ES2833100T3 - Procedimiento - Google Patents

Abstract

Procedimiento para incrementar el rendimiento de IgG en un proceso de purificación de un intermedio de producción, que comprende (1) fraccionamiento con ácido octanoico, (2) incubación a bajo pH, (3) desplazamiento de pH y filtración profunda, (4) cromatografía de intercambio aniónico, (5) filtración de virus y concentración mediante ultra/diafiltración, en el que el paso (3) de desplazamiento de pH y filtración profunda es modificado para que comprenda (a) suministro de una solución ácida que comprende IgG, otras inmunoglobulinas y/u otros contaminantes de proteína con un pH entre 3,5 a 5,2 y una concentración total de proteína de por lo menos 10g/I; (b) ajuste de la solución a un pH de 5,2 a 6,2 mientras se mantiene una conductividad por debajo de 1,5 mS/cm; (c) incubación de la solución por al menos 15 minutos; y (d) retirada de cualquier precipitado en el que el ajuste de pH en el paso (b) se realiza mediante adición de por lo menos un compuesto de amina con varios hidroxilos con o sin un grupo carboxilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento

La invención se refiere a un procedimiento mejorado para la purificación de IgG. En particular, el procedimiento mejorado suministra mayores rendimientos que los procedimientos previos.

Antecedente de la invención

Como es bien sabido, las inmunoglobulinas juegan un papel importante en el sistema inmune de los mamíferos. Son producidas por los linfocitos B, hallados en el plasma sanguíneo, la linfa y otras secreciones corporales. Las inmunoglobulinas constituyen aproximadamente 20% de las proteínas del plasma en los humanos. La unidad básica de las inmunoglobulinas es un heterotetrámero, que contiene 2 cadenas pesadas y dos cadenas livianas, unidas por enlaces disulfuro. Cada una de estas cadenas tiene una región variable en su extremo N, que forma el sitio de unión del antígeno, y regiones constantes, que son responsables por las funciones efectoras de las inmunoglobulinas.

Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas, con diferentes propiedades bioquímicas y fisiológicas: IgG (cadena pesada y), IgA (a), IgM (p), IgD (8) y IgE (e). La IgG humana representa la inmunoglobulina más abundante en plasma, mientras la IgA representa la principal clase de anticuerpo en secreciones externas tales como saliva, lágrimas y moco de los tractos respiratorio e intestinal. IgM es con un mucho el anticuerpo físico más grande en el sistema circulatorio humano, estando usualmente presente como un pentámero de la unidad básica de inmunoglobulina, y aparece tempranamente en el curso de una infección.

Inicialmente, se usaron exitosamente preparaciones de IgG del plasma humano, para la profilaxis y tratamiento de diferentes enfermedades infecciosas. Los primeros productos fueron producidos mediante procesos relativamente crudos (fraccionamiento con etanol), y contenían impurezas y agregados en una extensión tal que pudieron ser administrados solamente de modo intramuscular. Las mejoras en los procedimientos de purificación han conducido a preparaciones de IgG que fueron adecuadas para la administración intravenosa (llamadas IVIG), debido a su pureza y calidad mejoradas, y también se han desarrollado preparaciones para la administración subcutánea (llamadas SCIG).

Los procesos industriales usados comúnmente para purificar IgG de plasma se basan en el procedimiento original diseñado por Cohn (Cohn E., et al., (1946), J Am Chem Soc, 68, 459-475, Oncley et al., (1949), J Am Chem Soc, 71, 541-550), que data de los años 1940s y descansa en la precipitación fraccionada en frío de proteínas de plasma. Después de adiciones progresivas de etanol bajo condiciones controladas de fuerza iónica, pH y temperatura, este proceso de fraccionamiento del plasma obtiene fracciones enriquecidas o concentradas de proteínas de plasma terapéuticamente útiles (factores de coagulación, albúmina, inmunoglobulina, antitrombina III). Mediante la aplicación del fraccionamiento de Cohn, se obtiene IgG de fracciones II III, I+II+III o el precipitado A equivalente (llamado precipitado NA) de acuerdo con Kistler y Nitschmann, quienes desarrollaron un procedimiento modificado de fraccionamiento de etanol (Kistler P y Nitschmann HS, (1952), Vox Sang, 7, 414-424).

En los años 1960s se mostró que los ácidos grasos de cadena corta (C6-C12) forman complejos insolubles con globulinas a y p , mientras las globulinas y no precipitan tan fácilmente (Chanutin et al., (1960) Arch. Biochem. Biophys.

89; 218).

Steinbuch & Audran ((1969) Arch. Biochem. Biophys. 134, 279-294) describieron un proceso de purificación para IgG con caprilato (es decir octanoato, un ácido graso c 8 saturado) como agente de precipitación. Las no inmunoglobulinas fueron precipitadas de plasma humano después de dilución con un amortiguador de acetato, para alcanzar un pH final de 4,8. Después de la adición de caprilato bajo agitación vigorosa se obtuvo una solución enriquecida en IgG. La pureza y el rendimiento dependieron de la cantidad de ácido caprílico, el pH, la molaridad del amortiguador y el factor de dilución.

La precipitación extensiva de no inmunoglobulinas fue obtenida mejor a pH ligeramente ácido, pero no inferior a pH 4,5. Se diluyó plasma 2:1 con amortiguador de acetato 0,06 M, pH 4,8, y luego se trató con caprilato 2,5 % en peso, para iniciar la precipitación. Se usó adsorción en lote del sobrenadante sobre celulosa d Ea E, para limpiar las impurezas adicionales de la fracción aislada de IgG. Un trabajo posterior de Steinbuch et al. mostró el uso de ácido caprílico para precipitar la mayoría de las proteínas y lipoproteínas (diferentes a las inmunoglobulinas) presentes en la fracción III de etanol de Cohn (Steinbuch et al., (1973), Prep. Biochem. 3, 363-373).

