JP2016520521A - 酸化還元製剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、どちらも参照によりその内容全体が本明細書に組み入れられる、2013年3月13日出願の米国仮特許出願第61/780845号、及び2013年11月27日出願の同第61/909813号の利益を請求する。
発明を詳細に記載する前に、本発明が、特定の組成物又は生体系に限定されるものではなく、言うまでもなく様々に変形可能であることを理解されたい。また、本明細書で用いる用語は、特定の実施態様を説明するためのものであり、限定することを目的としていないことを理解されたい。
本発明は、ここでは、タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤であって、化合物が、5−ヒドロキシ−トリプトファン、5−ヒドロキシ インドール、7−ヒドロキシ インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、液体製剤に関する。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、製剤中において、約0.3mM〜約10mM、又は多くとも化合物が可溶である最大濃度である。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、約1mMである。いくつかの実施態様では、化合物は、トリプトファン、及びメチオニンからなる群より選択されるタンパク質中において一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施態様では、化合物は、活性酸素種(ROS)によるタンパク質の酸化を防止する。更なる実施態様では、活性酸素種は、一重項酸素、超酸化物(O2−)、アルコキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、過酸化水素(H2O2)、二水素三酸化物(H2O3)、ヒドロトリオキシラジカル(HO3・)、オゾン(O3)、ヒドロキシルラジカル、及びアルキルペルオキシドからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のタンパク質は酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及び/又はチロシンは、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のトリプトファン及び/又はメチオニンは、酸化の影響を受けやすい。例えば、モノクローナル抗体のFab部分中のトリプトファンアミノ酸及び/又はモノクローナル抗体のFc部分中のメチオニンアミノ酸は、酸化の影響を受けやすいことがある。いくつかの実施態様では、タンパク質は治療用タンパク質である。本明細書のいくつかの実施態様では、タンパク質は抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である。更なる実施態様では、化合物は、抗体のFab部分中の一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。更に別の実施態様では、化合物は、抗体のFc部分中の一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施態様では、本明細書において提供される製剤は、対象に投与するために適した薬学的製剤である。本明細書で使用される、治療又は投与の目的のための「対象」又は「個体」は、哺乳動物に分類されるいずれかの動物を指し、それには、ヒト、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、又は愛玩用の動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどが含まれる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施態様では、製剤は水性である。本明細書のいくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質(例えば、抗体)の濃度は、約1mg/mL〜約250mg/mLである。いくつかの実施態様では、製剤は更に、安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の賦形剤を含む。例えば、本発明の製剤は、モノクローナル抗体、タンパク質の酸化を防止する本明細書に提供される化合物(例えば、5−ヒドロキシインドール)と、製剤のpHを所望のレベルに維持するバッファーとを含むことができる。いくつかの実施態様では、本明細書に提供される製剤のpHは約4.5〜約7.0である。
本明細書に提供される液体製剤中の抗体は、対象の抗原に対するものである。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、障害を有する哺乳動物に対する抗体の投与は、その哺乳動物に治療的利益を提供することができる。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対する抗体も考慮される。
任意選択的に他の分子にコンジュゲートされる、可溶型抗原又はその断片は、抗体を生成するためのイムノゲンとして使用することができる。受容体といった膜貫通分子のために、これらの断片(例えば、受容体の細胞外ドメイン)をイムノゲンとして使用することができる。代替的に、膜貫通分子を発現する細胞をイムノゲンとして使用することができる。このような細胞は、自然源(例えば、がん細胞株)に由来するものとすることができるか、又は膜貫通分子を発現するように組み換え技術によって形質転換された細胞でもよい。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には自明である。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原及びアジュバントの複数回にわたる皮下(sc)又は腹腔内(ip)注入により動物内で生成される。関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子に、二機能性剤又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基によるコンジュゲート)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又はR1N=C=NR(RとR1は異なるアルキル基)にコンジュゲートすることが有益である。
本明細書に記載される製剤及び組成物中の抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して一又は複数の所望の活性を有する抗体をスクリーニングすることにより作製することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするために、様々な方法が当技術分野で知られている。このような方法の概要は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)に記載されている。例えば、対象の抗体を生成する一つの方法は、Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載されている、ファージ抗体ライブラリーの使用によるものである。
