CN104968362A - 氧化降低的配制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含蛋白质与防止该蛋白质氧化的化合物的组合的配制剂。本发明还提供用于生成此类配制剂的方法和使用此类配制剂的方法。本发明进一步提供筛选防止蛋白质组合物中的蛋白质氧化的化合物的方法和防止配制剂中的蛋白质氧化的方法。

Description

氧化降低的配制剂

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年03月13日提交的美国临时申请No.61/780,845和2013年11月27日提交的美国临时申请No.61/909,813的权益，在此通过述及完整收录其每一篇。

发明领域

本发明涉及包含蛋白质且进一步包含防止所述蛋白质氧化的化合物的液体配制剂、用于生成和使用该液体配制剂的方法以及筛选防止蛋白质组合物中的蛋白质氧化的化合物的方法。

发明背景

氨基酸残基的氧化性降解是在蛋白质药物中常常观察到的一种现象。一些氨基酸残基对氧化易感，特别是甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)(Li et al.,Biotechnology and Bioengineering48:490-500(1995))。当蛋白质在各种加工步骤期间暴露于过氧化氢、光、金属离子或这些的组合时通常观察到氧化(Li et al.,Biotechnology andBioengineering 48:490-500(1995))。特别地，暴露于光(Wei,et al.,AnalyticalChemistry 79(7):2797-2805(2007))、AAPH或Fenton试剂(Ji et al.,J Pharm Sci98(12):4485-500(2009))的蛋白质显示出升高水平的色氨酸残基氧化，而那些暴露于过氧化氢的通常只显示出甲硫氨酸氧化(Ji et al.,J Pharm Sci98(12):4485-500(2009))。光暴露可经由形成反应性氧种类(ROS)(包括单线态氧、过氧化氢和超氧化物)导致蛋白质氧化(Li et al.,Biotechnology andBioengineering 48:490-500(1995)；Wei,et al.,Analytical Chemistry79(7):2797-2805(2007)；Ji et al.,J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009)；Frokjaeret al.,Nat Rev Drug Discov 4(4):298-306(2005))，而在Fenton介导的反应中通常经羟根发生蛋白质氧化(Prousek et al.,Pure and Applied Chemistry79(12):2325-2338(2007))及在AAPH介导的反应中通常经烃氧基过氧化物发生蛋白质氧化(Werber et al.,J Pharm Sci 100(8):3307-15(2011))。色氨酸氧化导致众多氧化产物，包括羟基色氨酸、犬尿氨酸(kynurenine)、和N-甲酸基犬尿氨酸，而且具有影响安全性和功效的潜力(Li et al.,Biotechnology andBioengineering 48:490-500(1995)；Ji et al.,J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009)；Frokjaer et al.,Nat Rev Drug Discov 4(4):298-306(2005))。与生物学功能丧失有关的单克隆抗体重链互补决定区(CDR)中特定色氨酸残基的氧化已有报告(Wei,et al.,Analytical Chemistry 79(7):2797-2805(2007))。最近关于Fab分子报告了由组氨酸配位金属离子介导的Trp氧化(Lam et al.,Pharm Res28(10):2543-55(2011))。该报告还援引Fab配制剂中聚山梨酯20的自氧化，其导致各种过氧化物的生成。自氧化诱导的这些过氧化物生成还可导致药物产品长期贮藏期间蛋白质中的甲硫氨酸氧化，因为蛋白质中的Met残基提示起内部抗氧化剂的作用(Levine et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 93(26):15036-15040(1996))且容易被过氧化物氧化。氨基酸残基的氧化具有影响蛋白质生物学活性的潜力。单克隆抗体(单抗)可尤其如此。IgG1单抗中Met254和Met430处的甲硫氨酸氧化在转基因小鼠中潜在影响血清半衰期(Wang et al.,Molecular Immunology48(6-7):860-866(2011))，而且还影响人IgG1对FcRn和Fcγ受体的结合(Bertolotti-Ciarlet et al.,Molecular Immunology 46(8-9)1878-82(2009))。

在药物产品制造和贮藏期间需要评估蛋白质(尤其在液体状态)的稳定性。药物配制剂的开发有时包括添加抗氧化剂以防止活性组分氧化。将L-甲硫氨酸添加至配制剂导致蛋白质和肽中的甲硫氨酸残基氧化降低(Ji et al.,JPharm Sci 98(12):4485-500(2009)；Lam et al.,Journal of PharmaceuticalSciences 86(11):1250-1255(1997))。同样地，添加L-色氨酸显示出降低色氨酸残基氧化(Ji et al.,J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009)；Lam et al.,Pharm Res28(10):2543-55(2011))。然而，L-Trp拥有UV区(260-290nm)中的强吸光度，使之成为光氧化期间的主要靶物(Creed,D.,Photochemistry and Photobiology39(4):537-562(1984))。Trp假设是内源光敏剂，增强酪氨酸(Babu et al.,IndianJ Biochem Biophys 29(3):296-8(1992))和其它氨基酸(Bent et al.,Journal of theAmerican Chemical Society 97(10):2612-2619(1975))的氧依赖性光氧化。已经证明，L-Trp能在暴露于光时生成过氧化氢，而且L-Trp在UV光下经超氧化物阴离子生成过氧化氢(McCormick et al.,Science 191(4226):468-9(1976)；Wentworth et al.,Science 293(5536):1806-11(2001)；McCormick et al.,Journalof the American Chemical Society 100:312-313(1978))。另外，已知色氨酸在暴露于光时生成单线态氧(Davies,M.J.,Biochem Biophys Res Commun305(3):761-70(2003))。与由聚山梨酯20自氧化诱导的蛋白质氧化相似，有可能的是在正常操作条件下由蛋白质配制剂中的其它赋形剂(例如L-Trp)所致的ROS生成时可发生蛋白质氧化。

根据最近的研究可见，将意图稳定蛋白质的标准赋形剂(诸如L-Trp和聚山梨酯)添加至蛋白质组合物可导致出乎意料的且不想要的后果，诸如ROS诱导的蛋白质氧化。因此，仍然需要鉴定用于蛋白质组合物和开发此类组合物的备选赋形剂。

发明概述

本文中提供一种配制剂(其包含蛋白质和防止该配制剂中的该蛋白质氧化的化合物)、生成该配制剂的方法、和筛选防止蛋白质组合物中的蛋白质氧化的化合物的方法。

一方面，本文中提供一种液体配制剂，其包含蛋白质和防止该液体配制剂中的该蛋白质氧化的化合物，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。

在一些实施方案中，该液体配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。在一些实施方案中，该配制剂含水。

在一些实施方案中，该配制剂中防止该蛋白质氧化的化合物为约0.3mM至约10mM，或直至该化合物在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，该配制剂中防止该蛋白质氧化的化合物为约0.3mM至约9mM、约0.3mM至约8mM、约0.3mM至约7mM、约0.3mM至约6mM、约0.3mM至约5mM、约0.3mM至约4mM、约0.3mM至约3mM、约0.3mM至约2mM、约0.5mM至约2mM、约0.6mM至约1.5mM、或约0.8mM至约1.25mM。在一些实施方案中，该配制剂中防止该蛋白质氧化的化合物为约0.3mM至约1mM。在一些实施方案中，该配制剂中防止该蛋白质氧化的化合物为约0.3mM至约5mM。在一些实施方案中，该配制剂中防止该蛋白质氧化的化合物为约1mM。在一些实施方案中，该化合物防止该蛋白质中的色氨酸和/或甲硫氨酸氧化。在一些实施方案中，该化合物防止反应性氧种类对该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该反应性氧种类选自下组：单线态氧，超氧化物(O₂-)，过氧化氢，羟根，和烃基过氧化物。

在一些实施方案中，该配制剂中的该蛋白质对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、或抗体片段)。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。

在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自下组的赋形剂：稳定剂，缓冲剂，表面活性剂，和张度剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。

另一方面，本文中提供一种生成液体配制剂的方法，其包括将一定量的防止蛋白质氧化的化合物添加至液体配制剂，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。另一方面，本文中提供一种防止液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括将一定量的防止该蛋白质氧化的化合物添加至液体配制剂，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。

在本文所述方法的一些实施方案中，该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。在一些实施方案中，该配制剂含水。

在本文所述方法的一些实施方案中，该配制剂中的该化合物为约0.3mM至约10mM，或直至该化合物在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，该配制剂中的该化合物处于约0.3mM至约9mM、约0.3mM至约8mM、约0.3mM至约7mM、约0.3mM至约6mM、约0.3mM至约5mM、约0.3mM至约4mM、约0.3mM至约3mM、约0.3mM至约2mM、约0.5mM至约2mM、约0.6mM至约1.5mM、或约0.8mM至约1.25mM的浓度。在一些实施方案中，该配制剂中的该化合物为约0.3mM至约1mM。在一些实施方案中，该配制剂中的该化合物为约0.3mM至约5mM。在一些实施方案中，该配制剂中的该化合物为约1mM。在一些实施方案中，该化合物防止该蛋白质中的色氨酸和/或甲硫氨酸氧化。在一些实施方案中，该化合物防止反应性氧种类对该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该反应性氧种类选自下组：单线态氧，超氧化物(O₂-)，过氧化氢，羟根，和烃基过氧化物。

在一些实施方案中，该蛋白质对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、或抗体片段)。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。

在一些实施方案中，将一种或多种选自下组的赋形剂添加至配制剂中：稳定剂，缓冲剂，表面活性剂，和张度剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。

另一方面，本文中提供一种筛选防止蛋白质组合物中的蛋白质氧化的化合物的方法，其包括选择具有与L-色氨酸相比更低的氧化势和更少的光敏感性的化合物，并测试选定化合物防止该蛋白质氧化的效果。

在该方法的一些实施方案中，光敏感性是基于在光暴露时由该化合物生成的H₂O₂的量测量的。在一些实施方案中，选择生成比由L-色氨酸生成的H₂O₂的量的约20％要少的H₂O₂的化合物。在一些实施方案中，氧化势是通过循环伏安法测量的。在一些实施方案中，测试选定化合物防止由2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)、光、和/或Fenton试剂生成的反应性氧种类对该蛋白质的氧化的效果。

要理解，可以组合本文所述各个实施方案的一种、一些、或所有特性以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对本领域技术人员会变得明显。通过下面的详述进一步描述本发明的这些和其它实施方案。

附图简述

图1是一系列图，演示在250W/m²光暴露8小时后A)mAb1中的Fab，和B)mAb1中的Fc的氧化。mAb1以5mg/mL存在于20mM组氨酸乙酸盐，250mM海藻糖，0.02％聚山梨酯20中。所有管形瓶放置在灯箱中，mAb1 RefMat除外。箔对照管形瓶覆盖在箔中，之后放置在灯箱中。为每份样品平均三个分开的实验管形瓶，例外如下：“10mM Met，1mM Trp”(*)是两个实验管形瓶的平均，而mAb1 Ref Mat是一个实验管形瓶及在HPLC上的三次独立注射。误差条代表一个标准偏差。

图2是一幅图，显示由L-Trp进行的剂量依赖性H₂O₂生成。菱形指示单独的L-Trp；三角形指示L-Trp+SOD；圆形和正方形指示L-Trp+NaN₃±SOD。所有研究是在20mM L-His HCl，pH 5.5中实施的。

图3是一系列图，演示A)在暴露于环境光条件达1、3和7天时含有3.2mML-Trp的50mg/mL mAb1配制剂中的过氧化氢(H₂O₂)生成和B)在暴露于环境光条件10天后含有3.2mM L-Trp的mAb1配制剂中的百分百(％)Fab氧化。