Se aplicó el mismo procedimiento a plasma humano diluido, usando 2,16 % en peso de caprilato (Habeeb et al., (1984) Prep. Biochem. 14, 1-17). Se siguió la precipitación con ácido caprílico con fraccionamiento sobre celulosa DEAE. La IgG resultante derivada de plasma estaba esencialmente libre de agregados, plasmina y plasminógeno. Adicionalmente, la IgG obtenida tenía baja actividad anticomplemento y era relativamente estable durante el almacenamiento. Por ello, el paso de precipitación con caprilato fue reconocido como muy útil, y fue introducido dentro de muchos procesos modernos para la producción de IgG de plasma.

Adicionalmente a los procedimientos de fraccionamiento con alcohol, PEG y ácido caprílico, se usaron varios procedimientos cromatográficos, en combinación con procedimientos de fraccionamiento, para la purificación de IVIG.

El procedimiento cromatográfico más comúnmente usado es cromatografía de intercambio iónico, que toma ventaja de la distribución de superficie y densidad de carga sobre la proteína y el medio de intercambio iónico. La resina de intercambio iónico presenta una superficie que tiene carga positiva. La densidad de carga es específica para la resina y en general es independiente del pH (dentro del intervalo de trabajo de la resina). Un intercambiador típico de iones se enlazará con proteínas que tienen una carga negativa neta (es decir cuando el pH de la solución está por encima del punto isoeléctrico de la proteína). En realidad, la superficie de una proteína no presenta una carga singular; más bien es un mosaico de cargas positivas y negativas, y áreas neutras. La estructura de la superficie es específica para una proteína dada y será afectada por las condiciones de solución, tales como fuerza iónica y pH. Esta singularidad puede ser explotada para establecer condiciones específicas, en las que las proteínas individuales se enlazarán o liberarán de la resina de intercambio aniónico. Al establecer estas condiciones, pueden separarse efectivamente con elevado rendimiento (> 95%) proteínas con sólo ligeras diferencias en las propiedades de superficie o de carga.

Las mejoras en la estructura de los soportes de resina de cromatografía han hecho de la cromatografía a gran escala, una alternativa práctica a los procedimientos más convencionales de purificación. Las resinas rígidas permiten el procesamiento rápido (<5 horas) de grandes volúmenes, y la elevada densidad del ligando da el incremento de capacidad necesario para procesar grandes volúmenes. Estos factores, acoplados con elevados rendimientos, pureza del producto y simplicidad del proceso, favorecen el uso de cromatografía en la manufactura a gran escala.

En particular, la cromatografía de intercambio aniónico y/o catiónico, algunas veces combinada en el pasos separados o en serie, ha sido usada para la purificación de IgG de plasma o fracciones del mismo (por ejemplo como se describe en el documento WO 99/64462). En la mayoría de los procedimientos, la cromatografía de intercambio aniónico es usada en modo negativo, es decir se usan condiciones para habilitar la unión de las proteínas contaminantes, por ejemplo IgA, IgM, albúmina, fibrinógeno, transferrina, mientras la IgG es recuperada en la fracción o adsorbida.

La combinación de la precipitación con caprilato, seguida por cromatografía de intercambio iónico, para la purificación de IgG fue descrita en muchas publicaciones. Steinbuch & Audran ((1969) Arch Biochem Biophys 134, 279-284) describieron la purificación adicional de IgG después de la precipitación con caprilato con celulosa DEAE. Lebing et al. (US 5.886.157) describieron dos columnas de intercambio aniónico usadas en serie para el retiro de IgM, IgA, albúmina y otras impurezas. Lebing et al. combinaron los efectos mediados por caprilato, es decir la reducción esencial de proteínas no IgG mediante precipitación, usando con ello la partición del virus, y las propiedades de inactivación del virus envuelto, del ácido graso en un paso separado de incubación. Se enfatiza la importancia de la denominada "oscilación de pH" partiendo de la reconstitución de una pasta/precipitado que contiene IgG, a pH 4,2 y la subsiguiente adición de caprilato luego de ajustar el pH a 5,2 como esencial para el procedimiento de enriquecimiento de IgG, requerido así para reducir efectivamente las proteínas no IgG. A continuación se redujeron unas pocas otras impurezas, como IgA y IgM, así como el caprilato, mediante los mencionados pasos de cromatografía de intercambio iónico.

El documento de EEUU No. 5.164.487 se relaciona con el uso de ácido caprílico para manufactura de una preparación de una IgG tolerable de modo intravenoso, libre de agregados, sustancias vasoactivas y enzimas proteolíticas. El procedimiento incluye el contacto del material de partida que contiene IgG, con ácido caprílico 0,4% a 1,5%, antes de la purificación cromatográfica con una matriz de intercambio iónico o hidrófoba.

Debido a las continuas mejoras en los procesos de purificación, ha habido una evolución en los productos de IgG a lo largo de los años. Como se mencionó anteriormente, los primeros productos de IgG fueron adecuados solamente para uso intramuscular, dado que causaban demasiados eventos adversos cuando eran administrados de modo intravenoso. La primera generación de un producto de IgG adecuado para uso intravenoso (IVIG) fue preparada mediante escisión con pepsina del material de partida (fracción II de Cohn), en la que el propósito de la escisión era el retiro de agregados de inmunoglobulina, que causaban serios eventos adversos tales como activación del complemento y hacían imposible la administración de los primeros productos por vía intravenosa. En el proceso no se incluyeron pasos de cromatografía en columna. El producto tuvo que ser secado por congelación, para que permaneciera estable por un periodo razonable de tiempo y fuera disuelto inmediatamente antes del uso.

