CN104245730B - 源自血浆的免疫球蛋白的级分i‑iv‑1沉淀 - Google Patents

Abstract

在其它方面，本发明提供用于从混合血浆中生产血液蛋白质组合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供允许从起始血浆样品中纯化的血液蛋白质的产率显著增加的醇分级分离方案。在具体的实施方案中，提供使混合血浆分级分离的方法，所述方法包括初始低pH、高醇沉淀步骤。本发明还提供治疗性血液蛋白质的药物组合物。

Description

源自血浆的免疫球蛋白的级分I-IV-1沉淀

申请的交叉引用

本申请要求2012年2月23日提交的美国临时专利申请序列号61/602,488的优先权，所述申请的公开内容出于所有目的在此通过引用整体并入本文。

发明背景

在1952年，源自人血浆的免疫球蛋白产品首次用于治疗免疫缺陷。最初，所选方法为肌内或皮下施用分离自血浆的免疫球蛋白同种型G(IgG)。然而，这些方法不允许施用有效治疗各种疾病所必需的大量IgG。因此，研发可静脉内施用的IgG产品。通常，静脉内免疫球蛋白(IVIG)含有源自超过一千个血液供体的血浆的混合免疫球蛋白G(IgG)免疫球蛋白。制剂通常含有超过95％的具有完整Fc依赖性效应器功能的未修饰的IgG和仅痕量的免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)。通常，IVIG是无菌过滤的并且生产过程包含灭活和/或除去病毒的步骤。这些纯化的IgG产品主要用于治疗以下三大类医学病状：(1)免疫缺陷：X连锁丙种球蛋白缺乏血症、低丙种球蛋白血症(原发性免疫缺陷)和特征为低抗体水平的获得性免疫低下病状(继发性免疫缺陷)；(2)炎性和自身免疫疾病；和(3)急性感染。

具体地，患有原发性免疫缺陷病症的许多人缺乏抵抗感染所需的抗体。在某些情况下，这些缺陷可通过通常通过静脉内施用输注纯化的IgG(即，IVIG治疗)来弥补。通常以以下形式治疗几种原发性免疫缺陷病症，包括X连锁丙种球蛋白缺乏血症(XLA)、普通可变性免疫缺陷(CVID)、高IgM综合症(HIM)、重症联合免疫缺陷(SCID)和一些IgG亚类缺陷(Blaese和Winkelstein,J.Patient&Family Handbook for Primary ImmunodeficiencyDiseases.Towson,MD:Immune Deficiency Foundation；2007)。

尽管IgG治疗可极为有效地管控原发性免疫缺陷病症，但此治疗仅临时性替代体内未产生的抗体，而不能治愈该疾病。因此，患者依赖于IgG治疗的反复给药，通常大约每月一次，至死方休。此治疗非常需要连续生产IgG组合物。然而，与通过重组DNA载体的体外表达产生的其它生物制剂不同，IgG是从人血液和血浆供体中分级分离得到。因此，可商购的IgG的水平受到血液和血浆供体可资供应量的限制。

若干个因素促进对IgG的需求，包括对IgG治疗的认可、对IgG治疗有效的其它适应症的鉴定以及患者诊断和IgG处方的增加。值得注意的是，在1990年和2009年之间全球对IgG的需求已增长四倍以上，并且以每年约7％至10％的速率继续增加(Robert P.,Pharmaceutical Policy and Law,11(2009)359-367)。例如，澳大利亚国家血液管理局报道，澳大利亚在2008-2009财年对IgG的需求增加10.6％(National Blood AuthorityAustralia Annual Report 2008-2009)。

部分由于全球需求的增加和免疫球蛋白产品可资供应量的波动，若干个国家(包括澳大利亚和英国)已开始实施需求管理程序，从而在产品短缺期间保护这些产品对需求最高的患者的供应。

在2007年已报道，对两千六百五十万升血浆进行分级分离，产生75.2公吨IgG，平均产率为2.8克/升(Robert P.，如前所述)。据同一报道评估，到2012年预期全球IgG产率将增加至约3.43克/升。然而，由于全球对IgG的需求持续增长(预期从现在起至2015年每年增长约7％至13％)，因此需要进一步提高IgG总体产率来满足全球需求。

IgG产品的市场供应商使用多种IgG制备方法。现行IgG生产方法的常见问题是在纯化过程期间IgG大量损失，据估算至少为起始材料中总IgG含量的30％至35％。一个挑战在于维持病毒灭活的质量和除去可导致不良反应的杂质，同时提高增加IgG产率的过程效率。在IgG的当前生产水平下，即便产率的较小增加实际上也是极有意义的。例如在2007年的生产水平下，效率增加2％(等于增加56毫克/升)将多产生1.5公吨IgG。

在一系列关于血清和血浆蛋白质的制备和特性的已出版学术论文的第四期中，Cohn等人，(J.Am.Chem.Soc.,1946,68(3):459-475)首次描述血浆蛋白质的醇分级分离方法(方法6)，其使得可分离来自人血浆的富含IgG的级分。若干年后，Oncley等人，(J.Am.Chem.Soc.,1949,71(2):541-550)基于Cohn的方法进行了扩展，其公开了使得可分离更纯净的IgG制剂的方法(方法9)。

尽管这些方法为源自血浆的血液蛋白质的整个工业奠定了基础，但这些方法不能提供具有足够高纯度的IgG制剂来治疗若干种免疫相关的疾病，包括川崎综合症(Kawasakisyndrome)、免疫性血小板减少性紫癜和原发性免疫缺陷。因此，研发出采用诸如离子交换色谱的各种技术的其它方法来提供较高纯度的IgG制剂。Hoppe等人，(Munch MedWochenschr 1967(34):1749-1752)、Falksveden(瑞典专利号348942)以及Falksveden和Lundblad(Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)首先采用离子交换色谱来实现此目的。

