el precipitado podría bloquear el filtro, lo que lo haría menos deseable en la fabricación.

Ejemplo 2: Efecto del pH, del cloruro de sodio y del caprilato de sodio en la eliminación de las HCP

El objetivo de este experimento era evaluar la eficacia de tres factores (pH, cloruro de sodio y caprilato de sodio) y sus combinaciones en la eliminación de las HCP cuando se incluyen en un tampón de lavado de proteína A para un segundo anticuerpo monoclonal que se une específicamente a interleucina-6 (IL-6) humana. El procedimiento fue el mismo que el descrito para el ejemplo 1 anterior. Los resultados se muestran en la tabla 9.

Tabla 9: R r i n r z H P

Los resultados de la tabla 10 muestran que la pureza se vio significativamente afectada por cada factor (pH, cloruro de sodio y caprilato de sodio) por separado. Además, los resultados indican una interacción entre el caprilato de sodio y el lavado con cloruro de sodio, y del lavado con cloruro de sodio con el pH de lavado. Los efectos del pH de lavado, el cloruro de sodio y el caprilato de sodio sobre la pureza del eluido también se muestran en la figura 12. De ello se desprende que el aumento de los niveles de los tres componentes dio lugar a una reducción de la pureza del eluido.

La figura 13 muestra que, en ausencia de cloruro de sodio, el cambio de los niveles de pH o de caprilato de sodio (líneas negras a la izquierda y a la derecha) tuvo poco efecto sobre la pureza. Sin embargo, en presencia de cloruro de sodio, hubo un efecto negativo en la pureza del eluido cuando se incrementó el caprilato de sodio o el pH (línea gris a la izquierda y a la derecha). El análisis de recuperación solo identificó el pH de lavado y su interacción cuadrática como significativos para la recuperación (tabla 11). Los resultados mostrados en la figura 14 indican que el aumento del pH dio lugar a valores de recuperación más altos. Curiosamente, el análisis de las HCP en el eluido solo identificó el caprilato de sodio como un factor significativo (tabla 12). El impacto del caprilato de sodio en los niveles de HCP en el eluido se muestra en la figura 15.

Debido a los grandes niveles de ruido en el modelo, se realizó un análisis alternativo. El análisis alternativo fue un análisis de mínimos cuadrados estándar del log de las HCP en los valores de las HCP del eluido. Los resultados del análisis alternativo muestran que el lavado con cloruro de sodio tuvo un efecto significativo y que hubo una interacción entre el caprilato de sodio y el lavado con cloruro de sodio, así como el efecto del caprilato de sodio de manera individual (tabla 13).

Tabla 10: Pureza

Tabla 11: Recuperación

Tabla 12: HCP en el eluido

Tabla 13: Lo de las HCP en el eluido

Los datos de la figura 16 muestran los efectos de los tres factores sobre los niveles de HCP. El aumento de los niveles de caprilato de sodio mostró el mayor efecto sobre los niveles de HCP. La interacción entre el lavado con cloruro de sodio y el caprilato de sodio puede verse en la figura 17. En ausencia de cloruro de sodio, se produjo una pequeña disminución de los niveles de HCP al aumentar el caprilato de sodio (línea gris). Sin embargo, en presencia de cloruro de sodio, se produjo una mayor reducción del aclaramiento al aumentar el caprilato de sodio (línea negra).

El análisis retrospectivo de la actividad proteasa identificó un efecto significativo de todos los factores individuales (pH de lavado, lavado con cloruro de sodio y caprilato de sodio), así como una interacción entre el caprilato de sodio y el pH de lavado, el caprilato de sodio y el lavado con cloruro de sodio y el pH de lavado y el lavado con cloruro de sodio. La última columna de la tabla 14 muestra la importancia de los efectos.

Tabla 14: Actividad proteasa

La figura 18 muestra una clara disminución de la actividad proteasa para los niveles de HCP después de la filtración a medida que se aumenta cada factor (pH de lavado, cloruro de sodio y caprilato de sodio). La figura 19 muestra la interacción entre el pH de lavado y el caprilato de sodio. En particular, en presencia de caprilato de sodio, hubo poca diferencia en la actividad. Sin embargo, en ausencia de caprilato de sodio, el aumento del pH de lavado redujo la actividad proteasa.

