ES2625030T3

ES2625030T3 - Procedimiento de preparación de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes

Info

Publication number: ES2625030T3
Application number: ES12733726.9T
Authority: ES
Inventors: Abdessatar Chtourou; Damien BATAILLE; Georges MICHAUX
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2032-07-11
Also published as: US9718856B2; AU2012282566B2; TWI579301B; CA2838930C; JP2014520829A; CN103687874B; AU2012282566A1; KR20140062459A; WO2013007740A1; US20140141021A1; EP2731966A1; TW201307384A; BR112014000278A2; FR2977893B1; JP6132839B2; FR2977893A1; EP2731966B1; CA2838930A1; CN103687874A

Abstract

Procedimiento de preparación de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas a partir de una solución inicial de plasma sanguíneo o de fracción de plasma enriquecida en inmunoglobulinas, caracterizado por que comprende: (a) una etapa de eliminación de los contaminantes proteicos por el ácido caprílico para obtener una solución desprovista de proteasas, en la que la concentración de ácido caprílico utilizada va del 0,5 al 1,5%, expresada en gramo de ácido caprílico por volumen de solución a tratar, (b) una etapa de clarificación a pH ácido por filtración en profundidad, (c) seguida de una etapa de cromatografía en lecho fluidizado de la solución desprovista de proteasas, permitiendo dicho procedimiento obtener un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas con un rendimiento superior a 4,5 g de inmunoglobulinas por litro de plasma sanguíneo utilizado.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes

La presente invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes para una utilizacion terapeutica.

Las inmunoglobulinas (Ig) son sintetizadas por los linfocitos B y los plasmocitos, que se distribuyen en el plasma, los lfquidos extravasculares y las secreciones. Se dividen en 5 categoffas, isotipos o clases, en base a su estructura proteica: IgA, IgG, IgM, IgE e IgD. Su distribucion natural en el cuerpo humano es la siguiente: IgG: 75%, IgA: 20 %, IgM: 5% y < 1% para IgE y Ig D. Existen normalmente de 8 a 15 g de IgG por litro de plasma. En el plasma, la media de vida de las inmunoglobulinas circulantes de clase IgG, es de aproximadamente 21 dfas, las de IgA, IgM, IgD, IgE es inferior a 7 dfas.

Las inmunoglobulinas polivalentes de origen humano y farmaceuticamente utilizadas estan compuestas por un 97% de IgG, que corresponde a la presencia de una gran diversidad de anticuerpos contra diversos agentes infecciosos.

La utilizacion de fracciones de plasma humano enriquecidas en inmunoglobulinas polivalentes para el tratamiento de diversas infecciones o deficiencias congenitas se conoce por su efecto terapeutico. Las inmunoglobulinas polivalentes o normales son administradas para corregir una deficiencia inmunitaria primitiva y ciertos deficits secundarios (leucemias, mielomas o infecciones recidivantes). Se deben disociar de los anticuerpos espedficos (anticuerpos citotoxicos anti-Rh o anti-D). Se pueden prescribir a dosis muy elevadas, hasta 2 g/kg/dfa, para frenar la evolucion de ciertas enfermedades, de las que la fisiopatologfa es poco conocida, pero comprende un componente de tipo inmunitario. La administracion de inmunoglobulinas polivalentes ha mostrado su eficacia, al menos transitoria, en el tratamiento de la trombocitopenia de origen inmunologico, tambien denominada purpura trombogenica idiopatica. Las inmunoglobulinas polivalentes pueden tambien tener un efecto beneficioso en el tratamiento del smdrome de Guillain-Barre, de las polineuropaffas desmielinizantes, de la esclerosis multiple, del smdrome miastenico de Lambert-Eaton, o de las dermatomiositis.

Las inmunoglobulinas polivalentes contienen diversas moleculas, por lo que su mecanismo de accion es complejo: interviniendo en varios niveles, modifican el equilibrio inmunitario del paciente y pueden asf tener un efecto beneficioso.

Varios procedimientos de preparacion de concentrados de inmunoglobulinas polivalentes son ya conocidos por el experto en la materia. El procedimiento de preparacion mas conocido comprende varias etapas de precipitacion con etanol (Cohn et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459).

La patente EP 0703 922 (Laboratoire Frangais du Fractionnement et des Biotechnologies, “Concentre d'immunoglobulines G a usage therapeutique et procede de production dudit concentre”) describe en particular un procedimiento de produccion de un concentrado de inmunoglobulinas G a partir de plasma humano o de sobrenadante de plasma crioprecipitado. Este procedimiento no comprende ninguna precipitacion con etanol y comprende una sucesion de etapas de cromatograffa y una etapa de inactivacion viral por disolvente/detergente. Este metodo permite solo dar un rendimiento relativamente bajo, a causa de la sucesion de etapas de cromatograffa, incluyendo el procedimiento descrito en efecto dos ciclos de intercambio anionico y cationico en tandem asf como dos etapas de ultrafiltracion.

La patente EP 1 385 886 (Laboratoire Frangais du Fractionnement et des Biotechnologies, “Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage thearapeutique”) describe un procedimiento de preparacion de concentrados de inmunoglobulinas humanas que comprende una prepurificacion por precipitacion de contaminantes lipfdicos y proteicos y una etapa unica de cromatograffa efectuada sobre un intercambiador de aniones de pH alcalino. Este metodo permite obtener hasta 4 g de inmunoglobulinas por litro de plasma inicialmente tratado.

La publicacion de Tanaka K. et al., 2000 ("High quality human immunoglobulin G purified from Cohn fractions by liquid chromatography” Braz J Med Bio Res 2000, 33(1): 27-30) describe un procedimiento de purificacion de inmunoglobulinas G a partir de fracciones “I+II+II” e “II+III” obtenidas segun el metodo de Cohn, por separacion por cromatograffa sobre tres tipos de geles, dos geles intercambiadores de iones (Q-Sepharose FF y CM- Sepharose FF) y un gel de filtracion (Sephacryl S-300 HR). Este procedimiento permite obtener hasta 4,3 + 0,2 g de inmunoglobulinas G por litro de plasma.

El documento WO2007/077365 describe un concentrado de inmunoglobulinas G para uso terapeutico en el que los contenidos respectivos en anticuerpos anti-A y anti-B son conformes a un resultado negativo al ensayo de Coombs indirecto in vitro. Este concentrado de IgG presenta ademas un contenido de IgG polireactivas comprendido entre el 0,01% y el 0,1%, en particular entre el 0,07 y el 0,1%, con respecto al contenido total en IgG. El procedimiento de obtencion del concentrado de IgG del documento WO2007/077365, que comprende una etapa de preparacion de un concentrado de IgG por fraccionamiento etanolico y/o por separacion cromatografica, asocia una etapa de inactivacion viral, una etapa de cromatograffa de inmunoafinidad por percolacion de dicho concentrado de IgG sobre

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una mezcla de soporte cuyas matrices se injertan con grupos oligosacaridos antigenicamente similares a los grupos sangumeos A y B, y una etapa de filtracion de eliminacion de virus y/o de parffculas de tamano superior a 20 nm.

Sin embargo, habiendose multiplicado las indicaciones terapeuticas de las inmunoglobulinas, existe una necesidad importante de aumentar el rendimiento de la produccion de inmunoglobulinas, asegurandose al mismo tiempo que el producto final presente una pureza elevada y este desprovisto de contaminantes virales.

En consecuencia, la presente invencion tiene por objeto un procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas con un rendimiento superior con respecto a los procedimientos conocidos por el experto en la materia.

La invencion se refiere asf a un procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas a partir de una solucion inicial de plasma sangumeo o de una fraccion de plasma enriquecida en inmunoglobulinas, caracterizado por que comprende:

(a) una etapa de eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico para obtener una solucion desprovista en proteasas, en la que la concentracion de acido capnlico utilizada va del 0,5 al 1,5%, expresada en gramos de acido capnlico por volumen de solucion a tratar,

(b) una etapa de clarificacion del pH acido por filtracion en profundidad,

(c) seguida de una etapa de cromatograffa en lecho fluidizado de la solucion desprovista de proteasas,

permitiendo dicho procedimiento obtener un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas con un rendimiento superior a 4,5 g de inmunoglobulinas/litro de solucion inicial de plasma sangumeo o de fraccion de plasma enriquecida en inmunoglobulinas.

La solucion obtenida al final de la etapa (a) de eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico del procedimiento de la invencion posee una concentracion en proteasas conforme a la norma 2.6.15 de la Farmacopea Europea 7.5 edicion del 01/2012: 0918, la cual es como maximo de 35 Ul/ml, calculada con respecto a una dilucion de la preparacion a examinar que contiene 30 g/l de inmunoglobulinas.

La invencion se basa en la constatacion de que la combinacion de una etapa de eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico con una etapa de cromatograffa en lecho fluidizado permite aumentar de manera sorprendente el rendimiento de la produccion de inmunoglobulinas.