用于纯化源自血浆的免疫球蛋白的多种现代方法采用与柱色谱偶联的沉淀步骤，诸如辛酸盐沉淀(Lebing等人,Vox Sang 2003(84):193-201)和Cohn级分(I+)II+III乙醇沉淀(Tanaka等人,Braz J Med Biol Res 2000(33)37-30)。最近，Teschner等人(VoxSang,2007(92):42-55)描述生产10％IgG产品的方法，其中首先从混合血浆中除去冷冻沉淀物，然后进行经过修改的Cohn-Oncley冷乙醇分级分离，之后对中间体进行S/D处理，进行离子交换色谱，纳米过滤，并且任选地进行超滤/渗滤。

尽管这些IgG分离方法提供了纯度、安全性和产率，但仍可提高从血浆回收的IgG的产率。例如，Teschner等人报道，其方法使IgG产率提高65％(Teschner等人，如前所述)。根据各种血浆产品会议期间的报道，大规模制备IgG(诸如Baxter、CSL Behring、UpfrontTechnology、Cangene、Prometric BioTherapeutics和Finnish Red Cross)的平均产率在最终容器中在约61％至约65％的范围内。虽然优于前面采用的方法，但此IgG回收的量仍表示在分离过程中存在于混合血浆级分中的IgG损失至少约三分之一。

由于用于生产血浆衍生的产品的可用的血浆供应有限，因此通过将纯化并入单一框架可实现从常见起始血浆库分离若干血液蛋白质。例如，通常通过形成Cohn级分II+III沉淀物或Kistler-Nitschmann沉淀物A来富集IgG，然后将沉淀物相应的上清液用于生产α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)和白蛋白。类似地，已经描述了用于从生产IgG免疫球蛋白期间形成的副产物中生产因子H的几种方法，包括WO2008/113589和WO 2011/011753。

因此，需要生产治疗性IgG产品的改进的和更有效的方法。此外，这些方法也应允许从单一血浆源中生产其它血浆衍生的产品。本发明通过提供产率为高于当前可获得的产率大约20％至25％的IgG分离方法以及从该方法中提供的IgG组合物来满足这些及其它需求。有利地，本文提供的方法允许共分离其它重要的治疗性血浆衍生蛋白，包括α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、因子H、间-α-抑制剂蛋白质(IaIp)、凝血酶原复合物、因子VII(FVII)、因子VIII(FVIII)、抗凝血酶III(ATIII)、纤维蛋白原、丁酰胆碱酯酶等。

发明概述

生产IVIG和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)的现行方法依赖于多个蛋白质沉淀步骤以从人血浆中发现的其它成分中分离免疫球蛋白IgG和A1PI。例如，许多生产商使用Cohn-Oncley方法6的变量，其中采用三个初始醇沉淀步骤。第一沉淀步骤(称为级分I沉淀)在高pH(7.2)和低乙醇浓度(8-10％v/v)下进行以从IgG和A1PI中沉淀诸如纤维蛋白原和因子XIII的蛋白质，而IgG和A1PI保留在上清液中。然后在第二沉淀反应中使IgG从级分I上清液中沉淀，称为级分II+III沉淀，其在温和pH(6.8)和高乙醇浓度(20-25％)下进行。大部分A1PI保留在级分II+III沉淀反应的上清液中，如随后从第三初始沉淀反应的白蛋白中分离，称为级分I-IV-1沉淀，其在低pH(5.2)和中等乙醇浓度(18％)下进行。

不幸的是，由于上述Cohn-Oncley方法以及采用四个初始沉淀以使IgG和A1PI分级分离、在一系列复杂的沉淀反应中分离单一成分的可比较的Kistler-Nitschmann过程，分级分离是不充分的。在这些初始沉淀步骤中IgG和A1PI产率的显著降低可归因于部分沉淀成非目标级分以及目标级分的不完全沉淀。例如，IgG在某种程度上与级分I沉淀物中的纤维蛋白原和因子XIII共沉淀并且一些IgG未被级分II+III沉淀所沉淀。溶解的级分II+III沉淀物澄清后，IgG产率通常为存在于起始Cohn池的IgG的75％和85％之间。因此，在这两个分级分离步骤后，损失起始材料的总IgG含量的15％至25％。

通过不再需要多个初始沉淀步骤，本公开改进从混合血浆中对IgG和A1PI的回收。相反，本文所述方法依赖于单一初始沉淀步骤，该步骤捕获在级分I、级分II+III和级分IV-1沉淀物组合中通常沉淀的所有蛋白质。本文中此单一沉淀步骤称为“级分I+II+III+IV-1沉淀”、“级分I-IV-1沉淀”或“初始低pH、高醇沉淀”。有利地，发现可以从级分I-IV-1沉淀物中有效提取IgG和A1PI而不使用随后的蛋白质沉淀。此外，发现级分I-IV-1沉淀物含有原料血浆的几乎所有IgG和A1PI含量，而白蛋白保留在上清液中。总之，这些优点导致这些重要的商业产品的总回收量显著增加。

如实施例所示，在从冷冻贫乏的血浆(cryo-poor plasma)纯化IgG中使用低pH、高醇沉淀步骤(级分I-IV-1沉淀)作为初始步骤，允许生产药用级IgG组合物，具有4.3-4.7gIgG/L原料血浆的前所未有的产率。这些产率代表与最先进的生产过程相比产率大约增加20％至25％，所述最先进的过程诸如用于从相同血浆类型中生产GAMMAGARD的那些过程(Baxter International；Deerfield,IL)。