Las figuras 20A y B muestran los beneficios de incluir caprilato de sodio en el lavado. La figura 20A muestra la actividad proteasa en ausencia de caprilato de sodio. La figura 20B muestra la actividad proteasa en presencia de caprilato de sodio. La actividad más baja se observó en ausencia de caprilato de sodio (A), con un pH y una concentración de cloruro de sodio elevados. Por el contrario, la mayor actividad se observó con niveles de pH y cloruro de sodio bajos. Sin embargo, en presencia de caprilato de sodio los contornos cambiaron (B). El valor más alto se observó con un pH alto y sin cloruro de sodio. Al aumentar el lavado con cloruro de sodio, los contornos se aplanaron y el efecto del pH desapareció, ya que tanto a pH 7 como 9 no mostraron actividad. La figura 21 muestra todos los efectos en una sola gráfica.

Para mejorar la eliminación de las HCP, el lavado con caprilato de sodio se fijó en el valor máximo (es decir, 100 mM). (Figura 22) El pH de lavado se fijó a pH 8,1, ya que si se aumentaba más el pH disminuía la recuperación, y el lavado con cloruro de sodio se fijó en 1,9 M, ya que si se aumentaba más el nivel de cloruro de sodio disminuía la pureza. Los resultados confirman que el caprilato de sodio y el pH influyen en la pureza del eluido. Sin embargo, en este ejemplo, el aumento de los tres factores dio lugar a una disminución de la pureza, mientras que en el caso del anticuerpo dirigido contra IL-18 del ejemplo 1, hubo un aumento de la pureza en presencia de caprilato de sodio. Los tres factores tuvieron poca repercusión en la recuperación, salvo por que se observó una reducción de la misma cuando se disminuyó el pH de lavado. Sin embargo, esto podría atribuirse al ruido de los otros factores. Sólo el caprilato de sodio afectó significativamente a las HCP en el eluido. Cuando se realizó una transformación logarítmica para transformar los datos a un modelo lineal, los resultados indicaron que el aumento del lavado con cloruro de sodio y del caprilato de sodio redujo los valores de HPC. Lo mismo ocurrió con el pH, aunque el efecto no fue tan significativo. Como se ha observado en el anticuerpo dirigido contra IL-18 del ejemplo 1, las condiciones óptimas incluyen los tres factores en su valor más alto. El efecto sobre la actividad proteasa reflejó el efecto general sobre las HCP, lo que era de esperar. La combinación de los resultados indica que la combinación de los tres factores proporciona un lavado mejorado para la eliminación de las HCP.

Ejemplo de referencia 3: Evaluación de otros ácidos grasos para la reducción de las HCP

El objetivo de este experimento era evaluar la eficacia de los ácidos grasos distintos del caprilato de sodio como constituyentes de un tampón de lavado de proteína A en la eliminación de las HCP para el anticuerpo monoclonal utilizado en el ejemplo 1 [un anticuerpo anti-IL-18]. Los experimentos se realizaron utilizando un pH de lavado de 9,0 y cloruro de sodio 2,5 M, las condiciones óptimas determinadas para el anticuerpo anti-IL-18 en el ejemplo 1. Todos los tampones de lavado experimentales se prepararon en Tris 100 mM y se ajustó el pH con HCI o Tris para lograr un pH final de 9,0. En función de la solubilidad, algunos de los tampones incluían cloruro de sodio 2,5 M, mientras que otros se prepararon sin cloruro de sodio 2,5 M, véase la tabla 16. Los tampones de cromatografía de proteína A se prepararon como se describe en el ejemplo 1 y el procedimiento fue el mismo que el descrito en el ejemplo 1. La tabla 15 proporciona una lista de los ácidos grasos insaturados y la tabla 16 proporciona los detalles de los tampones de lavado experimentales.

Tabla 15: ácidos rasos insaturados

Tabla 16: tampones de lavado experimentales

Los resultados se muestran en la tabla 17. La pureza de todos los desarrollos fue menor que la esperada. Sin embargo, la reducción de la pureza podría deberse a la antigüedad de la recolección de anticuerpos anti-IL-18 clarificada. Por lo tanto, solo se evaluó el aclaramiento y la recuperación de HCP y se comparó con los desarrollos de control de los ejemplos anteriores.