Una segunda generación de IVIG en base a moléculas no escindidas y no modificadas de inmunoglobulina, con baja actividad anticomplemento y mayor estabilidad, fue introducida a mediados de los años 80, pero todavía en la forma de un producto seco por congelación. Esta IVIG fue purificada mediante procesos que incluyen varios pasos de cromatografía. Se evitó la escisión con pepsina, los agregados y partícula fueron retirados mediante precipitación, y se logró purificación adicional mediante procedimientos de intercambio iónico en columna de cromatografía.

Para la tercera generación de IVIG, en los procesos se incluyeron pasos de inactivación de virus dedicado. Mientras en particular los pasos de precipitación en los procesos de purificación retiraron muchos virus, algunos pacientes tratados con productos de sangre sin embargo fueron infectados con VIH, necesitando además la adopción de pasos dedicados, para inactivar y retirar virus de estos productos.

La refinación adicional de los procesos continuó, para lograr mejor calidad y pureza de la proteína, con objeto de habilitar la disponibilidad de productos líquidos estables, y mejorar la seguridad y tolerabilidad de estos productos para los pacientes. Adicionalmente, se desarrollaron formulaciones subcutáneas.

Los productos de IgG son usados actualmente en varias aplicaciones clínicas. Aparte del uso tradicional para el tratamiento de inmunodeficiencias primarias o adquiridas, y enfermedades infecciosas, se ha mostrado que estos productos son efectivos también en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y ciertos desórdenes neurológicos tales como CIDP. También ha habido un marcado incremento en el número de estudios enfocados en los usos terapéuticos adicionales de los productos de IgG. Así, la demanda por productos de IgG ha estado aumentando. Los productos de IgG son ahora los productos de plasma con la demanda más grande en el mercado mundial; en 2008 el mercado alcanzó aproximadamente 82 toneladas métricas (incluyendo 37 toneladas en los EEUU, 21 toneladas en Europa y 17 toneladas en Asia), con una tendencia para crecer a una tasa de aproximadamente 7% al año (la demanda predicha en 2013 es 110 toneladas métricas) (The Worldwide Plasma Fractions Market 2008. The Marketing Research Bureau, Inc. edición de abril de 2010). Dado que el plasma humano es un recurso valioso, limitado, los procesos para purificación de IgG de plasma, requieren mejora adicional para lograr mayores rendimientos frente a los posibles actualmente, mientras no se comprometa la calidad del producto. Los procesos actuales tienen un promedio de rendimiento de 3,7 a 4,2 g de IgG por litro de plasma, lo cual representa solamente hasta 55% del IgG presente en el plasma.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un proceso modificado para la purificación de IgG de plasma u otras soluciones que comprenden IgG y otras proteínas, mejorando el rendimiento de IgG por litro de solución de partida (preferentemente plasma), sin comprometer la calidad del producto.

Un primer aspecto de la invención es un procedimiento para incrementar el rendimiento de IgG en un proceso de purificación de un intermedio de producción, que comprende (1) fraccionamiento con ácido octanoico, (2) incubación a pH bajo, (3) desplazamiento de pH y filtración en profundidad, (4) cromatografía de intercambio aniónico, (5) filtración y concentración del virus mediante ultra/diafiltración, en el que el paso de desplazamiento de pH y filtración profunda (3) es modificado, para comprender

(a) suministro de una solución ácida que comprende IgG, otras inmunoglobulinas y/u otros contaminantes de proteína con un pH entre 3,5 y 5,2 y una concentración total de proteína de por lo menos 10g/l;

(b) ajuste de la solución a un pH de 5,2 a 6,2, mientras se mantiene una conductividad por debajo de 1,5 mS/cm;

(c) incubación de la solución durante por lo menos 15 minutos; y

(d) retiro de cualquier precipitado

en el que el ajuste de pH es realizada en el paso (b), mediante adición de por lo menos un compuesto de amina con varios hidroxilos, con o sin un grupo carboxilo.

Preferentemente, el intermedio de producción comprende anticuerpos derivados de plasma, más preferentemente, el intermedio de producción obtenido mediante fraccionamiento con etanol, de plasma humano o plasma humano crioempobrecido. En otra realización preferida de la invención, el intermedio de producción es un sobrenadante de una precipitación con ácido octanoico.

Típicamente, la solución en el paso (a) ha sido clarificada mediante ultradiafiltración. Preferentemente, el pH de la solución en el paso (a) es 3,9 a 5,0, más preferentemente 3,9 a 4,6, incluso más preferentemente de 3,9 a 4,3, Preferentemente, la concentración de proteína en el paso (a) está entre 10 y 50 g/l, más preferentemente entre 20 y 25 g/l.

En el paso (b), el pH es ajustado a un pH de 5,2 a 6,2, preferentemente a un pH de 5,6 a 6,0, más preferentemente a un pH de 5,8 a 6,0, Preferentemente, el ajuste de pH en el paso (b) es realizado mediante adición de por lo menos un compuesto de amina con varios hidroxilos. Preferentemente, el ajuste de pH es realizado con Tris a una concentración por encima de 250 mM, más preferentemente por encima de 500mM, incluso más preferentemente por encima de 750 mM, con máxima preferencia alrededor de 1M. Preferentemente, el ajuste de pH es realizado sobre un período de tiempo de por lo menos 15 minutos. La conductividad en el paso (b) está por debajo de 1,5 mS/cm, preferentemente por debajo de 1,2 mS/cm, más preferentemente por debajo de 1,0 mS/cm, incluso más preferentemente por debajo de 0,8 mS/cm, con máxima preferencia entre 0,2 y 0,5 mS/cm. Con máxima preferencia, el pH en el paso (b) es ajustado a pH de 5,6 a 6,0, y la conductividad está entre 0,2 y 0,5 mS/cm.