非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースから導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的には、Winter and co-workers (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、げっ歯類のDCR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより、実施されうる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列により置換されている、キメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基及び可能であればいくつかのFR残基がげっ歯動物抗体における相似部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。
抗体断片は、酵素消化などの常套的手段によって、又は組み換え技術によって生成される。特定の状況では、抗体全体ではなく抗体断片を使用することが有利である。小さい断片は、迅速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍へのアクセスの改善に繋がりうる。特定の抗体断片の総説について、Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134を参照されたい。
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープについて結合特異性を有し、この場合これらエピトープは通常異なる抗原に由来している。このような分子は通常二つの異なるエピトープにのみ結合するが(即ち二重特異性抗体、BsAbs)、この表現を本発明で使用する場合、更なる特異性を有する三重特異性抗体のような抗体も包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab’)2二重特性抗体)として調製することができる。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の、重鎖可変ドメインの全部又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全部又は一部を含む単一ポリペプチド鎖である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, Mass.;例えば、米国特許第6248516B1参照)。一実施態様では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部又は一部からなる。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列修飾を考慮する。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成されうる。アミノ酸の改変は、配列が作成されるときに、対象抗体のアミノ酸配列中に導入されうる。
本発明の製剤及び組成物中の抗体は、当技術分野で既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含めるために、更に修飾することができる。特定の実施態様では、抗体の誘導体化に適切な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定しないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキソラン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(単独重合体又はランダム共重合体)及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーはいずれかの分子量のものであってよく、分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動し、複数のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子又は異なる分子でありうる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び/又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのかなどを含む検討事項に基づいて決定することができる。
抗体は、組換え法を使用して生成することもできる。抗抗原抗体の組換え生産の場合、抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするDNAは、容易に単離され、従来の手順を用いて (例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定されうる。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は、通常、限定しないが、以下のうち一又は複数を含む:シグナル配列、複製源、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
本明細書に記載される製剤及び組成物中の抗体は、直接組換え的に生成されるだけでなく、好ましくは成熟タンパク質又はポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドである、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして生成することもできる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる(例えば、シグナルペプチダーゼによって切断)されるものである。天然抗体 シグナル配列を認識及びプロセシングしない原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、又は熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置き換えられる。酵母分泌の場合、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー(サッカロミセス及びクルイベロミセスα因子リーダー)、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンスグルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第90/13646号に記載のシグナルによって置き換えられる。哺乳動物の細胞発現では、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。