Tabla 17: Resultados de los desarrollos con ácidos rasos

Tabla 18: t m n l v n r l in i r l m l 1

Las recuperaciones de los desarrollos 1-6 fueron comparables a las de los dos tampones de lavado de control. En los desarrollos 7 y 8, se observó una reducción significativa de la recuperación (casi la mitad que en los otros desarrollos). En estos desarrollos, se observó un gran pico durante los desarrollos cromatográficos en el lavado. Por lo tanto, parece que el dodecanoato de sodio y el ácido láurico provocan una pérdida de recuperación cuando se añaden a un tampón de lavado de proteína A.

La figura 23 muestra una amplia gama de niveles de HCP antes de la filtración: tan altos como 850 ng/mg para el desarrollo 1 (usando el ácido graso de cadena corta butirato de sodio) y hasta 85 ng/mg (usando dodecanoato de sodio). Para determinar si estos valores demuestran una disminución de las HCP en el eluido, se compararon con el tampón de control. Los desarrollos 1-4 se realizaron en tris 100 mM, cloruro de sodio 2,5 M, pH 9,0 (más el ácido graso a 100 mM) y se compararon con el segundo desarrollo de control que también contenía cloruro de sodio 2,5 M (tabla 18), que alcanzó una concentración de HCP en el eluido de proteína A antes de la filtración de 599 ng/mg. Por lo tanto, se puede observar que tanto el butirato de sodio como el ácido butírico (desarrollos 1 y 2) no demostraron un aumento del aclaramiento de HCP en el nivel analizado. Los valores del hexanoato de sodio (desarrollo 3) son ligeramente inferiores a los del control (500 mg/mg frente a 599 ng/mg), lo que demuestra una pequeña reducción con respecto al control.

El decanoato de sodio y el ácido denoico no se disolvieron en el tampón que contenía cloruro de sodio 2,5 M. Por lo tanto, deben compararse con el tampón sin cloruro de sodio (es decir, Tris 100 mM, pH 9,0). La reducción de 600 ng/mg a 85 ng/ml y 97 ng/mg para el decanoato de sodio y el ácido denoico, respectivamente, representa una reducción significativa de los niveles de HCP. Este resultado fue inferior al obtenido para el caprilato de sodio (206 ng/mg) obtenido en las mismas condiciones.

Para el dodecanoato de sodio y el ácido láurico, los resultados fueron de 88 y 99 ng/mg, respectivamente. Sin embargo, la recuperación fue baja (~45 %). Es posible que la baja recuperación se deba a los bajos niveles de HCP, ya que es posible que tanto el producto como las HCP se hayan lavado de la columna. Sin embargo, una mayor optimización podría proporcionar condiciones aceptables tanto para la eliminación como para la recuperación de las HCP.

Los resultados de después de la filtración para los desarrollos 1 a 4 son comparables con los de antes de la filtración. Los niveles de HCP se redujeron tras la filtración, probablemente debido a la eliminación de precipitados durante la misma.

Los desarrollos con decanoato de sodio y ácido denoico (desarrollos 5 y 6) demostraron una mejor eliminación de HCP en comparación con las condiciones de lavado de control. Curiosamente, los niveles de HCP eran de 140 ng/mg y 139 ng/mg, respectivamente, que eran superiores a los valores previos a la filtración. Esto podría deberse a un error en el análisis de las HCP. Independientemente de esta variación, tanto el resultado medio como el más alto representan una reducción significativa de los niveles de HCP en comparación con el tampón de control y el que contiene caprilato de sodio (tabla 19). En la figura 23 se presenta un resumen de los niveles de HCP en el eluido para los diferentes tampones de lavado de ácidos grasos.

Tabla 19: Resultados del decanoato de sodio del ácido denoico en comparación con los tampones de control

Resulta evidente que hubo una amplia variación en la eliminación de HCP para los ácidos grasos evaluados. Los ácidos grasos de cadena corta y sus sales de sodio, incluidos el butirato de sodio y el ácido butírico, no dieron lugar a niveles de HCP inferiores a los de los controles de los tampones. Sin embargo, al aumentar la longitud de la cadena del ácido graso, de 4 a 6 para el hexanoato de sodio y el ácido hexanoico, se observó una reducción de las HCP, de 844 ng/mg a 502 ng/mg para las sales de sodio y de 844 ng/mg a 599 ng/mg para el ácido graso.

