JP6474798B2

JP6474798B2 - 方法

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Publication number: JP6474798B2
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Inventors: メンヤウィイブラヒム・エル; ドリーン・ジーグムント
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Priority date: 2013-07-01
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Description

本発明は、ＩｇＧを精製するための改良された方法に関する。特に、該改良された方法は、従来の方法よりも高収量を実現する。

周知のとおり、免疫グロブリンは哺乳動物の免疫系において重要な役割を果たす。免疫グロブリンは、血漿、リンパ液および他の身体分泌物中に認められるＢリンパ球によって産生される。ヒトにおいて、免疫グロブリンは血漿タンパク質の約２０％を占める。免疫グロブリンの基本単位は、ジスルフィド結合で連結した２本の重鎖および２本の軽鎖を含むヘテロ四量体である。これらの鎖のそれぞれは、抗原結合部位を構成する可変領域をＮ末端に有し、免疫グロブリンのエフェクター機能を司る定常領域を有す。

免疫グロブリンには、異なる生化学的および生理学的特性を持つ主要な５種類のクラスがある：ＩｇＧ（γ重鎖）、ＩｇＡ（α）、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）およびＩｇＥ（ε）。ヒトＩｇＧは血漿中で最も豊富な免疫グロブリンであり、ＩｇＡは唾液、涙液ならびに気道および腸管の粘液のような外分泌物中の主要な抗体クラスである。ＩｇＭは、通常免疫グロブリンの基本単位の五量体として存在するヒトの循環器系内で抜きん出て物理的に最大の抗体であり、感染過程の早期に出現する。

当初、ヒト血漿由来のＩｇＧ製剤は様々な感染症の予防および治療に問題なく使用されていた。初期の製品は、比較的精製度の低い方法（ｃｒｕｄｅｐｒｏｃｅｓｓ）（エタノール分画）で製造されており、ある程度の不純物や凝集体を含有するため筋肉内投与のみ可能であった。精製方法の改良によって、純度および品質が改善したため、静脈内投与に適したＩｇＧ製剤（ＩＶＩＧと呼ばれる）が製造されるようになり、さらに皮下投与用の製剤（ＳＣＩＧと呼ばれる）も開発された。

血漿からＩｇＧを精製するために一般的に用いられる工業的方法は、Ｃｏｈｎが考案した原法（非特許文献１、２）に基づく方法であり、これは１９４０年代まで遡るもので、低温下での血漿タンパク質の分画沈殿によって行われる。イオン強度、ｐＨおよび温度を管理した条件下でエタノールを漸進的に添加した（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅａｄｄｉｔｉｏｎ）後、前記血漿分画法によって治療上有用な血漿タンパク質（凝固因子、アルブミン、免疫グロブリン、アンチトロンビンＩＩＩ）の富化または濃縮した画分が得られる。Ｃｏｈｎ分画法を適用した場合、ＩｇＧは画分ＩＩ＋ＩＩＩ、Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたは改変したエタノール分画法（非特許文献３）を開発したＫｉｓｔｌｅｒとＮｉｔｓｃｈｍａｎｎの方法で得られた同等の沈殿物Ａ（ＮＡ沈殿物と呼ばれる）から得られる。

１９６０年代、短鎖脂肪酸（Ｃ６〜Ｃ１２）はα−およびβ−グロブリンと不溶性の複合体を形成するが、γ−グロブリンはそれ程容易に沈殿しないことが示された（非特許文献４）。

ＳｔｅｉｎｂｕｃｈおよびＡｕｄｒａｎ（非特許文献５）は、沈殿剤としてカプリル酸塩（すなわちオクタン酸塩、Ｃ８飽和脂肪酸）を用いたＩｇＧ精製方法に関して記述している。ヒト血漿を酢酸緩衝液で希釈して最終的にｐＨ４．８とすると、免疫グロブリン以外の物質（Ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）が沈殿した。激しく撹拌しながらカプリル酸塩を添加すると、ＩｇＧ富化液が得られた。この純度および収量は、カプリル酸の量、ｐＨ、緩衝液のモル濃度および希釈係数にかかっている。

免疫グロブリン以外の大量の沈殿物は、ｐＨ４．５を下回らないわずかに酸性のｐＨで最もよく得られた。血漿とｐＨ４．８の０．０６Ｍ酢酸緩衝液を２：１で希釈した後、沈殿を開始させるため２．５重量％カプリル酸塩で処理した。この上清をＤＥＡＥセルロースによるバッチ吸着を行うことで、分離したＩｇＧ画分からさらに不純物を除去した。後にＳｔｅｉｎｂｕｃｈ他が行った研究では、Ｃｏｈｎのエタノール画分ＩＩＩに存在する大部分のタンパク質およびリポタンパク質（免疫グロブリン以外）を沈殿させるため、カプリル酸を用いることが示されている（非特許文献６）。

同じ方法を、２．１６重量％カプリル酸塩を用いて希釈したヒト血漿に適用した。（非特許文献７）。Ｈａｂｅｅｂ他は、カプリル酸を用いた沈殿に続き、ＤＥＡＥセルロースによる分画を行った。得られた血漿由来ＩｇＧは、基本的に凝集体、プラスミンおよびプラスミノーゲンを含まない。さらに、得られたＩｇＧは抗補体活性が低く、保存中比較的安定していた。このため、カプリル酸塩を用いた沈殿工程は非常に有用であると認められており、血漿からＩｇＧを製造する多くの最新の方法に導入された。