発現ベクター及びクローニングベクターの両方は、一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクター中において、この配列は、宿主の染色体DNAから独立してベクターが複製することを可能にするものであり、複製の開始点又は自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、及びウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322からの複製の開始点は、大部分のグラム陰性細菌に適しており、2μ、プラスミド開始点は酵母に適しており、種々のウイルスの開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞中におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点の成分は哺乳動物の発現ベクターには不要である(SV40開始点は、早期プロモーターを含むという理由のみで典型的に使用される。)
発現ベクター及びクローニングべクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含みうる。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンに耐性を付与する、(b)栄養要求性欠陥を補う、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素、例えば、バシリに対する遺伝子コードD−アラニンラセマーゼを供給するタンパク質をコードする。
発現ベクター及びクローニングベクターは、一般に、宿主生物体によって認識され、抗体をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主との使用に適したプロモーターには、phoAプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター系、及びtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも適している。細菌系に使用されるプロモーターも、抗体をコードするDNAに動作可能に連結されたシャイン−ダルガーノ(S.D.)配列を含むであろう。
より高等な真核生物による抗体をコードするDNAの転写は、しばしばベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増強される。現在のところ、多くのエンハンサー配列が哺乳動物の遺伝子から既知である(グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製開始点の後期側のSV40エンハンサー(塩基対100〜270)、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化の亢進要素についてYaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード化配列への5’又は3’位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくは、プロモーターから5’位に位置している。
真核生物の宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)において使用される発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのDNA又はcDNAsの未翻訳領域である、通常は5’、場合によっては3’から取得できる。これら領域は、抗体をコードするmRNAの未翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分は、ウシ増殖ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号及び本明細書に記載の発現ベクターを参照。
本明細書のベクター中におけるDNAのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、原核細胞、酵母、又は上記の高等真核細胞である。この目的のために適切な原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物体といった真正細菌、例えば、大腸菌類のような腸内細菌科、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルビニア菌属、クレブシエラ菌、プロテウス、サルモネラ菌、例えばネズミチフス菌、セラシア属、例えばセラチア菌、及び赤痢菌、並びに枯草菌及びバチルスリケニフォルミスといった桿菌(例えば、1989年4月12日公開のDD266710に開示されたバチルスリケニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿菌、及びストレプトマイシンが含まれる。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌294(ATCC31446)であるが、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31537)、及び大腸菌W3110(ATCC27325)といった他の菌株も適している。これらの例は限定的なものではなく説明的なものである。
抗体を生成するために使用される宿主細胞は、種々の培地中において培養することができる。ハムのF10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma)、RPMI−1640(Sigma)、及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM)といった市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。加えて、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第4767704号;同第4657866号;同第4927762号;同第4560655号;又は同第5122469号;国際公開90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載の培地のいずれもが、宿主細胞の培地として使用できる。これら培地のいずれにも、ホルモン及び/又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子)、塩(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びホスフェート)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばGENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。他のあらゆる必要な補充物も、当業者に既知の適切な濃度で含めることができる。温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を使用した場合、抗体は、細胞周辺腔内で細胞内に生成されるか又は、培地中に直接分泌されうる。抗体が細胞内に生成される場合、最初の工程として、宿主細胞か又は溶解断片の何れかである微粒子状破片は、例えば遠心分離又は限外濾過により除去されうる。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌(E.coli)の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載する。簡潔には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA及びフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)の存在下で、約30分間にわたって融解される。細胞破片は、遠心分離により除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、一般的に、そのような発現系からの上清はまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pellicon限外濾過ユニットを使用して濃縮される。PMSF等のプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するように前述の工程のいずれかに含まれてよく、抗生物質は、偶発的な夾雑物の増殖を防止するために含まれてよい。