图4是一系列图，显示在4小时250W/m²光压力下由色氨酸衍生物和吲哚衍生物进行的过氧化氢生成。A)在20mM HisAc pH5.5配制剂中对色氨酸衍生物(1mM)筛选过氧化氢(μM)生成。B)在20mM HisAc pH5.5配制剂中对吲哚衍生物(1mM)筛选过氧化氢(μM)生成。

图5是一幅图，显示NaN₃对在光暴露时由各种Trp衍生物进行的H₂O₂生成的影响。数据显示为就由L-Trp生成的过氧化物而言的比。

图6是一幅图，显示氧化势和光诱导的过氧化物形成之间的关联。框示区域显示候选抗氧化剂化合物。

图7是一系列图，显示在AAPH温育后A)mAb1中的Fab，和B)mAb1中的Fc的氧化。所有样品与AAPH一起温育，mAb1 Ref Mat和无AAPH除外。所有样品于40℃温育，mAb1 Ref Mat除外。所示数据是三份实验样品的平均值±1个SD，mAb1 Ref Mat除外，它是六次HPLC注射的平均值，没有误差条。

图8是一系列图，显示在16小时250W/m²光暴露后A)mAb1中的Fab，和B)mAb1中的Fc的氧化。所有管形瓶放置在灯箱中，mAb1 Ref Mat除外。箔对照管形瓶覆盖在箔中，之后放置在灯箱中。为每份样品平均三个分开的实验管形瓶，例外如下：L-色氨酸酰胺(*)是两个实验管形瓶的平均，而mAb1Ref Mat是一个管形瓶及在HPLC上的三次独立注射。误差条代表一个标准偏差。

图9是一系列图，显示在使用10ppm H₂O₂和0.2mM Fe(III)进行Fenton反应之后A)3mg/mL mAb1中的Fab，和B)3mg/mL mAb1中的Fc的氧化。反应于40℃温育3小时，用100mM L-Met淬灭，并在木瓜蛋白酶消化后使用RP-HPLC进行分析。所有样品是三个分开的管形瓶的平均，而mAb1对照(RefMat)是一个管形瓶及HPLC上的五次独立注射。误差条代表一个标准偏差。

图10是一系列图，显示A)L-Trp和B)5-羟基-L-色氨酸激发及生成和淬灭¹O₂中的推定机制。k_25C代表淬灭¹O₂的二级速率常数(Dad et al.,J PhotochemPhotobiol B,78(3):245-51(2005))，而E_ox是分子对Ag/AgCl的氧化势。

发明详述

I.定义

在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于特定组合物或生物学系统，它们当然可以有所变化。还应理解本文中所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并非意图对其进行限制。

术语“药物配制剂”指如下形式的制备物，使得容许活性组分的生物学活性有效，且不含别的对会施用配制剂的受试者有不可接受的毒性的成分。此类配制剂是无菌的。

“无菌”配制剂没有活菌或者没有或基本上没有所有活的微生物及其孢子。

“稳定”配制剂为一种其中的蛋白质在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的。优选地，配制剂在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性，以及其生物学活性。贮藏期一般基于配制剂的预定架存期来选择。多种用于测量蛋白质稳定性的分析技术是本领域可得的且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。可测量在预定量的光暴露和/或温度贮藏预定时间段后的稳定性。可以多种不同方式定性和/或定量评估稳定性，包括评估聚集体形成(例如使用大小排阻层析、通过测量浊度、和/或通过视觉检查)；评估ROS形成(例如通过使用光应激测定法或2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)应激测定法)；蛋白质的特定氨基酸残基的氧化(例如单克隆抗体的Trp残基和/或Met残基)；使用阳离子交换层析、图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原型(reduced)和完整抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估蛋白质的生物学活性或靶物结合功能(例如抗体的抗原结合功能)；等。不稳定性可涉及下述一项或多项：聚集，脱酰胺(例如Asn脱酰胺)，氧化(例如Met氧化和/或Trp氧化)，异构化(例如Asp异构化)，修剪/水解/片段化(例如铰链区片段化)，琥珀酰亚胺形成，不配对的半胱氨酸，N端延伸，C端加工，糖基化差异，等。

若在视觉检查颜色和/或澄清度时，或根据UV光散射或大小排阻层析的测量，蛋白质显示很少的聚集、沉淀和/或变性或没有上述迹象的话，则它在药物配制剂中“保留其物理稳定性”。

若在给定时间的化学稳定性使得蛋白质被认定为仍然保留其生物学活性，如下文定义的，则蛋白质在药物配制剂中“保留其化学稳定性”。化学稳定性可通过检测和定量蛋白质的化学改变形式来评估。化学改变可涉及蛋白质氧化，这可使用例如胰蛋白酶消化肽作图、反相高效液体层析(HPLC)和液体层析-质谱术(LC/MS)来评估。其它类型的化学改变包括蛋白质的电荷改变，其可通过例如离子交换层析或icIEF来评估。

若蛋白质在给定时间的生物学活性在制备药物配制剂时展现的生物学活性的约10％之内(在测定法的误差之内)，如在例如用于单克隆抗体的抗原结合测定法中测定的，则蛋白质在药物配制剂中“保留其生物学活性”。

如本文中使用的，蛋白质的“生物学活性”指蛋白质结合其靶物的能力，例如单克隆抗体结合抗原的能力。它可进一步包括生物学应答，其可在体外或在体内测量。此类活性可以是拮抗性的或激动性的。

“对氧化易感的”蛋白质为包含一个或多个发现倾向于氧化的残基(诸如但不限于甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr))的蛋白质。例如，单克隆抗体的Fab部分中的色氨酸氨基酸或单克隆抗体的Fc部分中的甲硫氨酸氨基酸可能对氧化易感。

“等张”表示感兴趣的配制剂与人血液具有基本上相同的渗透压。等张配制剂一般会具有约250至350mOsm的渗透压。等张性可使用例如蒸气压或冰冻型渗透压计来测量。

如本文中使用的，“缓冲液”指通过其酸-碱配合成分的作用来抵抗pH变化的缓冲溶液。本发明的缓冲液优选具有在约4.5至约8.0的范围中的pH。例如，会控制pH在此范围中的缓冲液的一个例子是组氨酸乙酸盐。

“防腐剂”为如下的化合物，其可任选地包括在配制剂中以本质上降低其中的细菌作用，如此便于生产例如多次使用配制剂。潜在防腐剂的例子包括十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、氯己双胺、苯扎氯铵(烃基苯甲基二甲基氯化铵的混合物，其中烃基是长链化合物)、和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇诸如酚、丁醇和苯甲醇，烃基对羟基苯甲酸酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，邻苯二酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇，和间甲酚。在一个实施方案中，本文中的防腐剂为苯甲醇。

如本文中使用的，“表面活性剂”指表面活性作用剂，优选非离子型表面活性剂。本文中的表面活性剂的例子包括聚山梨酯(例如聚山梨酯20和聚山梨酯80)；Poloxamer(例如Poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、或硬脂酰基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、或硬脂酰基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基、或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰氨基丙基-、椰油酰氨基丙基-、亚油酰氨基丙基-、肉豆蔻酰氨基丙基-、棕榈酰氨基丙基-、或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(例如月桂酰氨基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基-、棕榈酰氨基丙基-、或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；和MONAQUAT^TM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，N.J.)；聚乙二醇、聚丙二醇、及乙二醇和丙二醇共聚物(例如Pluronics、PF68等)；等。在一个实施方案中，本文中的表面活性剂为聚山梨酯20。

如本文中使用的，“药学可接受”赋形剂或载剂包括药学可接受载体、稳定剂、缓冲剂、酸、碱、糖、防腐剂、表面活性剂、张度剂、等等，它们是本领域公知的(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd Ed.,Pharmaceutical Press,2012)。药学可接受赋形剂的例子包括缓冲剂诸如磷酸、柠檬酸、乙酸、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、L-色氨酸和甲硫氨酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；金属复合物(诸如Zn-蛋白质复合物)；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子诸如钠；和/或非离子型表面活性剂诸如聚山梨酯、poloxamer、聚乙二醇(PEG)、和PLURONICS^TM。“药学可接受”赋形剂或载剂为那些可合理施用于受试者以提供有效剂量的活性组分，在采用的剂量和浓度对暴露于其的受试者无毒的。

配制的蛋白质优选基本上纯的且希望基本上同质的(例如没有污染性蛋白质等)。“基本上纯的”蛋白质表示基于组合物的总重量，组合物包含以重量计至少约90％、优选以重量计至少约95％的蛋白质(例如单克隆抗体)。“基本上同质的”蛋白质表示基于组合物的总重量，组合物包含以重量计至少约99％的蛋白质(例如单克隆抗体)。

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，它可以包含经过修饰的氨基酸，而且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然地或通过干预进行修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其它操作或修饰，诸如与标记成分缀合。定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的蛋白质。本文中的定义内涵盖的蛋白质的例子包括哺乳动物蛋白质，诸如例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；高血糖素；瘦蛋白；凝固因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子、和冯·维勒布兰德(vonWillebrand)氏因子；抗凝固因子，诸如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化剂，诸如尿激酶或人尿型或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；林蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；肿瘤坏死因子受体诸如死亡受体5和CD120；TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)；B细胞成熟抗原(BCMA)；B-淋巴细胞刺激物(BLyS)；增殖诱导配体(APRIL)；脑啡肽酶；RANTES(活化时受到调节，正常情况由T-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，诸如人血清清蛋白；穆勒(Muellerian)抑制性物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；活化素；血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血管内皮生长因子家族蛋白质(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、和P1GF)；血小板衍生生长因子(PDGF)家族蛋白质(例如PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、及其二聚体)；成纤维细胞生长因子(FGF)家族，诸如aFGF、bFGF、FGF4、和FGF9；表皮生长因子(EGF)；激素或生长因子的受体，诸如VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2、和VEGFR3)、表皮生长因子(EGF)受体(例如ErbB1、ErbB2、ErbB3、和ErbB4受体)、血小板衍生生长因子(PDGF)受体(例如PDGFR-α和PDGFR-β)、和成纤维细胞生长因子受体；TIE配体(血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受体，诸如TIE1和TIE2；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)、或神经生长因子，诸如NGF-b；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(BMP)；趋化因子，诸如CXCL12和CXCR4；干扰素，诸如干扰素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；细胞因子，诸如白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；中期因子；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如例如AIDS被膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肝配蛋白；Bv8；德尔塔样配体4(DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；促卵泡素抑制素；肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)；Alk1；Robo4；ESM1；串珠蛋白聚糖；EGF样域、multiple 7(EGFL7)；CTGF和它的家族的成员；血小板反应蛋白，诸如血小板反应蛋白1和血小板反应蛋白2；胶原，诸如胶原IV和胶原XVIII；神经毡蛋白(neuropilin)，诸如NRP1和NRP2；多效营养因子(PTN)；Progranulin；增殖蛋白；Notch蛋白，诸如Notch1和Notch4；脑信号蛋白，诸如Sema3A、Sema3C、和Sema3F；肿瘤相关抗原，诸如CA125(卵巢癌抗原)；免疫粘附素；和任何上文所列蛋白的片段和/或变体以及结合一种或多种蛋白(包括例如任何上文所列蛋白)的抗体(包括抗体片段).