アルコール、ＰＥＧおよびカプリル酸による分画法の他、複数のクロマトグラフィー法が、ＩＶＩＧを精製する基本的な分画法と組み合わせて用いられた。

最もよく用いられるクロマトグラフィー法は、イオン交換クロマトグラフィーであり、これはタンパク質およびイオン交換担体の両方における表面分布および電荷密度の利点を生かした方法である。陰イオン交換樹脂の表面は正電荷を帯びている。電荷密度は樹脂特有のものあり、通常ｐＨ（樹脂の実用範囲内）とは無関係である。典型的な陰イオン交換体は、正味の負電荷を有するタンパク質と結合する（すなわち溶液のｐＨがタンパク質の等電点を上回る場合）。実際には、１つのタンパク質表面は単一の電荷を示さず；むしろ正電荷、負電荷および中性域の寄せ集めである。表面構造は所定のタンパク質に特有であり、イオン強度およびｐＨなどの溶液条件の影響を受ける。この独自性は、各タンパク質が陰イオン交換樹脂と結合する、または陰イオン交換樹脂から放出される特定の条件を確立するために利用できる。これらの条件を確立することによって、表面特性または電荷特性がわずかにのみ異なるタンパク質を高収量（＞９５％）で効率的に分離できる。

クロマトグラフィーの樹脂担体が有する構造の改良によって、大規模なクロマトグラフィーを従来の精製方法に代わる実際的な方法とした。硬質樹脂によって、大容量を迅速に（＜５時間）処理でき、高いリガンド密度によって、大容量処理に必要な性能が増大する。これらの要素は、高収量、生成物の純度および方法の簡易性とともに、大規模な製造においてクロマトグラフィーを用いるために好都合なものである。

特に、陽イオンおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィーは、時に個々の工程で組み合わせてまたは直列に連結して、血漿またはその画分からＩｇＧを精製するために用いられてきた（例えば特許文献１に記載されるように）。これらの方法の大半において、陰イオン交換クロマトグラフィーはネガティブモードで用いられ、すなわち、条件は混入タンパク質、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミン、フィブリノーゲン、トランスフェリンとの結合を可能にするために用いられる一方、ＩｇＧは非吸着画分に回収される。

ＩｇＧ精製のため、カプリル酸塩を用いた沈殿後にイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて用いることは、多くの刊行物に記載されている。ＳｔｅｉｎｂｕｃｈおよびＡｕｄｒａｎ（非特許文献５）は、カプリル酸塩による沈殿後、ＤＥＡＥセルロースを用いてさらにＩｇＧを精製することに関して記述している。Ｌｅｂｉｎｇ他（特許文献２）は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、アルブミンおよび他の不純物を除去するため、２本の陰イオン交換カラムを直列に連結して使用することに関して記述している。Ｌｅｂｉｎｇ他は、カプリル酸塩を介した効果、すなわち沈殿とそれによるウイルス分離（ｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）を用いたＩｇＧ以外のタンパク質の不可欠な低減および個々のインキュベーション工程において脂肪酸がエンベロープを持つウイルスを不活化する特性を組み合わせた。ＩｇＧを含有するペースト／沈殿物をｐＨ４．２で溶解（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）させ、続いてｐＨ５．２に調整してカプリル酸塩を添加することから開始する、いわゆる「ｐＨスイング法」の重要性は、それがＩｇＧを富化する手順に不可欠であり、ＩｇＧ以外のタンパク質を効率的に低減するために必要であることで強調される。次に、ＩｇＡおよびＩｇＭなど他の数種類の不純物ならびに前記カプリル酸塩を、上記イオン交換クロマトグラフィー工程で低減した。

特許文献３は、凝集体、血管作動性物質およびタンパク分解酵素を含有しない静脈内投与が許容されるＩｇＧ製剤の製造におけるカプリル酸の使用に関する。該方法は、イオン交換または疎水性マトリックスによるクロマトグラフィーを用いた精製前に、ＩｇＧを含有する出発物質を０．４％〜１．５％のカプリル酸と接触させることを含む。

精製方法の絶え間ない改良によって、この数年に渡るＩｇＧ製剤の発展が得られた。上記のとおり、最初のＩｇＧ製剤は、静脈内投与した場合に有害事象の発生が多過ぎたため、筋肉内使用にのみ適していた。静脈内使用に適したＩｇＧ製剤（ＩＶＩＧ）の第一世代は、出発物質（Ｃｏｈｎ画分ＩＩ）をペプシンで切断することにより製造された。この切断は、補体活性化などの重篤な有害事象の原因であり、初期製剤の静脈内投与を不可能とした免疫グロブリン凝集体の除去を目的として行われた。該方法にカラムクロマトグラフィー工程は含まれなかった。得られた製剤は、妥当な期間安定した状態を維持するため、凍結乾燥する必要があり、使用直前に溶解した。

ＩＶＩＧの第二世代は、低い抗補体活性およびより高い安定性を持つ切断および修飾されていない免疫グロブリン分子をもとに製造され、８０年代半ばに導入されたが、依然として凍結乾燥製剤の形態であった。このＩＶＩＧは、複数回のクロマトグラフィー工程を含む方法で精製された。ペプシンによる切断を避け、凝集体および粒子を沈殿させることによって除去し、イオン交換カラムクロマトグラフィー法でさらに精製した。