La invencion comprende la combinacion de una etapa preparada con cuidado para la eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico a pH acido seguida de una clarificacion a pH acido del sobrenadante obtenido al final de la etapa de tratamiento por el acido capnlico que permite la fijacion de las inmunoglobulinas sobre un gel de cromatograffa utilizado en una columna fluidizada (gel del tipo intercambiador anionico y/o del tipo afinidad y/o del tipo “pseudo-afinidad”, preferentemente del tipo “modo-mixto”), lo que permite aumentar el rendimiento de la produccion de inmunoglobulinas polivalentes. De manera preferida, la productividad se puede aumentar si las condiciones de elucion de las inmunoglobulinas polivalentes del gel de cromatograffa permiten una compatibilidad directa con las etapas siguientes del procedimiento sin etapa de formulacion por unas tecnicas de tipo dialisis o ultrafiltracion. De manera particular, el procedimiento segun la invencion permite obtener una ganancia de productividad del 0,25% de inmunoglobulinas polivalentes por litro de plasma y un producto final que tiene una pureza elevada (99%).

El procedimiento de la invencion comprende, entre la etapa de eliminacion de contaminantes proteicos por el acido capnlico (a) y la etapa de cromatograffa en lecho fluidizado (b), una etapa de clarificacion a pH acido, por filtracion en profundidad.

Se definiran ventajosamente las etapas de elucion a fin de extraer selectivamente las inmunoglobulinas de tipo G (IgG).

La invencion se refiere tambien a un procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas a partir de una solucion inicial de plasma sangumeo o de una fraccion de plasma enriquecida en inmunoglobulinas, caracterizado por que comprende:

(a) una etapa de eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico a pH acido para obtener una solucion desprovista en proteasas,

(b) una etapa de clarificacion a pH acido,

(c) una etapa de cromatograffa en lecho fluidizado de la solucion desprovista en proteasas,

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(d) una elucion en un tampon de elucion de las inmunoglobulinas.

De manera particular, la etapa (b) de clarificacion a pH acido se realiza por una filtracion en profundidad basandose en una porosidad lo mas elevada posible, pero que permite el paso del sobrenadante clarificado en una columna en lecho fluidizado.

La solucion obtenida al final de la etapa (a) de eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico del procedimiento de la invencion posee una concentracion en proteasas conforme a la norma 2.6.15 de la Farmacopea Europea 7.5 edicion 01/2012:0918, la cual es como maximo de 35 Ul/ml calculada con respecto a una dilucion de la preparacion a examinar, que contiene 30 g/l de inmunoglobulinas.

La invencion se refiere tambien al procedimiento tal como se ha descrito anteriormente y que integra despues de la etapa (b) de clarificacion a pH acido una etapa de aumento del pH, que corresponde al acondicionamiento de las inmunoglobulinas polivalentes que permite la fijacion de estas ultimas en un gel de cromatograffa utilizado en modo fluidizado.

De manera sorprendente, el concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas obtenido al final del procedimiento de la invencion presenta una actividad anti-complementaria inferior al 30%, la cual se determina con referencia al metodo indicado en la Farmacopea Europea 7.5, edicion 01/2012:0918; parrafo 2.6.17.

Se entiende por “inmunoglobulinas polivalentes” en el ambito de la invencion, unas inmunoglobulinas enteras, o unos fragmentos de inmunoglobulinas, tales como F(ab')2 o F(ab) y cualquier fraccion intermedia obtenida durante el procedimiento de fabricacion.

Se entiende por “fraccion de plasma” cualquier solucion sangumea obtenida despues de un tratamiento que permite separar o fraccionar el plasma sangumeo humano natural, en particular cualquier fraccion intermedia obtenida durante el procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes.

Se entiende por “fraccion de plasma enriquecida en inmunoglobulinas” una fraccion de plasma que contiene un porcentaje de inmunoglobulinas superior al contenido en el plasma humano natural.

Se entiende por precipitado “l+ll+ll” o “N+IN” un precipitado obtenido a partir de plasma sangumeo fraccionado con etanol segun el metodo de Cohn (Cohn et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459) o de Kistler y Nistschmann (1962, Vox Sang. 7, 414).

Se entiende por “contaminantes proteicos” cualquier protema diferente de las inmunoglobulinas de tipo G, por ejemplo y de manera no limitativa, las inmunoglobulinas de tipo A, E o M, asf como las otras protemas plasmaticas tales como, de manera no limitativa:

- la albumina, la transferrina, la a2-macroglobulina, el plasminogeno, el fibrinogeno, etc.

- los factores de la coagulacion tales como, de manera no limitativa, FX, FXl o FXll,

- las proteasas tales como, de manera no limitativa, la calicrema, la precalicrema, o el activador de la precalicrema, y

- las hemaglutininas anti-A y -B.

Se entiende por “cromatograffa en lecho fluidizado” una tecnica que, por aplicacion de un caudal en el sentido inverso de la gravedad sobre unas perlas de cromatograffa de densidad elevada, permite disponer un espacio entre estas que permite asf el paso en la columna de cromatograffa de una solucion debilmente clarificada sin generar la obstruccion del flujo de solucion. Las cromatograffas en lecho fluidizado pueden ser unas cromatograffas de tipo intercambio de iones, de tipo afinidad, de tipo “pseudo-afinidad” o de tipo “modo-mixto” (es decir al mismo tiempo intercambio de iones y pseudo-afinidad).

De manera particular, la cromatograffa en lecho fluidizado se realiza con el gel UpFront lVlG de tipo “modo-mixto” que comprende la presencia sobre las perlas de un ligando qmmico que combina unas cargas electroestaticas y unos grupos hidrofobos que confieren una pseudo-afinidad espedfica para las inmunoglobulinas.

La concentracion de acido capnlico utilizada en el procedimiento segun la invencion se prepara con cuidado, es decir que la precipitacion de los contaminantes se realiza con una concentracion final en acido capnlico suficientemente baja con el fin de no atrapar las inmunoglobulinas polivalentes durante la precipitacion de los otros constituyentes de la solucion. La concentracion en acido capnlico va del 0,5 al 1,5%, ventajosamente del 0,8 al 1,2%, particularmente del 0,9 al 1,1% y mas particularmente es igual al 1% (el porcentaje en acido capnlico corresponde a unos gramos de acido capnlico por volumen de solucion a tratar).

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En un modo de realizacion, la etapa de eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico se desarrolla a un pH comprendido entre 4,3 y 4,9, preferentemente comprendido entre 4,6 y 4,8.

La solicitante ha constatado de manera sorprendente que la concentracion de acido capnlico utilizada en el procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes segun la invencion influye directamente en el rendimiento del procedimiento cuando este ultimo comprende una etapa ulterior de clarificacion. Si la concentracion en acido capnlico es demasiado baja, la precipitacion sera imperfecta (en particular una parte importante de ffpidos permanece en la solucion) y la etapa de clarificacion sera muy diffcil de realizar. Por el contrario, si la concentracion en acido capnlico es demasiado alta, las inmunoglobulinas polivalentes quedaran atrapadas en el precipitado formado y no estaran disponibles en el sobrenadante despues de la clarificacion.

En un modo de realizacion, se anade una etapa de clarificacion a pH acido entre la etapa de eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico y la etapa de cromatograffa en lecho fluidizado. Esta etapa de clarificacion a pH acido se realiza a un valor de pH comprendido entre 4.3 y 4.9, preferentemente entre 4,4 y 4,8 y de manera preferida a un pH comprendido entre 4,6 y 4,8.

La etapa de clarificacion a pH acido segun la invencion es una etapa de clarificacion por filtracion en profundidad. Esta clarificacion se realiza con el fin de retener solo las parffculas mas grandes, que pueden interferir en el funcionamiento del lecho fluidizado. Preferentemente, se utilizan los filtros que tienen un porcentaje de retencion nominal de 15 a 100 |im, preferentemente de 25 a 70 |im o de 15 a 40 |im. En un modo de realizacion, se utilizan en esta etapa los filtros clarificantes de tipo SEITZ T5500 que tienen un mdice de retencion nominal de 25-70 |im, y mas particularmente el filtro T2600 cuyo mdice de retencion nominal es de 15-40 |im. Se puede utilizar cualquier tipo de filtro, cargado o no, que permita una clarificacion equivalente. La clarificacion se realiza ventajosamente en presencia de tierras de filtracion, que permiten asf reducir la superficie de filtro a utilizar. A fin de aumentar la fluidez de la solucion a filtrar, la clarificacion se realiza ventajosamente entre 4 y 30°C, mas particularmente entre 10 y 25°C, por ejemplo entre 20 y 25 °C. De manera ventajosa, el filtro utilizado en la etapa de clarificacion segun la invencion tiene una capacidad de al menos 40 litros por m2, es decir 8 kg de precipitado por m2, mas precisamente 55 litros por m2, es decir 11 kg de precipitado por m2.

Al final de la filtracion en profundidad, el pH y la osmolalidad del sobrenadante de filtracion se ajustan ventajosamente sin etapa de dialisis o de ultrafiltracion, en funcion de las necesidades de la etapa siguiente del procedimiento.