因此，在其它方面，本发明提供新的血浆分级分离过程，该过程在初始步骤将血浆或冷冻贫乏的血浆分离成级分I-IV-1沉淀和级分I-IV-1上清液。级分I-IV-1沉淀物含有几乎所有免疫球蛋白(例如，IgG、IgA和IgM)和α1弹性蛋白酶抑制剂(A1PI)，而上清液主要含有白蛋白。

一方面，本发明提供用于从Cohn池制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一沉淀步骤中从冷冻贫乏的血浆中共沉淀免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)以形成第一沉淀物和第一上清液；(b)使第一沉淀物中的免疫球蛋白溶解，以形成具有包含免疫球蛋白的可溶性部分和包含A1PI的不溶性部分的第一悬浮液；(c)从第一悬浮液的不溶性部分中分离第一悬浮液的可溶性部分；和(d)回收第一悬浮液的可溶性级分，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。

在上述方法的一个实施方案中，第一沉淀步骤是醇沉淀步骤。

在上述方法的一个实施方案中，醇沉淀步骤包括在pH为5至6时将乙醇加至冷冻-贫乏的血浆中以得到20％至30％乙醇(v/v)的终浓度。

在上述方法的一个实施方案中，在第一沉淀步骤中乙醇的终浓度为25±4％。在上述方法的一个实施方案中，乙醇的终浓度为25±3％。在上述方法的一个实施方案中，乙醇的终浓度为25±2％。在上述方法的一个实施方案中，乙醇的终浓度为25±1％。在上述方法的一个实施方案中，乙醇的终浓度为25％。

在上述方法的一个实施方案中，第一沉淀步骤的pH为5.5±0.4。在上述方法的一个实施方案中，pH为5.5±0.3。在上述方法的一个实施方案中，pH为5.5±0.2。在上述方法的一个实施方案中，pH为5.5±0.1。在上述方法的一个实施方案中，pH为5.5。

在上述方法的一个实施方案中，第一沉淀步骤的持续时间保持pH。

在上述方法的一个实施方案中，第一个醇沉淀步骤包括通过喷雾加入醇。

在上述方法的一个实施方案中，第一个醇沉淀步骤包括在邻近叶轮的位点加入醇。在另一个实施方案中，在多于一个位点将醇引入到该溶液。在一个实施方案中，在多个小端口将醇引入到该溶液。在具体的实施方案中，加入醇的多个位点位于或接近叶轮或其它分散元件。在另一个实施方案中，通过包括多个开口的扩散器端口将醇引入到该溶液。在具体的实施方案中，扩散器端口的多个开口中的一个或多个各自的开口位于或靠近叶轮或其它分散元件。

在上述方法的一个实施方案中，在温度为-3℃至-10℃下进行第一沉淀步骤。在上述方法的一个实施方案中，在温度为-5℃至-9℃下进行第一沉淀步骤。

在上述方法的一个实施方案中，用4L至60L缓冲液/kg沉淀物悬浮第一沉淀物。在上述方法的一个实施方案中，用8L至15L缓冲液/kg沉淀物悬浮第一沉淀物。

在上述方法的一个实施方案中，第一悬浮液具有的pH为4.0至5.4。在上述方法的一个实施方案中，第一悬浮液具有的pH为4.7至5.1。

在上述方法的一个实施方案中，第一悬浮液具有的电导率为0mS/cm至4mS/cm。在上述方法的一个实施方案中，第一悬浮液具有的电导率为0.5mS/cm至2mS/cm。

在上述方法的一个实施方案中，第一沉淀物悬浮于包含乙酸盐和/或磷酸盐的缓冲液中。

在上述方法的一个实施方案中，通过离心或过滤从第一悬浮液的不溶性部分中分离第一悬浮液的可溶性部分。

在上述方法的一个实施方案中，从第一悬浮液的不溶性部分中分离第一悬浮液的可溶性部分的步骤包括：(i)使细碎二氧化硅(SiO₂)与第一悬浮液混合；和(ii)从悬浮液中分离SiO2。

在上述方法的一个实施方案中，细碎二氧化硅(SiO₂)具有的平均比表面积为350m²/g至410m²/g。

在上述方法的一个实施方案中，在15g/kg第一沉淀物至80g/kg第一沉淀物的终浓度下将细碎二氧化硅(SiO₂)加至第一悬浮液中。

在上述方法的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)在第一沉淀步骤中在pH为5.3和5.7之间并且温度在-6℃和-8℃之间用24％和26％之间的醇从冷冻贫乏的血浆中沉淀免疫球蛋白以形成第一沉淀物和第一上清液；(b)将第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；(c)用细碎二氧化硅(SiO₂)处理第一悬浮液；(d)从第一悬浮液的不溶性级分中分离第一悬浮液的可溶性级分；和(e)回收第一悬浮液的可溶性级分，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。

在上述方法的一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物含有存在于Cohn池中用于步骤(a)的IgG的至少90％的免疫球蛋白含量。

在上述方法的一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物含有存在于Cohn池中用于步骤(a)的IgG的至少95％的免疫球蛋白含量。

在上述方法的一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：(f)在第二沉淀步骤中从第一悬浮液的可溶性级分中沉淀免疫球蛋白以得到第二沉淀物和第二上清液；(g)将第二沉淀物悬浮以形成第二悬浮液；和(h)回收第二悬浮液的可溶性级分，从而形成进一步富集的免疫球蛋白组合物。