ＩＶＩＧの第三世代については、ウイルス不活化に特化した工程が方法に含まれた。特に、精製方法の沈殿工程では多くのウイルスが除去されるにもかかわらず、血液製剤を投与された患者の中にはＨＩＶに感染するものがおり、ウイルスの不活化およびこれらの製剤からのウイルス除去のためのさらに特化した工程が必要であった。

より高い純度および品質のタンパク質を得るため、安定した液体製剤を得るため、さらに患者に対するこれらの製剤の安全性および忍容性を改善するため、精製方法の改良が続けられている。さらに、皮下投与製剤が開発された。

今やＩｇＧ製剤は臨床的に応用されることが多い。従来の用途である原発性または後天性免疫不全、および感染症の治療に加え、これらの製剤は、自己免疫疾患およびＣＩＤＰなどの特定の神経疾患の治療にも有効であることが示されている。また、ＩｇＧ製剤のさらなる治療的使用に焦点を当てた研究が著しく増加した。このため、ＩｇＧ製剤の需要は増加した。今やＩｇＧ製剤は世界市場で需要が最も大きい血漿分画製剤である；２００８年の需要は約８２メートルトン（米国の３７トン、欧州の２１トンおよびアジアの１７トンを含む）に達し、年率約７％で増加する傾向にあった（２０１３年の需要予測は１１０メートルトンである）（非特許文献８、９）。ヒト血漿は貴重で限られた原料であるため、製剤の品質を損なうことなく、現時点で可能な収量よりも高い収量が得られるよう、血漿からＩｇＧを精製する方法のさらなる改良が必要である。従来の方法では、血漿１Ｌ当たりのＩｇＧ平均収量が３．７〜４．２ｇであり、これは血漿中に存在するＩｇＧの５５％に過ぎない。

ＷＯ９９／６４４６２米国特許第５，８８６，１５７号米国特許第５，１６４，４８７号

ＣｏｈｎＥ．他、（１９４６年）、ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ、６８、４５９〜４７５頁Ｏｎｃｌｅｙ他、（１９４９年）、ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ、７１、５４１〜５５０頁ＫｉｓｔｌｅｒＰおよびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎＨＳ、（１９５２年）、ＶｏｘＳａｎｇ、７、４１４〜４２４頁Ｃｈａｎｕｔｉｎ他、（１９６０年）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９；２１８頁ＳｔｅｉｎｂｕｃｈおよびＡｕｄｒａｎ、（１９６９年）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３４、２７９〜２８４頁Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈ他、（１９７３年）、Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３、３６３〜３７３頁Ｈａｂｅｅｂ他、（１９８４年）Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４、１〜１７頁ＴｈｅＷｏｒｌｄｗｉｄｅＰｌａｓｍａＦｒａｃｔｉｏｎｓＭａｒｋｅｔ２００８年ＴｈｅＭａｒｋｅｔｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＢｕｒｅａｕ，Ｉｎｃ．２０１０年４月版

本発明は、製剤の品質を損なうことなく出発溶液（好ましくは血漿）１Ｌ当たりのＩｇＧの収量を向上させる、ＩｇＧおよび他のタンパク質を含む血漿または他の溶液からＩｇＧを精製するための改良された方法に関する。

本発明の第１の態様は、ＩｇＧ、他の免疫グロブリンおよび／または他のタンパク質混入物を含む溶液からの精製方法におけるＩｇＧの収量を増加させる方法であって、
（ａ）ＩｇＧ、他の免疫グロブリンおよび／または他のタンパク質混入物を含み、ｐＨが３．５〜５．２の間であり、総タンパク質濃度が少なくとも１０ｇ／Ｌである酸性溶液を用意すること；
（ｂ）該溶液の伝導率を１．５ｍＳ／ｃｍ未満に維持しつつ、ｐＨを５．２〜６．２に調整すること；
（ｃ）該溶液を少なくとも１５分間インキュベートすること；ならびに
（ｄ）任意の沈殿物を除去すること
を含む前記方法である。

好ましくは、ＩｇＧを含む溶液は血漿由来の抗体を含み、より好ましくは、ＩｇＧを含む溶液はヒト血漿またはヒト脱クリオ血漿のエタノール分画によって得られる。本発明の別の好ましい実施形態では、ＩｇＧを含む溶液はオクタン酸沈殿から得た上清である。

通常、工程（ａ）における溶液は限外濾過ダイアフィルトレーションによって清澄化されている。工程（ａ）における溶液のｐＨは、好ましくは３．９〜５．０、より好ましくは３．９〜４．６、さらにより好ましくは３．９〜４．３である。工程（ａ）におけるタンパク質濃度は、好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌの間、より好ましくは２０〜２５ｇ／Ｌの間である。

工程（ｂ）において、ｐＨは５．２〜６．２、好ましくは５．６〜６．０、より好ましくは５．８〜６．０に調整される。好ましくは、工程（ｂ）におけるｐＨ調整は、少なくとも１種の多水酸化アミン化合物（ｍｕｌｔｉ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄａｍｉｎｅｃｏｍｐｏｕｎｄ）の添加によって行われる。ｐＨ調整は、好ましくは２５０ｍＭを超える濃度、より好ましくは５００ｍＭを超える濃度、さらにより好ましくは７５０ｍＭを超える濃度、最も好ましくは約１Ｍの濃度のトリスを用いて行われる。好ましくは、ｐＨ調整は少なくとも１５分かけて行われる。工程（ｂ）における伝導率は、１．５ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは１．２ｍＳ／ｃｍ未満、より好ましくは１．０ｍＳ／ｃｍ未満、さらにより好ましくは０．８ｍＳ／ｃｍ未満、最も好ましくは０．２〜０．５ｍＳ／ｃｍの間である。最も好ましくは、工程（ｂ）におけるｐＨは５．６〜６．０に調整され、伝導率は０．２〜０．５ｍＳ／ｃｍの間である。