本文中术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“分离的”蛋白质(例如分离的抗体)指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的蛋白质。其天然环境的污染性成分指将会干扰该蛋白质的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。既然蛋白质天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的蛋白质包括重组细胞内的原位蛋白质。然而，分离的蛋白质通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(V_H)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(V_L)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。

术语“恒定域”指免疫球蛋白分子中的如下部分，其相对于免疫球蛋白的其它部分，即含有抗原结合位点的可变域，具有更加保守的氨基酸序列。恒定域含有重链的C_H1、C_H2和C_H3域(统称CH)及轻链的CHL(或CL)域。

抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“V_H”。轻链的可变域可以称为“V_L”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

如本文中使用的，术语IgG“同种型”或“亚类”意指由其恒定区的化学和抗原特征定义的任何免疫球蛋白亚类。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价连接而形成的更大融合分子的一部分。

术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，而非下文定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')₂抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和重链可以在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在V_H与V_L结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Plückthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，例如构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。

修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow etal.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling et al.,于:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year inImmuno.7:33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔、或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSE^TM技术)。还可参见例如Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在V_H中(H1、H2、H3)，三个在V_L中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.,Immunity 13:37-45(2000)；Johnsonand Wu,于:Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.Nature363:446-448,(1993)；Sheriff et al.Nature Struct.Biol.3:733-736,(1996)。

本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。

HVR可包括如下“延伸的HVR”：V_L中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及V_H中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等,见上文编号的。

“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。

术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat et al.,见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。

Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest.5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.,见上文中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG₁EU抗体的残基编号方式。

表述“线性抗体”指Zapata等(1995)Protein Eng,8(10):1057-1062中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，或者是单特异性的。

如本文中使用的，术语“约”指由本领域普通技术人员为相应数值确定的可接受的误差范围，它会部分取决于该数值是如何测量或确定的，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或超过1个标准偏差内。在本文中提到“约”数值或参数包括及描述指向该数值或参数本身的实施方案。例如，提到“约X”的叙述包括“X”的叙述。

如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数所指物，除非另有明确说明。如此，例如，提及“一个/种化合物”任选包括两个/种或更多个/种此类化合物的组合，诸如此类。

理解的是，本文所述发明的各方面和实施方案包括“包含”、“由……组成”、和“基本上由……组成”的方面和实施方案。

II.蛋白质配制剂和制备物

本文中的发明涉及液体配制剂，其包含蛋白质和防止该液体配制剂中的该蛋白质氧化的化合物，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。在一些实施方案中，该配制剂中的该化合物为约0.3mM至约10mM，或直至该化合物在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，该配制剂中的该化合物为约1mM。在一些实施方案中，该化合物防止该蛋白质中的一种或多种选自下组的氨基酸氧化：色氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，该化合物防止反应性氧种类(ROS)对该蛋白质的氧化。在又一个实施方案中，该反应性氧种类选自下组：单线态氧，超氧化物(O₂-)，烃氧根，过氧根，过氧化氢(H₂O₂)，三氧化二氢(H₂O₃)，氢三氧根(HO₃·)，臭氧(O₃)，羟根，和烃基过氧化物。在一些实施方案中，本文所述蛋白质对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、和/或酪氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸和/或甲硫氨酸对氧化易感。例如，单克隆抗体的Fab部分中的色氨酸氨基酸和/或单克隆抗体的Fc部分中的甲硫氨酸氨基酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些本文中的实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、或抗体片段。在一个进一步的实施方案中，该化合物防止抗体的Fab部分中的一种或多种氨基酸氧化。在另一个进一步的实施方案中，该化合物防止抗体的Fc部分中的一种或多种氨基酸氧化。在一些实施方案中，本文中提供的配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。如本文中使用的，出于治疗或施用目的，“受试者”或“个体”指归类为哺乳动物的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园动物、体育运动用动物、或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛、等。优选地，哺乳动物为人。在一些实施方案中，该配制剂含水。在一些本文中的实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自下组的赋形剂：稳定剂，缓冲剂，表面活性剂，和张度剂。例如，本发明的配制剂可包含单克隆抗体、本文中提供的防止该蛋白质氧化的化合物(例如5-羟基吲哚)、和维持该配制剂的pH至期望水平的缓冲剂。在一些实施方案中，本文中提供的配制剂具有约4.5至约7.0的pH。

可使用本领域已知方法来制备该配制剂中的蛋白质和抗体。使用本领域可得技术来制备液体配制剂中的抗体(例如全长抗体、抗体片段和多特异性抗体)，其非限制性例示性方法更为详细地描述于下面各节。本领域技术人员能使本文中的方法适应于制备包含其它蛋白质(诸如基于肽的抑制剂)的配制剂。关于普遍较好理解且通常采用的用于生成治疗性蛋白质的技术和规程，参见Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook et al.,4th ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,2003)；Short Protocolsin Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,J.Wiley and Sons,2002)；CurrentProtocols in Protein Science,(Horswill et al.,2006)；Antibodies,A LaboratoryManual(Harlow and Lane,eds.,1988)；Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,6th ed.,J.Wileyand Sons,2010)，均通过提述完整收入本文。

A.抗体制备

本文提供的液体配制剂中的抗体针对感兴趣抗原。优选地，抗原是生物学重要多肽，而且对罹患病症的哺乳动物施用抗体可在该哺乳动物中导致治疗好处。然而，也涵盖针对非多肽抗原的抗体。

在抗原是多肽的情况中，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体，诸如生长因子。例示性抗原包括如下分子，诸如血管内皮生长因子(VEGF)；CD20；ox-LDL；ox-ApoB100；肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；高血糖素；凝固因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子、和(冯)维勒布兰德(von Willebrand)氏因子；抗凝固因子，诸如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化剂，诸如尿激酶或人尿型或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；林蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子受体诸如死亡受体5和CD120；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(活化时受到调节，正常情况由T-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，诸如人血清清蛋白；穆勒(Muellerian)抑制性物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；活化素；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)，或神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如例如AIDS被膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如HER2、HER3或HER4受体；和任何上文所列多肽的片段。

(i)抗原制备

可溶性抗原或其片段(任选偶联有其它分子的)可作为免疫原用于生成抗体。对于跨膜分子，诸如受体，它们的片段(例如受体的胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是经重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。对于制备抗体有用的其它抗原及其形式对于本领域技术人员会是显而易见的。

(ii)某些基于抗体的方法

多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔虫戚血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。

通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。

感兴趣单克隆抗体可使用杂交瘤方法来生成，其首先记载于Kohler et al.,Nature,256:495(1975)，并进一步记载于例如Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold SpringHarbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling et al.,in:MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981),和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)，关于人-人杂交瘤。别的方法包括那些记载于例如U.S.Pat.No.7,189,826的，其关于自杂交瘤细胞系生成单克隆人天然IgM抗体。人杂交瘤技术(三元杂交瘤(Trioma)技术)记载于Vollmersand Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmersand Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。

关于各种其它杂交瘤技术，参见例如US 2006/258841；US 2006/183887(完全人的抗体)；US 2006/059575；US 2005/287149；US 2005/100546；US2005/026229；和U.S.Pat.Nos.7,078,492和7,153,507。一种使用杂交瘤方法来生成单克隆抗体的例示性方案记载如下。在一个实施方案中，免疫小鼠或其它适宜宿主动物(诸如仓鼠)以引发生成或能够生成会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射感兴趣多肽或其片段和佐剂诸如单磷脂酰脂质A(MPL)/海藻糖二棒分枝菌酸酯(TDM)(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,Mont.)，在动物中生成抗体。感兴趣多肽(例如抗原)或其片段可使用本领域公知方法来制备，诸如重组方法，其中一些在本文中有进一步描述。对来自经免疫动物的血清测定抗抗原抗体，并任选施用加强免疫。自生成抗抗原抗体的动物分离淋巴细胞。或者，在体外免疫淋巴细胞。

然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。参见例如Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,pp.59-103(Academic Press,1986)。可使用高效融合、支持选定的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体、且对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。例示性的骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤细胞，诸如那些衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自索尔克(Salk)研究所细胞分发中心,SanDiego,Calif.USA)的，及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自美国典型培养物保藏中心,Rockville,Md.USA)的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur etal.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，例如含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的会含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选地，使用无血清杂交瘤细胞培养方法来降低动物衍生血清的使用，诸如胎牛血清，如记载于例如Even etal.,Trends in Biotechnology,24(3),105-108(2006)。

作为提高杂交瘤细胞培养物生产力的工具的寡肽记载于Franek,Trendsin Monoclonal Antibody Research,111-122(2005)。具体地，标准培养基富含某些氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)或蛋白质水解产物级分，而且可通过由3-6个氨基酸残基构成的合成寡肽来显著遏制凋亡。所述肽以毫摩尔或更高浓度存在。

可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定结合本文所述抗原的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Scatchard分析来测定。参见例如Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)。

在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(参见例如Goding,见上文)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。一种用于自杂交瘤细胞分离蛋白质的规程记载于US2005/176122和U.S.Pat.No.6,919,436。该方法包括在结合过程中最低限度地使用盐，诸如易溶盐，而且优选还在洗脱过程中使用少量的有机溶剂。

(iii)某些文库筛选方法

本文所述配制剂和组合物中的抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的抗体来生成。例如，本领域知道用于构建噬菌体展示库及对此类文库筛选具有期望的结合特性的抗体的多种方法。此类方法一般记载于Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2001)。例如，一种产生感兴趣抗体的方法是经由使用如Lee et al.,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93中所描述的噬菌体抗体文库。

原则上，通过筛选噬菌体文库来选择合成的抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。通过针对所需抗原的亲和层析来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。任何抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,BethesdaMd.(1991),卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗体克隆。

在某些实施方案中，抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自轻链(V_L)和重链(V_H)，都呈现三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中V_H和V_L通过短的、柔性的肽共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。

V_H和V_L基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。

在某些实施方案中，通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中V_H与V_L结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过替换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等,Nucl.AcidsRes.,19:4133-4137(1991)所述。

一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗抗原克隆，那么可以给受试者免疫接种抗原以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个实施方案中，如下得到了偏向抗抗原克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗抗原抗体应答，使得抗原免疫接种产生生成针对抗原的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在下文中有描述。

可以如下获得抗抗原反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达抗原特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用抗原亲和层析进行的细胞分离或者细胞对荧光染料标记的抗原的吸附及后续的荧光激活细胞分选(flow-activated cell sorting,FACS)。

或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用抗原在其中没有抗原性的任何动物(人或非人的)物种构建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马和禽类物种等)获得感兴趣的免疫细胞。

从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括V_H和V_L区段)的核酸并扩增。就重排的V_H和V_L基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的V_H和V_L基因的5'和3'末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5'末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等,Nature,341:544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子内，如Jones等,Biotechnol.,9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。在某些实施方案中，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的V_H和V_L重排，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的方法中所述或Orum等,Nucleic Acids Res.,21:4491-4498(1993)的方法中所述。为了将所扩增的DNA克隆入表达载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)所述。

合成重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人V_H基因区段已经克隆和测序(Tomlinson等,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992))，并定位(Matsuda等,Nature Genet.,3:88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构造)可用于生成多样性V_H基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。V_H全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams和Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993))，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列V_H和V_L折叠结构及L3和H3长度的合成V基因全集将编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。

抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将V_H与V_L基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe等,Gene,128:119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse等,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分开克隆未免疫的V_H和V_L全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含一种不同组合来联合两个文库，库容量只受细胞存在数的限制(约10¹²个克隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得V_H与V_L基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(K_d ^-1为约10^-8M)的多样性抗体。