El tiempo de incubación en el paso (c) es hasta 72 horas, hasta 48 horas, hasta 24 horas, preferentemente hasta 12 horas, más preferentemente hasta 6 horas, con máxima preferencia entre 15 minutos y 90 minutos. Preferentemente, la incubación en el paso (c) es llevada a cabo a temperatura ambiente.

El precipitado en el paso (d) es preferentemente retirado mediante filtración profunda. Son posibles también otros procedimientos para retirar el precipitado, por ejemplo otros procedimientos de filtración o centrifugación.

Después del paso (d), pueden llevarse a cabo pasos adicionales de purificación, tales como procedimientos por cromatografía, por ejemplo cromatografía de intercambio iónico. Preferentemente, se lleva a cabo un paso de cromatografía de intercambio iónico, bajo condiciones que permiten que los contaminantes, pero no IgG, se enlacen a la resina. Preferentemente, la cromatografía de intercambio iónico es una cromatografía de intercambio aniónico. Preferentemente, la cromatografía de intercambio iónico es llevada a cabo sin ajuste adicional de la conductividad de la solución.

El procedimiento comprenderá además un paso de inactivación de virus. Preferentemente, el paso de inactivación de virus es un tratamiento a pH bajo. Preferentemente, el tratamiento a pH bajo para inactivación del virus, es llevado a cabo antes del paso (a).

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para el incremento del rendimiento de IgG en un proceso de purificación de una solución de partida, preferentemente un intermedio de producción de un proceso actual, que comprende anticuerpos IgG, otras inmunoglobulinas y/u otros contaminantes de proteína. El procedimiento comprende los pasos de:

(a) Suministro de una solución ácida que comprende IgG, otras inmunoglobulinas y/u otros contaminantes de proteína, con un pH de entre 3,5 a 5,2, preferentemente 4,0 a 5,0, más preferentemente 4,6 a 4,8, y una concentración total de proteína de por lo menos 10 g/l, preferentemente aproximadamente 10 a 50 g/l, más preferentemente aproximadamente 10 a 40 g/l, incluso más preferentemente 15 a 30 g/l, con máxima preferencia 20-25 g/l.

La composición que comprende IgG puede ser cualquier material, preferentemente es un fluido biológico que contiene IgG. Preferentemente, la composición que comprende IgG esto se deriva de sangre, plasma o suero. sin embargo, en la invención pueden usarse también otros materiales de partida que contienen IgG. Por ejemplo, la IgG puede ser enriquecida también a partir de otros fluidos biológicos, tales como sobrenadante de cultivo celular, usando el procedimiento de la invención.

La composición que comprende IgG puede ser una solución de una pasta o precipitado, preferentemente una fracción de un proceso de fraccionamiento con etanol frío, tales como (FII+III), (F I+II+II) o Fill como se describe en Cohn/Oncley et. al. o modificaciones del mismo, o precipitado A (PPT-A), precipitado B (PPT-B) y precipitado G (PPT-G) como se describe en el proceso de Kistlery Nitschman o modificaciones del mismo.

Sin embargo, preferentemente la solución que comprende IgG es una solución de un precipitado de intermedio de producción o una solución de intermedio de producción, obtenida durante la purificación de IgG, usando precipitación con ácido octanoico, con polietilen glicol y/o con sulfato de amonio, partiendo de una fracción de etanol como se describió anteriormente, o cualquier intermedio de producción que contiene IgG. Cuando se parte de fracciones de plasma, la precipitación con ácido octanoico es un procedimiento preferido para la producción de un intermedio de producción enriquecido en IgG. El ácido octanoico puede ser añadido a una solución de intermedio de producción, por ejemplo a un precipitado disuelto en etanol, a una concentración final de alrededor de 5% (p/p), como se describe por Steinbuch &Audran ((1969) Arch. Biochem. Biophys. 134, 279-294). Pueden usarse también mayores concentraciones de ácido octanoico. El ácido octanoico debería ser añadido lentamente, a temperatura ambiente bajo condiciones definidas tales como pH, conductividad y tiempo de incubación. Si se usa una concentración mayor de ácido octanoico, puede adicionalmente añadirse fosfato de calcio, seguido por un periodo adicional de incubación. Se forma un precipitado de proteínas, lípidos y caprilato contaminantes, mientras la mayoría de las inmunoglobulinas, en particular la IgG, permanece en solución. Las proteínas, lípidos y caprilato precipitados pueden ser retirados por filtración a temperatura ambiente (por ejemplo, entre 18 °C y 26 °C). Por ejemplo, puede usarse filtración profunda en presencia de ayuda de filtro (por ejemplo usando tierra de diatomáceas, pero pueden usarse otras ayudas de filtro). La solución puede ser filtrada usando filtración de flujo normal. Sin embargo, también se conciben otros procedimientos para el retiro del precipitado y clarificación de la solución. La solución clarificada puede ser sometida luego a dia-/ultrafiltración para ajustar pH, conductividad y concentración de proteína.

Preferentemente la solución de partida es una solución de intermedio de producción, ya enriquecida con inmunoglobulinas y clarificada mediante ultra/diafiltración durante un proceso para la purificación de IgG de plasma o fracciones de plasma en condiciones ácidas, como se describió anteriormente.