工程（ｃ）におけるインキュベーション時間は、７２時間まで、４８時間まで、２４時間まで、好ましくは１２時間まで、より好ましくは６時間まで、最も好ましくは１５分〜９０分の間である。好ましくは、工程（ｃ）におけるインキュベーションは室温で行われる。

好ましくは、工程（ｄ）における沈殿物は深層濾過によって除去される。沈殿物を除去する他の方法は、他の濾過法または遠心分離などでもよい。

工程（ｄ）後、イオン交換クロマトグラフィーなど、クロマトグラフィー法のような追加の精製工程を行ってもよい。好ましくは、その樹脂に混入物を結合するが、ＩｇＧを結合しない条件下でイオン交換クロマトグラフィー工程が行われる。好ましくは、イオン交換クロマトグラフィーは陰イオン交換クロマトグラフィーである。好ましくは、溶液の伝導率をさらに調整することなく、イオン交換クロマトグラフィーを行う。

前記方法はウイルス不活化工程をさらに含むこともある。好ましくは、ウイルス不活化工程は低ｐＨ処理である。好ましくは、ウイルス不活化のための低ｐＨ処理は工程（ａ）の前に行われる。

本発明は、出発溶液、好ましくはＩｇＧ抗体、他の免疫グロブリンおよび／または他のタンパク質混入物を含む従来の方法の中間体からの精製方法におけるＩｇＧの収量を増加させる方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：
（ａ）ＩｇＧ、他の免疫グロブリンおよび／または他のタンパク質混入物を含み、ｐＨが３．５〜５．２の間、好ましくは４．０〜５．０、より好ましくは４．６〜４．８であり、総タンパク質濃度が少なくとも１０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜５０ｇ／Ｌ、より好ましくは約１０〜４０ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは１５〜３０ｇ／Ｌ、最も好ましくは２０〜２５ｇ／Ｌである酸性溶液を用意する工程。

ＩｇＧを含む組成物は、任意の原料でよく、好ましくはＩｇＧを含む生体液である。好ましくは、ＩｇＧを含む組成物は、血液、血漿もしくは血清または血液、血漿もしくは血清由来のものである。しかし、本発明ではＩｇＧを含む他の出発物質を用いてもよい。例えば、本発明の方法を用いて細胞培養上清のような他の生体液からでもＩｇＧを富化することは可能である。

ＩｇＧを含む組成物は、ペーストまたは沈殿物の溶液、好ましくはＣｏｈｎ／Ｏｎｃｌｅｙ他が記述している（ＦＩＩ＋ＩＩＩ）、（ＦＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）もしくはＦＩＩＩまたはそれらの修飾物、またはＫｉｓｔｌｅｒとＮｉｔｓｃｈｍａｎｎの方法に記述される沈殿物Ａ（ＰＰＴ−Ａ）、沈殿物Ｂ（ＰＰＴ−Ｂ）および沈殿物Ｇ（ＰＰＴ−Ｇ）またはそれらの修飾物のような，低温エタノール分画法から得られる画分であってもよい。

しかし、好ましくはＩｇＧを含む溶液は、オクタン酸沈殿、ポリエチレングリコール沈殿および／または硫酸アンモニウム沈殿を用いて上記のエタノール画分または任意のＩｇＧを含む中間体から開始してＩｇＧを精製する際に得られる中間沈殿物の溶液または中間溶液である。血漿画分から開始する場合、オクタン酸沈殿はＩｇＧ富化中間体を製造するための好ましい方法である。ＳｔｅｉｎｂｕｃｈおよびＡｕｄｒａｎ（（１９６９年）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３４、２７９〜２８４頁）が記述しているとおり、最終濃度を約５％（ｗ／ｗ）にするためオクタン酸を可溶化したエタノール沈殿物などの中間溶液に添加してもよい。より高濃度のオクタン酸を用いてもよい。オクタン酸は、ｐＨ、伝導率およびインキュベーション時間などを定義した条件下の室温でゆっくりと加えること。より高濃度のオクタン酸を用いる場合、さらにリン酸カルシウムを添加し、続いてインキュベーション時間を延長してもよい。免疫グロブリンの大部分、特にＩｇＧは溶液中に残るが、夾雑タンパク質、脂質およびカプリル酸塩の沈殿物は形成される。沈殿したタンパク質、脂質およびカプリル酸塩は、室温（１８℃〜２６℃の間など）で濾過することによって除去してもよい。例えば、濾過助剤（例えば珪藻土を用いるが、他の濾過助剤を用いてもよい）の存在下で深層濾過を行ってもよい。前記溶液の濾過には全量濾過（ｎｏｒｍａｌｆｌｏｗｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてもよい。しかし、沈殿物の除去および溶液の清澄化のための他の方法も考えられる。その後、清澄化した溶液は、ｐＨ、伝導率およびタンパク質濃度を調整するためにダイアフィルトレーション／限外濾過を行ってもよい。

好ましくは、出発溶液は、上記のとおり酸性条件で血漿または血漿画分からＩｇＧを精製する際、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって、すでに免疫グロブリンを富化し、かつ清澄化した中間溶液である。