El caprilato de sodio contiene 8 átomos de carbono y se clasifica como un ácido graso de cadena media (7-12 átomos de carbono). Los resultados de los ejemplos anteriores demostraron que el caprilato de sodio fue capaz de reducir los niveles de HCP a 206 mg/mg en un tampón que contenía caprilato de sodio 100 mM en Tris 100 mM, a pH 9. Del mismo modo, los resultados del decanoato de sodio, el ácido decanoico, el dodecanoato de sodio y el ácido láurico demuestran que estos ácidos grasos también fueron capaces de reducir los niveles de HCP (a 150 ng/mg), lo que indica que los ácidos grasos de cadena media tienen la capacidad de reducir las HCP cuando se incluyen en un tampón de lavado de proteína A. Dado que es importante mantener una alta recuperación durante la purificación de anticuerpos, por ejemplo, para reducir el coste de los productos, la recuperación reducida observada con el dodecanoato de sodio y el ácido láurico no era del todo deseable. Sin embargo, si se compara con la reducción de los niveles de HCP, la reducción de la recuperación puede ser aceptable.

Los resultados demuestran que se pueden incluir muchos ácidos grasos en un tampón de lavado de proteína A para reducir los niveles de HCP. En general, los niveles de HCP disminuyeron al aumentar la longitud de la cadena. En particular, los resultados sugieren que los ácidos grasos de longitud de cadena media pueden ser los candidatos más deseables debido al efecto potencialmente indeseable sobre la recuperación observado con los ácidos grasos que tienen una longitud de cadena de 12 y la reducción de la eliminación de HCP observada con los ácidos grasos que tienen una longitud de cadena de 6. Sin embargo, puede ser posible optimizar las condiciones para que estos ácidos grasos adicionales sean componentes viables en los tampones de lavado de proteína A.

Ejemplo 4: El efecto de los tampones de lavado con caprilato en la eliminación de HCP durante la cromatografía de proteína A

El objetivo de este experimento era probar la eficacia de los tampones de lavado de caprilato para la eliminación de proteínas de células hospedadoras (HCP) para el anticuerpo anti-IL-18 (n.° de registro de la NCIMB 41786) durante la cromatografía de proteína A. Se probaron dos formas de caprilato, el caprilato de sodio y el ácido caprílico, a una concentración de 50 mM en un tampón Tris 100 mM que contiene cloruro de sodio 2,5 M a pH 9,0. Se realizaron cuatro desarrollos cromatográficos utilizando una matriz MabSelect SurRe (GE Healthcare) en una columna Tricorn de 0,5 mm con una altura de lecho de 20 cm y un volumen de columna de 3,98 ml con un caudal lineal de 350 cm/h. Antes de su uso, la columna se higienizó con 2 volúmenes de columna de hidróxido de sodio 0,5 M seguido de una retención de 15 minutos.

Los tampones de proceso y los volúmenes de las columnas se muestran en la tabla 20. Después de su uso, la columna se higienizó con 2 volúmenes de columna de hidróxido de sodio 0,5 M seguido de una retención de 15 minutos. Para la recogida de los picos de eluido, la DO se inició a 100 mAU y terminó a 100 mAU (0,5 DO). Todas las fracciones se analizaron a A280 para determinar la concentración de proteínas y las HCP se cuantificaron usando el ensayo de HCP Gyros descrito en el ejemplo 1.

Tabla 20: T m n r v l m n l mn

El desarrollo 2 fue un desarrollo de control con un lavado con caprilato de sodio y sin segundo lavado. Sin embargo, la ausencia de un segundo lavado dio lugar a una alta concentración de cloruro de sodio en el borde de avance del pico de elución. Se sabe que el anticuerpo anti-IL-18 utilizado en este experimento (n.° de registro de la NCIMB 41786) se separa en fase a altas concentraciones de sal y así lo hizo en este eluido. Por lo tanto, el desarrollo 2 se descartó y no se analizó. Los resultados de los desarrollos 1, 3 4 también se muestran en la tabla 21.