上述のように生成される抗体に一又は複数の「生物活性」アッセイを実行し、治療的見地から有利な特性を持つ抗体を選択することができる。抗体は、意図された抗原に結合する能力についてスクリーニングされる。例えば、抗DR5抗体(例えば、ドロジツマブ(drozitumab))のために、デスレセプター5(DR5)に結合する能力を検出するアッセイにおいて抗体の抗原結合特性を評価することができる。
本明細書において提供されるのは、タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤を調製する方法である。液体製剤は、所望の純度を有するタンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを混合することにより調製される。特定の実施態様では、製剤化されるタンパク質は、前もって凍結乾燥されておらず、本明細書で対象とする製剤は水性製剤である。いくつかの実施態様では、タンパク質は治療用タンパク質である。特定の実施態様では、タンパク質は抗体である。更なる実施態様では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である。特定の実施態様では、抗体は完全長抗体である。一実施態様では、製剤中の抗体はF(ab’)2などの抗体断片であり、この場合、完全長抗体には起こりえない問題(例えば、抗体のFabへのクリッピング)に対応する必要が生じうる。製剤中に存在するタンパク質の治療的有効量は、例えば、所望の用量体積及び投与モードを考慮することにより決定される。約1mg/mL〜約250mg/mL、約10mg/mL〜約250mg/mL、約15mg/mL〜約225mg/mL、約20mg/mL〜約200mg/mL、約25mg/mL〜約175mg/mL、約25mg/mL〜約150mg/mL、約25mg/mL〜約100mg/mL、約30mg/mL〜約100mg/mL又は約45mg/mL〜約55mg/mLが、製剤中の例示的タンパク質濃度である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のタンパク質は酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中の、メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択される一又は複数のアミノ酸は、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のトリプトファンは、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のメチオニンは、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、本明細書において提供される抗体は、抗体のFab部分及び/又はFc部分における酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、本明細書において提供される抗体は、抗体のFab部分のトリプトファンアミノ酸における酸化の影響を受けやすい。更なる実施態様では、酸化の影響を受けやすいトリプトファンアミノ酸は、抗体のCDRにある。いくつかの実施態様では、本明細書において提供される抗体は、抗体のFc部分のメチオニンアミノ酸における酸化の影響を受けやすい。
液体製剤は、タンパク質(例えば、抗体)を用いた治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに対し、既知の方法、例えば静脈内投与ボーラスとして又は一定期間にわたる連続的注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局所、若しくは吸入経路で、投与される。一実施態様では、液体製剤は、静脈内投与により哺乳動物に投与される。このような目的のために、製剤は、例えば注射器を用いて又はIVラインを介して注入される。一実施態様では、液体製剤は、皮下投与により哺乳動物に投与される。
本明細書では、タンパク質組成物中のタンパク質の酸化を防止する化合物のスクリーニング方法も提供される。いくつかの実施態様では、方法は、L−トリプトファンより酸化電位及び光感受性が共に低い化合物を選択すること、並びに選択された化合物の、タンパク質の酸化を防止する効果を試験することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、光感受性は、光暴露時に化合物によって生成されるH2O2の量に基づいて測定される。例えば、化合物を含む液体組成物を、一定量の時間にわたって250W/m2の光に暴露することができ、その結果得られたH2O2の形成を定量化する。光感受性の低い化合物は、特定量の光への暴露により、同じ量の光に暴露された光感受性の高い化合物と比較して少ないH2O2を生成する。いくつかの実施態様では、H2O2の量の約15%未満、約20%未満、又は約25%未満を生成する化合物が選択される。H2O2は、酸化の影響を受けやすいタンパク質中のアミノ酸残基の酸化により生成される。いくつかの実施態様では、酸化電位は、サイクリックボルタンメトリーによって測定される。
本発明の別の実施態様では、本発明の液体製剤を保持し、任意選択的にその使用に関する指示を提供する容器を含む製品が提供される。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、及びシリンジが含まれる。容器は、ガラス、金属合金(例えばステンレス鋼)又はプラスチックといった種々の材料から形成することができる。例示的な一容器は、300ccの金属合金容器(例えば、−20oCでの貯蔵用の)である。例示的な一容器は、3〜20ccの単回使用ガラス製バイアルである。代替的に、マルチドーズ製剤のために、容器は3〜100ccのガラス製バイアルでもよい。容器は製剤を保持し、容器の上又は容器に関連付けられたラベルは使用の説明を表示することができる。製品は更に、商業的見地及びユーザの検知から望ましい他の材料を含むことができ、それには、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用の説明が書かれた添付文書が含まれる。