En un modo de realizacion particular, la etapa de cromatograffa en lecho fluidizado puede ser una cromatograffa de tipo “modo-mixto” que comprende:

- la carga sobre una columna de cromatograffa previamente equilibrada con un tampon a un pH comprendido entre

4.5 y 8, mas particularmente entre 4,5 y 7,5; 4,5 y 7,0; 4,5 y 6,8; 4,5 y 6,5; 5,0 y 7,0; 5,0 y 6,5; 5,5 y 6,3; o entre 5,7 y 6,3; de la solucion que ha sufrido la etapa de clarificacion por filtracion en profundidad previamente ajustada al mismo pH, es decir a un pH comprendido entre 4,5 y 8, mas particularmente entre 4,5 y 7,5; 4,5 y 7,0; 4,5 y 6,8; 4,5 y 6,5; 5,0 y 7,0; 5,0 y 6,5; 5,5 y 6,3; o entre 5,7 y 6,3,

- el lavado de dicha columna con una solucion tampon hasta la eliminacion de todas las protemas no adsorbidas sobre la columna,

- la elucion de las inmunoglobulinas polivalentes adsorbidas sobre la columna por un tampon de elucion ajustado a un pH comprendido entre 8 y 10, preferentemente entre 8 y 9,8; 8,3 y 9,8; 8,5 y 9 ,8; 8,8 y 9,8; 9,0 y 9,8; 9,5 y 9,8, y

- la recuperacion de la solucion enriquecida en inmunoglobulinas polivalentes humanas.

La cromatograffa de tipo “modo-mixto” en lecho fluidizado utilizada en la invencion utiliza, preferentemente, unas perlas que tienen unos tamanos diferentes, lo que permite estabilizar el lecho de cromatograffa. Las perlas utilizadas en la cromatograffa de tipo “modo-mixto” en lecho fluidizado segun la invencion tienen una densidad media de 2,5 a

3.5 kg/l, un diametro comprendido entre 20 y 400 |im y una capacidad de fijacion de las inmunoglobulinas polivalentes en las condiciones de la invencion que pueden ventajosamente superar los 70 g/l.

La elucion utilizada en la cromatograffa en lecho fluidizado es, por ejemplo, una elucion a pH basico y con baja fuerza ionica, a fin de poder encadenar directamente la etapa siguiente del procedimiento, despues de proceder a unos ajustes simples de pH y de conductividad. Un tampon de elucion utilizable en el ambito de la invencion puede por ejemplo contener: glicina de 5 a 500 mM, en particular 20 mM, y NaCl de 5 a 500 mM, en particular 20 mM, a pH comprendido entre 7 y 10, en particular comprendido entre 9 y 10, en particular comprendido entre 9,5 y 10, y de manera mas interesante entre pH 9,5 y 9,8.

En el caso en el que la etapa despues de la cromatograffa en lecho fluidizado no sea compatible con unas condiciones de fuerza ionica elevadas, y que, en consecuencia, necesitana previamente una dilucion o una dialisis importante del eluato obtenido al final de la etapa de cromatograffa en lecho fluidizado, se puede utilizar un tampon

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de elucion que tiene un pH elevado pero una fuerza ionica baja. Un tampon de elucion utilizable en el ambito de la invencion puede contener por ejemplo: glicina de 5 a 20 mM, en particular 10 mM, a un pH comprendido entre 9,5 y 10,5, en particular comprendido entre 9,8 y 10,5 y de manera mas interesante entre pH 9,8 y 10,2.

En un modo de realizacion particular, el procedimiento segun la invencion comprende ademas, despues de la etapa de cromatograffa en lecho fluidizado, una o varias de las etapas siguientes:

(i) una etapa de inactivacion viral;

(ii) una etapa de cromatograffa de intercambio de aniones de la solucion obtenida al final de la etapa anterior que tiene como objetivo eliminar los componentes qmmicos utilizados durante la etapa de inactivacion viral y reducir la contaminacion en IgA e IgM;

(iii) una etapa de eliminacion de anticuerpos anti-A y anti-B de la solucion obtenida al final de la etapa anterior;

(iv) una etapa de filtracion a traves de filtros nanometricos de porosidad decreciente de 100 a 15 nm;

(v) una etapa de concentracion por ultrafiltracion de la solucion procedente de la etapa anterior asociada a una etapa de formulacion;

(vi) una etapa de filtracion esterilizante convencional.

El concentrado de inmunoglobulinas polivalentes obtenido segun el procedimiento de la invencion ha sufrido generalmente al menos una etapa de eliminacion o de inactivacion de al menos un agente infeccioso. Entre los agentes infecciosos, se pueden citar los virus y los ATNC (agentes transmisibles no convencionales) como el prion. Una inactivacion viral comprende frecuentemente un tratamiento con unos productos qmmicos, por ejemplo por disolvente, y/o detergente y/o por calor, por ejemplo por UVC, irradiacion gamma, y/o pasteurizacion. Una nanofiltracion es tambien util para eliminar un agente infeccioso, en particular los virus. Preferentemente, el procedimiento comprende al menos un tratamiento por disolvente y detergente, y una nanofiltracion. El tratamiento por disolvente y/o detergente (denominado generalmente tratamiento disolvente/detergente) comprende en particular el tratamiento por tri-n-butilfosfato (TnBP) y/o un detergente que se selecciona entre el Triton X-100, el Tween (preferentemente Tween 80), el colato de sodio y el 2-[4-(2,4,4-trimetilpentano-2-il)fenoxi]etanol (Octoxinol). La nanofiltracion se refiere generalmente a la filtracion del concentrado de inmunoglobulinas polivalentes a traves de un filtro con un tamano de poros inferior a 80 nm. Los filtros disponibles son, por ejemplo, los filtros BioEx, Planova ™ 75 nm, Planova ™ 35 nm, Planova ™ 20 nm o Planova™ 15 nm (Asahi corporation), Ultipor DV 50 or DV 20 (Pall corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFR o NFP (Millipore). Preferentemente, una nanofiltracion se realiza antes de la etapa (v) de concentracion de las inmunoglobulinas polivalentes por ultrafiltracion asociada a una etapa de formulacion. En un modo de realizacion particular, el concentrado de inmunoglobulinas polivalentes purificado se filtra sobre una secuencia de filtros con un tamano de poros de entre 15 y 50 nm, por ejemplo de 20 o 35 nm.

La cromatograffa de intercambio de aniones utilizada en el procedimiento segun la invencion se efectua a pH alcalino y baja fuerza ionica para permitir la fijacion de las inmunoglobulinas polivalentes. Esta etapa se realiza por ejemplo segun el procedimiento descrito en la patente EP 1 385 886 (Laboratoire Frangais du Fractionnement y des Biotechnologies, “Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique”). La resina se equilibra por cualquier tampon que tiene un poder de tampon de baja concentracion para unos pH comprendidos entre 8,5 y 9,5, tal como los tampones Tris o mas particularmente glicina. La concentracion en glicina puede estar comprendida entre 5 y 50 mM, por ejemplo entre 5 y 20 mM, y mas particularmente entre 8 y 10 mM. El pH se ajustara entre 8,5 y 9,5 y mas particularmente entre 8,9 y 9,1.

De manera ventajosa, el eluato de la cromatograffa en lecho fluidizado se diluye y ajusta en pH con el fin de permitir la fijacion de las inmunoglobulinas polivalentes sobre el soporte cromatografico intercambiador de aniones. Esta dilucion se efectua con agua a fin de llevar la conductividad por debajo de un valor de 1500 |iS/cm, y mas preferiblemente por debajo de 1100 |iS/cm. La columna se lava en el tampon de equilibrado, despues se eluyen las inmunoglobulinas polivalentes en tampon Na/Na2 PO4 20 mM a pH 6,2. Finalmente, la columna se lava con una solucion de NaCl a 150 mM.

La eliminacion de anticuerpo anti-A y anti-B en la solucion obtenida a partir de la cromatograffa de intercambio de aniones se puede efectuar segun el metodo descrito en la solicitud de patente WO 2007/077365 (Laboratoire Frangais du Fractionnement y des Biotechnologies, “Concentre d'immunoglobulines G (IgG) appauvri en anticorps anti-A y anti-B y en IgG polyreactives”). La solucion obtenida en la etapa anterior se somete a una etapa de eliminacion de los anticuerpos anti-A y anti-B por cromatograffa de inmunoafinidad por percolacion de dicho concentrado de inmunoglobulinas polivalentes sobre una mezcla de soportes cuyas matrices se injertan con grupos oligosacaridos antigenicamente similares a los grupos sangmneos A y B.

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En un modo de realizacion particular de la invencion, la solucion inicial es plasma sangumeo o una fraccion de plasma enriquecida en inmunoglobulinas por unos metodos bien conocidos por el experto en la materia, y en particular por fraccionamiento etanolico y/o por separacion cromatografica.

En un modo de realizacion particular, la solucion inicial es un precipitado “I+N+IN” o un precipitado “II+III” obtenido a partir de plasma sangumeo fraccionado con etanol segun el metodo de Cohn o de Kistler y Nistschmann (1962, Vox Sang. 7, 414) y vuelto a poner en solucion. Ventajosamente, el precipitado “I+II+NI” o el precipitado “N+IN” se vuelve a poner en suspension en el ambito de la invencion en agua purificada para inyeccion (ppi) o en una solucion que contiene iones. La solucion que contiene iones utilizada en el ambito de la invencion puede ser una solucion que comprende NaCl a una concentracion inferior o igual a 20 mM, preferentemente comprendida entre 5 y 15 mM, y de manera preferida igual a 10 mM.

En otro modo de realizacion, poner de nuevo en solucion el precipitado “I+II+III” o el precipitado “II+III” se realiza en condiciones que permiten la precipitacion del fibrinogeno contaminante. La precipitacion del fibrinogeno contaminante puede entonces obtenerse por tratamiento del precipitado “I+II+III” o del precipitado “II+III” con una solucion que precipita especfficamente el fibrinogeno, por ejemplo una solucion de CaCl2 cuya concentracion es inferior o igual a 20 mM, preferentemente comprendida entre 5 y 15 mM, y de manera preferida con una solucion de sales 10 mM. En tal modo de realizacion, el fibrinogeno permanece en forma precipitada mientras que las inmunoglobulinas polivalentes son resolubilizadas.