Los resultados indican que el ácido caprílico fue capaz de eliminar las HCP, pero no en la misma medida que el caprilato de sodio en los niveles analizados. En ambos casos, los niveles de HCP se redujeron significativamente en comparación con el control. En el eluido de control, el nivel de las HCP era de 680 ng/ml, que se redujo 4 veces a 152 ng/mg en el experimento con ácido caprílico y 35 veces en el experimento con caprilato de sodio. Es posible que el aumento de la concentración del lavado con ácido caprílico reduzca aún más las HCP en el eluido. Los resultados demuestran que tanto el ácido caprílico como el caprilato de sodio son capaces de reducir los niveles de HCP en los eluidos de proteína A.

Ejemplo 5: Reducción de la formación de partículas inducida por proteasas de las células hospedadoras

El propósito de este experimento fue investigar la formación de partículas de aparición retardada para un anticuerpo anti-IL6. Se observó un retraso en la formación de partículas en una formulación que contenía 50 mg/ml de anticuerpo anti-IL6 después de 6 meses a 5 °C. La carga microbiana fue de 0 ufc/ml, lo que indica que no hay contaminación bacteriana. Un análisis por espectrometría de masas de las partículas reveló que éstas contenían anticuerpos anti-IL6 y niveles elevados de fragmentos. No se detectaron elementos pesados mediante SEM. No se detectaron HCP mediante SDS PAGE 2D (figura 24).

Los niveles de HCP en el eluido de la purificación de proteína A fueron superiores a 100 ng/mg cuando se utilizó un tampón de lavado que incluía Tris 20 mM, NaCl 1 M a pH 7,5 ("tampón de lavado estándar"). La inclusión de un lavado con caprilato que contiene Tris 100 mM; caprilato de sodio 50 mM, NaCl 2,5 M a pH 9,0 durante la purificación de proteína A redujo los niveles de HCP de más de 100 ng/ml a menos de 10 ng/ml. La pureza del anticuerpo anti-IL6 se midió mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) utilizando una columna TSK-GEL G3000SWXL (Tosoh Bioscience LLC, Mongomeryville, PA, e E. UU.) con detección UV a 280 nm. Se inyectaron aproximadamente 250 |jg de proteína en la columna de ensayo. La elución de los agregados solubles, del monómero y de los fragmentos se produjo a los aproximadamente 6 a 8 minutos, 8,5 minutos y entre 9 y 11,5 minutos, respectivamente. Se utilizó un caudal de 1,0 ml/min durante 20 minutos utilizando una fase móvil a pH 6,8 que contenía fosfato de sodio 0,1 M, sulfato de sodio 0,1 M y azida de sodio al 0,05 % (p/v) para analizar las muestras.

La SEC detectó una mayor tasa de fragmentación a 40 °C para los lotes de anticuerpos anti-IL6 con los niveles más altos de HCP (es decir, superiores a aproximadamente 100 ng/mg) (figuras 25 y 26). Las muestras de anticuerpos anti-IL6 se diluyeron a aproximadamente 1 mg/ml en tampón fosfato 1 mM a pH 7,0 y se analizaron su fragmentación en volúmenes de inyección de 10 j l mediante cromatografía en fase inversa (RP-HPLC). Para realizar los análisis se utilizó una columna PLRP-S CM810092/00 de Michrom Bioresources (Auburn, CA, EE. UU.) con una elución en gradiente a 75 °C usando TFA al 0,1 % en agua (fase móvil A, fm A) y TFA al 0,1 % (fm B) en acetonitrilo. Las especies se eluyeron utilizando un gradiente de fm B (3 min de retención al 5 %, 5-34 % durante 3 min, 34-44 % durante 16 min, 44-75 % durante 2,5 min, seguido de un acondicionamiento de la columna al 95 % durante 8 min).

Cuando se analizó mediante RP-HPLC a 40 °C, los índices de fragmentación fueron superiores al 3 % por mes para los lotes con los niveles más altos de HCP (es decir, superiores a aproximadamente 100 ng/mg), mientras que los lotes que se purificaron con la etapa de lavado con caprilato, con niveles de HCP mucho más bajos y sin actividad proteasa detectable, tuvieron índices de fragmentación mucho más bajos, de aproximadamente 2 al 2,5 % por mes.

Todos los lotes con niveles de HCP superiores a 100 ng/mg formaron partículas visibles de aparición retardada según la inspección visual (tabla 24).