モノクローナル抗体は、抗体が水と一重項酸素との反応を触媒して過酸化水素を生成しうる、抗体触媒水酸化経路(ACWOP)を介してROSを生成することが示されている(Wentworth et al., Science 293(5536):1806-11 (2001); Wentworth et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97(20):10930-5 (2000))。ACWOPでは、超酸化物アニオン、三酸化二水素、オゾン、及び場合によってはヒドロトリオキシ基を含む様々なROSが、経路内において、過酸化水素の生成を目的として生成される(Zhu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101(8):2247-52 (2004))。モノクローナル抗DR5抗体中の、表面暴露トリプトファンである、本明細書ではmAb1とも呼ぶドロジツマブ(CAS番号912628−39−8)は、弱い光条件下においてさえ、時間及び濃度に依存してACWOPを助ける基質(1O2及びO2 −)ジェネレーターとして機能することが示されている(Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013))。薬剤的に適切な条件下での貯蔵の間に、mAb1が特に酸化の影響を受けやすいことが実証された(Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013))。酸化は、部位特異的であり、トリプシンペプチドマッピングにより評価したところ、重鎖CDR(Fab)上のTrp53(W53)に局在することが示された。加えて、逆相HPLCアッセイが、パパイン消化、DTT還元、及び逆相分離を介してmAb1のHC Fab及びFc領域における全体の酸化を測定するために使用された。RP−HPLCからのピークが、LC/MSを用いて同定され、チロシンペプチドマップの結果との強い相関を示し、これによりRP法をW53(即ち%Fab)酸化の検出の代替として使用可能であることが示唆された(Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013))。RPパパイン消化法において、Fab及びFc酸化のピークが、それぞれの主要なピークの前に溶出され、それらの全ピーク領域に対する%Fab及び%Fc酸化の定量化が可能となった。この試験は更に、過酸化水素が、超酸化物及び一重項酸素を含む複数のROSの代理として機能しうることを示した。
トリプトファン(Trp)は、ヒドロキシルラジカル及び一重項酸素といったROSの存在下において酸化的及び求電的な追加反応を受ける、電子の豊富なアミノ酸である。タンパク質中においてTrpの酸化を保護するいずれの抗酸化剤候補も、これらROSに対して、優れていないといしても同様の反応性を有さなければならない。L−Trp構造に基づいているか又は抗酸化特異性を有することが報告されている一連の化合物を評価した。本試験において抗酸化能力についてスクリーニングされた化合物には、トリプトファンの誘導体、インドール、サリチル酸及びアントラニル酸などの芳香族酸、並びに何らかのビタミンが含まれた。種々の化合物の化学構造は、(A)トリプトファン誘導体、(B)キヌレニン、(C)インドール誘導体、及び(D)芳香族酸誘導体に基づくものであった。
L−Trpは特定の状況下で効果的な抗酸化剤であるが、通常の処理の間、特別な事前注意なしではその光感受性により有用性が制限されることがある。上記分子の光感受性を調査して、分子をL−Trpに対するそのH2O2生成能力について評価した。スクリーニングツールとして、抗酸化剤候補を四時間にわたり250W/m2の光に曝し、その結果のH2O2形成をAmplex Ultra Redアッセイにより定量化した。具体的には、抗酸化剤を、20mMのヒスチジンアセテートバッファー(pH5.5)中で1mMに調製した。1mMの抗酸化剤溶液を、ガラス製バイアルに分注し(2mL/ガラス製バイアル)、Atlas SunTest CPS+ Xenon Test Instrument(Chicago,IL)中において四時間にわたり250W/m2の光に曝した。4時間にわたる、全体のUV用量は90ワット−時間/m2であり、全体の可視用量は22万ルクス時間であった。コントロールバイアルをアルミホイルに包み、同様に処理した。光への暴露後に生成された過酸化水素の量を、製造者が推奨する手順に従ってAmplex(登録商標)Ultra Red Assay(Invitrogen、Carlsbad,CA)を用いて測定した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)の添加時、染剤が化学量論的に1:1でH2O2と反応し、その結果蛍光性酸化生成物であるレゾルフィンが生成された。この試験では、蛍光性の読み取りは、励起及び放出をそれぞれ560nm及び590nmに設定したSpectra Max M2 Micro−plate Reader(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を用いて行われた。最終的なH2O2濃度は、0μm〜20μmの検量線を用いて決定された。
光感受性スクリーニングアッセイの結果に基づいて、芳香環置換基を有する化合物は、生成される過酸化水素の量に影響すると思われた。目標とするのは、タンパク質薬ではなく賦形剤の優先的酸化であるので、酸化電位の低い賦形剤が、効果的な抗酸化剤として機能していると思われた。化合物の酸化/還元特性を調査した。L−Trp及び誘導体を含む複数の化合物が、サイクリックボルタンメトリー(CV)を用いてタンパク質中のTrp酸化の保護について評価され、それらの酸化電位に基づいて順位付けされた(表2)。具体的には、候補抗酸化剤を脱イオン化水に溶解し、次いで0.2Mの過塩素酸リチウム電解質溶液に添加した。溶液を、作用電極としてModel616 RDE Glassy Carbon Electrodeを有するEG&G Princeton Applied Research Model264A Polarograph/Voltammeterにより特徴付けた。溶液を、100又は500mV/秒のスキャンレートで、−0.10Vから+1.50Vまでスキャンした。分析セルを、窒素で四分間パージした後で各抗酸化剤溶液をスキャンした。入力は、作用電極の電位の線形スキャンであり、出力は結果として得られる電流の測定値であった。電位がスキャンされるとき(直線的に増加又は減少)、CVセル内の電気化学的に活性な種は作用電極の表面において酸化及び還元反応を受け、その結果連続的に測定される電流が生じた。酸化還元反応は、電流の急激な上昇又は下降(ピーク)によって特徴付けられた。酸化反応が起こった電位を陽極ピーク電位(又は酸化電位)と呼び、還元が起こった電位を陰極ピーク(又は還元)電位と呼んだ。
酸化(陽極ピーク)電位を、0.2Mの過塩素酸リチウム中において、ガラス状炭素作用電極を有するサイクリックボルタンメトリーを使用して測定した。