或者，可以将全集序贯克隆入同一载体，例如如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，例如如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将V_H和V_L DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合V_H与V_L基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton等,Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)所述。

未免疫文库(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力(K_d ^-1为约10⁶-10⁷M^-1)，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建次生文库并再次选择，如Winter等(1994),见上文所述。例如，在Hawkins等,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法或Gram等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung等,Technique,1:11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的V_H或V_L结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体全集重组，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力约10^-9M或小于10^-9M的抗体和抗体片段。

文库的筛选可通过本领域已知的多种技术来实现。例如，抗原可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。

在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的抗原。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理学条件。对结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,88:7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者通过抗原竞争洗脱，例如在与Clackson等,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。

选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述)来促进。

有可能在对抗原具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变(例如如有些亲和力成熟技术中所进行的)有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制抗原，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化抗原一起温育，但是生物素化抗原的浓度以摩尔计低于抗原的目标摩尔亲和常数。然后可以用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作用于清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。

抗抗原克隆可以基于活性进行选择。在某些实施方案中，本发明提供了结合天然表达抗原的活细胞或结合游离漂浮抗原或附着于其它细胞结构的抗原的抗抗原抗体。对应于此类抗抗原抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗抗原克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养所分离的噬菌体克隆群来扩增该群体；(2)选出抗原和分别想要阻断和不阻断针对它的活性的第二蛋白质；(3)使抗抗原噬菌体克隆吸附至固定化的抗原；(4)使用过量的第二蛋白质来洗脱任何不想要的、识别抗原结合决定簇(其与第二蛋白质的结合决定簇交叠或共享)的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸附的克隆。任选的是，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。

编码杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等,Curr.Opinion inImmunol.,5:256(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。

编码Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat等,见上文)以形成编码全长或部分长度重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长度人重链和/或轻链的编码序列。

还可以修饰编码衍生自杂交瘤的抗抗原抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中的方法)。通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列，可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA。可以以该方式制备具有Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。

(iv)人源化抗体和人抗体

本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些CDR残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。

用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变域的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims et al.,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA,89:4285(1992)；Presta et al.,J.Immnol.,151:2623(1993))。

更为重要的是抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照该方法的一个实施方案，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。

本文所述配制剂和组合物中的人抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成人单克隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991).

有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann etal.,Year in Immuno.,7:33(1993)；及Duchosal et al.Nature 355:258(1992)。

基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链-人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链恢复在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链时遭到破坏的抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公开于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。

(v)抗体片段

抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。

已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992)；及Brennan等,Science 229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')₂片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')₂片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。

(vi)多特异性抗体

多特异性抗体具有对至少两种不同表位的结合特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。尽管此类分子通常只结合两种不同表位(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')₂双特异性抗体)。

用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO93/08829及Traunecker等,EMBO J.,10:3655-3659(1991)。

依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。通常在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。

在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,Methodsin Enzymology,121:210(1986)。

依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。一种界面包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。

双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体。例如，可以将异源偶联物中的一种抗体与亲合素偶联，而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体已经建议用于例如将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360,WO 92/200373,和EP 03089)。异源偶联抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利No.4,676,980。

文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,Science,229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')₂片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab'片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab')₂分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。

还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994)。

设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tuft等,J.Immunol.,147:60(1991)。

(vii)单域抗体

在有些实施方案中，本文所述抗体是单域抗体(single-domain antibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。

(viii)抗体变体

在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。

(ix)抗体衍生物

可进一步修饰本发明的配制剂和组合物中的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。在某些实施方案中，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

(x)载体、宿主细胞、和重组方法

也可以使用重组方法来生成抗体。为了重组生成抗抗原抗体，分离编码抗体的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。

(a)信号序列构件

本文所述配制剂和组合物中的抗体不仅可以直接重组生成，而且可以作为与异源多肽的融合多肽重组生成，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(例如受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。

(b)复制起点

表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。

(c)选择基因构件

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、谷氨酰胺合酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，通过将转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可使用内源DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。

或者，通过将转化子在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)(L-methioninesulfoximine)(GS的一种抑制剂)的培养基中进行培养来鉴定经GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可以与上文描述的DHFR选择/扩增系统组合地使用GS选择/扩增系统。

或者，可以通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素、或G418的培养基中的细胞生长来选择经编码感兴趣抗体、野生型DHFR基因、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利4,965,199。

适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.,Nature 282:39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones,Genetics 85:12(1977).酵母宿主细胞基因组中存在trp1损害随之提供了用于通过在不存在色氨酸下生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。

此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg,Bio/Technology 8:135(1990)。还披露了适用于通过克鲁维氏酵母属的工业菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.,Bio/Technology 9:968-975(1991)。

(d)启动子构件

表达和克隆载体一般包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适地插入真核表达载体。

适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。

作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。

抗体在哺乳动物宿主细胞中自载体的转录可通过例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、猿猴病毒40(SV40)基因组，或从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子来控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.,Nature 297:598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

(e)增强子元件构件

常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。

(f)转录终止构件

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。

(g)宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。

可以在细菌中生产全长抗体、抗体融合蛋白、和抗体片段，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在将治疗性抗体偶联至自身在肿瘤细胞破坏方面显示出效力的细胞毒剂(例如毒素)时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。大肠杆菌中的生成是较快的且较合算的。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利No.5,648,237(Carter et.al.),美国专利No.5,789,199(Joly et al.),美国专利No.5,840,523(Simmons et al.),其描述了使表达和分泌优化的翻译起始区(TIR)和信号序列。还可参见Charlton,Methodsin Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,编,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp.245-254,其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。表达后，可以在可溶性级分中自大肠杆菌细胞浆液分离抗体，并可以通过例如蛋白A或G柱(取决于同种型)来纯化抗体。可以实施最终的纯化，其类似于用于纯化在例如CHO细胞中表达的抗体的工艺。

在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用途的综述参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。

可选择如下的某些真菌和酵母株，其中糖基化途径已经“人源化”，导致具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的生成。参见例如Li et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)(记载了巴斯德毕赤氏酵母中糖基化途径的人源化)；及Gerngross et al.,见上文。

适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。

还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍(Leninaceae)、苜蓿(M.truncatula)、和烟草的植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；6,040,498；6,420,548；7,125,978；和6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

可使用脊椎动物细胞作为宿主，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1,ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞细胞系，诸如NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参阅例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,编,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp.255-268。

用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。

(h)培养宿主细胞

可以在多种培养基中培养用于生产抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham etal.,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度、pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。

(xi)抗体的纯化

在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.,Bio/Technology10:163-167(1992)记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。

可以使用例如羟磷灰石层析、疏水相互作用层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析是优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark etal.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5:1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含C_H3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。

一般而言，用于制备供研究、测试、和临床中使用的抗体的各种方法学是本领域完善建立的，与上文所述方法学一致，和/或是本领域技术人员认为适合于特定的感兴趣抗体的。

B.选择生物学活性抗体

可对如上所述生成的抗体进行一种或多种“生物学活性”测定法以选择从治疗观点看具有有益特性的抗体。可对抗体筛选其结合生成它时所针对的抗原的能力。例如，抗DR5抗体(例如drozitumab)，可在检测结合死亡受体5(DR5)的能力的测定法中评估抗体的抗原结合特性。

在另一个实施方案中，可通过例如饱和结合；ELISA；和/或竞争测定法(例如RIA)来测定抗体的亲和力。

还有，可对抗体进行其它生物学活性测定法，例如为了评估它作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的且依赖于抗体的靶抗原和预定用途。

为了筛选结合感兴趣抗原上的特定表位的抗体，可实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)中记载的。或者，可实施表位作图例如如Champe et al.，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)所述来测定抗体是否结合感兴趣表位。

C.配制剂的制备

本文中提供制备液体配制剂的方法，其包含蛋白质和防止该液体配制剂中的该蛋白质氧化的化合物。该液体配制剂可以通过混合具有期望纯度的该蛋白质与防止该液体配制剂中的该蛋白质氧化的化合物来制备。在某些实施方案中，要配制的蛋白质尚未进行在先冻干且本文中的感兴趣配制剂是含水配制剂。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在某些实施方案中，该蛋白质是抗体。在进一步的实施方案中，该抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、或抗体片段。在某些实施方案中，该抗体是全长抗体。在一个实施方案中，该配制剂中的该抗体是抗体片段，诸如F(ab’)2，在该情况中可能需要解决全长抗体可能不会发生的问题(诸如抗体剪成Fab)。配制剂中存在的蛋白质的治疗有效量通过考虑例如期望剂量体积和施用模式来确定。配制剂中的一种例示性蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL、约10mg/mL至约250mg/mL、约15mg/mL至约225mg/mL、约20mg/mL至约200mg/mL、约25mg/mL至约175mg/mL、约25mg/mL至约150mg/mL、约25mg/mL至约100mg/mL、约30mg/mL至约100mg/mL或约45mg/mL至约55mg/mL。在一些实施方案中，本文所述蛋白质对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的一种或多种选自下组的氨基酸对氧化易感：甲硫氨酸，半胱氨酸，组氨酸，色氨酸，和酪氨酸。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的甲硫氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，本文中提供的抗体对抗体Fab部分和/或Fc部分中的氧化易感。在一些实施方案中，本文中提供的抗体对抗体Fab部分中的色氨酸氨基酸处的氧化易感。在又一个实施方案中，对氧化易感的色氨酸氨基酸在抗体的CDR中。在一些实施方案中，本文中提供的抗体对抗体Fc部分中的甲硫氨酸氨基酸处的氧化易感。

本文中的发明提供的液体配制剂包含蛋白质和防止液体配制剂中的蛋白质氧化的化合物，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。在一些实施方案中，该配制剂中的该化合物处于约0.3mM至约10mM的浓度，或直至该化合物在该配制剂中可溶的最高浓度。在某些实施方案中，该配制剂中的该化合物处于约0.3mM至约9mM、约0.3mM至约8mM、约0.3mM至约7mM、约0.3mM至约6mM、约0.3mM至约5mM、约0.3mM至约4mM、约0.3mM至约3mM、约0.3mM至约2mM、约0.5mM至约2mM、约0.6mM至约1.5mM、或约0.8mM至约1.25mM的浓度。在一些实施方案中，该配制剂中的该化合物为约1mM。在一些实施方案中，该化合物防止该蛋白质中的一种或多种氨基酸氧化。在一些实施方案中，该化合物防止该蛋白质中一种或多种选自下组的氨基酸氧化：色氨酸，甲硫氨酸，酪氨酸，组氨酸，和/或半胱氨酸。在一些实施方案中，该化合物防止反应性氧种类(ROS)对该蛋白质的氧化。在又一个实施方案中，该反应性氧种类选自下组：单线态氧，超氧化物(O₂-)，烃氧根，过氧根，过氧化氢(H₂O₂)，三氧化二氢(H₂O₃)，氢三氧根(HO₃·)，臭氧(O₃)，羟根，和烃基过氧化物。在一个进一步的实施方案中，该化合物防止抗体的Fab部分中的一种或多种氨基酸氧化。在另一个进一步的实施方案中，该化合物防止抗体的Fc部分中的一种或多种氨基酸氧化。