在上述方法的一个实施方案中，第二沉淀步骤是醇沉淀步骤。

在上述方法的一个实施方案中，第二个醇沉淀步骤包括在pH为6.5和7.5之间将乙醇加至第一悬浮液的可溶性级分中以得到22％和28％乙醇之间的终浓度。

在上述方法的一个实施方案中，第二个醇沉淀步骤包括通过喷雾加入醇。

在上述方法的一个实施方案中，第二个醇沉淀步骤包括在邻近叶轮的位点加入醇。在另一个实施方案中，在多于一个位点将醇引入到该溶液。在一个实施方案中，在多个小端口将醇引入到该溶液。在具体的实施方案中，加入醇的多个位点位于或接近叶轮或其它分散元件。在另一个实施方案中，通过包括多个开口的扩散器端口将醇引入到该溶液。在具体的实施方案中，扩散器端口的多个开口中的一个或多个各自的开口位于或靠近叶轮或其它分散元件。

在上述方法的一个实施方案中，第二沉淀步骤在-3℃和-10℃之间的温度下进行。

在上述方法的一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物含有存在于冷冻贫乏的血浆中用于步骤(a)的至少90％的IgG含量。

在上述方法的一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物含有存在于冷冻贫乏的血浆中用于步骤(a)的至少95％的IgG含量。

在上述方法的一个实施方案中，该方法还包括阴离子交换色谱富集步骤。

在上述方法的一个实施方案中，该方法还包括阳离子交换色谱富集步骤。

在上述方法的一个实施方案中，该方法还包括病毒灭活或除去步骤。

在上述方法的一个实施方案中，该方法包括溶剂/去污剂(S/D)病毒灭活步骤。

在上述方法的一个实施方案中，该方法包括纳米过滤步骤。

在上述方法的一个实施方案中，该方法包括在pH为4.0至5.0并且温度为20℃至40℃下将组合物孵育至少一周的步骤。

在上述方法的一个实施方案中，最终富集的IgG组合物包含至少98％IgG。

在上述方法的一个实施方案中，最终富集的IgG组合物包含至少99％IgG。

在上述方法的一个实施方案中，该方法产生至少4g IgG/L用于步骤(a)的冷冻-贫乏的血浆。

在上述方法的一个实施方案中，该方法产生至少4.25g IgG/L用于步骤(a)的冷冻贫乏的血浆。

在上述方法的一个实施方案中，该方法产生至少4.5g IgG/L用于步骤(a)的冷冻-贫乏的血浆。

在上述方法的一个实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中进一步纯化α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)。

在上述方法的一个实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中进一步纯化纤维蛋白原。

在上述方法的一个实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中进一步纯化因子H。

在上述方法的一个实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中进一步纯化间-α-胰蛋白酶抑制剂蛋白(IαIp)。

在上述方法的一个实施方案中，用细碎二氧化硅(SiO₂)处理第一悬浮液的不溶性级分。

在上述方法的一个实施方案中，从第一上清液中进一步纯化白蛋白。

一方面，本发明提供通过根据权利要求1至63中任一项所述的方法制备的富集的免疫球蛋白组合物。

一方面，本发明提供治疗有此需要的个体的免疫缺陷、炎性疾病、自身免疫性疾病或急性感染的方法，该方法包括给所述受试者施用根据权利要求64所述的富集的免疫球蛋白组合物。

附图简述

图1.根据本文所述的一个实施方案的血浆分级分离方案图。

发明详述

I.引言

在其它方面，本发明提供用于从混合血浆中分离治疗性蛋白质的更有效的方法。本文提供的用于混合血浆分级分离的方法提供多个重要的治疗性血浆衍生的包括免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)的血液蛋白的更高产率。在特别重要的方面，本发明提供与用于生产治疗性IgG组合物的最先进的方法相比，显著增加从血浆分离的免疫球蛋白G(IgG)产率的方法。在一个实施方案中，通过在低pH、高醇条件下从起始血浆样品(这里称为“Cohn池”)中沉淀免疫球蛋白和AIP1而得到这些提高的产率。低pH、高醇沉淀步骤导致大规模捕获起始Cohn池的免疫球蛋白组合物。与最先进的免疫球蛋白生产过程相比，本文提供的方法显著减少在血浆的上游分级分离期间损失的免疫球蛋白的量。

本发明的方法减少在用于治疗性施用的足够高的纯度下从人血浆中分离蛋白质所需的蛋白质沉淀步骤的数量，然而同时增加重要的治疗性血液蛋白质诸如免疫球蛋白G(IgG)的回收率。具体地，该方法不需要用于来源于Cohn-Oncley、Kistler-Nitschmann和Deutsch分级分离方案的生产过程的初始高pH、低醇沉淀步骤(通常称为级分I沉淀)。相反，本文提供的方法采用分配沉淀物中大部分血浆IgG、IgA、IgM和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)含量和上清液中大部分白蛋白的初始低pH、高醇沉淀步骤(本文称为级分I-IV-1沉淀)。然后通过各种方法从IgA、IgM和A1PI中分离IgG，得到高产率IgG组合物。与采用级分I沉淀步骤的方法相比，在初始级分I-IV-1沉淀步骤中大规模捕获IgG增加生产过程的终产率为至少10％至25％。

在1946年，E.J.Cohn首先建立使用乙醇而不是盐用于血浆分级分离的方法。从此，乙醇沉淀已成为大规模生产血浆衍生的产品(诸如IgG和A1PI)的所选方法。通常，这些生产过程采用一系列乙醇分级分离步骤，提供各种血浆衍生的血液蛋白质的粗级分，其通过各种不同的下游方法/技术进一步富集。

最初开发Cohn方法以通过用醇分级沉淀获得相对高(95％)纯度的白蛋白。然而，通过Oncley等人、Deutsch等人以及Kistler和Nitschmann可以快速实现：来自Cohn方法6号的特定蛋白沉淀物(级分II+III)可被用作起始材料用于高度富集的免疫球蛋白组合物的纯化。为了获得静脉内施用IgG组合物所需的更高纯度和安全性，在醇分级分离步骤后几种纯化和精制(polishing)步骤(例如一般吸附或所有不同的色谱技术、交叉流过滤等)被加至IgG生产过程。