Un modo de realizacion particular de la invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas, que comprende:

(i) una etapa de eliminacion de contaminantes proteicos por el acido capnlico;

(ii) una etapa de clarificacion por filtracion en profundidad;

(iii) una etapa de cromatograffa en lecho fluidizado, de tipo “modo-mixto”;

(iv) una etapa de inactivacion viral por tratamiento disolvente/detergente;

(v) una etapa de cromatograffa de intercambio de aniones;

(vi) una etapa de eliminacion de los anticuerpos anti-A y anti-B;

(vii) una filtracion a traves de filtros nanometricos de porosidad decreciente de 100 a 15 nm;

(viii) una etapa de concentracion por ultrafiltracion de la solucion procedente de la etapa anterior asociada a una etapa de formulacion, despues una etapa de filtracion esterilizante convencional.

En un modo de realizacion mas particular, la invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas, que comprende:

(i) el tratamiento de una solucion inicial de plasma sangumeo o de una fraccion enriquecida en inmunoglobulinas por fraccionamientos con etanol, para obtener un precipitado “I+II+III” o “II+III”, segun el metodo de Cohn (ya citado) o de Kistler y Nitschmann (1962, Vox Sang. 7, 414);

(ii) volver a poner en solucion el precipitado “I+II+III” o (II+III” con agua ppi, bajo agitacion, a 20°C (preferiblemente 4 a 15°C). Se pueden proporcionar diferentes iones a fin de facilitar el poner de nuevo en solucion las inmunoglobulinas polivalentes antes citadas, por ejemplo unos cationes tales como Na+, unos aniones tales como Cl, por ejemplo NaCl. La concentracion de sal es inferior o igual a 20 mM, preferentemente comprendida entre 5 y 15 mM, y de manera preferida igual a 10 mM, como por ejemplo NaCl a una molaridad de 10 mM;

(iii) la precipitacion, a partir del precipitado “I+II+III” o “II+III” vuelto a poner en solucion, de contaminantes proteicos por el acido capnlico a una concentracion del 0,5 al 1,5%, en particular del 0,8 al 1,2%, particularmente del 0,9 al 1,1%, para obtener una solucion plasmatica desprovista en proteasas, despues el ajuste del pH entre 4,3 y 4,9, preferiblemente entre 4,4 y 4,8, y preferentemente entre 4,6 y 4,8. En un modo de realizacion, el ajuste del pH se realiza con HCl;

(iv) la filtracion de la solucion plasmatica desprovista en proteasa procedente de la etapa (iii) a pH acido por un filtro en profundidad que tiene la porosidad mas amplia posible, que permite la inyeccion del filtrado sobre una columna de cromatograffa utilizada en modo lecho fluidizado;

(v) un ajuste del pH y de la osmolalidad de la solucion procedente de la etapa (iv),

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(vi) una cromatograffa en lecho fluidizado de la solucion obtenida al final de la etapa anterior, para obtener una solucion sangumea enriquecida en inmunoglobulinas polivalentes humanas. De manera ventajosa, dicha cromatograffa debe permitir una elucion de las inmunoglobulinas polivalentes en un tampon similar al tampon necesario para las etapas siguientes del procedimiento, a fin de limitar las perdidas de inmunoglobulinas polivalentes, que podran deberse a una etapa de dialisis, de ultrafiltracion o cualquier etapa necesaria para la reformulacion de la solucion;

(vii) el tratamiento por disolvente/detergente que comprende en particular el tratamiento por tri-n-butilfosfato (TnBP) y/o un detergente que se selecciona entre el Triton X-100, el Tween (preferentemente Tween 80), el colato de sodio y el 2-[4-(2,4,4-trimetilpentano-2-il)fenoxi]etanol (Octoxinol), para inactivar unos virus en la solucion obtenida al final de la etapa anterior;

(viii) la cromatograffa de intercambio de aniones de la solucion obtenida al final de la etapa anterior, utilizando un gel de polisacarido reticulado o de poffmero vimlico, injertado con grupos TMAE a fin de eliminar los disolventes y detergentes utilizados en la etapa anterior y retirar unos contaminantes de tipo IgA e IgM;

(ix) la cromatograffa de afinidad tal como se describe en la solicitud de patente WO 2007/077365 (Laboratoire Frangais du Fractionnement y des Biotechnologies, “Concentre d'immunoglobulines G (IgG) appauvri en anticorps anti-A y anti-B y en IgG polyreactives”) para eliminar los anticuerpos anti-A y anti-B de la solucion obtenida al final de la etapa anterior;

(x) la nanofiltracion de la solucion obtenida al final de la etapa anterior, utilizando un pre-filtro de porosidad 50 (por ejemplo en un filtro PALL DV20) o 35 nm (por ejemplo en un filtro PLANOVA 35 N), seguida de un filtro de porosidad 20 (por ejemplo un filtro PLAnOvA 20 N), o 15 nm (por ejemplo un filtro PLAnOvA 20 N o BIOEX) para eliminar unos priones o unos virus resistentes al tratamiento de la etapa (ix);

(xi) la concentracion o diafiltracion de la solucion obtenida al final de la etapa anterior, para obtener una solucion que contiene al menos 50 g/l de inmunoglobulinas polivalentes.

La solucion obtenida al final de la etapa (iii) de eliminacion de los contaminantes por el acido capfflico del procedimiento de la invencion posee una concentracion en proteasas conforme a la norma 2.6.15 de la Farmacopea Europea 6.7, edicion 01/2012:0918, la cual es como maximo de 35 Ul/ml, calculada con respecto a una dilucion de la preparacion a examinar que contiene 30 g/l de inmunoglobulinas.

La invencion tiene tambien por objeto un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas obtenido por el procedimiento de la invencion, caracterizado por que dicho concentrado posee una actividad anti-complementaria inferior al 30%.

La invencion tiene tambien por objeto un procedimiento de preparacion de una composicion farmaceutica de inmunoglobulinas polivalentes humanas lfquida, congelada o liofilizada, caracterizada por:

a. la adicion al concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas, obtenido segun el procedimiento descrito en la invencion, de uno o varios estabilizantes farmaceuticamente aceptables, y

b. opcionalmente, la congelacion o la liofilizacion de la preparacion farmaceutica obtenida en la etapa anterior; de manera que dicha preparacion farmaceutica este en forma lfquida, congelada o liofilizada.

Los estabilizantes farmaceuticamente aceptables utilizados en el ambito de la invencion son, por ejemplo, los descritos en las solicitudes de patente FR 2 853 551, FR 2 961 107 y FR 2 962 650. La solicitud FR 2 853 551 describe una formulacion estabilizante que comprende un azucar alcoholico tal como el manitol, la glicina y un detergente no ionico. La concentracion en manitol esta ventajosamente comprendida entre 30 g/l y 50 g/l, la de la glicina entre 7 g/l y 10 g/l, y la del detergente no ionico entre 20 y 50 ppm. La solicitud FR 2 961 107 describe una formulacion estabilizante que comprende glicina y un detergente no ionico a un pH inferior o igual a 4,8. La concentracion de glicina es al menos de 200 mM, preferentemente de 250 mM + 50 mM y la del detergente no ionico esta comprendida entre 20 y 100 mg/l, preferentemente 35 mg/l + 15 mg/l, mas preferentemente 50 mg/l. La solicitud FR 2 962 650 describe la adicion a una preparacion de inmunoglobulinas G humanas de excipientes seleccionados entre los aminoacidos, los azucares, los derivados de azucares, las sales y los tensioactivos, siendo dichos tensioactivos anadidos a una concentracion inferior a la concentracion micelar cfftica de dichos tensioactivos.

La invencion tiene tambien por objeto la utilizacion de una composicion farmaceutica de inmunoglobulinas polivalentes humanas lfquida, congelada o liofilizada, en particular una composicion farmaceutica de inmunoglobulinas polivalentes humanas lfquida, congelada o liofilizada obtenida segun el procedimiento de la invencion, para el tratamiento de patologfas, tales como las polineuropaffas desmielinizantes, la esclerosis multiple, el smdrome miastenico de Lambert-Eaton, las dermatomiositis, para el tratamiento sustitutivo en el caso de deficiencias inmunitarias primitivas tales como las agammaglobulinemias congenitas y las hipogammaglobulinemias

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congenitas, la deficiencia inmunitaria comun variable, la deficiencia inmunitaria combinada severa, el smdrome de Wiskott Aldrich, el mieloma o la leucemia linfoide cronica con hipogammaglobulinemia secundaria severa e infecciones recurrentes, las infecciones recurrentes en el nino infectado por VIH, o para el tratamiento de deficiencias inmunitarias primitivas con hipogammaglobulinemia o padecimiento funcional de la inmunidad humoral. La presente invencion comprende tambien la utilizacion de la composicion farmaceutica de inmunoglobulinas polivalentes humanas Nquida, congelada o liofilizada de la invencion para el tratamiento de deficiencias inmunitarias secundarias de la inmunidad humoral, en particular la leucemia linfoide cronica o el mieloma con hipogammaglobulinemia y asociados a infecciones de repeticion, el aloinjerto de celulas madres hematopoyeticas con hipogammaglobulinemia asociada a una infeccion, asf como el tratamiento inmunomodulador de purpura trombopenica idiopatica (PTI) en el adulto y el nino en caso de riesgo hemorragico importante o antes de una operacion medica o quirurgica para corregir el porcentaje de plaquetas, de la retinocoroiditis de Birdshot, del smdrome de Guillain-Barre, de la neuropatfa motriz multifocal (NMM), de las polirradiculoneuritis inflamatorias desmielinizantes cronicas (PIDC), y de la enfermedad de Kawasaki.