在一些实施方案中，该液体配制剂进一步包含一种或多种选自下组的赋形剂：稳定剂，缓冲剂，表面活性剂，和张度剂。在pH缓冲溶液中制备本发明的液体配制剂。本发明的缓冲剂具有在约4.5至约7.0的范围中的pH。在某些实施方案中，pH在pH 4.5至6.5的范围中，在pH 4.5的6.0范围中，在pH 4.5至5.5的范围中，在pH 4.5至5.0的范围中，在pH 5.0至7.0的范围中，在pH 5.5至7.0的范围中，在pH 5.7至6.8的范围中，在pH 5.8至6.5的范围中，在pH 5.9至6.5的范围中，在pH 6.0至6.5的范围中，或在pH 6.2至6.5的范围中。在本发明的某些实施方案中，该液体配制剂具有6.2或约6.2的pH。在本发明的某些实施方案中，该液体配制剂具有6.0或约6.0的pH。会控制pH在此范围内的缓冲液的例子包括有机和无机酸及其盐。例如，乙酸盐(例如组氨酸乙酸盐、精氨酸乙酸盐、乙酸钠)、琥珀酸盐(例如组氨酸琥珀酸盐、精氨酸琥珀酸盐、琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、磷酸盐、延胡索酸盐、草酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、及其组合。缓冲剂浓度可以是约1mM至约600mM，取决于例如缓冲剂和期望的配制剂等渗性。在某些实施方案中，该配制剂包含组氨酸缓冲剂(例如约5mM至100mM的浓度)。组氨酸缓冲剂的例子包括组氨酸氯化物、组氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐、组氨酸硫酸盐、组氨酸琥珀酸盐、等。在某些实施方案中，该配制剂包含组氨酸和精氨酸(例如组氨酸氯化物-精氨酸氯化物、组氨酸乙酸盐-精氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐-精氨酸磷酸盐、组氨酸硫酸盐-精氨酸硫酸盐、组氨酸琥珀酸盐-精氨酸琥珀酸盐、等)。在某些实施方案中，该配制剂包含浓度为约5mM至100mM的组氨酸和浓度为50mM至500mM的精氨酸。在一个实施方案中，该配制剂包含组氨酸乙酸盐(例如约20mM)-精氨酸乙酸盐(例如约150mM)。在某些实施方案中，该配制剂包含组氨酸琥珀酸盐(例如约20mM)-精氨酸琥珀酸盐(例如约150mM)。在某些实施方案中，该配制剂中的组氨酸为约10mM至约35mM、约10mM至约30mM、约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约15mM至约35mM、约20mM至约35mM、约20mM至约30mM或约20mM至约25mM。在进一步的实施方案中，该配制剂中的精氨酸为约50mM至约500mM(例如约100mM、约150mM、或约200mM)。

本发明的液体配制剂可进一步包含糖，诸如二糖(例如海藻糖或蔗糖)。如本文中使用的，“糖”包括一般组成(CH₂O)_n及其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原糖、非还原糖、等。本文中的糖的例子包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、右旋糖酐、甘油(glycerin)、赤藓醇、甘油(glycerol)、阿糖醇、木糖醇(sylitol)、山梨醇、甘露醇、蜜二糖(mellibiose)、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖、乳果糖(lactulose)、麦芽酮糖、葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖、等。

可任选地将表面活性剂添加至液体配制剂。例示性表面活性剂包括非离子型表面活性剂，诸如聚山梨酯(例如聚山梨酯20、80等)或Poloxamer类(例如Poloxamer 188)。所添加的表面活性剂的量使得它降低所配制的抗体的聚集和/或使配制剂中的颗粒形成降至最低和/或降低吸附。例如，配制剂中存在的表面活性剂的量可以为约0.001％至约0.5％，约0.005％至约0.2％，约0.01％至约0.1％，或约0.02％至约0.06％，或约0.03％至约0.05％。在某些实施方案中，表面活性剂以0.04％或约0.04％的量存在于配制剂中。在某些实施方案中，表面活性剂以0.02％或约0.02％的量存在于配制剂中。在一个实施方案中，配制剂不包含表面活性剂。

在一个实施方案中，配制剂含有上文所述药剂(例如抗体、缓冲液、糖、和/或表面活性剂)且基本上没有一种或多种防腐剂，诸如苯甲醇、酚、间甲酚、氯丁醇和苄索氯铵。在另一个实施方案中，配制剂中可包括防腐剂，特别是配制剂为多剂配制剂的情况。防腐剂的浓度可以在约0.1％至约2％，优选约0.5％至约1％的范围中。配制剂中可包括一种或多种其它药学可接受载体、赋形剂或稳定剂，诸如那些在Remington's Pharmaceutical Sciences 16thedition,Osol,A.Ed.(1980)中记载的，只要它们对配制剂的期望特征没有不利影响。本文中的例示性药学可接受赋形剂进一步包括间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和No.2006/0104968。在一个方面，sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。

配制剂可进一步包含金属离子螯合剂。金属离子螯合剂是本领域技术人员公知的，而且包括但不必然限于氨基聚羧酸酯、EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-二(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸)、NTA(氮川三乙酸)、EDDS(乙二胺二琥珀酸盐)、PDTA(1,3-丙二胺四乙酸)、DTPA(二乙撑三胺五乙酸)、ADA(β-丙氨酸二乙酸)、MGCA(甲基甘氨酸二乙酸)、等。另外，本文中的一些实施方案包含膦酸盐/膦酸螯合剂。

存在等渗剂以调节或维持组合物中液体的等渗性。当与大的、带电荷的生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时，它们常常称作“稳定剂”，因为它们能与氨基酸侧链的带电荷基团相互作用，由此减轻分子间和分子内相互作用的势(potential)。等渗剂可以以0.1％至25％(以重量计)、优选1-5％之间的任何量存在，其中考虑了其它成分的相对量。优选的等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基的或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。

本文中的配制剂还可含有超过一种对所治疗的特定适应证必需的蛋白质或小分子药物，优选那些具有互补活性的、对其它蛋白质没有不利影响的。例如，在抗体是抗DR5(例如drozitumab)的情况中，可将它与另一药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)组合。

在一些实施方案中，该配制剂用于体内施用。在一些实施方案中，该配制剂是无菌的。可以通过过滤穿过无菌滤膜使得该配制剂无菌。一般地，将本文中的治疗性配制剂放入具有无菌存取口的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶。施用路径依照已知的和可接受的方法，诸如通过合适方式的一次或多次推注或一长段时间里的输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病变内或关节内路径的注射或输注，表面施用，吸入或通过持续释放或延长释放手段。

本发明的液体配制剂在贮藏时可以是稳定的。在一些实施方案中，液体配制剂中的蛋白质在于约0至5℃贮藏至少约12个月、至少约18个月、至少约21个月、或至少约24个月(或至少约52周)时是稳定的。在一些实施方案中，液体配制剂中的蛋白质在于约-20℃贮藏至少约12个月、至少约18个月、至少约21个月、或至少约24个月(或至少约52周)时是稳定的。在一些实施方案中，液体配制剂中的蛋白质在配制剂制造期间是稳定的。在一些实施方案中，液体配制剂中的蛋白质在金属合金容器(例如不锈钢容器)中保存时是稳定的。在一些实施方案中，液体配制剂中的蛋白质在玻璃管形瓶中保存时是稳定的。在一些实施方案中，液体配制剂中的蛋白质在塑料容器中保存时是稳定的。在一些实施方案中，评估或测量液体配制剂中的蛋白质的物理稳定性、化学稳定性、或生物学活性。可使用本领域已知的任何方法；来评估稳定性和生物学活性。在一些实施方案中，通过贮藏后液体配制剂中的蛋白质的氧化来测量稳定性。可以在配制时间左右以及贮藏后通过评估配制剂中的抗体的物理稳定性、化学稳定性、和/或生物学活性来测试稳定性。可以以多种不同方式定性和/或定量评估物理和/或化学稳定性，包括评估聚集物形成(例如使用大小排阻层析，通过测量浊度，和/或通过目视检查)；通过使用阳离子交换层析或毛细管区带电泳来评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析来比较还原的和完整的抗体；肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物学活性或抗原结合功能；等。不稳定性可导致聚集，脱酰胺(例如Asn脱酰胺)，氧化(例如Trp氧化)，异构化(例如Asp异构化)，裁剪/水解/片段化(例如铰链区片段化)，琥珀酰亚胺形成，不配对半胱氨酸，N端延伸，C端加工，糖基化差异，等。在一些实施方案中，使用RP-HPLC、LC/MS、或胰蛋白酶消化肽作图中的一种或多种测定蛋白质中的氧化。在一些实施方案中，使用RP-HPLC、LC/MS、或胰蛋白酶消化肽作图中的一种或多种及下述公式作为百分百测定抗体中的氧化：

要用于体内施用的配制剂应当是无菌的。这容易通过在制备配制剂之前或之后过滤穿过无菌滤膜来实现。

本文中还提供生成液体配制剂或防止液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括将一定量的防止蛋白质氧化的化合物添加至液体配制剂，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。本文中的发明还提供防止液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括将一定量的防止该蛋白质氧化的化合物添加至该液体配制剂，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。在某些实施方案中，该液体配制剂包含抗体。本文中提供的防止蛋白质氧化的化合物的量为约0.3mM至约10mM或任何本文中公开的量。

III.蛋白质配制剂的施用

依照已知方法将液体配制剂施用于需要用蛋白质(例如抗体)治疗的哺乳动物(优选人)，诸如静脉内施用，作为推注(bolus)或通过一段时间里的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径。在一个实施方案中，通过静脉内施用将液体配制剂施用于哺乳动物。为了此类目的，可例如使用注射器或经IV线注射配制剂。在一个实施方案中，通过皮下施用将液体配制剂施用于哺乳动物。

蛋白质的适宜剂量(“治疗有效量”)将取决于例如要治疗的状况、状况的严重性和过程、施用蛋白质是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对蛋白质的响应、所使用的蛋白质的类型、和主治内科医师的判断。将蛋白质以一次或在一系列治疗中合适地施用于患者，而且可在诊断后的任何时间施用于患者。可作为唯一治疗或与在治疗所讨论的状况中有用的其它药物或疗法联合施用蛋白质。如本文中使用的，术语“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。如本文中使用的，“病症”指将会从处理中获益的任何疾患，包括但不限于慢性和急性病症，或者包括那些使哺乳动物趋向于所讨论病症的病理状况的疾病。

在药理学意义上，在本发明的语境中，蛋白质(例如抗体)的“治疗有效量”指有效预防或治疗抗体可有效治疗的病症的量。作为一般建议，所施用的蛋白质的治疗有效量会在约0.1至约50mg/kg患者体重的范围中，无论是通过一次或多次施用，所使用的蛋白质的典型范围为约0.3至约20mg/kg、优选约0.3至约15mg/kg，例如每日施用。然而，其它剂量方案也是有用的。例如，以每1、2、3、或4周约100或400mg的剂量施用蛋白质或以每1、2、3、或4周约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、15.0、或20.0mg/kg的剂量施用蛋白质。剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2或3剂)施用，诸如输注。此疗法的进展容易通过常规技术来监测。

IV.筛选用于防止蛋白质氧化的化合物的方法

本文中还提供筛选防止蛋白质组合物中的蛋白质氧化的化合物的方法。在一些实施方案中，该方法包括选择具有与L-色氨酸相比更低的氧化势和更少的光敏感性的化合物，并测试选定化合物防止该蛋白质氧化的效果。在一些实施方案中，光敏感性是基于在光暴露时由该化合物生成的H₂O₂的量测量的。例如，可以将包含该化合物的液体组合物暴露于250W/m²光达某量的时间，并对所得H₂O₂形成定量。光敏感性更少的化合物在暴露于某量的光时生成比具有更高光敏感性的化合物在暴露于相同量的光时更少的H₂O₂。在一些实施方案中，选择生成少于约15％、少于约20％、或少于约25％的量的H₂O₂的化合物。H₂O₂可以是通过对氧化易感的蛋白质中的氨基酸残基氧化生成的。在一些实施方案中，氧化势是通过循环伏安法测量的。