通常，IgG生产依赖于Cohn方法6级分II+III沉淀物或Kistler-Nitschmann沉淀物A作为起始材料用于下游处理。通过两步过程形成两种级分，其中：i.)通过在高pH(7.2)与低乙醇浓度(8-10％v/v)下进行的初始沉淀步骤(级分I沉淀)除去诸如纤维蛋白原和因子XIII的蛋白；和ii.)在pH 6.8和20-25％(v/v)乙醇(级分II+III)或在pH5.85和19％乙醇(v/v)乙醇(沉淀物A)下从级分I上清液中沉淀IgG，而白蛋白和大部分A1PI保留在上清液中。然而，使用级分II+III沉淀物或沉淀物A作为用于生产IgG组合物的起始材料导致在如上所述过程的几个步骤损失IgG。

为了克服这些问题，本发明人已开发使免疫球蛋白和A1PI共沉淀的初始纯化步骤，以提供含有原料血浆的几乎所有IgG和A1PI含量的起始材料，而白蛋白保留在上清液中。此分级分离步骤基本上将如Oncley等人(同上)所述的分级沉淀步骤I、II+III和IV-1合并为单一沉淀反应，本文称为级分I+II+III+IV-1(或级分I-IV-1)沉淀。

一方面，本发明提供使用级分I-IV-1沉淀物作为起始材料用于生产用于静脉内、皮下或肌内施用的高产率免疫球蛋白组合物的过程。在各种实施方案中，该方法还包括将α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)分离成从级分I-IV-1沉淀物中提取免疫球蛋白期间形成的悬浮液的不溶性级分。然后分离的不溶性级分可被用作生产血浆衍生的A1PI组合物的起始材料。

在一个实施方案中，本发明提供生产从混合血浆分离的蛋白质的治疗性组合物的方法。在一些实施方案中，这些生产方法包括与传统方法相比，增加各种血液蛋白质回收的初始低pH、高醇(例如，乙醇)沉淀步骤。在一些实施方案中，该方法用于生产含有分离自人血液、血浆的免疫球蛋白(例如，IgG)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H或间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白或其衍生物的一种或多种治疗性组合物。

II.定义

如本文所用，术语“IgG治疗”通常是指给患者静脉内、皮下或肌内施用IgG免疫球蛋白组合物用于治疗多种病状(诸如免疫缺陷、炎性疾病和自身免疫疾病)的治疗方法。IgG免疫球蛋白通常混合并由血浆制备。可以使用完整抗体或片段。IgG免疫球蛋白可被配制成更高浓度(例如，大于10％)用于皮下施用，或配制用于肌内施用。这对于制备成对特异性抗原(例如，Rho D因子、百日咳毒素、破伤风毒素、肉毒中毒毒素、狂犬病等)具有高于平均滴度的特定IgG制剂特别常见。

如本文所用，“冷冻-贫乏的血浆”是指除去在接近冷冻的温度下(例如，在温度低于约10℃，优选温度不高于约6℃)通过使血浆或混合血浆解冻而形成的冷冻沉淀物之后生成的上清液。在本发明的上下文中，血浆可以互换地指回收的血浆(即，已经从来自体内的全血分离的血浆)或原料血浆(即，通过血浆取出法收集的血浆)。虽然也可以使用新鲜血浆，但冷冻沉淀通常是例如通过使先前冷冻的混合血浆解冻来进行，该血浆已被测定安全和质量考虑因素。在低温下使冷冻的血浆完全解冻后，在冷却下(例如，≤6℃)通过离心或过滤从液体上清液中分离固体冷冻沉淀物。

如本文所用，“Cohn池”是指用于分级分离血浆样品或混合血浆样品的起始材料。Cohn池可以包括一个或多个全血浆、冷冻-贫乏的血浆和已经历预处理步骤的冷冻贫乏的血浆。在某些实施方案中，Cohn池是在预处理步骤中，例如，通过吸附到固相(例如，氢氧化铝、细碎二氧化硅等)或色谱步骤(例如，离子交换或肝素亲和色谱)已从中除去一个或多个血液因子的冷冻贫乏的血浆样品。各种血液蛋白，包括但不限于因子VIII抑制剂旁路活性(Factor Eight Inhibitor Bypass Activity)(FEIBA)、因子IX-复合物、因子VII、凝血酶原复合物和/或抗凝血酶III，可以在分级分离之前从冷冻贫乏的血浆样品中分离。

如本文所用，术语“富集的组合物”是指从血浆样品中分离的蛋白质组合物，其中所述蛋白质的纯度高于起始血浆样品中的蛋白质纯度。在一个实施方案中，富集的组合物中的蛋白质比起始血浆样品中的蛋白质纯至少25％。在其它实施方案中，富集的组合物比起始血浆样品纯至少50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。例如，与起始血浆样品(其中10％的总蛋白为IgG)相比，富集的IgG组合物(其中70％的总蛋白为IgG)为7倍富集。

如本文所用，术语“扩散加入”是指以离域形式向液体体系中加入物质的方法。例如，通过喷雾或使液体(例如，醇、pH调节剂、溶剂、去污剂或其它液体)雾化到液体系统(例如，血浆级分)、在多个位点将液体引入系统、使用扩散器端口将液体引入系统、位于或靠近叶轮或其它分散元件将液体引入或将以固态存在的化学物质分散在液体系统的扩展区域，可以实现扩散加入。

如本文所用，术语“喷雾”是指例如，在醇沉淀步骤(诸如级分I-IV-1沉淀步骤)期间，以液体物质的细液滴或雾形式将液体物质递送至系统的方法。喷雾可以通过任何加压装置来实现，诸如具有喷头或喷嘴并且手动或自动操作以产生液体的细雾的容器(例如，喷雾瓶)。通常，进行喷雾的同时将接收液体物质的系统连续搅拌或混合以确保液体在系统内快速和均匀分布。