Tabla 24: Nivel de HCP

Se implementó un ensayo fluorescente de proteasa (kit de ensayo de proteasa Invitrogen EnzChek®) para diagnosticar la estabilidad relacionada con las proteasas de las HCP. Todos los lotes con actividad proteasa formaron partículas de aparición retardada. Por el contrario, los lotes purificados con el lavado de caprilato (símbolos huecos) no demostraron actividad proteasa (véase la figura 27) y no formaron partículas de aparición retardada (tabla 25).

Tabla 25: Actividad roteasa

Los resultados de la tabla 25 demuestran claramente que los lotes más estables (lotes E, F y G) fueron los lotes con el lavado con caprilato durante la purificación de proteína A. Como se muestra en la tabla 26, el lote D, que se sometió a un lavado estándar durante la purificación de proteína A y mostró altos niveles de HCP y actividad de proteasa detectable, demostró una formación significativa de partículas a los 3-12 meses. Por el contrario, el lote E, que se purificó a partir del mismo medio de cultivo celular que el lote D y que tenía un nivel de HCP significativamente menor y una actividad proteasa nula, mostró muy poca formación de partículas con el paso del tiempo. Por lo tanto, al parecer, la reducción de los niveles de HCP/proteasa con un lavado de caprilato durante la purificación de proteína A mitiga la formación de partículas de aparición retardada inducida por las proteasas de las HCP. Se cree que el mejor factor de predicción de la formación de partículas de aparición retardada son los niveles elevados de HCP y la actividad proteasa.

Se examinó la actividad aspartil y serina proteasa en la aparición de partículas del lote B utilizando el kit de ensayo de proteasas EnzChek® de Invitrogen para el formato de microplacas HTS. Los resultados de muestran en la figura 28. La pepstatina (inhibidor de las aspartil proteasas) redujo drásticamente la actividad proteasa. AEBSF (inhibidor de serina proteasa) tuvo un impacto menor a un pH más alto (otros inhibidores de serina también tuvieron impacto). Otras clases de inhibidores no redujeron la actividad proteasa (no mostrado).

Tabla 26: Estabilidad

Ejemplo 6: Identificación de proteínas de células hospedadoras en varios puntos del proceso de purificación

En este ejemplo, se examinaron e identificaron las proteínas de células hospedadoras (HCP) y el diagnóstico de alto rendimiento de la actividad proteasa en varias etapas del proceso de purificación de anti-IL6. Las muestras se analizaron a partir de los medios de cultivo celular y luego en el producto durante el proceso de proteína A tanto para el lavado estándar como para el caprilato y en las fracciones de lavado de la etapa de proteína A para el proceso tanto estándar como con caprilato.

Se utilizó un ensayo fluorescente de proteasa (kit de ensayo de proteasa Invitrogen EnzChek®) junto con varios inhibidores de proteasa disponibles en el mercado para detectar y diagnosticar la presencia y la clase/tipos de proteasas presentes en el principio activo final y en cualquier muestra de purificación intermedia. Para evaluar la actividad proteasa en las muestras se utilizó el kit de ensayo de proteasa EnzChek® (E6638, Molecular Probes, Eugene, OR). El sustrato de detección del kit es el conjugado BODIPY®-caseína. Las muestras se diluyeron 10 veces en un tampón de citratofosfato 20 mM a pH que suelen oscilar entre 4 y 8. Se prepararon placebos iguales. El tampón citrato-fosfato se preparó mezclando ácido cítrico 20 mM y fosfato de sodio dibásico 20 mM para alcanzar los pH deseados. La preparación de los reactivos se adaptó al procedimiento suministrado. El sustrato de detección del conjugado BODIPY®-caseína se diluyó en el tampón adecuado para generar un reactivo de trabajo a cada pH de 4 a 8 a aproximadamente 10 |jg/ml. Se añadió un volumen igual (normalmente 100 j l) de muestra y reactivo de trabajo a los pocillos de una microplaca blanca para generar muestras de ensayo por triplicado y placebos coincidentes en el intervalo de pH de 4 a 8. Las muestras se sellaron y se incubaron a 40 °C durante una duración típica de 3 a 5 horas. La fluorescencia del colorante se excitó a 485 nm y la intensidad de emisión a 530 nm se registró utilizando un filtro de corte de 495 nm en un lector de placas de fluorescencia SpectraMax® de Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Se registró la intensidad frente al pH de las muestras. Los aumentos de intensidad de la muestra en comparación con el blanco de menos de aproximadamente un 20 % se consideraron negativos para la actividad proteasa según las directrices del fabricante, dependiendo de la variabilidad del método. Se restaron los resultados del tampón de los de las muestras y se representaron frente al pH y esto se usó para determinar la presencia de actividad proteasa en las muestras. Se realizaron múltiples copias para evaluar la variabilidad de las lecturas bajas. Para la cuantificación relativa, se utilizaron preparaciones de control de proteasas conocidas, tales como catepsina-D o tripsina como comparadores. Para confirmar la presencia de proteasas, se añadieron inhibidores de proteasas a las muestras, lo que provocó una disminución relativa o la eliminación de la actividad proteasa detectada como confirmación de los resultados.