在一些实施方案中，测试选定化合物防止由2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)、光、和/或Fenton试剂生成的反应性氧种类对该蛋白质的氧化的效果。在任何本文中的实施方案中，可使用实施例(例如实施例2和3)中描述的方法来筛选防止蛋白质组合物中的蛋白质氧化的化合物。

V.制品

在本发明的另一个实施方案中，提供制品，其包含装有本发明液体配制剂的容器，而且任选提供它的使用说明。合适的容器包括例如瓶、管形瓶和注射器。容器可用各种材料制成，诸如玻璃、金属合金(诸如不锈钢)或塑料。一种例示性的容器为300cc金属合金容器(例如用于于-20℃保存)。一种例示性的容器为3-20cc一次使用的玻璃管形瓶。或者，对于多剂配制剂，容器可以是3-100cc玻璃管形瓶。容器装有配制剂，而且该容器上或关联的标签可指示使用说明。制品可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明的包装插页。

认为本说明书足以使得本领域技术人员实施本发明。根据上述描述，在本文所示和所述之外对本发明的各种更改对本领域技术人员会变得显然，且落在所附权利要求的范围之内。通过述及将本文中引用的所有出版物、专利、和专利申请完整收入本文，用于所有目的。

实施例

通过参考下述实施例，会更加全面地理解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。要理解，本文中描述的实施例和实施方案只是出于例示目的，而且根据它们，本领域技术人员会想到各种变更和变化，而且它们被包括在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围内。

实施例1：抗氧化剂L-Trp生成ROS，其氧化蛋白质配制剂中的单克隆抗体。

单克隆抗体已经显示出经由抗体催化的水氧化途径(ACWOP)生成ROS，该途径中抗体潜在地催化水和单线态氧之间的反应，生成过氧化氢(Wentworth et al.,Science 293(5536):1806-11(2001)；Wentworth et al.,ProcNatl Acad Sci U S A 97(20):10930-5(2000))。在ACWOP中，在朝向过氧化氢生成的途径中生成多种ROS，包括超氧化物阴离子、三氧化二氢、臭氧、和甚至氢三氧根(Zhu et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 101(8):2247-52(2004))。显示了单克隆抗DR5抗体drozitumab(CAS编号912628-39-8)(在本文中也称作mAb1)中的表面暴露色氨酸起底物(¹O₂和O₂-)发生器的作用，甚至在温和光条件下以时间和浓度依赖性方式推动ACWOP(Sreedhara et al.,Mol.Pharmaceutics(2013))。证明了mAb1在药学相关条件下贮藏期间对氧化特别易感(Sreedhara et al.,Mol.Pharmaceutics(2013))。氧化显示为位点特异性的且定位于重链CDR(Fab)上的Trp53(W53)，如通过胰蛋白酶肽作图评估的。另外，经木瓜蛋白酶消化、DTT还原、和反相分开，使用反相HPLC测定法来测量mAb1的Fc区和HC Fab中的总氧化。使用LC/MS鉴定来自RP-HPLC的峰，其显示与胰蛋白酶肽图结果的强关联，指示RP方法可作为替代方法用于检测W53(即％Fab)氧化(Sreedhara et al.,Mol.Pharmaceutics(2013))。在RP木瓜蛋白酶消化方法中，Fab和Fc氧化峰在它们相应主峰之前洗脱，容许关于它们的总峰面积对％Fab和％Fc氧化定量。该研究进一步显示过氧化氢能充当多种ROS(包括超氧化物和单线态氧在内)的替代物。

为了确定有限的(即受控制的)光暴露是否可用作加速压力模型来研究蛋白质氧化，使用相同的人单克隆IgG1抗体(mAb1)来筛选和评估潜在的抗氧化剂。L-色氨酸(L-Trp)(蛋白质配制剂中使用的一种抗氧化剂)最近显示为光敏感的(Igarashi et al.,Anal Sci 23(8):943-8(2007))且具有在光暴露时生成H₂O₂的能力。评估在有和无添加L-甲硫氨酸(L-Met)作为潜在抗氧化剂的情况下在光压力下mAb1对L-Trp的敏感性。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达mAb1，并通过一系列层析方法进行纯化，包括通过蛋白A层析进行的亲和层析和离子交换层析。在玻璃管形瓶中在20mM组氨酸乙酸盐，250mM海藻糖和0.02％聚山梨酯20的配制剂中以5mg/mL制备mAb1，而且含1mML-Trp和各种浓度的L-Met，范围从10mM到100mM，并在Atlas SunTest CPS+Xenon测试仪(Chicago,IL)中暴露于250W/m²光达8小时。在铝箔中包裹对照管形瓶，并类似地进行处理。光暴露后，制备用于通过反相HPLC进行分析的溶液。对于RP-HPLC，在0.1M Tris，4.4mM EDTA，和1.1mM半胱氨酸中制备来自压力研究的mAb1溶液为1.1mg/mL。将150μL 0.1mg/mL木瓜蛋白酶添加至1.35mL mAb1溶液，之后于37℃温育2小时。温育后，将900μL溶液与100μL 1M二硫苏糖醇(DTT)组合，并于37℃再温育30分钟。然后在Agilent公司1100/1200HPLC系统(Santa Clara,CA)上运行样品，其配备有280nm UV检测连同Varian公司Pursuit 3μm，2mm ID x 250mm联苯柱(Palo Alto,CA)。流动相A为水中的0.1％TFA。流动相B为乙腈中的0.1％TFA。流动相梯度从0分钟时的34％B线性升高至50.0分钟时的43％B，然后升高至50.1分钟时的95％B。梯度保持于95％B直至60.1分钟，然后在60.1和60.2分钟之间从95％B线性降低至34％B。梯度保持于34％B直至循环在80.2分钟时结束。柱温度为65℃，总流速为0.2mL/min，且每份样品的注射体积为6μL。然后对层析图积分以对氧化定量。

另外，发现mAb1在基于L-His的pH 6.0缓冲液中是稳定的。L-Trp和L-Met对mAb1 Fab氧化的光暴露效应的分析显示了mAb1参照材料(无光暴露)和箔对照具有约2％的Fab氧化(图1A)。由于箔对照和参照材料显示相同水平的Fab氧化，因此不太可能的是单独的加热引起Fab氧化。当mAb1暴露于光时(“无赋形剂”样品)，Fab氧化翻倍至4％。随着添加1mM L-Trp，Fab氧化升高至几乎9％，提示游离L-Trp在光暴露下生成ROS，其可能导致Fab上的W53的氧化。进一步对含有1mM L-Trp的配制剂添加10、25、50、和100mML-Met看来略微降低Fab氧化，但是甚至100倍摩尔过量的L-Met也没有将Fab氧化降低至箔对照的水平(图1A)。

mAb1的Fc区中的氧化显示出主要是Met残基Met 254和Met 430的(Sreedhara et al.,Mol.Pharmaceutics(2013))。L-Trp和L-Met对mAb1Fc氧化的光暴露效应的分析显示了mAb1参照材料和箔对照甚至在暴露于光之前也具有约8％的Fc氧化(图1B)。暴露于光对配制缓冲液中的mAb1只导致Fc氧化的较小升高(“无赋形剂”)。然而，与1mM L-Trp一起温育导致Fc区中的这些Met位点处超过20％的氧化，如通过RP-HPLC测定法看到的。对含有1mML-Trp的配制剂添加各种浓度的L-Met(10、25、50和100mM)降低Fc氧化的量，尽管即使100mM L-Met也没有将Fc氧化降低至对照的水平(图1B)。

先前报告了L-Trp经超氧化物离子且以亚化学计量方式生成H₂O₂，而抗体在相似条件下生成催化量(Wentworth et al.,Science 293(5536):1806-11(2001)；McCormick et al.,Journal of the American Chemical Society100:312-313(1978))。为了测试游离L-Trp在药学相关条件下(诸如在ICH和环境光条件二者下)的易感性，将包含0.32mM至7.5mM L-Trp(在pH7.1磷酸钠缓冲液中溶解L-Trp)的配制剂暴露于250W/m²UV光和约150k勒克斯可见光3小时。取样品并立即经Amplex测定法进行分析以检测在这些条件下生成的H₂O₂的量。游离L-Trp在光暴露时以浓度依赖性方式生成大量的H₂O₂(图2)。此H₂O₂生成在50mM叠氮化钠(单线态氧的一种已知淬灭剂)存在下大大降低(图2)。将L-Trp与50mM NaN₃和150U超氧化物歧化酶(SOD)的组合或单独的SOD一起温育时，在不含NaN₃的样品中仍然检测到显著量的H₂O₂。这指示在单线态氧以外，在光照射时还生成超氧化物离子，它被SOD转变成H₂O₂。

在确认游离L-Trp在ICH光条件下的光敏感性时，研究了通常在实验室中看到的环境光的影响。在多个实验室中使用DLM1数字测光表进行的测量指示实验台(具有白色荧光照明)上平均300勒克斯、层流净化罩(具有白色荧光照明)中平均3000勒克斯和暴露于东南日光的窗台约10000勒克斯。在这些条件下，含有50mg/mL mAb1的配制缓冲液中的L-Trp生成微摩尔范围中的过氧化氢，如使用Amplex红外测定法检测的(图3A)。过氧化物生成随光度(300、3000、和10000勒克斯)和时间(1、3、和7天)二者而升高。使用mAb1特异性RP-HPLC测定法进一步分析蛋白质样品，显示了随光度升高而升高的重链Fab氧化，其对应于W53中的氧化(图3B)。同时，在这些条件下mAb1中的％Fc氧化分别在300和10000勒克斯之间升高5至40％。确定了这些水平的光暴露和时间对于填充/终结操作之前和潜在地检查药物产品管形瓶之时的环境光和温度下的药物物质操作是药学相关的。这些结果支持L-Trp是光敏感性的而且它生成数种反应性氧种类，包括单线态氧、超氧化物和H₂O₂，它们对于单抗产品质量可以是有害的，而且在操作和贮藏含有L-Trp的缓冲液时应当小心。

实施例2：筛选候选抗氧化剂化合物。

色氨酸(Trp)是一种富含电子的氨基酸，其在ROS(诸如羟根和单线态氧)存在下经历氧化性和亲电子性添加反应。保护蛋白质中的Trp氧化的任何潜在抗氧化剂应当具有相似的(如果不是卓越的话)朝向这些ROS的反应性。评估了基于L-Trp结构或已报告具有抗氧化剂特性的一系列化合物。在此研究中筛选抗氧化剂能力的化合物包括色氨酸、吲哚、芳香酸(诸如水杨酸和邻氨基苯甲酸)、和一些维生素的衍生物。使用的各种化合物的化学结构基于(A)色氨酸衍生物、(B)犬尿氨酸、(C)吲哚衍生物和(D)芳香酸衍生物：