如本文所用，术语“溶剂”包括能够溶解或分散一种或多种其它物质的任何液体物质。溶剂在性质上可以是无机的，诸如水，或者它可以是有机液体，诸如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。如在术语“溶剂去污剂处理”中所用，溶剂表示有机溶剂(例如，三-N-磷酸丁酯)，其为用于使溶液中脂质包膜的病毒灭活的溶剂去污剂混合物的一部分。

如本文所用，在本申请中术语“去污剂”与术语“表面活性剂”或“表面活性剂”互换使用。表面活性剂通常为两亲性，即，含有疏水性基团(“尾部”)和亲水性基团(“头部”)的有机化合物，这使得表面活性剂可溶于有机溶剂和水中。通过其头部形式上带电基团的存在可以将表面活性剂分类。非离子型表面活性剂在其头部不具有带电基团，而离子型表面活性剂在其头部带有净电荷。两性离子型表面活性剂含有具有两个相反的带电基团的头部。常见表面活性剂的一些实例包括：阴离子型(基于硫酸根、磺酸根或羧酸根阴离子)：全氟辛酸盐(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵和其它烷基硫酸盐、十二烷基醚硫酸钠(也称为月桂基醚硫酸钠或SLES)、烷基苯磺酸盐；阳离子型(基于季铵阳离子)：溴化十六烷基三甲铵(CTAB)即十六烷基三甲基铵溴化物和其它烷基三甲基铵盐、氯化十六烷基吡啶(CPC)、聚乙氧基化牛油脂肪胺(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)；长链脂肪酸及其盐：包括辛酸盐、辛酸、庚酸盐、己酸、庚酸、壬酸(nanoicacid)、癸酸等；两性离子型(两性的)：十二烷基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、可可两性甘氨酸盐；非离子型：烷基聚(环氧乙烷)、聚烷基酚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(商业上称为泊洛沙姆(Poloxamers)或泊洛沙胺(Poloxamines))、烷基聚葡萄糖苷(包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(例如，鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨醇酯(Tween 20、Tween 80等)、Triton去污剂和十二烷基二甲基氧化胺。

通过“治疗有效量或剂量”或“足够/有效量或剂量”意指产生施用效果的剂量。精确剂量将取决于治疗目的，并且本领域技术人员将使用已知技术(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)来确定。

如本文所用，术语“初始低pH、高醇沉淀”和“级分I-IV-1沉淀”可互换地指在最终醇浓度(通常为乙醇)为20％至30％(v/v)且pH为5.0至6.0时从Cohn池沉淀蛋白质。通常，所得的级分I-IV-1沉淀含有起始Cohn池的至少90％的免疫球蛋白含量，优选起始Cohn池的至少95％、更优选至少98％、最优选至少99％的免疫球蛋白含量。在优选的实施方案中，免疫球蛋白包括IgG免疫球蛋白。在另一个优选的实施方案中，在级分I-IV-1沉淀中α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)与免疫球蛋白共沉淀。

III.血浆分级分离

一方面，本发明提供采用初始沉淀步骤从混合血浆中分级分离治疗性蛋白质的方法，其中起始血浆的大部分免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)含量沉淀并且起始血浆的大部分白蛋白含量保留在上清液中。起始于这种初始沉淀步骤，许多重要的治疗性血液蛋白质可以以高回收率生产。

在一个实施方案中，本发明提供将血浆样品中的血液蛋白质分级分离的方法，所述方法包括在低pH、高醇条件下从起始血浆中沉淀免疫球蛋白和A1PI。这种低pH、高醇沉淀步骤导致形成沉淀物(本文称为级分I-IV-1沉淀物)和上清液(本文称为级分I-IV-1上清液)。

级分I-IV-1上清液将含有起始血浆的至少70％、优选至少80％、最优选至少90％的白蛋白含量。因此，此上清液可被用作用于生产药物白蛋白组合物的起始材料。

级分I-IV-1沉淀物将含有起始血浆的至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、最优选至少99％的免疫球蛋白含量。在具体的实施方案中，级分I-IV-1沉淀物含有起始血浆的至少98％、优选99％的IgG含量。因此，此沉淀物可被用作用于生产药物免疫球蛋白组合物的起始材料。在一个实施方案中，级分I-IV-1沉淀物被用作用于生产药物IgG组合物的起始材料。在又一个实施方案中，级分I-IV-1沉淀物被用作用于生产含有超过一种免疫球蛋白亚型的药物免疫球蛋白组合物的起始材料。

同样，级分I-IV-1沉淀物将含有起始血浆的至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、最优选至少98％的A1PI含量。因此，此沉淀物可被用作用于生产药物A1PI组合物的起始材料。

级分I-IV-1沉淀物还将含有起始血浆的至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％的因子H含量。因此，此沉淀物可被用作用于生产药物因子H组合物的起始材料。

级分I-IV-1沉淀物还将含有起始血浆的至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％的间-α-抑制剂(IaIp)含量。因此，此沉淀物可被用作用于生产药物IaIp组合物的起始材料。

一方面，本发明提供用于从在级分I-IV-1沉淀物中发现的A1PI中分离免疫球蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括将免疫球蛋白溶解于级分I-IV-1沉淀物的悬浮液中，同时将A1PI保留在悬浮液的不溶性部分中，并且然后分离可溶性和不溶性部分，例如通过过滤或离心。在一个实施方案中，该分离是借助于在分离可溶性和不溶性部分之前用细碎二氧化硅处理级分I-IV-1悬浮液。不受理论的约束，二氧化硅可结合与免疫球蛋白共溶解的A1PI，提高分配到悬浮液的不溶性部分的A1PI的量。