Los ejemplos siguientes describen unos modos de realizacion del procedimiento segun la invencion. Los ejemplos siguientes tienen como objetivo ilustrar el objeto de la invencion e ilustrar unos modos de realizacion ventajosos, pero de ninguna manera tienen como objetivo restringir el alcance de la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1

1.1 Vuelta a poner en solucion el precipitado “I+N+IN”

Se utiliza como material de origen el precipitado “I+N+IN” obtenido a partir del plasma sangumeo fraccionado con etanol segun el metodo de Cohn o de Kistler y Nistschmann (1962, Vox Sang. 7, 414). Este precipitado se vuelve a poner en solucion a razon de 56,7 g para 228 ml de agua desmineralizada o proporciones equivalentes. Se agita la mezcla durante 20 minutos a 15°C + 5°C. Despues la temperatura se aumenta a 22°C + 2°C y el acido capnlico (1% peso/volumen) se anade lentamente en el precipitado “I+N+IN” vuelto a poner en solucion. El pH de la solucion obtenida despues de la adicion de acido capnlico se ajusta a 4,8, y la solucion permanece bajo agitacion durante 60 minutos.

1.2 Filtracion en profundidad

La solucion resultante se clarifica por una filtracion en profundidad sobre filtro SEITZ® T 2600 (Pall Corporation). Esta filtracion retiene al mismo tiempo los adyuvantes de filtracion presentes en el precipitado “I+II+III” y el precipitado proteico generado por la adicion de acido capnlico.

El pH de la muestra esta tambien ventajosamente estudiado para optimizar el rendimiento de filtracion.

El pH de la solucion proteica se ajusta a 6,0 unicamente despues de la filtracion. En efecto, el ajuste del pH de 4,8 a

6,0 genera un ligero precipitado (insolubilidad de las inmunoglobulinas polivalentes) retenido por el filtro y por lo tanto una disminucion del rendimiento de filtracion en inmunoglobulinas polivalentes.

El volumen de aclarado del filtro (agua purificada apirogena) es equivalente al volumen de la muestra de origen a fin de optimizar el rendimiento final.

1.3 Cromatograffa de tipo “modo-mixto” en lecho fluidizado Las condiciones de realizacion son las siguientes:

* tampon de equilibrado y de lavado: 20 mM de Na/Na2PO4 a pH 6.

* tampon de elucion: 20 mM glicina/20 mM de NaCl a pH 9,8.

La eleccion de una elucion por efecto de pH en un tampon Gly/NaCl permite por simple dilucion (ajuste de la conductividad y del pH) obtener una muestra lista para ser inyectada sobre la columna de intercambio de iones (TMAE Fractogel).

1.4 Tratamiento por disolvente/detergente

El eluato de la cromatograffa de tipo “modo-mixto” en lecho fluidizado segun el ejemplo 1.3 sufre un tratamiento de inactivacion viral por disolvente/detergente como se describe por Neurath y Horowitz (US 4,764,369).

La mezcla disolvente/detergente 10 veces concentrada contiene un 3% de TnBP (tri(n-butil)fosfato) y un 10% de octoxinol. La concentracion final en el eluato es de un 0,3% de TnBP y un 1% de octoxinol.

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Despues de 1 hora de inactivacion, se ajusta el eluato a pH 9,0 y diluido en agua para obtener una conductividad inferior a 1100 |iS/cm.

1.5 Cromatograffa de intercambio de iones

El gel de intercambio de iones utilizado es el TMAE-Fractogel®, Merck.

* tampon de pre-equilibrado: glicina 80 mM / NaCl 80 mM a pH 9,

* tampon de equilibrado: glicina 9 mM / NaCl 9 mM a pH 9.

Despues de la carga de la muestra, la columna se lava con el tampon de equilibrado. Despues se eluye en tampon Na/Na2 PO4 20 mM a pH 6,2.

1.6 Cromatograffa de afinidad

El gel de afinidad utilizado es el Iso A/Iso B Hypercel, Pall Corporation.

El eluato de la cromatograffa TMAE se somete a esta cromatograffa de afinidad, a fin de eliminar los anticuerpos anti-A y anti-B. Las inmunoglobulinas polivalentes de interes atraviesan la columna sin ser retenidas.

* equilibrado del gel en agua desmineralizada

* recuperacion de la fraccion no absorbida sin lavado de la columna.

1.7 Filtracion

La solucion proteica procedente de la cromatograffa de afinidad se filtra sobre un filtro en profundidad 90LA CUNO, 3M despues en un filtro de 0,2 |im. Los filtros son aclarados con agua y la solucion de aclarado se incorpora al filtrado.

1.8 Nanofiltracion

El filtrado anterior, ajustado a pH 4,5, se pre-filtra en ffnea sobre un filtro Fluorodyne II 0,1 |im, Pall Corporation y se nanofiltra sobre filtro DV50, Pall Corporatio, despues sobre un filtro Planova 20N, Asahi.

1.9 Formulacion

El producto se pre-concentra a aproximadamente 80 g/l por ultrafiltracion sobre un casete de ffmite de corte 30 kDa, despues se diafiltra a volumen constante hasta que la conductividad sea < 600 |iS/cm. El producto se formula entonces y se ajusta 50 g/l de protemas.

Ejemplo 2: Obtencion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes por la realizacion del procedimiento de la invencion a escala piloto

2.1 Vuelta a poner en solucion del precipitado “I+M+IM”

Se utiliza como material de origen el precipitado “I+M+IN” obtenido a partir del plasma sangumeo fraccionado con etanol segun el metodo de Cohn o de Kistler y Nistschmann (1962, Vox Sang. 7, 414). Este precipitado se vuelve a poner en solucion a razon de 3 kg para 12 l de agua desmineralizada. Se agita la mezcla durante 20 minutos a 10°C + 3°C. Despues la temperatura se sube a 22°C + 2°C y el acido capnlico (1% peso/volumen) se anade lentamente en el precipitado “I+II+II” vuelto a poner en solucion. El pH de la solucion obtenido despues de la adicion de acido capnlico se ajusta a 4,8, y la solucion permanece bajo agitacion durante 60 minutos.

2.2 Filtracion en profundidad

La solucion resultante se clarifica por una filtracion en profundidad sobre filtro SEITZ® T 2600 (Pall Corporation). Esta filtracion retiene al mismo tiempo los adyuvantes de filtracion presentes en el precipitado “I+II+III” y el precipitado proteico generado por la adicion de acido capnlico. Para este ensayo, la superficie utilizada es de 8,7 kg de precipitado/m2 de media filtrante.

El volumen de aclarado del filtro (agua purificada apirogena) es equivalente al volumen de la muestra de origen, es decir 15 l.

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2.3 Cromatograffa de tipo “modo-mixto” en lecho fluidizado

El gel de cromatograffa utilizado es el gel Rhobust IGIV, Upfront. 4,3 l de gel en una columna de diametro de 10 cm. Las condiciones de realizacion son las siguientes:

* tampon de equilibrado y de lavado: 20 mM de Na/Na2PO4 a pH 6.

* tampon de elucion: 20 mM glicina/20 mM de NaCl a pH 9,8.

2.4 Tratamiento por disolvente/detergente

El eluato de la cromatograffa de tipo “modo-mixto” en lecho fluidizado sufre un tratamiento de inactivacion viral por disolvente/detergente como se describe por Neurath y Horowitz (US 4,764,369).

Despues de una hora de inactivacion, se ajusta el eluato a pH 9,0 y se diluye en agua para obtener una conductividad inferior a 1100 |iS/cm.

2.5 Cromatograffa de intercambio de iones

El gel de intercambio de iones utilizado es el EMD-TMAE-Fractogel®, Merck.

4 litros en una columna de 12,7 cm de diametro.

* tampon de pre-equilibrado: glicina 80 mM / NaCl 80 mM a pH 9,

* tampon de equilibrado: glicina 9 mM / NaCl 9 mM a pH 9.

2.6 Cromatograffa de afinidad

El gel de afinidad utilizado es el Iso A/Iso B Hypercel, Pall Corporation. 154 ml de gel en una columna de 7 cm de diametro.

* equilibrado del gel en agua desmineralizada

* recuperacion de la fraccion no absorbida sin lavado de la columna.

2.7 Filtracion

La solucion proteica procedente de la cromatograffa de afinidad Iso A/Iso B Hypercel se filtra sobre un filtro en profundidad 90LA CUNO, 3M despues en un filtro de 0,2 |im. El aclarado de los filtros en agua se incorpora al filtrado.

2.8 Nanofiltracion

El filtrado anterior, ajustado a pH 4,5, se prefiltra en lmea sobre un filtro Fluorodyne II 0,1 |im, Pall Corporation y se nanofiltra sobre filtro DV50, Pall Corporation, despues sobre un filtro Planova 20N, Asahi.