Se utilizó espectrometría de masas bidimensional (2D-EM) para identificar la serina proteasa y la aspartil proteasa (catepsina-D) en el medio de cultivo celular y en las diversas etapas de producto de proteína A y de lavado. Se identificaron doscientas sesenta y cuatro HCP en el medio de cultivo, incluidas las proteasas. Utilizando un lavado estándar, se observaron 24 HCP en el producto de proteína A. En cambio, utilizando un lavado con caprilato, solo se observaron 8 HCP en el producto de proteína A. Los resultados demuestran claramente que la reducción de las HCP se logró mediante el tratamiento con caprilato.

Debido a los niveles muy bajos de proteasas en el principio activo final, se necesitó purificación por afinidad y enriquecimiento y concentración de la aspartil proteasa (utilizando pepstatina inmovilizada, 786-789, G-Biosciences, St. Louis, MO) para generar una muestra con niveles de proteasas lo suficientemente altos como para permitir la identificación positiva de la presencia de catepsina-D mediante espectrometría de masas. La purificación por afinidad se utilizó para identificar las proteasas en el principio activo final. Se utilizó pepstatina inmovilizada (786-789, G-Biosciences, St. Louis, MO) para capturar, enriquecer y eluir las aspartil proteasas del principio activo. La muestra enriquecida se analizó por espectrometría de masas en 2D para identificar la proteasa. Este material de la resina de afinidad contiene el ligando que se une a las aspartil proteasas. Se siguieron los procedimientos del fabricante para unir las aspartil proteasas a la resina de afinidad, lavar el anticuerpo anti-IL6 y finalmente eluir las aspartil proteasas capturadas enriquecidas/concentradas de la columna para su posterior análisis e identificación. Se utilizó un gran volumen de principio activo para concentrar/enriquecer estas muestras para mejorar la detectabilidad

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para reducir el nivel de proteínas de células hospedadoras (HCP) en una composición que comprende un polipéptido producido de manera recombinante, comprendiendo el método:

proporcionar un sobrenadante de cultivo celular clarificado que comprende el polipéptido producido de manera recombinante y una o más HCP;

cargar el sobrenadante de cultivo celular clarificado en una columna de cromatografía de proteína A; lavar la columna de cromatografía de proteína A con un tampón de lavado que comprende caprilato de sodio entre 50 mM y 100 mM a un pH entre 8 y 9 para eliminar las HCP.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las HCP comprenden una o más proteasas seleccionadas entre: serina proteasas, aspartil proteasas, cisteína proteasas, metaloproteasas, aminopeptidasas y combinaciones de las mismas.

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón de lavado comprende además cloruro de sodio, opcionalmente, a una concentración entre 1,0 M y 2,5 M.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende una etapa de clarificar el cultivo celular recolectado para obtener un cultivo celular recolectado clarificado y cargar el cultivo celular recolectado clarificado en la columna de cromatografía de proteína A.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende equilibrar la columna de proteína A cargada con un tampón de equilibrado antes de lavar la columna con el tampón de lavado.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el tampón de equilibrado comprende fosfato de sodio, opcionalmente, en donde el tampón de equilibrado comprende fosfato de sodio entre 10 mM y 100 mM.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende una segunda etapa de lavado después de lavar la columna con el tampón de lavado de ácidos grasos, opcionalmente, en donde el tampón usado en la segunda etapa de lavado comprende fosfato de sodio.