Si como material de partida se usa un precipitado, la IgG puede ser extraída del precipitado (fracción de proceso o fracción lateral) mediante resuspensión del precipitado en un amortiguador por varias horas. Preferentemente, la solubilización es llevada a cabo usando una solución con una conductividad entre 1 y 15 mS/cm, más preferentemente entre 5 y 15 mS/cm. El pH de la solución usada para la solubilización está entre 3,5 y 6, preferentemente entre 4,0 y 5,5, más preferentemente entre 4,5 y 5,2, con máxima preferencia alrededor de 4,8. Por ejemplo, la solubilización puede ser llevada a cabo con acetato 0,2 M a pH 4,8. Sin embargo, la persona experta será capaz de identificar amortiguadores más adecuados. La relación de amortiguador y precipitado puede ser aproximadamente 1:5 a 1:10, pero también pueden usarse otras relaciones. La solubilización es llevada a cabo durante por lo menos 2 horas, preferentemente durante por lo menos 4 horas bajo agitación fuerte, usando un mezclador adecuado.

En el siguiente paso del procedimiento de la invención, se ajusta adicionalmente el pH de la solución del paso (a), a aproximadamente 5,2 a 6,2, preferentemente 5,4 a 6,0, más preferentemente 5,6 a 6,0, incluso más preferentemente 5,7 a 5,9, con máxima preferencia alrededor de 5,8. La conductividad de esta solución, independiente del pH, está por debajo de 1,5 mS/cm, por ejemplo entre 0,2 y 1,5 mS/cm, preferentemente por debajo de 1,0 mS/cm, por ejemplo entre 0,2 y 1,0 mS/cm, incluso más preferentemente por debajo de 0,8 mS/cm, por ejemplo entre 0,2 y 0,8 mS/cm, o incluso por debajo de 0,5 mS/cm, con máxima preferencia entre 0,2 a 0,5 mS/cm.

Preferentemente el reactivo usado para el ajuste del pH y conductividad es o comprende un compuesto de amina, preferentemente un compuesto de amina con varios hidroxilos tal como 2-amino-1-etanol (C2H7NO), bis(hidroxietil)-amina (C4H11NO2), tris(2-hidroxietil) amina (C6H15NO3), preferentemente (bis(2-hidroxietil)-amino-tris(hidroximetil)-metano) (C8H19NO5), N,N bis(2-hidroxietil) glicina (C6H13NO4), 1,3-bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano (C11H26N2O6), con máxima preferencia 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (C4H11NO3) (base Tris).

Se ha hallado de manera ventajosa que el uso de un compuesto de amina con varios hidroxilos con o sin grupos carboxilo conduce a una baja pérdida de IgG durante el segundo ajuste de pH (estabilizando la IgG). Los contaminantes de proteína son precipitados, mientras la conductividad permanece constante en el valor deseado, por ejemplo 0,2 a 0,5 mS/cm.

En el paso (c), esta solución que comprende IgG es luego incubada, bajo mezcla vigorosa usando un mezclador adecuado, por al menos 15 minutos. La persona experta será capaz de ajustar el tiempo requerido para este paso, dependiendo del procedimiento usado para la mezcla. El tiempo de incubación puede ser hasta 72 h, preferentemente hasta 48 h, más preferentemente entre 12 y 24 h, con máxima preferencia entre 15 min y 12 h. Sin embargo, pueden usarse también otros tiempos de incubación; la persona experta estará consciente de que para tiempos de incubación más largos, puede ser necesario usar temperaturas más bajas, por ejemplo 4-8 °C, mientras para tiempos de incubación más cortos, puede elegirse temperatura ambiente.

En el paso (d), se retiran las proteínas precipitadas formadas durante el desplazamiento de pH del paso (c), por ejemplo mediante filtración profunda a temperatura ambiente (por ejemplo, 18-26 °C). La filtración profunda requiere la adición de ayuda de filtro, como sabe la persona experta. La solución puede ser filtrada usando filtración de flujo normal. Sin embargo, también pueden usarse otros procedimientos para el retiro de proteínas precipitadas, por ejemplo otros procedimientos de filtración, centrifugación. La persona experta es bien consciente de otros procedimientos adecuados para el retiro de precipitados. Este paso da como resultado una significativa reducción de IgM y IgA.

La solución clarificada puede luego ser procesada para purificar adicionalmente IgG. Una opción preferida es someter esta solución a cromatografía de intercambio iónico. Preferentemente, la solución es cargada en un intercambiador de iones bajo condiciones que permiten enlazar las IgA, IgM residuales y otros contaminantes, mientras la IgG permanece en el flujo que pasa. Preferentemente, la solución clarificada puede ser cargada directamente en la columna. De manera ventajosa, no es necesario ajustar el pH o conductividad.

El intercambiador de iones usado en este paso puede ser un intercambiador fuerte de iones o un intercambiador débil de iones. Preferentemente, el intercambiador de iones comprende un ligando de intercambio aniónico, tal como un amonio cuaternario, aminoetil, dietilaminoetil, trimetilaminoetil, o dimetilaminoetil cuaternarios. Más preferentemente, el intercambiador de iones es seleccionado de entre DEAE Sepharose FF, Q-Sepharose (HP y FF), ANX Sepharose FF (con baja y alta sustitución), Capto Q, Capto Q XP, Capto DEAE, Source 30 Q y 15 Q, con máxima preferencia Fractogel DEAE y MPHQ.