(A)色氨酸衍生物

(B)犬尿氨酸

(C)吲哚衍生物

(D)芳香酸衍生物

自光敏感性筛选测定法获得的候选抗氧化剂化合物。

虽然L-Trp在某些情况下可能是有效的抗氧化剂，但是它的光敏感性可能限制它在没有特殊防范的正常加工期间的效用。因此，调查了上述分子的光敏感性，并对它们关于L-Trp就它们的H₂O₂生成能力而言定级。作为筛选工具，将抗氧化剂候选暴露于250W/m²光达4小时，并通过Amplex红外测定法对所得H₂O₂形成定量。具体而言，在20mM组氨酸乙酸盐缓冲剂pH 5.5中制备抗氧化剂为1mM。将1mM抗氧化剂溶液等分入玻璃管形瓶(2mL/玻璃管形瓶)，并在Atlas SunTest CPS+Xenon测试仪器(Chicago,IL)中暴露于250W/m²光4小时。在4小时时段里总UV剂量为90瓦特-小时/平方米且总可见剂量为22万勒克斯小时。在铝箔中包裹对照管形瓶，并类似地进行处理。使用红外测定法(Invitrogen,Carlsbad,CA)遵循制造商推荐的规程测量暴露于光后生成的过氧化氢的量。在添加辣根过氧化物酶(HRP)后，染料与H₂O₂以1:1化学计量反应，导致发荧光的氧化产物试卤灵生成。在此研究中，使用Spectra Max M2微量板读数仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)分别以激发和发射套组560nm和590nm获得荧光读数。使用范围为0μm至20μm的标准曲线测定最终的H₂O₂浓度。

在光暴露时由色氨酸衍生物进行的过氧化氢(H₂O₂)生成的分析显示在光(对应于4小时时段里22万勒克斯小时)和缓冲剂(20mM L-His-乙酸盐，pH5.5)的相似条件下，与L-Trp相比，5-羟基-L-色氨酸(5-HT)生成约十分之一的H₂O₂，而犬尿氨酸生成约五分之一的H₂O₂(图4A)。其它色氨酸衍生物生成L-Trp生成量的30％和105％之间无论何处的H₂O₂。与L-Trp相比，Trolox(一种水溶性维生素E衍生物)生成多123倍的H₂O₂，而吡哆醇(维生素B6)生成多5倍的H₂O₂(表1)。像L-Trp一样具有碱性结构的吲哚行为与L-Trp相似，但是吲哚-3-乙酸生成多达两倍的H₂O₂(图4B)。吲哚的羟基衍生物行为像5-HT，即它们在光暴露时生成可忽略量的H₂O₂。还测试了L-Trp的数种生物化学相关衍生物，即色胺、血清素和褪黑激素。色胺生成多达L-Trp约一半的H₂O₂(表1)。有趣的是，血清素(5-羟基色胺)行为很像吲哚和色氨酸的5-OH衍生物，在光暴露时生成很少的H₂O₂，而褪黑激素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)生成少于L-Trp生成量三分之一的H₂O₂(表1)。

表1：测试化合物和L-Trp之间的过氧化氢生成比

为了了解光照射期间形成的ROS，如上所述在光暴露下在50mM NaN₃(一种已知的单线态氧淬灭剂)存在下测试数种Trp衍生物。所有测试化合物显示这些条件下生成的过氧化氢的量的实质性减少，指示单线态氧是光照射Trp及其衍生物时产生的一种主要ROS(图5)。

还基于其报告的抗氧化剂特性测试了其它芳香化合物(诸如水杨酸和衍生物)(Baltazar et al.,Curr Med Chem 18(21):3252-64(2011))。水杨酸在光暴露时生成很少的H₂O₂，而它的5-OH衍生物行为像L-Trp(表1)。另一方面，邻氨基苯甲酸生成多达L-Trp两倍的H₂O₂，但是5-OH-邻氨基苯甲酸生成与L-Trp相比多达一半的H₂O₂(表1)。

自CV筛选测定法获得的候选抗氧化剂化合物。

基于来自光敏感性筛选测定法的结果，具有芳香环取代的化合物看来影响生成的过氧化氢的量。既然目标是优先氧化赋形剂而非蛋白质药物，那么具有低氧化势的赋形剂可充当有效抗氧化剂。调查了化合物的氧化/还原特征。使用循环伏安法(CV)对数种化合物(包括L-Trp和衍生物)评估了对蛋白质中的Trp氧化的保护，并根据它们的氧化势排序(表2)。具体而言，在去离子水中溶解候选抗氧化剂，然后添加至0.2M高氯酸锂电解液。用EG&GPrinceton Applied Research Model 264A极谱仪/伏特安培计及Model 616RDE玻璃碳电极作为工作电极表征溶液。以100或500mV/sec任一的扫描速率自-0.10V至+1.50V扫描溶液。分析室用氮净化4分钟，之后扫描每种抗氧化剂溶液。输入是工作电极的电势的线性扫描，而输出是所得电流的测量。随着对电势进行扫描(线性升高或降低)，CV室中的电化学活性种类在工作电极的表面经历氧化和还原反应，产生电流，对其连续测量。还原氧化反应通过电流的急剧升高或降低(峰)来表征。氧化反应发生时的电势称作阳极峰电势(或氧化势)，而还原发生时的电势称作阴极峰电势(或还原势)。

此研究中赋形剂对Ag/AgCl的氧化势的范围从0.410到1.080V(表2)。在这些条件下，L-Trp对Ag/AgCl具有0.938V的不可逆氧化势。发现9种化合物具有比L-Trp更低的氧化势，包括所有5-OH化合物，它们对Ag/AgCl具有介于0.535和0.600V之间的氧化势。在所有测试化合物中，5-氨基-DL-色氨酸具有最低的氧化势，为0.410V，而N-乙酰基化合物(0.730-0.880V)和5-甲氧基-DL-色氨酸(0.890V)也低于L-Trp。7种化合物具有比L-Trp高的氧化势(表2)。这些是吲哚-3-乙酸、5-氟-L-色氨酸、色胺、L-色氨酸酰胺、L-犬尿氨酸、5-硝基-DL-色氨酸、和水杨酸。水杨酸具有此研究中最高的氧化势(1.080V，对Ag/AgCl)。所有测试化合物显示不可逆的CV，指示一旦氧化，这些种类就不趋向于接受电子，而且大概不能参与进一步的电化学反应。

表2：赋形剂的氧化势

在0.2M高氯酸锂中用玻璃碳工作电极使用循环伏安法测量氧化(阳极峰)势。

为16种化合物(它们具有高于和低于L-Trp氧化势的氧化势及高于和低于L-Trp H₂O₂生成水平的H₂O₂生成水平)测定了氧化势和光诱导的H₂O₂生成之间的相关性(图6)。由于吲哚和色氨酸在光暴露下的H₂O₂生成方面行为相似，因此可能的是5元环的C₃位置上的取代不影响此特性。然而，在C₃位置具有-CH₂COOH取代的吲哚-3-乙酸和具有-CH₂CH₂NH₂取代的色胺分别生成比L-Trp少和多两倍的H₂O₂。这些数据指示C₃取代在光活化和过氧化物生成中发挥作用。C₃取代不影响分子的氧化势，而吲哚本身在这些实验条件下具有比L-Trp显著更低的氧化势。6元芳香环的C₅处的取代的行为较为可预测。一般而言，具有给电子基团(诸如-NH₂和-OH)的化合物具有比它们的亲本化合物更低的氧化势，而且还在光活化后显示低水平的H₂O₂生成(例如5-氨基-DL-色氨酸、5-羟基吲哚-3-乙酸、5-羟基-L-色氨酸、5-羟基吲哚、血清素)。类似地，具有高氧化势的化合物在这些条件下生成更多的H₂O₂(5-甲氧基-DL-色氨酸、L-Trp、吲哚-3-乙酸、5-氟-L-色氨酸)。这种相关性有例外；一些化合物具有高氧化势，但是不生成较多的H₂O₂(例如水杨酸和L-犬尿氨酸)，指示对于这些6元芳香化合物潜在地有用含有L-Trp吲哚主链的化合物可能未观察到的其它机制发挥重要作用。感兴趣的领域是含有具有比L-Trp更低的氧化势和更低的光暴露时H₂O₂生成的化合物的四分体(quadrant)(图6，虚线)。认为具有这两种性质的化合物是新的候选抗氧化剂，因为它们能(1)比蛋白质上的Trp更快氧化且(2)在药物产品生产期间的环境加工和/或长期贮藏期间生成很少的H₂O₂，因此能在这些条件下保护蛋白质免于进一步氧化。

实施例3：候选抗氧化剂化合物降低单克隆抗体配制剂的氧化。

使用AAPH、光、和Fenton反应作为氧化压力模型，选择与L-Trp相比在光处理时生成更少的H₂O₂的化合物以及具有比L-Trp更低的氧化势的化合物来评估它们可能的抗氧化剂特性(表3)。通过不同氧化压力模型使用mAb1作为模型蛋白质来评估选定候选抗氧化剂针对Trp氧化的保护的有效性。每种压力模型经由不同机制产生氧化，因此在生物药物稳定性评估中评估每一种。使用AAPH或2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐作为压力模型来模拟自配制剂赋形剂(诸如降解的聚山梨酯)潜在生成的烃基过氧化物。AAPH的分解生成烃基、烃氧基、和烃基过氧基根，它们显示出氧化蛋白质中的氨基酸残基，包括甲硫氨酸、酪氨酸、和色氨酸残基(Ji et al.,J Pharm Sci98(12):4485-500(2009)；Chao et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 94(7):2969-74(1997))。类似地，可使用受控制的光作为压力模型来模拟药物在加工和贮藏期间可能经历的环境光暴露。光诱导的生物药物氧化显示出经由单线态氧(¹O₂)和/或超氧化物阴离子(O₂-)机制进行(Sreedhara et al.,Mol.Pharmaceutics(2013))。Fenton反应也常常用作氧化压力模型。这种H₂O₂和Fe离子混合物经由金属催化的羟根机制产生氧化(Prousek et al.,Pure and Applied Chemistry79(12):2325-2338(2007))，而且用于模拟来自药物制造和贮藏中使用的不锈钢表面的金属残基。

表3：氧化压力模型

先前使用RP-HPLC和LC-MS方法(Sreedhara et al.,Mol.Pharmaceutics(2013))彻底表征了mAb1上的色氨酸(W53)氧化。简言之，用木瓜蛋白酶消化mAb1以生成重链(HC)Fab、HC Fc、和轻链片段。用DTT还原片段，然后分开，并经液体层析术-质谱术(LC-MS)进行鉴定。发现氧化型式的HC Fab和HC Fc洗脱比它们的天然对应物早。使用氧化和天然峰下的积分面积的比较来定量HC Fab和Fc氧化。另外，LC-MS/MS肽图(通过胰蛋白酶消化和通过Lys-C消化)显示HC Fab的氧化主要是Trp残基(W53)的，而HC Fc的氧化主要归于两个Met残基(M254和M430)的氧化。通过在本研究中使用木瓜蛋白酶消化物RP-HPLC方法，有可能通过定量HC Fab氧化来调查Trp残基氧化及通过定量HC Fc氧化来调查Met残基氧化。