2.9 Formulacion

El producto se pre-concentra a aproximadamente 80 g/l por ultrafiltracion sobre un casete de lfmite de corte 30 kDa, despues se diafiltra a volumen constante hasta que la conductividad sea < 600 |iS/cm. El producto se formula entonces y se ajusta a 50 g/l de protemas.

Ejemplo 3: Rendimiento del procedimiento

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Se han realizado tres lotes con tres precipitados “I+N+IN” diferentes segun el procedimiento segun la invencion descrito en el ejemplo 1 y precisado en el ejemplo 3. La eliminacion de las proteasas se obtiene con un 1% de acido capnlico. La filtracion se efectua en filtro-prensa sobre placas SEITZ T2600.

Se trata un lote control segun el procedimiento de referencia, tal como se describe en la solicitud de patente EP 1 385 886.

Los resultados de rendimiento del nuevo procedimiento se muestran en la tabla siguiente:

Rendimientos acumulados en g/l de protemas o de Ig de plasma en la fase concentrado formulado

: Lote segun la invencion Lote control tratado segun el procedimiento tal como se describe en el documento EP 1 385 886

10AXTO1064 015 (Lot 1): 10AXTO1064 038

Rendimiento en g de protemas por litro de plasma tratado.: 5,22 4,67

Rendimiento en g de Ig polivalentes por litro de plasma tratado: 4,75 4,49

El procedimiento segun la invencion permite aumentar el rendimiento en g de inmunoglobulinas polivalentes por litro de plasma tratado, con respecto al procedimiento de referencia (EP 1 385 886).

La ganancia en el ejemplo anterior es de 0,26 g de IgG/l de plasma, entre el lote segun la invencion y el lote control realizado a partir del mismo precipitado.

Ejemplo 4: Actividad anti-complementaria

Se han realizado tres lotes exploratorios segun el procedimiento de la invencion a tamano piloto a partir de tres precipitados “I+II+II” diferentes. Estos lotes se han comparado con un lote realizado a la misma escala (tamano piloto), pero segun el procedimiento industrial de produccion de las inmunoglobulinas por intravenosa, tal como se describe en la patente EP 1 385 886, y con tres lotes industriales preparados segun el procedimiento descrito en la solicitud EP 1 385 886 fabricados a partir de los mismos precipitados.

Un lote fabricado al tamano piloto corresponde a un lote cuyo tamano representa al menos un 10% del lote industrial.

Los lotes segun la invencion presentan una actividad anti-complementaria (AAC) medida segun el ensayo de la Farmacopea europea 7.5, edicion 01/2012:0918, parrafo 2.6.17, siempre inferior a las de los lotes realizados segun el procedimiento descrito en la solicitud EP 1 385 886. Por otro lado, la progresion observada en 18 meses sobre este criterio es menor para los lotes realizados segun la invencion.

Los resultados de actividad anti-complementaria (AAC) se muestran en la tabla siguiente:

: T = 0 T = +18 meses Progresion (%)

Lotes exploratorios fabricados al tamano piloto preparados segun el: AAC AAC %

procedimiento de la invencion:: %

Lote 1*: 28 31 11%

Lote 2**: 27 31 15%

Lote 3***: 27 31 15%

Lote fabricado al tamano piloto* preparado segun el procedimiento descrito: 33 40 21%

en la solicitud EP 1 385 886 :

Lotes industriales preparados segun el procedimiento descrito en la solicitud

EP 1 385 886 :

Lote industrial 1*: 36 38 6%

Lote industrial 2**: 32 39 22%

Lote industrial 3***: 32 37 16%

*, **, *** lotes realizados con los mismos precipitados

El procedimiento de la invencion permite por lo tanto obtener un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes cuya actividad anti-complementaria es inferior al 30%.

Ejemplo 5: Pureza de las inmunoglobulinas producidas segun el procedimiento de la invencion.

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Los datos analfticos de pureza para los lotes pilotos descritos en el ejemplo 2 se resumen en la tabla siguiente.

analisis: Metodo de medicion Lote Piloto N°1 Lote Piloto N°2 Lote Piloto N°3 Media de lotes industriales obtenidos segun el procedimiento descrito en la solicitud EP 1 385 886

pH: Ph.Eur (2.2.35) 5,0 4,8 4,8 4,9

Osmolalidad mosmol/kg: Ph.Eur (2.2.29) 297 294 299 297

DTM polimeros (%): Ph.Eur (2.2.29) <0,4 <0,4 <0,4 0,5

Dimeros (%): Ph.Eur (2.2.29) 2,7 3,7 2,4 ND

Monomeros (%): Ph.Eur (2.2.29) 96,3 95,3 96,4 98,7 *

Fragmentos (%): Ph.Eur (2.2.29) 1 1,1 1,1 1

Proteinas totales (g/l): Ph.Eur (2.5.33) 51 49 49 50

Porcentaje de proteinas (%): Ph.Eur (2.5.33) 98 98 98



: % proteinas % proteinas % proteinas % proteinas

IgG g/l: Nefelomet ria ** 46,4 91 46 95 47,6 96 45,7 92

IgG1 g/l: Nefelomet ria ** 29,5 58 27,1 56 26,7 54 28 56

IgG2 g/l: Nefelomet ria ** 18 35 17,8 37 16,7 34 16,1 32

IgG3 g/l: Nefelomet ria ** 1,4 3 1,2 2 1,3 3 1,1 2

IgG4 g/l: Nefelomet ria ** 1,1 2 1 2 1 2 0,9 2

IqGA g/l: ELISA *** 7, 4 0,01 7,1 0,01 6 0,01 8,6 0,02

IgGE g/l: Nefelomet ria ** <0,8 ND <0,8 ND <0,8 ND <0,8 ND

IgGM g/l: Nefelomet ria ** 0,23 0,2 0,18 0,16

Anticuerpos anti- Hbs Ag (UI/ml): ELISA *** 5,1 3,5 3,3 4,6

Albumina mg/l: Nefelomet ria ** <2,2 <2,2 <2,2 <2,2

Tranferrina mg/l: Nefelomet ria ** <2,1 <2,1 <2,1 <2,1

Activador de la precalicreina: Ph.Eur (2.6.15) <1 <1 <1 <2

Hemaglutininas anti-A: Ph.Eur (2.6.20) 4 16 8 8

Hemaglutininas anti-B: Ph.Eur (2.6.20) 2 4 8 4

Actividad anti- complementaria%: Ph.Eur (2.6.17) 28 27 27 33

Ph.Eur: Farmacopea Europea 6a edicion * Monomeros + dfmeros

** Pressac M, Later R. “Dosages seriques d'IgG, IgA, IgM, transferrine y haptoglobine. II Precision analytique y comparaison des resultats fournis par differents analyseurs”. Ann Biol Clin 1995; 53: 273-81

*** R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne y J. Kuby, “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”, in Immunology, 5a edicion, paginas 148-150, W. H. Freeman, New York, 2003.

La suma “monomeros + dfmeros”, la distribucion de las subclases, los porcentajes de contaminantes y la actividad anticomplementaria son equivalentes para las inmunoglobulinas procedentes del procedimiento de la invencion o del procedimiento de referencia segun la patente EP 1 385 886. Estas caractensticas satisfacen los criterios de la Farmacopea Europea.

Ejemplo 6: Estabilidad de las inmunoglobulinas producidas segun el procedimiento de la invencion

Los productos formulados procedentes de los lotes pilotos descritos en el ejemplo 2 se han conservado a 4°C y unas alrouotas de lotes industriales realizados con los mismos precipitados de origen se han conservado en la misma fase

en las mismas condiciones. Unas extracciones efectuadas cada seis meses han permitido observar sobre tres criterios las diferencias entre los lotes obtenidos segun la invencion (lotes pilotos 1, 2 y 3) y los lotes obtenidos segun el procedimiento industrial de referencia EP 1 385 886 (lotes industriales 1,2 y 3). Los tres criterios medidos son los siguientes:

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- la medicion de la concentracion en inmunoglobulinas G (IgG) y la de la concentracion en inmunoglobulinas anti-Hbs segun el metodo descrito en la Farmacopea Europea 6.7 (Pharmeuropa, volumen 21, numero 2, abril de 2009), parrafo 2.7.1, y

10 - la determinacion del tamano molecular (poUmeros, dfmeros, monomeros y fragmentos) segun el metodo descrito

en la Farmacopea Europea 6.7 (Pharmeuropa, volumen 21, numero 2, abril de 2009), parrafo 2.2,29.