光処理時にL−Trpより少ないH2O2を生成する化合物、並びにL−Trpより酸化電位の低い化合物を、それらの抗酸化特性の可能性を評価するために、酸化ストレスモデルとしてAAPH、光、及びフェントン反応を用いて選択した(表3)。mAb1を、異なる酸化ストレスモデルによるTrp酸化から保護する選択候補抗酸化剤の有効性を評価するためのモデルタンパク質として使用した。各ストレスモデルは、異なるメカニズムで酸化を生じさせ、したがって各々がバイオ医薬品の安定性の評価に有益であった。AAPH、又は2,2’−アゾビス(2−アミジノプロパン)ジヒドロクロリドは、分解したポリソルベートなどの製剤から生じる可能性のあるアルキル過酸化物を模倣するためのストレスモデルとして使用される。AAPHの分解により、アルキル、アルコキシル、及びアルキルペルオキシル基が生じ、これらは、メチオニン、チロシン、及びトリプトファン残基を含むタンパク質中のアミノ酸残基を酸化することが示されている(Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Chao et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94(7):2969-74 (1997))。同様に、処理及び貯蔵の間に薬物が受ける周囲光への暴露を模倣するために、ストレスモデルとして制御光が使用される。バイオ医薬品の光誘導性の酸化は、一重項酸素(1O2)及び/又は超酸化物陰イオン(O2 −)のメカニズムを経ることが示された(Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013))。フェントン反応も、酸化ストレスモデルとして一般的に使用される。H2O2とFeイオンとのこのような混合物は、触媒される金属、ヒドロキシルラジカルメカニズムにより酸化を生じさせ(Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007))、薬物の製造と貯蔵に使用されるステンレス鋼の表面からの金属残留物をモデル化するために使用される。
Claims (36)
- タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤であって、化合物が、5−ヒドロキシ−トリプトファン、5−ヒドロキシ インドール、7−ヒドロキシ インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、製剤。
- 対象に対する投与のために適切な薬学的製剤である、請求項1に記載の製剤。
- 水性である、請求項1又は2に記載の製剤。
- 製剤中の化合物が約0.3mMから約5mMである、請求項1から3のいずれか一項に記載の製剤。
- 製剤中の化合物が約1mMである、請求項1から4のいずれか一項に記載の製剤。
- 化合物が、タンパク質中のトリプトファン及び/又はメチオニンの酸化を防止する、請求項1から5のいずれか一項に記載の製剤。
- 化合物が、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する、請求項1から6のいずれか一項に記載の製剤。
- 活性酸素種が、一重項酸素、超酸化物(O2−)、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される、請求項7に記載の製剤。
- タンパク質が酸化の影響を受けやすい、請求項1から8のいずれか一項に記載の製剤。
- タンパク質中のトリプトファンが酸化の影響を受けやすい、請求項1から9のいずれか一項に記載の製剤。
- タンパク質が抗体である、請求項1から10のいずれか一項に記載の製剤。
- 抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である、請求項11に記載の製剤。
- 製剤中のタンパク質濃度が約1mg/mLから約250mg/mLである、請求項1から12のいずれか一項に記載の製剤。
- 安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の賦形剤を更に含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の製剤。
- 製剤が約4.5から約7.0のpHを有する、請求項3から14のいずれか一項に記載の製剤。
- タンパク質の酸化を防ぐ化合物の量を液体製剤に加えることを含む、液体製剤の製造方法であって、化合物が、5−ヒドロキシ−トリプトファン、5−ヒドロキシ インドール、7−ヒドロキシ インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、方法。
- タンパク質の酸化を防ぐ化合物の量を液体製剤に加えることを含む、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する方法であって、化合物が、5−ヒドロキシ−トリプトファン、5−ヒドロキシ インドール、7−ヒドロキシ インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、方法。
- 製剤が、対象に対する投与のために適切な薬学的製剤である、請求項16又は17に記載の方法。
- 製剤が水性である、請求項16から18のいずれか一項に記載の方法。
- 製剤中の化合物が約0.3mMから約5mMである、請求項16から19のいずれか一項に記載の方法。
- 製剤中の化合物が約1mMである、請求項16から20のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物が、タンパク質中のトリプトファン及び/又はメチオニンの酸化を防止する、請求項16から21のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物が、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する、請求項16から22のいずれか一項に記載の方法。
- 活性酸素種が、一重項酸素、超酸化物(O2−)、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
- タンパク質が酸化の影響を受けやすい、請求項16から24のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質中のトリプトファンが酸化の影響を受けやすい、請求項16から25のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質が抗体である、請求項16から26のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である、請求項27に記載の方法。
- 製剤中のタンパク質濃度が約1mg/mLから約250mg/mLである、請求項16から28のいずれか一項に記載の方法。
- 製剤が、安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の賦形剤を更に含む、請求項16から29のいずれか一項に記載の方法。
- 製剤が約4.5から約7.0のpHを有する、請求項16から30のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質組成物中のタンパク質の酸化を防止する化合物のスクリーニング方法であって、L−トリプトファンに比べて酸化電位及び光感受性が低い化合物を選択すること、並びに選択された化合物の、タンパク質の酸化を防止する効果を試験することを含む方法。
- 光感受性が、光暴露時に化合物によって生成されるH2O2の量に基づいて測定される、請求項32に記載の方法。
- L−トリプトファンによって生成されるH2O2の量の約20%未満を生成する化合物が選択される、請求項33に記載の方法。
- 酸化電位がサイクリックボルタンメトリーによって測定される、請求項32に記載の方法。
- 選択された化合物が、2,2’−アゾビス(2−アミジノプロパン)ジヒドロクロリド(AAPH)、光、及び/又はフェントン試薬によって生成された活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する効果について試験される、請求項32に記載の方法。
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