如下计算％Fab氧化和％Fc氧化(注意：每个抗体分子具有两个Fab；因此，获得的％Fab氧化不反映％含有Fab氧化的氧化的完整抗体)：

对于mAb1光压力研究，在20mM组氨酸乙酸盐pH 6.0，250mM海藻糖，和0.02％聚山梨酯20配制剂中制备mAb1为5mg/mL。自在20mM组氨酸乙酸盐pH 6.0，250mM海藻糖，和0.02％聚山梨酯20中制备的10mM储液添加抗氧化剂至1mM(终浓度)。例外是L-Met，它自相同缓冲剂(即20mM组氨酸乙酸盐pH 6.0，250mM海藻糖，和0.02％聚山梨酯20)中的200mM L-Met储液添加至1、10、25、50、和100mM的终浓度。于环境温度在Atlas SunTest CPS+Xenon测试仪(Chicago,IL)中将装有这些配制剂的玻璃管形瓶暴露于250W/m²光。在铝箔中包裹对照管形瓶，并类似地进行处理。光暴露后，如上所述制备用于通过反相HPLC进行分析的溶液。

对于mAb1AAPH压力研究，在20mM组氨酸乙酸盐pH 6.0，250mM海藻糖，和0.02％聚山梨酯20配制剂中制备mAb1为4mg/mL。自在20mM组氨酸乙酸盐pH 6.0，250mM海藻糖，和0.02％聚山梨酯20中制备的10mM储液添加抗氧化剂至1mM(终浓度)。将200μL 10mM AAPH添加至2mL每种mAb1溶液，然后于40℃温育24小时。温育后，使用PD-10柱将每种溶液用配制缓冲液(20mM组氨酸乙酸盐pH6.0、250mM海藻糖、和0.02％聚山梨酯20)进行缓冲液交换，使得mAb1终浓度为2.3mg/mL。缓冲液交换后，如上所述为通过反相HPLC进行的分析制备每种溶液。

对于mAb1Fenton压力研究，在20mM组氨酸盐酸盐pH 6.0配制剂中制备mAb1为3mg/mL。自在20mM组氨酸盐酸盐中制备的10mM储液添加抗氧化剂至终浓度1mM。对每种mAb1溶液添加FeCl₃和H₂O₂至终浓度0.2mM和10ppm，然后于40℃温育3小时。温育后，通过添加100mM L-Met(自20mM组氨酸盐酸盐中的200mM L-Met储液制备)来淬灭每个反应，然后如上所述为通过反相HPLC进行的分析进行制备。

确定了mAb1与AAPH一起于40℃温育24小时导致27％Fab(Trp残基)氧化(图7A)和47％Fc(Met残基)氧化(图7B)。将先前使用光压力和循环伏安法筛选的7种赋形剂与mAb1一起在AAPH条件下温育以评估抗氧化剂能力。发现7种化合物中的6种显著降低AAPH诱导的Fab氧化(图7A)。所有这6种化合物均含有吲哚主链。此外，所有测试羟基衍生物(5-羟基-L-Trp、5-羟基吲哚、7-羟基吲哚、和血清素)降低Fab氧化至接近对照水平(约2％)。同时，水杨酸在AAPH压力下对Fab氧化几乎没有影响。赋形剂无一看来影响AAPH诱导的Fc氧化的水平(图7B)。

对于光压力研究，将mAb1暴露于250W/m²光16小时，同时测试上述7种赋形剂(图8)。将mAb1暴露于光(“无赋形剂”)提高Fab氧化超出对照水平(“mAb1 Ref Mat”)3.5倍(图8A)。先前在模型蛋白质甲状旁腺素(PTH)中显示了L-Trp能针对Trp氧化提供保护(Ji et al.,J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009))。然而，此研究发现将1mM L-Trp添加至mAb1提高Fab氧化超过11倍，大概是经由由光暴露的L-Trp生成ROS，诸如单线态氧(图2)。添加羟基化合物(5-羟基-L-Trp、5-羟基吲哚、7-羟基吲哚、和血清素)针对光诱导的Fab氧化提供保护，降低Fab氧化至接近对照水平(图8A)。另一方面，水杨酸行为与L-色氨酸酰胺相似，提供Fab氧化超出对照水平8倍。在光压力下对Fc氧化观察到相似的结果(图8B)。mAb1的光暴露导致Fc氧化升高超过对照水平40％，而添加L-Trp提高Fc氧化至对照水平的7倍。与对照(无赋形剂)相比，L-色氨酸酰胺和水杨酸也导致更多的Fc氧化。羟基化合物产生与无赋形剂对照相似的Fc氧化，潜在地因为它们在光暴露下生成比L-Trp少得多的ROS。实施例2中的光筛选和NaN₃研究结果显示由赋形剂生成的H₂O₂的量和mAb1的Fc Met氧化之间较好的相关性。

使用H₂O₂和Fe离子的混合物的Fenton反应经由金属催化的羟根反应产生氧化(Prousek et al.,Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338(2007))。此反应产生mAb1中的Fab(即色氨酸)氧化。还在如上文报告的针对AAPH和光诱导的氧化二者有用的选定抗氧化剂存在下进行该反应。如上所述使用RP-HPLC测定法分析与针对Fenton介导的反应的抗氧化剂特性有关的数据(图9)。在测试条件下，Fenton反应产生超出对照约4倍的mAb1的Fab区中的氧化。除水杨酸外，大多数测试抗氧化剂显示与L-Trp相似的羟根淬灭特性，L-Trp相对于无赋形剂的情况保护Fab氧化达约25％(图9A)。就针对Fc氧化的保护而言，测试的赋形剂(除水杨酸外)行为略微好于L-Trp(图9B)。

芳香环上的给电子取代可推动吲哚基根阳离子形成和潜在更快的与根的反应性。附着于芳香环的羟基基团是电子供体，因为氧原子具有一对孤对电子，它们可参与共振结构，导致更低的氧化势和潜在地更多的对亲电子攻击的易感性。从表2可见，羟基取代导致实质性更低的氧化势，指示这些化合物能成为比L-Trp和/或吲哚更好的抗氧化剂。羟基取代的吲哚和Trp衍生物也在光照射时生成最小量的过氧化氢(表1)。这可以是由于这些分子在将光能传递给分子氧时的低量子效率，结合它们的高淬灭常数，如对5-羟基-L-色氨酸证明的(Dad et al.,J Photochem Photobiol B,78(3):245-51(2005))。如图7和图8中所示，羟基取代的吲哚和色氨酸衍生物针对AAPH、光和Fenton诱导的mAb1的Fab区中的W53氧化提供可观的保护。然而，这些化合物在AAPH诱导的降解中无一对mAb1的Fc区中的Met氧化提供实质性抗氧化剂保护。与之对比，吲哚和色氨酸衍生物在光介导的氧化下行为如预期。在光活化时生成更多量的过氧化物的分子(例如L-Trp和Trp-酰胺)还产生更高的mAb1的Fc区中的Met氧化，而–OH衍生物产生更少的H₂O₂，而且还有光氧化条件下最低量的Fc区中的Met氧化。甲硫氨酸易于被H₂O₂和烃基过氧化物经由亲核取代反应氧化成甲硫氨酸亚砜(Li et al.,Biotechnology and Bioengineering48:490-500(1995))。甲硫氨酸变成甲硫氨酸亚砜的光氧化经单线态氧发生，尽管此反应经一种不同的中间体发生(Li et al.,Biotechnology andBioengineering 48:490-500(1995))。AAPH在热压力下降解产生烃基过氧化物和烃氧基根二者，它们分别对Met和Trp具有不同的反应性(Werber et al.,JPharm Sci 100(8):3307-15(2011))。先前的研究显示了L-Trp能够阻止PTH中由AAPH诱导的Trp氧化，而且L-Trp在相同条件下不阻止PTH中的Met氧化(Ji etal.,J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009))。类似地，L-Met能够针对AAPH诱导的氧化保护PTH，但是不保护Trp氧化。这些观察结果符合Met氧化主要经由亲核取代反应而Trp氧化主要经由自由基机制的反应机制。

L-Trp的光活化产生单线态氧并最终产生H₂O₂及由5-HT进行的单线态氧形成和淬灭的一种推定机制显示于图10。

Claims (36)

1.一种液体配制剂，其包含蛋白质和防止该液体配制剂中的该蛋白质氧化的化合物，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。

2.权利要求1的配制剂，其为适合于施用于受试者的药物配制剂。

3.权利要求1或2的配制剂，其含水。

4.权利要求1-3任一项的配制剂，其中该配制剂中的该化合物为约0.3mM至约5mM。

5.权利要求1-4任一项的配制剂，其中该配制剂中的该化合物为约1mM。

6.权利要求1-5任一项的配制剂，其中该化合物防止该蛋白质中的色氨酸和/或甲硫氨酸氧化。

7.权利要求1-6任一项的配制剂，其中该化合物防止反应性氧种类对该蛋白质的氧化。

8.权利要求7的配制剂，其中该反应性氧种类选自下组：单线态氧，超氧化物(O₂-)，过氧化氢，羟根，和烃基过氧化物。

9.权利要求1-8任一项的配制剂，其中该蛋白质对氧化易感。

10.权利要求1-9任一项的配制剂，其中该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。

11.权利要求1-10任一项的配制剂，其中该蛋白质是抗体。

12.权利要求11的配制剂，其中该抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、或抗体片段。

13.权利要求1-12任一项的配制剂，其中该配制剂中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。

14.权利要求1-13任一项的配制剂，其进一步包含一种或多种选自下组的赋形剂：稳定剂，缓冲剂，表面活性剂，和张度剂。

15.权利要求3-14任一项的配制剂，其中该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。

16.一种生成液体配制剂的方法，其包括将一定量的防止蛋白质氧化的化合物添加至液体配制剂，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。

17.一种防止液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括含将一定量的防止该蛋白质氧化的化合物添加至液体配制剂，其中该化合物选自下组：5-羟基-色氨酸，5-羟基吲哚，7-羟基吲哚，和血清素。

18.权利要求16或17的方法，其中该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。

19.权利要求16-18任一项的方法，其中该配制剂含水。

20.权利要求16-19任一项的方法，其中该配制剂中的该化合物为约0.3mM至约5mM。

21.权利要求16-20任一项的方法，其中该配制剂中的该化合物为约1mM。

22.权利要求16-21任一项的方法，其中该化合物防止该蛋白质中的色氨酸和/或甲硫氨酸氧化。

23.权利要求16-22任一项的方法，其中该化合物防止反应性氧种类对该蛋白质的氧化。

24.权利要求23的方法，其中该反应性氧种类选自下组：单线态氧，超氧化物(O₂-)，过氧化氢，羟根，和烃基过氧化物。

25.权利要求16-24任一项的方法，其中该蛋白质对氧化易感。

26.权利要求16-25任一项的方法，其中该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。

27.权利要求16-26任一项的方法，其中该蛋白质是抗体。

28.权利要求27的方法，其中该抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、或抗体片段。

29.权利要求16-28任一项的方法，其中该配制剂中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。

30.权利要求16-29任一项的方法，其中该配制剂进一步包含一种或多种选自下组的赋形剂：稳定剂，缓冲剂，表面活性剂，和张度剂。

31.权利要求16-30任一项的方法，其中该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。

32.一种筛选防止蛋白质组合物中的蛋白质氧化的化合物的方法，其包括选择具有与L-色氨酸相比更低的氧化势和更少的光敏感性的化合物，并测试选定化合物防止该蛋白质氧化的效果。

33.权利要求32的方法，其中光敏感性是基于在光暴露时由该化合物生成的H₂O₂的量测量的。

34.权利要求33的方法，其中选择生成少于由L-色氨酸生成的H₂O₂的量的约20％的H₂O₂的化合物。

35.权利要求32的方法，其中氧化势是通过循环伏安法测量的。

36.权利要求32的方法，其中测试选定化合物防止由2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)、光、和/或Fenton试剂生成的反应性氧种类对该蛋白质的氧化的效果。