沈殿物を出発物質として用いる場合、ＩｇＧは、沈殿物（処理画分または副画分）（ｐｒｏｃｅｓｓｆｒａｃｔｉｏｎｏｒｓｉｄｅｆｒａｃｔｉｏｎ）を緩衝液に数時間再懸濁することによって沈殿物から抽出し得る。可溶化は、伝導率が好ましくは１〜１５ｍＳ／ｃｍの間、より好ましくは５〜１５ｍＳ／ｃｍの間の溶液を用いて行う。可溶化に用いる溶液のｐＨは、３．５〜６の間、好ましくは４．０〜５．５の間、より好ましくは４．５〜５．２の間、最も好ましくは約４．８である。例えば、可溶化はｐＨ４．８で０．２Ｍ酢酸塩を用いて行ってもよい。しかし、当業者であればより適当な緩衝液を見出すことが可能である。緩衝液と沈殿物の割合は、約１：５〜１：１０であってもよいが、他の割合でもよい。可溶化は、適当なミキサーを用いて強く撹拌しながら少なくとも２時間、好ましくは少なくとも４時間かけて行う。

本発明の方法における次の工程では、工程（ａ）の溶液のｐＨを、さらに約５．２〜６．２、好ましくは５．４〜６．０、より好ましくは５．６〜６．０、さらにより好ましくは５．７〜５．９、最も好ましくは約５．８に調整する。ｐＨの影響を受けない溶液の伝導率は、０．２〜１．５ｍＳ／ｃｍの間などの１．５ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは０．２〜１．０ｍＳ／ｃｍの間などの１．０ｍＳ／ｃｍ未満、さらにより好ましくは０．２〜０．８ｍＳ／ｃｍの間などの０．８ｍＳ／ｃｍ未満、または０．５ｍＳ／ｃｍ未満で最も好ましくは０．２〜０．５ｍＳ／ｃｍの間である。

好ましくは、ｐＨおよび伝導率の調整に用いる試薬は、アミン化合物であるかアミン化合物を含む。好ましくは、アミン化合物は２−アミノ−１−エタノール（Ｃ_２Ｈ_７ＮＯ）、ビス（ヒドロキシエチル）−アミン（Ｃ_４Ｈ_１１ＮＯ_２）、トリス（２−ヒドロキシエチル）アミン（Ｃ_６Ｈ_１５ＮＯ_３）、好ましくは（ビス（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−トリ（ヒドロキシメチル）−メタン（Ｃ_８Ｈ_１９ＮＯ_５）、Ｎ，Ｎビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｃ_６Ｈ_１３ＮＯ_４）、１，３−ビス（トリ（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｃ_１１Ｈ_２６Ｎ_２Ｏ_６）、最も好ましくは２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｃ_４Ｈ_１１ＮＯ_３）（トリス塩基）のような多水酸化アミン化合物である。

本発明者は、カルボキシル基の有無にかかわらず、多水酸化アミン化合物を使用することにより、二度目のｐＨ調整（ＩｇＧの安定化）時のＩｇＧ損失が低減することを有利に発見した。伝導率を０．２〜０．５ｍＳ／ｃｍなどの目標値で一定に保ちつつ、タンパク質混入物を沈殿させる。

次に、工程（ｃ）で、前記ＩｇＧを含む溶液のインキュベートは、適当なミキサーを用いて激しく混合しながら少なくとも１５分行う。当業者であれば、混合に用いる方法に応じ、工程に必要とされる時間を調整し得る。インキュベーション時間は７２時間まで、好ましくは４８時間まで、より好ましくは１２〜２４時間の間、最も好ましくは１５分〜１２時間の間であってもよい。しかし、他のインキュベーション時間でもよい；当業者であれば、インキュベーション時間がより短い場合は室温で行ってもよいが、インキュベーション時間がより長い場合は４〜８℃などのより低い温度で行う必要があることを認識していると思われる。

工程（ｄ）で、工程（ｃ）におけるｐＨシフトの際に形成されるタンパク質沈殿物は、例えば、室温（１８〜２６℃など）での深層濾過によって除去する。当業者には公知のとおり、深層濾過は濾過助剤の添加を必要とする。溶液の濾過には全量濾過を用いてもよい。しかし、他の濾過法、遠心分離などのタンパク質沈殿物を除去するための他の方法を用いてもよい。当業者であれば、沈殿物を除去するための他の適当な方法を熟知している。工程によってＩｇＭおよびＩｇＡが大幅に減少する。

次に、清澄化した溶液はＩｇＧをさらに精製するための処理を行ってもよい。１つの好ましい選択肢は溶液を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行うことである。好ましくは、ＩｇＧは流出液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中に残るが、残存するＩｇＡ、ＩｇＭおよび他の混入物は結合させる条件下で溶液を陰イオン交換体に導入する。好ましくは、清澄化した溶液を直接カラムに導入してもよい。好都合にも、ｐＨまたは伝導率を調整する必要はない。

工程で用いる陰イオン交換体は、強陰イオン交換体でも弱陰イオン交換体でもよい。好ましくは、陰イオン交換体は、第四級アンモニウム、第四級アミノエチル、ジエチルアミノエチル、トリメチルアミノエチルまたはジメチルアミノエチルのような陰イオン交換リガンドを含む。陰イオン交換体は、より好ましくはＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨＰおよびＦＦ）、ＡＮＸＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（低置換度および高置換度）、ＣａｐｔｏＱ、ＣａｐｔｏＱＸＰ、ＣａｐｔｏＤＥＡＥ、Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑおよび１５Ｑ、最も好ましくはＦｒａｃｔｏｇｅｌＤＥＡＥおよびＭＰＨＱから選択する。