此外，已知在某些条件下因子H和IaIp结合颗粒二氧化硅(参见，WO/2011/011753、PCT/US2011/45099和PCT/US2011/038247；其公开内容出于所有目的据此以引用的方式整体特别并入本文)。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于从发现于级分I-IV-1沉淀物中的A1PI、因子H和IaIp中分离免疫球蛋白的方法，所述方法包括将级分I-IV-1沉淀物悬浮于足以溶解免疫球蛋白的水或低电导率缓冲液中；用二氧化硅处理该悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离可溶性部分，其中可溶性部分含有免疫球蛋白并且不溶性部分含有A1PI、因子H和IaIp。

在以上提供的方法的一个实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的可溶性部分含有起始血浆样品的至少80％的IgG含量。在优选的实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的可溶性部分含有起始血浆样品的至少90％的IgG含量。在更优选的实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的可溶性部分含有起始血浆样品的至少95％的IgG含量。在其它实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的可溶性部分含有起始血浆样品的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的IgG含量。

在以上提供的方法的一个实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的不溶性部分含有起始血浆样品的至少70％的A1PI含量。在优选的实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的不溶性部分含有起始血浆样品的至少80％的A1PI含量。在更优选的实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的不溶性部分含有起始血浆样品的至少90％的A1PI含量。在更优选的实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的不溶性部分含有起始血浆样品的至少95％的A1PI含量。在其它实施方案中，级分I-IV-1悬浮液的分离的不溶性部分含有起始血浆样品的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的A1PI含量。

使用初始大规模沉淀步骤(例如，级分I-IV-1沉淀)分级分离的血液蛋白质可以被例如，沉淀(例如，醇分级分离或聚乙二醇分级分离)、色谱法(离子交换色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱等)、过滤(超滤/渗滤、纳米过滤)、超离心、电泳制备等的适当方法进一步富集。

A.冷冻-贫乏的血浆的制备

用于制备浓缩的IgG组合物的起始材料通常由回收的血浆(即，已经从来自体内的全血分离的血浆)或原料血浆(即，通过血浆取出法收集的血浆)组成。纯化过程通常是以使预先冷冻的混合血浆解冻开始，该血浆已被测定安全和质量考虑因素。通常在温度不高于6℃进行解冻。在低温下使冷冻的血浆完全解冻后，在冷却下(例如，≤6℃)进行离心以从液体上清液中分离固体冷冻沉淀物。或者，通过过滤而不是离心可以进行分离步骤。然后将液体上清液(在通过离心从新鲜的解冻血浆中除去冷的不溶性蛋白质之后，也称为“冷冻-贫乏的血浆”)在下一步骤进行处理。可在此时进行各种附加步骤用于分离因子VIII抑制剂旁路活性(FEIBA)、因子IX-复合物、因子VII、抗凝血酶III、凝血酶原复合物等。

B.第一沉淀事件–级分I-IV-1沉淀

在一个实施方案中，本发明提供将血浆样品中的血液蛋白质分级分离的方法，所述方法包括在第一沉淀步骤中在低pH、高醇条件下使起始血浆中的免疫球蛋白和A1PI沉淀。这种低pH、高醇沉淀步骤导致形成沉淀物(级分I-IV-1沉淀物)和上清液(级分I-IV-1上清液)。

在一个实施方案中，通过在pH 5.0和6.0之间将乙醇与起始血浆池(Cohn池)混合至终浓度为20％至30％(v/v)来进行第一沉淀步骤。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±2％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±1％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25％(v/v)。同样，在一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.5下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.4下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.3下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.2下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.1下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5下进行。在其它实施方案中，第一沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表1、表1、表1、表1、表1和表1所示。

表1.用于Cohn池的低pH、高醇沉淀的pH和最终乙醇浓度的组合。

表2.用于Cohn池的低pH、高醇沉淀的pH和最终乙醇浓度的组合。

表3.用于Cohn池的低pH、高醇沉淀的pH和最终乙醇浓度的组合。

表4.用于Cohn池的低pH、高醇沉淀的pH和最终乙醇浓度的组合。

表5.用于Cohn池的低pH、高醇沉淀的pH和最终乙醇浓度的组合。

表6.用于Cohn池的低pH、高醇沉淀的pH和最终乙醇浓度的组合。

表7.用于Cohn池的低pH、高醇沉淀的pH和最终乙醇浓度的组合。

表8.用于Cohn池的低pH、高醇沉淀的pH和最终乙醇浓度的组合。

因此，在一个实施方案中，本发明提供用于使血浆样品中的血液蛋白质分级分离的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使免疫球蛋白和A1PI沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；其中所述第一上清液含有Cohn池的至少75％的白蛋白含量。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。

在本文提供的方法的一个实施方案中，起始Cohn池的至少90％的免疫球蛋白含量在初始沉淀反应中沉淀。在优选的实施方案中，起始Cohn池的至少95％的免疫球蛋白含量在初始沉淀反应中沉淀。在更优选的实施方案中，起始Cohn池的至少99％的免疫球蛋白含量在初始沉淀反应中沉淀。在某些实施方案中，起始Cohn池的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的免疫球蛋白含量在初始沉淀反应中沉淀。在更具体的实施方案中，起始Cohn池的免疫球蛋白含量是指起始Cohn池的IgG、IgA和IgM含量。在一个具体的实施方案中，起始Cohn池的免疫球蛋白含量是指起始Cohn池的IgG含量。

在本文提供的方法的一个实施方案中，起始Cohn池的至少80％的α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)含量在初始沉淀反应中沉淀。在优选的实施方案中，起始Cohn池的至少90％的A1PI含量在初始沉淀反应中沉淀。在更优选的实施方案中，起始Cohn池的至少95％的A1PI含量在初始沉淀反应中沉淀。在某些实施方案中，起始Cohn池的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的A1PI含量在初始沉淀反应中沉淀。