Como se mencionó anteriormente, la carga es ejecutada preferentemente bajo condiciones que permiten que las IgA, IgM residuales y otros contaminantes se enlacen con el intercambiador de iones. Típicamente, el intercambiador de iones es llevado al equilibrio antes del uso, frecuentemente con un sistema de dos amortiguadores (amortiguadores 1 y 2 de equilibrio), por lo cual el amortiguador 2 de equilibrio es usado antes de la carga. Los amortiguadores de equilibrio son un sistema amortiguador común, adaptado al intercambiador de iones usado. la conductividad del amortiguador 1 de equilibrio está entre 10 a 20 mS/cm, más preferentemente entre 11 a 15 mS/cm. El pH está entre 7 y 8, más preferentemente entre 7,1 y 7,5. Los ejemplos de amortiguadores adecuados son amortiguadores de fosfato o acetato o una combinación de ellos. Preferentemente, el amortiguador es una mezcla de fosfatos (mono- y dibásico).

Los pasos adicionales que pueden ser incluidos en el proceso, son los pasos de inactivación/retiro de virus, tales como nanofiltración, tratamiento con solvente/detergente, tratamiento a bajo pH o pasteurización. La persona experta estará bien consciente de los procedimientos adecuados de inactivación y retiro de virus. Estos pasos pueden ser incluidos en cualquier etapa adecuada en el proceso.

Típicamente, pueden añadirse excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como un estabilizante.

Un ejemplo particularmente preferido de un proceso en el cual el procedimiento de la invención ha sido implementado exitosamente, es un proceso que comprende el fraccionamiento con etanol frío y usando Precipitado A, un intermedio de producción del fraccionamiento con base de acuerdo con Kistler y Nitschmann, o Precipitado II+NI (PPT II+III) obtenido de acuerdo con Cohn et al y/o Precipitado I+II+III obtenido de acuerdo con las modificaciones de los procesos de Kistler-Cohn.

Los intermedios de producción son procesados esencialmente mediante los siguientes pasos:

(1) fraccionamiento con ácido octanoico (OA),

(2) incubación a bajo pH,

(3) desplazamiento de pH y filtración profunda,

(4) cromatografía de intercambio aniónico,

(5) filtración de virus, y

(6) concentración por ultra/diafiltración.

La modificación de proceso de acuerdo con la invención comprende uno o más de

(i) prepurificación mediante el cambio de pH (desplazamiento de pH) antes de la filtración profunda. Este paso es ejecutado a conductividad muy baja, con objeto de precipitar una gran parte de IgA y IgM y minimizar la coprecipitación de la IgG antes del paso de cromatografía de pulimento;

(ii) modificaciones del sistema amortiguador para el paso de cromatografía de intercambio aniónico.

Ventajosamente, el desplazamiento de pH es llevado a cabo usando (preferentemente) un amortiguador Tris, que no incrementa la conductividad de la solución; el filtrado resultante después de la filtración profunda puede ser así cargado directamente en la columna de intercambio aniónico, que ha sido llevada al equilibrio apropiadamente, por ejemplo con un amortiguador de fosfato. La baja conductividad es importante para reducir la precipitación de IgG en este paso. Usando ambas modificaciones en el proceso, aumenta el rendimiento de IgG en por lo menos 5%, comparado con el mismo proceso sin aquellas modificaciones.

Ejemplos

La invención será ahora ejemplificada. Se pretende que los ejemplos ilustren, pero no limiten la invención. Se hace referencia a las siguientes figuras:

Figura 1: diagrama de barras que muestra el efecto del ajuste de pH en el paso (b) sobre el rendimiento de proteína (barras grises claras) y rendimiento de IgG (barras negras).

Figura 2: diagrama de barras que muestra el efecto de la concentración de Tris usado para el desplazamiento de pH a pH 5,8 sobre el rendimiento de IgG (barras negras) o pérdida (barras grises) para 3 materiales de partida: (a) material de partida NA PPT de plasma recuperado, (b) material de partida NA PPT de plasma fuente, (c) PPT II+NI de plasma fuente.

Ejemplo 1

(a) Técnica previa de acuerdo con Steinbuch & Audran ((1969) Arch. Biochem. Biophys. 134, 279-294).

Se resuspendió una parte de precipitado NA congelado (PPT) en una cantidad adecuada de amortiguador de acetato de sodio, se agitó por varias horas la suspensión de NA PPT, hasta que la mayoría de la IgG se disolvió a temperatura ambiente, mientras se mantenía el pH constante a 4,8.

Se ejecutó la eliminación de lípidos mediante adición de ácido octanoico (OA) a la suspensión y una incubación subsiguiente por 240 minutos. Se añadió luego fosfato de calcio y se agitó la suspensión por otros 60 a 90 minutos. Mediante filtración se retiraron las proteínas, lípidos o lipoproteínas complejas precipitados y otros contaminantes precipitados bajo estas condiciones.

Se sometió al filtrado de OA a ultrafiltración para alcanzar una concentración de proteína de 3%, seguido por diafiltración contra Agua para Inyección (WFI). Durante la diafiltración, con HCI 0,2 mol/l se desplazó continuamente el pH hacia pH 4,1. Después de la diafiltración, se diluyó la solución de proteína con WFI a 20 g/l de proteína, se ajustó el pH a pH 4,0 ±0,1 y se añadió 23,5 mg/kg de polisorbato 80 (P80). Después de la filtración y un lavado postfiltración, se ejecutó una incubación a pH 4,0 a 37 °C por varias horas a una concentración de proteína de aproximadamente 20 g/l. El material incubado a pH 4 fue luego enfriado a temperatura ambiente.