上記のとおり、導入は、好ましくは残存するＩｇＡ、ＩｇＭおよび他の混入物を陰イオン交換体に結合させる条件下で行う。通常、陰イオン交換体は使用前に２種組合せ緩衝系（ｔｗｏｂｕｆｆｅｒｓｙｓｔｅｍ）（平衡化緩衝液１および２）を用いて平衡化することが多く、その場合は平衡化緩衝液２を導入前に用いる。平衡化緩衝液は、用いた陰イオン交換体に適した一般的な緩衝系である。平衡化緩衝液１の伝導率は、１０〜２０ｍＳ／ｃｍの間、より好ましくは１１〜１５ｍＳ／ｃｍの間である。ｐＨは、７〜８の間、より好ましくは７．１〜７．５の間である。適当な緩衝液の例は、リン酸塩もしくは酢酸塩の緩衝液またはそれらの組合せである。好ましくは、緩衝液はリン酸塩混合液（一塩基性および二塩基性）である。

方法に含まれてもよい追加工程は、ナノ濾過、溶媒／洗剤処理、低ｐＨ処理または低温殺菌のようなウイルス不活化／除去工程である。当業者であれば、適当なウイルス不活化および除去方法を熟知していると思われる。これらの工程は方法における任意の適当な段階に含まれてもよい。

通常、安定化剤のような薬学的に許容される添加物を加えてもよい。

本発明の方法が問題なく行われる特に好ましい方法の１例は、低温エタノール分画法を含み、ＫｉｓｔｌｅｒとＮｉｔｓｃｈｍａｎｎの方法による基礎分画法の中間体である沈殿物Ａ、またはＣｏｈｎ他の方法で得られる沈殿物ＩＩ＋ＩＩＩ（ＰＰＴＩＩ＋ＩＩＩ）および／または改変したＫｉｓｔｌｅｒ−Ｃｏｈｎの方法で得られる沈殿物Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩを用いる方法である。

これらの製造中間体は下記工程で基本的に処理する：
（１）オクタン酸（ＯＡ）分画、
（２）低ｐＨインキュベーション、
（３）ｐＨシフトおよび深層濾過、
（４）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（５）ウイルス濾過、および
（６）限外濾過／ダイアフィルトレーションによる濃縮。

本発明における方法の改良には、下記の１つまたはそれ以上が含まれる。
（ｉ）深層濾過前にｐＨを変更すること（ｐＨシフト）で行う予備精製。該工程は、仕上げのクロマトグラフィー工程前に非常に低い伝導率で行い、ＩｇＡおよびＩｇＭの大部分を沈殿させ、かつＩｇＧの共沈を最小限に抑える；
（ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー工程に用いる緩衝系の変更。

有利に、ｐＨシフトは（好ましくは）溶液の伝導率を上げることのないトリス緩衝液を用いて行う；したがって、深層濾過後に得られる濾液は、リン酸塩緩衝液などで適切に平衡化した陰イオン交換カラムに直接導入してもよい。低い伝導率は、該工程においてＩｇＧの沈殿を減少させるために重要である。

該方法に両改良を加えた場合、ＩｇＧ収量は、これらの改良を加えていない同じ方法と比較して少なくとも５％増加する。

本発明をここで例証する。実施例は、本発明の例証を意図しており、本発明を制限するものではない。下記の図に対する言及を行う。

工程（ｂ）でのタンパク質収量（薄灰色棒）およびＩｇＧ収量（黒色棒）に対するｐＨ調整の効果を示す棒グラフである。３種類の異なる出発物質におけるＩｇＧ収量（黒色棒）または損失（灰色棒）に対するｐＨ５．８へのｐＨシフトに用いたトリス濃度の効果を示す棒グラフである：（ａ）回収血漿由来の出発物質ＮＡＰＰＴ、（ｂ）原料血漿由来の出発物質ＮＡＰＰＴ、（ｃ）原料血漿由来のＰＰＴＩＩ＋ＩＩＩ。

（ａ）ＳｔｅｉｎｂｕｃｈおよびＡｕｄｒａｎ（（１９６９年）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３４、２７９〜２８４頁）による従来技術の方法。
凍結ＮＡ沈殿物（ＰＰＴ）の一部を適量の酢酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、ｐＨを４．８で一定に保ちつつ、ＮＡＰＰＴ懸濁液を室温でＩｇＧの大部分が溶解するまで数時間撹拌した。

脱脂は、オクタン酸（ＯＡ）を前記懸濁液に添加し、続く２４０分間のインキュベーションによって行われた。次に、リン酸カルシウムを添加し、前記懸濁液をさらに６０〜９０分間撹拌した。沈殿したタンパク質、脂質またはリポタンパク質複合体、およびこれらの条件下で沈殿した他の混入物を濾過によって除去した。

ＯＡ濾液をタンパク質濃度が３％に達するまで限外濾過し、続いて注射用蒸留水（ＷＦＩ）を用いてダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーション中、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いてｐＨを４．１に持続的にシフトさせた。ダイアフィルトレーション後、ＷＦＩを用いて前記タンパク質溶液をタンパク質２０ｇ／Ｌまで希釈し、ｐＨを４．０±０．１に調整し、かつポリソルベート８０（Ｐ８０）２３．５ｍｇ／ｋｇを添加した。濾過および濾過後洗浄の後、ｐＨ４．０におけるインキュベーションをタンパク質濃度が約２０ｇ／Ｌ、３７℃で数時間行った。次に、ｐＨ４でインキュベートした物質を室温まで冷却した。