La tabla siguiente da cuenta de estas diferencias:

: T= 0 T= +6 meses

Lotes preparados segun el procedimiento de la invencion:: IgG g/l ig aHbs UEml DTM % (agregados / dfmeros / monomeros / fragmentos) IgG g/l ig aHbs UEml DTM % (agregados / dfmeros / monomeros / fragmentos)

Lote piloto 1 *: 46,4 5,1 <0,4/2,7/96,3/1,0 43,7 5,2 < 0,4/5,7/93,4/<1,0

Lote piloto 2**: 46,0 3,5 <0,4/3,7/95,3/1,1 42,7 3,5 <0,4/5,2/93,7/1,1

Lote piloto 3***: 47,6 3,3 <0,4/2,4/96,4/1,1 43,5 3,0 <0,4/4,3/94,6/1,0

Lote fabricado con el tamano piloto* preparado segun e procedimiento descrito en el documento EP1385886:: 49,6 6,1 < 0,4/3,6/95,7/<1 45,3 5,4 <0,4/5,1/93,9/<1,0

Lotes industriales preparados segun el procedimiento descrito en el documento EP1385886:: 45,9 5,1 0,4/98,8/1,1 46,6 5,5 <0,4/4,8/94,1/1,0

Lote industrial 1 *

Lote industrial 2**: 46,0 4,7 0,7/98,6/1,0 44,9 4,4 0,9/5,1/93,2/<1,0

Lote industrial 3***: 45,2 3,9 0,4/98,6/1,0 44,4 3,5 < 0,4/4,6/94,3/<1,0

: T= +12 meses T= + 18 meses

Lote piloto 1 *: 51,7 5,2 <0,4/5,6/93,3/1,0 48,5 5,0 <0,4/4,8/94,1/1,0

Lote piloto 2**: 49,7 3,7 < 0,4/5,3/93,7/<1,0 45,7 3,3 <0,4/4,4/94,5/1,1

Lote piloto 3***: 49,5 3,2 <0,4/4,7/94,3/1,0 47,6 3,1 <0,4/4,4/94,5/1,1

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Lote fabricado con el tamano piloto * preparado segun el procedimiento descrito en el documento EP1385886: 51,8 5,7 <0,4/5,4/93,6/<1,0 49,1 5,4 <0,1/5,2/93,8/1,0

Lotes industriales preparados segun el procedimiento descrito en el documento EP1385886: Lote industrial 1 *: 51,4 5,9 <0,4/4,8/93,6/1,0 46,5 5,3 <0,4/4,1/94,8/1,0

Lote industrial 2**: 48,2 4,5 0,7/4,8/93,6/1,0 46,2 4,3 0,7/4,9/93,5/1,0

Lote industrial 3***: 49,5 3,7 <0,4/4,4/94,4/1,0 47,1 3,4 <0,4/4,4/94,4/1,0

*, **, ***, |0tes realizados con los mismos precipitados El analisis de los datos muestra:

- una estabilidad de la concentracion en IgG sobre 18 meses y una homogeneidad de 7 lotes,

- una estabilidad de la concentracion de los Ig anti-Hbs sobre 18 meses: siendo cada lote espedfico de este criterio,

- una suma “monomeros + dfmeros” constante y superior al 85% requerido por la Farmacopea, para cada lote sobre 18 meses.

Ejemplo 7: Procedimiento que comprende una etapa de precipitacion capnlica, de clarificacion y una etapa de cromatograffa de tipo “modo-mixto” en lecho fluidizado.

El tratamiento con acido capnlico tiene como objetivo la eliminacion por precipitacion (permaneciendo las inmunoglobulinas en solucion) de una parte de las protemas contaminantes procedentes del plasma y muy particularmente de proteasas. En funcion del porcentaje de acido capnlico utilizado y del metodo de separacion del sobrenadante y del precipitado, se puede perder una parte mas o menos importante de las inmunoglobulinas. Se han ensayado unas condiciones experimentales con el fin de tener la clarificacion mas basta posible compatible con la cromatograffa en lecho fluidizado y que genere la menor perdida en inmunoglobulinas. Para eso, unos filtros de porosidad creciente se han comparado sin precipitacion capnlica en una primera fase, y despues se han confirmado con el tratamiento con el acido capnlico a diferentes concentraciones.

Ensayo sobre filtro de diametro 90, es decir 50 cm2 (con aclarado).

Ninguna precipitacion con el acido capnlico.

N° de ensayo: 440 077 440 078 440 079

Tipo de filtro Porosidad pH Volumen pasado ml Aclarado pasado Volumen recuperado ml IgG inicial g/l IgG filtrado g/l Rendimiento % Volumen/Superficie l/m2: Pall Supradur50P 4-8 pm 4,8 150 0 9 (agua) 14,35 ND* ND* ND* Pall/Seitz T 5500 25-70 pm 4,8 150 75 208 15.05 10.5 97 30 Pall/Seitz T 2600 15-40 pm 4,8 150 75 216 15,05 10,2 98 30

* obstruccion del filtro, ninguna determinacion efectuada

Estos resultados muestran que una porosidad minima del orden de 10-20 pm debe ser realizada a fin de limitar la

perdida en IgG debida a la obstruccion. El filtro T2600 se selecciono con respecto al filtro T5500 para su porosidad mas baja a un rendimiento en IgG equivalente.

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Al tener el porcentaje de acido capnlico anadido un impacto sobre la precipitacion de las proteasas y sobre la filtrabilidad de la solucion, se analizo un intervalo de acido capnlico que va del 0,5 al 1% sin adicion de adyuvante de filtracion. Los resultados obtenidos son comparados con los que resultan de una clarificacion control por simple centrifugacion.

Ensayo - Vuelta a poner en suspension (RES) un 1% de acido capnlico - filtro de diametro 90, es decir 50 cm2, carga de 210 ml



: RES pH 4,8(1) RES clarificada (2)

Ensayo A: 1% Filtracion SEITZ 2600 IgG g/l 13,7 9,7

: Rendimiento (Rdt) % 100 76(3)

: Proteasas mDO/ml 570 13

Ensayo B: 0,5% Filtracion SEITZ 2600 IgG g/l 15 9,4

: Rdt % 100 51 (3)

: Proteasas mDO/ml NR NR

Ensayo C: 0,5% Centrifugacion IgG g/l 14,1 12,4

: Rdt % 100 72

: Proteasas mDO/ml 967 250

(1) : Precipitado vuelto a poner en solucion ajustada a pH 4,8 antes de la clarificacion

(2) : Precipitado vuelto a poner en solucion ajustada a pH y clarificado

(3) : Aclarado de los filtros con un volumen que corresponde a la mitad del producto a clarificar.

El control por centrifugacion muestra que una parte de las inmunoglobulinas se pierde en el precipitado, si este no se aclara, esta tecnica no se conserva. La condicion mas interesante ensayada es la concentracion de un 1% de acido capnlico: la contaminacion en proteasas es baja y la perdida en inmunoglobulinas es inferior al 30%. Una concentracion de un 1% de acido capnlico parece por lo tanto ser el mejor compromiso entre la filtrabilidad, el rendimiento y la eliminacion de las proteasas.

A fin de aumentar el rendimiento, el ensayo anterior se ha realizado con una carga mas baja (180 ml en lugar de

210) y aumentando el volumen de lavado del precipitado con el tampon de aclarado, tal como se describe en la tabla

siguiente.

Ensayo 09AXTO440 126 - RES 1% acido capnlico -filtro de 090, es decir 50 cm2, carga de 180 ml.

Etapas: Volumen (ml) IgG (g/l) Cantidad (mg) Rendimiento (Rdt) %

RES pH 4,8: 210 13,65 2866,5 100

RES filtrada: 180 11,2 2016,0 70,3

Aclarado 1: 30 3,71 111,3 3,9

Aclarado 2: 30 2,26 67,8 2,4

Aclarado 3: 30 2,28 68,4 2,4

Aclarado 4: 30 1,71 51,3 1,8

Aclarado 5: 30 1,16 34,8 1,2

Aclarado 6: 30 0,91 27,3 1

Aclarado 7: 30 0,91 27,3 1

Pool filtrado: 385 6,95 2675,8 93,3

Disminuyendo el volumen de carga sobre el filtro y aclarando el precipitado con un volumen de lavado equivalente al volumen de producto a clarificar (180 ml), no se observa ninguna obstruccion, y se recupera la totalidad de las inmunoglobulinas. La totalidad de las inmunoglobulinas esta disponible para la etapa de cromatograffa de afinidad que sigue en el procedimiento de purificacion.

Ejemplo 8: Mejora de la puesta de nuevo en solucion de las IgG

Durante la fabricacion de los lotes tamano piloto segun el nuevo procedimiento, tal como se ha descrito en el ejemplo 2, la comparacion con el lote preparado segun el procedimiento descrito en la solicitud de patente EP 1 385 886 a la misma escala (10AXTO1064015) muestra que se puede mejorar ventajosamente la puesta de nuevo en solucion del precipitado “I+N+IN”. En efecto, se observa en esta etapa una diferencia de al menos 1 g/l de IgG (siendo los volumenes equivalentes) como lo demuestra la tabla siguiente.

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Puesta de nuevo en solucion no filtrada

Lote de tamano piloto preparado segun el procedimiento descrito en la solicitud de patente EP 1 385 886 (g/l) *: Lotes de tamano piloto preparados segun el procedimiento de la invencion (g/l)

: Lote 1* Lote 2 Lote 3

12,8: 11,6 10,3 11,7

* lotes realizados con el mismo precipitado

Unos ensayos complementarios han mostrado que la puesta de nuevo en solucion de las inmunoglobulinas presentes en el precipitado puede ser ventajosamente efectuada con una solucion que contiene unos iones en lugar de con agua purificada. En particular, utilizando una solucion de NaCl 10 mM.

Por otro lado, la precipitacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico puede ser tambien mejorada a unos pH inferiores a 4,8. En particular, un pH de 4,6 permite esta mejora.

Un lote de tamano piloto (“nuevo lote”) se ha realizado teniendo en cuenta estas mejoras y se ha comparado con la fase “Eluato cromatograffa Robusta” con los tres lotes (lotes 1, 2 y 3) ya realizados segun la invencion.