Se incrementó el pH a pH 6,5 con NaOH, seguido por incubación por aproximadamente 90 min. El ajuste de pH e incubación retiraron por precipitación una parte significativa de las IgA y IgM. Las impurezas precipitadas fueron retiradas por filtración. Después del ajuste de la conductividad, se filtró en línea la solución clara y se aplicó a una columna, la cual estaba acondicionada y llevada al equilibrio con acetato de sodio 10 mM, pH 6,5, llena con un intercambiador fuerte de iones (Macroprep High Performance; MPHQ). Bajo las condiciones dadas, las IgA y IgM residuales así como otras impurezas de proteínas se enlazaron a la resina de intercambio aniónico (AIEX), mientras la IgG fue hallada en el flujo que pasó y las fracciones de lavado. Durante la recolección, el pH del flujo que pasó la AIEX y el lavado que contenía IgG, fue disminuido y mantenido a pH 4,8 ± 0,1.

El retiro del virus fue logrado mediante una prefiltración de 0,1 |jm, seguida por nanofiltración en la línea. El filtrado de virus fue concentrado a 2 - 3% de proteína, usando una membrana de polietersulfona, y se realizó diafiltración contra WFI. Durante la diafiltración, se desplazó continuamente el pH hacia pH 4,1. Luego se concentró la solución hasta un contenido de proteína de 105 - 135 g/l. Se diluyó la sustancia fármaco a 100 g de IgG por litro, se estabilizó con 250 mmol/l de L-prolina (concentración final) y se mantuvo el pH a 4,80 ± 0,10. Al granel formulado se le retiraron por filtración las partículas a través de un filtro de membrana de 0,2 jm .

(b) proceso modificado incluyendo el desplazamiento de pH optimización del sistema amortiguador de cromatografía

Se modificó el proceso descrito en (a) mediante la implementación del paso de desplazamiento de pH y optimización del sistema amortiguador para la cromatografía, de acuerdo con esta invención.

Se procesó el NA PPT como se describió anteriormente, incluyendo la precipitación con OA e inactivación del virus a bajo pH.

El pH de la solución incubada a bajo pH de 4 fue luego ajustado a pH 5,8 usando amortiguador Tris 1M. El ajuste de pH fue llevado a cabo en un período de tiempo de 90 min, seguido por incubación por 90 min a temperatura ambiente. Luego, se retiró por filtración el precipitado formado. El pH y conductividad permanecieron constantes como se describe en el paso (b) de la reivindicación 1, por ejemplo a un pH de alrededor de 5,8 y conductividad alrededor de 0,2-0,5 mS/cm.

Después del acondicionamiento, usando un amortiguador de fosfato (fosfato 0,12 M, pH 7,3 ± 0,2), y alcanzando el equilibrio, usando (fosfato 5 mM acetato 10 mM, pH 6,0 ± 0,1), la columna de cromatografía llena con un intercambiador fuerte de iones (Macroprep High Performance; MPHQ) fue cargada con <180 g de proteína por litro de resina a un flujo lineal de 70 - 130 cm/h. bajo las condiciones dadas, las IgA y IgM residuales así como otras impurezas de proteína se enlazaron a la resina de intercambio aniónico (AIEX), mientras la IgG fue encontrada en el flujo que pasa y las fracciones de lavado. Durante la recolección, el pH del flujo que pasa la AIEX y el lavado que contiene IgG, fue disminuido y mantenido a pH 4,8 ±0,1.

Los siguientes pasos fueron llevados a cabo como se describió en (a).

Comparación de rendimiento (proceso actual versus modificado)

En las Tablas 1 a 3 se muestra la comparación de los dos procesos respecto al rendimiento de proteína del mismo intermedio de producción de partida. El rendimiento de IgG después de la incubación a bajo pH (pH 4) fue ajustado como 100%.

Tabla 1: Comparación entre los procesos de la técnica previa y modificado -material NA de partida generado a partir de plasma recuperado

Tabla 2: Comparación entre los procesos de la técnica previa y modificado - material NA de partida generado a partir de plasma fuente

Tabla 3: Comparación entre la técnica previa y proceso modificado - material PPTII III de partida generado a partir de plasma fuente

Se mostró que no ocurrieron cambios significativos en la pureza del producto, como resultado de los cambios en el proceso e incrementos en el rendimiento.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra el impacto de diferentes ajustes de pH usando amortiguador Tris, sobre el rendimiento de IgG, comparado con el desplazamiento actual de pH de 6,5.

Partiendo de PPT-NA como se describe en el Ejemplo 1, se generó una solución incubada a bajo pH de 4, como se describió anteriormente. Se tomaron ocho porciones de 1 kg cada una y se ajustaron a pH de 5,2; 5,4; 5,6; 5,8; 6,0; 6,2; 6,4 usando amortiguador Tris 1M. El pH de la última porción fue ajustado usando NaOH 0,2 M de acuerdo con el proceso actual. El ajuste de pH fue llevado a cabo en un período de tiempo de 90 min seguido por incubación de 90 min a temperatura ambiente, como se describió anteriormente. Luego se retiró mediante filtración el precipitado formado. Se cargó luego el filtrado en la columna AIEX como se describe en el Ejemplo 1(b). Se compararon la proteína y rendimiento de IgG de las diferentes soluciones cargadas. En la Figura 1 se muestran los resultados. El impacto del amortiguador Tris 1M a diferentes desplazamientos de pH, comparado con la NaOH 0,2 M, como se usa para el proceso de la técnica previa según se describe en el Ejemplo 1(a), sobre el rendimiento de IgG, indica que con el incremento del desplazamiento de pH (pH: 5,2 - 6,2) usando amortiguador Tris 1M, se minimiza la pérdida de rendimiento de IgG.

Ejemplo 3

Este ejemplo muestra el impacto de la concentración del amortiguador Tris usado para el desplazamiento deseado de pH a 5,8. Partiendo de la solución incubada a bajo pH 4, se desplazó el pH de pH 4 a 5,8 usando amortiguador Tris 1M; 0,5M y 0,25M respectivamente.