ＮａＯＨを用いてｐＨを６．５まで上げ、続いて約９０分間インキュベーションを行った。ｐＨ調整およびインキュベーションによって、大部分のＩｇＡおよびＩｇＭを沈殿させることで除去した。沈殿した不純物を濾過によって除去した。伝導率の調整後、澄明溶液をインラインで濾過し、調整、１０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いたｐＨ６．５への平衡化、および強陰イオン交換体（ＭａｃｒｏｐｒｅｐＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ＭＰＨＱ）の充填を行ったカラムに導入した。所定の条件下で、ＩｇＧは流出液および洗浄画分中に認められるが、残存するＩｇＡおよびＩｇＭは他のタンパク質不純物とともに陰イオン交換（ＡＩＥＸ）樹脂に結合した。回収時、ＩｇＧを含む前記ＡＩＥＸの流出液および洗浄画分のｐＨを４．８±０．１まで下げ、その値で維持した。

ウイルスは、０．１μｍでの予備濾過後にインラインでナノ濾過を行って除去した。ウイルス除去後の濾液（ｖｉｒｕｓｆｉｌｔｒａｔｅ）は、ポリエーテルスルホン膜を用いてタンパク質濃度２〜３％まで濃縮し、ＷＦＩを用いてダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーション中、ｐＨを４．１に持続的にシフトさせた。その後、前記溶液をタンパク質含有量が１０５〜１３５ｇ／Ｌになるまで濃縮した。原薬をＩｇＧが１００ｇ／Ｌになるまで希釈し、Ｌ−プロリン２５０ｍｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）で安定化させ、ｐＨを４．８０±０．１０に維持した。製剤化原薬（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄｂｕｌｋ）は０．２μｍ膜フィルターを通して粒子を濾過した。

（ｂ）ｐＨシフトおよびクロマトグラフィー緩衝系の最適化を含む改良した方法
本発明によるｐＨシフト工程およびクロマトグラフィー緩衝系の最適化を組み込むことによって、（ａ）に記載された方法を改良した。

ＮＡＰＰＴに、上記のとおりＯＡ沈殿および低ｐＨウイルス不活化を含む処理を行った。

次に、低ｐＨ４でインキュベートした溶液のｐＨを、１Ｍトリス緩衝液を用いてｐＨ５．８に調整した。ｐＨ調整は９０分かけて行い、続いて室温で９０分間インキュベーションを行った。次に、形成された沈殿物を濾過によって除去した。請求項１の工程（ｂ）に記載されたとおり、ｐＨを約５．８および伝導率を約０．２〜０．５ｍＳ／ｃｍなど、ｐＨおよび伝導率を一定に保った。

リン酸塩緩衝液（０．１２Ｍリン酸塩、ｐＨ７．３±０．２）を用いた調整および（５ｍＭリン酸塩＋１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６．０±０．１）を用いた平衡化の後、強陰イオン交換体（ＭａｃｒｏｐｒｅｐＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ＭＰＨＱ）を充填したクロマトグラフィーカラムに樹脂１Ｌに対してタンパク質１８０ｇ以下を７０〜１３０ｃｍ／時間の直線流速で導入した。所定の条件下で、ＩｇＧは流出液および洗浄画分中に認められるが、残存するＩｇＡおよびＩｇＭは他のタンパク質不純物とともに陰イオン交換（ＡＩＥＸ）樹脂に結合した。回収時、ＩｇＧを含む前記ＡＩＥＸの流出液および洗浄画分のｐＨを４．８±０．１まで下げ、その値で維持した。

下記の工程は（ａ）に記載されたとおりに行われた。

収量比較（従来の方法対改良した方法）
同じ出発中間体からのタンパク質収量に関する２つの方法の比較は表１〜３に示す。低ｐＨインキュベーション（ｐＨ４）後のＩｇＧ収量を１００％に設定した。

方法の差異および収量の増加を原因として、製剤の純度に大きな違いが生じることはなかったことが示された。

本実施例は、ＩｇＧ収量に対するトリス緩衝液を用いた様々なｐＨへの調整の影響と、従来の６．５へのｐＨシフトの影響との比較を示す。

実施例１に記載されたとおり、ＰＰＴ−ＮＡから開始し、低ｐＨ４でインキュベートした溶液を上記のとおり作成した。１ｋｇずつ８つに分割し、それぞれ１Ｍトリス緩衝液を用いてｐＨ５．２；５．４；５．６；５．８；６．０；６．２；６．４に調整した。最後の区分のｐＨは、従来の方法に従って０．２ＭＮａＯＨを用いて調整した。上記のとおり、ｐＨ調整は９０分かけて行い、続いて室温で９０分間インキュベーションを行った。次に、形成された沈殿物を濾過によって除去した。次に、実施例１（ｂ）に記載されたとおり、濾液をＡＩＥＸカラムに導入した。導入した各溶液のタンパク質およびＩｇＧの収量を比較した。結果は図１に示す。ＩｇＧ収量に対する様々なｐＨシフトでの１Ｍトリス緩衝液の影響と、実施例１（ａ）に記載されたとおり従来技術の方法で用いられた０．２ＭＮａＯＨの影響とを比較したところ、１Ｍトリス緩衝液を用いた大幅なｐＨシフト（ｐＨ：５．２〜６．２）でＩｇＧ収量の損失が最小限になることが示唆された。