La tabla siguiente da cuenta de las diferencias:

Rendimiento del nuevo procedimiento en la fase “eluato de la cromatograffa en lecho fluidizado”

: Nuevo lote Lote 1 Lote 2 Lote 3

pH de RES: 4,6 4,8 4,8 4,8

g IgG/l plasma: 6,00 5,96 5,62 5,77

IgG/Protemas: 0,910 0,820 0,812 0,893

El nuevo lote, realizado con una puesta de nuevo en solucion con una solucion que tiene una concentracion en NaCl de 10 mM, tratado por el acido capnlico y ajustado a un pH igual a 4,6 presenta:

- un mejor rendimiento en inmunoglobulinas por litro de plasma utilizado,

- una mejor pureza frente a la relacion inmunologico/protemas totales.

Ejemplo 9: Aplicacion de la invencion al precipitado “N+IN”

El precipitado “N+IN” es una alternativa al precipitado “I+N+IN” como fuente de materia prima para la purificacion de IgG policlonales.

En base a esto, se han realizado dos lotes segun la invencion a partir de precipitados “N+IN” diferentes. Los resultados de las primeras evaluaciones obtenidos a partir de estas dos materias primas se compararon en la fase “eluato de la cromatograffa en lecho fluidizado”.

La tabla siguiente da cuenta de estos resultados:

: Lote “I+II+III” Lote “II+III” Lote “II+III”

pH de RES: 4,6 4,6 4,6

g IgG/l de plasma: 6,00 5,17 5,1

Rendimiento de purificacion %: 98 88 95

IgG/Protemas: 0,910 0,837 0,859

Estos resultados muestran que la realizacion de las primeras etapas del procedimiento segun la invencion se desarrolla de manera equivalente con los dos tipos de precipitado:

- de rendimiento de extraccion: los rendimientos acumulados de las etapas de clarificacion y de cromatograffa de afinidad Robusta son comparables, incluso si uno de los lotes esta un poco hacfa atras.

Sin embargo, los precipitados “N+IN” que han sufrido una etapa de fraccionamiento etanolico suplementario con respecto al precipitado “I+II+III” presentan un rendimiento en g de IgG/l de plasma del 15% inferior al obtenido con el precipitado “I+II+III”. Este deficit esta relacionado con la perdida de una parte de las IgG durante la etapa de fraccionamiento etanolico suplementario.

- de pureza: las relaciones IgG/protemas totales obtenidas con los precipitados “II+III” puestos de nuevo en solucion,

tratados por el acido capnlico y ajustados a un pH de 4,6 son comparables con las obtenidas con los precipitados “I+II+IN” vueltos a poner en solucion, tratados por el acido capnlico y ajustados a un pH de 4,8.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de preparacion de un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas a partir de una solucion inicial de plasma sangumeo o de fraccion de plasma enriquecida en inmunoglobulinas, caracterizado por que comprende:

(a) una etapa de eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico para obtener una solucion desprovista de proteasas, en la que la concentracion de acido capnlico utilizada va del 0,5 al 1,5%, expresada en gramo de acido capnlico por volumen de solucion a tratar,

(b) una etapa de clarificacion a pH acido por filtracion en profundidad,

(c) seguida de una etapa de cromatograffa en lecho fluidizado de la solucion desprovista de proteasas,

permitiendo dicho procedimiento obtener un concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas con un rendimiento superior a 4,5 g de inmunoglobulinas por litro de plasma sangumeo utilizado.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la concentracion de acido capnlico utilizada va del 0,8 al 1,2%, expresada en gramo de acido capnlico por volumen de solucion a tratar.
3. Procedimiento segun la reivindicacion 2, caracterizado por que la concentracion de acido capnlico utilizada va del 0,9 al 1,1%, expresada en gramo de acido capnlico por volumen de solucion a tratar.
4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la etapa de eliminacion de los contaminantes proteicos por el acido capnlico (a) se desarrolla a un pH comprendido entre 4,3 y 4,9, preferentemente entre 4,6 y 4,8.
5. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la etapa de cromatograffa en lecho fluidizado de la solucion desprovista de proteasas (c) se efectua con un soporte cromatografico de tipo intercambio de iones, de tipo afinidad, de tipo “pseudo-afinidad” o de tipo “modo-mixto”.
6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que la etapa de cromatograffa en lecho fluidizado de tipo “modo- mixto” comprende:

- cargar sobre una columna de cromatograffa previamente equilibrada con un tampon a un pH comprendido entre 4,5 y 8 la solucion que ha sufrido la etapa de clarificacion por filtracion en profundidad previamente ajustada al mismo pH,

- lavar dicha columna por una solucion tampon hasta la eliminacion de todas las protemas no absorbidas sobre la columna,

- eluir las inmunoglobulinas polivalentes adsorbidas sobre la columna por un tampon de elucion ajustado a pH comprendido entre 8 y 10, y

- recuperar la solucion enriquecida en inmunoglobulinas polivalentes humanas.
7. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas, despues de la etapa (c), una o varias de las etapas siguientes:

(i) una etapa de inactivacion viral,

(ii) una etapa de cromatograffa de intercambio de aniones de la solucion obtenida al final de la etapa anterior,

(iii) una etapa de eliminacion de anticuerpos anti-A y anti-B de la solucion obtenida al final de la etapa anterior,

(iv) una etapa de filtracion a traves de filtros nanometricos de porosidad decreciente de 100 a 15 nm,

(v) una etapa de concentracion por ultrafiltracion de la solucion procedente de la etapa anterior asociada a una etapa de formulacion,

(vi) despues una etapa de filtracion esterilizante convencional.
8. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la solucion inicial es una fraccion de plasma enriquecida en inmunoglobulinas por fraccionamiento etanolico y/o por separacion cromatografica.
9. Procedimiento segun la reivindicacion 8, en el que la solucion inicial es un precipitado “I+N+IN” o un precipitado

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“N+IN” obtenido a partir de plasma sangumeo fraccionado con etanol, y puesto de nuevo en solucion.
10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que el precipitado “I+N+NI” o el precipitado “N+NI” se vuelve a poner en solucion en agua purificada para inyeccion o en una solucion que contiene iones.
11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, en el que la solucion que contiene iones es una solucion que comprende NaCl a una concentracion inferior o igual a 20 mM, preferentemente comprendida entre 5 y 15 mM, y de manera preferida igual a 10 mM.
12. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el precipitado “I+N+IN” o el precipitado “II+III” se trata mediante una solucion de CaCl2 cuya concentracion es inferior o igual a 20 mM, preferentemente comprendida entre 5 y 15 mM, y de manera preferida con una solucion de CaCl210 mM.
13. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende:

(i) una etapa de eliminacion de contaminantes proteicos por el acido capnlico,

(ii) una etapa de clarificacion por filtracion en profundidad,

(iii) una etapa de cromatograffa en lecho fluidizado de tipo “modo-mixto”,

(iv) una etapa de inactivacion viral por tratamiento disolvente/detergente,

(v) una etapa de cromatograffa de intercambio de aniones,

(vi) una etapa de eliminacion de los anticuerpos anti-A y anti-B,

(vii) una filtracion a traves de filtros nanometricos de porosidad decreciente de 100 a 15 nm,

(viii) una etapa de concentracion por ultrafiltracion de la solucion procedente de la etapa anterior asociada a una etapa de formulacion, despues una etapa de filtracion esterilizante convencional.
14. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende ademas las etapas siguientes:

(a) anadir al concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas obtenido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, uno o varios estabilizantes farmaceuticamente aceptables, y

(b) opcionalmente, congelar o liofilizar la preparacion farmaceutica obtenida en la etapa anterior; de manera que dicha preparacion farmaceutica este en forma Nquida, congelada o liofilizada.
15. Concentrado de inmunoglobulinas polivalentes humanas obtenido segun el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que dicho concentrado posee una actividad anti-complementaria inferior al 30%.
16. Composicion farmaceutica de inmunoglobulinas polivalentes humanas Nquida, congelada o liofilizada obtenida segun el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para una utilizacion en el tratamiento de patologfas comprendidas en el grupo que consiste en las polineuropatfas desmielinizantes, la esclerosis multiple, el smdrome miastenico de Lambert-Eaton, los dermatomiositis, un tratamiento sustitutivo en el caso de deficiencias inmunitarias primitivas tales como las agammaglobulinemias congenitas y las hipogammaglobulinemias congenitas, la deficiencia inmunitaria comun variable, la deficiencia inmunitaria combinada severa, el smdrome de Wiskott Aldrich, el mieloma o la leucemia linfoide cronica con hipogammaglobulinemia secundaria severa e infecciones recurrentes, las infecciones recurrentes en el nino infectado por VIH, el tratamiento de deficiencias inmunitarias primitivas con hipogammaglobulinemia o padecimiento funcional de la inmunidad humoral, el tratamiento de deficiencias inmunitarias secundarias de la inmunidad humoral, en particular la leucemia linfoide cronica o el mieloma con hipogammaglobulinemia y asociados a infecciones de repeticion, el aloinjerto de celulas madre hematopoyeticas con hipogammaglobulinemia asociada a una infeccion, el tratamiento inmunomodulador de purpura trombopenica idiopatica (PTI) en el adulto y el nino en caso de riesgo hemorragico importante o antes una operacion medica o quirurgica, de la retinocoroiditis de Birdshot, del smdrome de Guillain-Barre, de la neuropatfa motriz multifocal (NMM), de los poliradiculoneuritis inflamatorias desmielinizantes cronicas (PIDC), y de la enfermedad de Kawasaki.