En la Figura 2 se muestran los resultados. Independientemente del material de partida (PPT-II+MI fuente, NA, o NA recuperado), la pérdida de IgG disminuyó con el incremento de la molaridad del amortiguador Tris usado.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra el impacto de diferentes reactivos (que comprenden un compuesto de amina, preferentemente un compuesto de amina con varios hidroxilos) usado para ajustar el pH en el paso (b), sobre el rendimiento de IgG.

Se usaron los siguientes reactivos: 2-amino-1-etanol (C2H7NO), bis(hidroxietil)-amina (C4H11NO2), tris(2-hidroxietil) amina (C6H15NO3), preferentemente (bis(2-hidroxietil)-amino-tris(hidroximetil)-metano) (C8H19NO5), N,N bis(2-hidroxietil) glicina (C6H13NO4), 1,3-bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano (C11H26N2O6), 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol (C4H11NO3) (base Tris), así como combinaciones de estos reactivos.

Partiendo de PPT-NA como se describió en el ejemplo 1, se generó una solución incubada a bajo pH de 4, como se describió anteriormente. Se tomaron ocho porciones de 1 kg cada una y se ajustaron a pH de 5,75 a 5,85 usando soluciones 1M de los reactivos descritos anteriormente. El pH de la última porción fue ajustado usando NaOH 0,2 M, de acuerdo con el proceso actual. El ajuste de pH fue llevado a cabo en un período de tiempo de 90 min, seguido por incubación de 90 min a temperatura ambiente, como se describió anteriormente. El precipitado formado fue luego retirado por filtración. Se compararon los rendimientos de IgG de los diferentes filtrados.

En la Tabla 4 se muestran los resultados. Los resultados muestran el impacto del uso de diferentes reactivos (como soluciones 1M) para el desplazamiento de pH en el paso (b), comparado con el uso de NaOH 0,2 M como se usa en los procesos de la técnica previa, sobre el rendimiento de IgG. Los resultados indican que con diferentes compuestos de amina, el rendimiento de IgG aumenta, comparado con el proceso de la técnica previa. Es particularmente ventajoso el uso de compuestos de amina con varios hidroxilos.

Tabla 4: Comparación entre la técnica previa y proceso modificado usando diferentes reactivos de neutralización, en comparación con el proceso de la técnica previa - material NA de partida generado a partir de plasma fuente

(continuación)

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para incrementar el rendimiento de IgG en un proceso de purificación de un intermedio de producción, que comprende (1) fraccionamiento con ácido octanoico, (2) incubación a bajo pH, (3) desplazamiento de pH y filtración profunda, (4) cromatografía de intercambio aniónico, (5) filtración de virus y concentración mediante ultra/diafiltración, en el que el paso (3) de desplazamiento de pH y filtración profunda es modificado para que comprenda

(a) suministro de una solución ácida que comprende IgG, otras inmunoglobulinas y/u otros contaminantes de proteína con un pH entre 3,5 a 5,2 y una concentración total de proteína de por lo menos 10g/I;

(b) ajuste de la solución a un pH de 5,2 a 6,2 mientras se mantiene una conductividad por debajo de 1,5 mS/cm; (c) incubación de la solución por al menos 15 minutos; y

(d) retirada de cualquier precipitado

en el que el ajuste de pH en el paso (b) se realiza mediante adición de por lo menos un compuesto de amina con varios hidroxilos con o sin un grupo carboxilo.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el intermedio de producción comprende un precipitado del fraccionamiento con etanol frío.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el intermedio de producción es obtenido mediante fraccionamiento con etanol de plasma humano o plasma humano crioempobrecido.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el intermedio de producción es un sobrenadante de una precipitación con ácido octanoico.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la solución en el paso (a) ha sido clarificada mediante ultradiafiltración.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el pH de la solución en el paso (a) es 3,9 a 5,0, preferentemente 3,9 a 4,6, con máxima preferencia 3,9 a 4,3.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la concentración de proteína en el paso (a) está entre 10 y 50 g/l, preferentemente entre 20 y 25 g/l.

8. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el pH en el paso (b) es ajustado a pH 5,6 a 6,0, preferentemente 5,8 a 6,0.

9. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la conductividad en el paso (b) es ajustada con Tris a una concentración por encima de 250 mM, preferentemente por encima de 500mM, más preferentemente por encima de 750 mM, con máxima preferencia alrededor de 1M.

10. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la conductividad en el paso (b) está por debajo de 1,0 mS/cm, preferentemente por debajo de 0,8 mS/cm, más preferentemente entre 0,2 y 0,5 mS/cm.

11. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el pH en el paso (b) es ajustado a pH de 5,6 a 6,0, y la conductividad está entre 0,2 y 0,5 mS/cm.

12. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el tiempo de incubación en el paso (c) es hasta 72 horas, hasta 48 horas, hasta 24 horas, preferentemente hasta 12 horas, más preferentemente hasta 6 horas, con máxima preferencia entre 15 minutos y 90 minutos.

13. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la incubación en el paso (c) es llevada a cabo a temperatura ambiente.

14. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el precipitado en el paso (d) es retirado mediante filtración profunda.

15. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que después del paso (d), se lleva a cabo un paso de cromatografía de intercambio iónico, bajo condiciones que permiten que los contaminantes, pero no la IgG, se enlacen a la resina.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la cromatografía de intercambio iónico es llevada a cabo sin ajuste adicional a la conductividad de la solución.

17. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, que comprende además un paso de inactivación del virus.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el paso de inactivación del virus es un tratamiento a bajo pH.

19. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que el tratamiento a bajo pH es llevado a cabo antes del paso (a).