本実施例は、５．８への望ましいｐＨシフトに用いたトリス緩衝液濃度の影響を示す。低ｐＨ４でインキュベートした溶液から開始し、１Ｍ；０．５Ｍおよび０．２５Ｍのトリス緩衝液をそれぞれ用いてｐＨを４〜５．８までシフトさせた。

結果は図２に示す。出発物質（原料血漿由来ＰＰＴ−ＩＩ＋ＩＩＩ、ＮＡ、または回収血漿由来ＮＡ）に関係なく、用いたトリス緩衝液のモル濃度が増加するとＩｇＧ損失は低減した。

本実施例は、ＩｇＧ収量に対する工程（ｂ）でｐＨ調整に用いた様々な試薬（アミン化合物、好ましくは多水酸化アミン化合物を含む）の影響を示す。

下記試薬を用いた：２−アミノ−１−エタノール（Ｃ_２Ｈ_７ＮＯ）、ビス（ヒドロキシエチル）−アミン（Ｃ_４Ｈ_１１ＮＯ_２）、トリス（２−ヒドロキシエチル）アミン（Ｃ_６Ｈ_１５ＮＯ_３）、好ましくはビス（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン（Ｃ_８Ｈ_１９ＮＯ_５）、Ｎ，Ｎビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｃ_６Ｈ_１３ＮＯ_４）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｃ_１１Ｈ_２６Ｎ_２Ｏ_６）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｃ_４Ｈ_１１ＮＯ_３）（トリス塩基）、およびこれらの試薬の組合せ。

実施例１に記載されたとおり、ＰＰＴ−ＮＡから開始し、低ｐＨ４でインキュベートした溶液を上記のとおり作成した。１ｋｇずつ８つに分割し、上記試薬の１Ｍ溶液を用いて５．７５〜５．８５にｐＨを調整した。最後の区分のｐＨは、従来の方法に従って０．２ＭＮａＯＨを用いて調整した。上記のとおり、ｐＨ調整は９０分かけて行い、続いて室温で９０分間インキュベーションを行った。次に、形成された沈殿物を濾過によって除去した。各濾液のＩｇＧの収量を比較した。

結果は図４に示す。本結果は、ＩｇＧ収量に対する工程（ｂ）でｐＨシフトに用いた様々な試薬（１Ｍ溶液）の影響と、従来技術の方法で用いられた０．２ＭＮａＯＨの影響との比較を示す。本結果は、様々なアミン化合物を用いることで、従来技術の方法と比較してＩｇＧ収量が増加することを示唆する。特に、多水酸化アミン化合物を用いることは有利である。

Claims

ＩｇＧ、他の免疫グロブリンおよび／または他のタンパク質混入物を含む溶液からの精製方法におけるＩｇＧの収量を増加させる方法であって、
（ａ）ＩｇＧ、他の免疫グロブリンおよび／または他のタンパク質混入物を含み、ｐＨが３．５〜５．２の間であり、総タンパク質濃度が少なくとも１０ｇ／Ｌである酸性溶液を用意すること；
（ｂ）該溶液の伝導率を１．５ｍＳ／ｃｍ未満に維持しつつ、ｐＨを５．２〜６．２に調整すること；
（ｃ）該溶液を少なくとも１５分間インキュベートすること；ならびに
（ｄ）任意の沈殿物を除去すること
を含み、
工程（ｂ）におけるｐＨ調整は、カルボキシル基の有無にかかわらず、少なくとも１種の多水酸化アミン化合物の添加によって行われる、前記方法。
ＩｇＧを含む溶液は血漿由来の抗体を含む、請求項１に記載の方法。
ＩｇＧを含む溶液はヒト血漿またはヒト脱クリオ血漿のエタノール分画によって得られる、請求項１または請求項２に記載の方法。
ＩｇＧを含む溶液はオクタン酸沈殿から得た上清である、請求項３に記載の方法。
工程（ａ）における溶液は限外濾過ダイアフィルトレーションによって清澄化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
工程（ａ）における溶液のｐＨは、３．９〜５．０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
工程（ａ）におけるタンパク質濃度は、１０〜５０ｇ／Ｌの間である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｂ）におけるｐＨは５．６〜６．０に調整される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｂ）における伝導率は、２５０ｍＭを超える濃度のトリスを用いて調整される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｂ）における伝導率は、１．０ｍＳ／ｃｍ未満である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｂ）におけるｐＨは５．６〜６．０に調整され、伝導率は０．２〜０．５ｍＳ／ｃｍの間である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｃ）におけるインキュベーション時間は、７２時間までである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｃ）におけるインキュベーションは室温で行われる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｄ）における沈殿物は深層濾過によって除去される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｄ）後、その樹脂に混入物を結合するが、ＩｇＧを結合しない条件下でイオン交換クロマトグラフィー工程が行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
イオン交換クロマトグラフィーは陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１５に記載の方法。
溶液の伝導率をさらに調整することなく、イオン交換クロマトグラフィーを行う、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
ウイルス不活化工程をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
ウイルス不活化工程は低ｐＨ処理である、請求項１８に記載の方法。
低ｐＨ処理は工程（ａ）の前に行われる、請求項１９に記載の方法。