在本文提供的方法的一个实施方案中，起始Cohn池的至少70％的因子H含量在初始沉淀反应中沉淀。在优选的实施方案中，起始Cohn池的至少80％的因子H含量在初始沉淀反应中沉淀。在优选的实施方案中，起始Cohn池的至少90％的因子H含量在初始沉淀反应中沉淀。在更优选的实施方案中，起始Cohn池的至少95％的因子H含量在初始沉淀反应中沉淀。在某些实施方案中，起始Cohn池的至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的因子H含量在初始沉淀反应中沉淀。

在本文提供的方法的一个实施方案中，起始Cohn池的至少70％的间-α-抑制剂(IaIp)含量在初始沉淀反应中沉淀。在优选的实施方案中，起始Cohn池的至少80％的IaIp含量在初始沉淀反应中沉淀。在优选的实施方案中，起始Cohn池的至少90％的IaIp含量在初始沉淀反应中沉淀。在更优选的实施方案中，起始Cohn池的至少95％的IaIp含量在初始沉淀反应中沉淀。在某些实施方案中，起始Cohn池的至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的IaIp含量在初始沉淀反应中沉淀。

因此，在一个实施方案中，本发明提供用于将Cohn池的血液蛋白质分级分离的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使免疫球蛋白、A1PI、因子H和IaIp沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；其中所述第一沉淀物含有i.)起始Cohn池的至少95％、优选至少97％、更优选至少99％的IgG含量、ii.)起始Cohn池的至少90％、优选至少95％、最优选至少97％的A1PI含量、iii.)起始Cohn池的至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的因子H含量、和iv.)起始Cohn池的至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的IaIp含量，并且进一步其中所述第一上清液含有Cohn池的至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的白蛋白含量。在一个实施方案中，通过在pH 5.0和6.0之间将乙醇与起始血浆池(Cohn池)混合至终浓度为22％至28％(v/v)来进行第一沉淀步骤。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±2％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±1％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25％(v/v)。同样，在一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.5下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.4下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.3下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.2下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.1下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5下进行。在其它实施方案中，第一沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。

IV.免疫球蛋白组合物的制备

通常，根据本发明的免疫球蛋白制剂可以从任何合适的起始血浆材料(例如，回收血浆或原料血浆)中制备。在典型的实例中，从健康供体收集血液或血浆。通常，从与将施用免疫球蛋白制剂的受试者相同的动物物种中收集血液(通常被称为“同源”免疫球蛋白)。回收的血浆或原料血浆可以被冷冻-沉淀或可以不被冷冻-沉淀以提供冷冻-贫乏的血浆。此外，还可以通过吸附、离子交换色谱或其它色谱方法处理血浆或冷冻-贫乏的血浆以除去一种或多种血液因子。然后在低pH、高醇条件下从血浆或冷冻-贫乏的血浆起始材料(称为“Cohn池”)中沉淀免疫球蛋白以形成级分I-IV-1沉淀物。

通过适当方法，例如，沉淀(醇分级分离或聚乙二醇分级分离)、色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱等)、过滤(超滤/渗滤、纳米过滤)、超离心、电泳制备等可以从级分I-IV-1沉淀物中进一步富集免疫球蛋白。(参见，例如，Cohn等人,J.Am.Chem.Soc.68:459-75(1946)；Oncley等人,J.Am.Chem.Soc.71:541-50(1949)；Barundern等人,Vox Sang.7:157-74(1962)；Koblet等人,Vox Sang.13:93-102(1967)；美国专利号5,122,373和5,177,194；PCT/US2010/036470；和PCT/US2011/038247；上述的公开内容出于所有目的在此通过引用整体并入本文)。

A.上游处理

在其它方面，本发明提供用于通过进行将起始血浆的大部分免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶含量沉淀的初始沉淀步骤将存在于混合血浆中的蛋白质分级分离的方法。为了进一步增加发现于初始沉淀步骤的沉淀物和上清液中的单一血浆蛋白质(例如，IgG、A1PI、因子H、IaIp等)的纯度，通过分级分离(例如，通过乙醇沉淀、PEG沉淀、盐析等)、色谱、过滤或其它方法可以进一步富集这些组合物。尽管用于富集血浆衍生的蛋白质的这些各种技术的使用可以任何顺序进行，但是在特定的实施方案中，第一沉淀物和/或上清液首先被分级分离(例如，通过乙醇沉淀)，然后使用色谱和/或过滤技术富集。在本发明的上下文中，初始沉淀反应和随后的分级分离合称为“上游处理”步骤，而色谱和过滤步骤合称为“下游处理”步骤。

1.大规模免疫球蛋白沉淀

如本文所述，发明人已发现用于使人血浆分级分离的改进方法以纯化治疗上有利的血液蛋白质，诸如免疫球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、因子H、间-α-抑制剂蛋白(IaIp)、白蛋白、纤维蛋白原等。此方法包括初始纯化步骤，其中起始Cohn池(即，血液、血浆和/或预处理血浆)的大部分免疫球蛋白、A1PI、因子H、IaIp和纤维蛋白原含量沉淀并且起始Cohn池的大部分白蛋白含量保留在上清液中。有利地，发明人已开发通过从初始沉淀物中提取免疫球蛋白而非其它蛋白质从A1PI、因子H和IaIp中分离免疫球蛋白的方法。特别地，发明人已发现用细碎二氧化硅(SiO₂)处理初始沉淀物的悬浮液改善了A1PI、因子H和IaIp在不溶性级分中的保留。不受理论限制，发明人相信在某些条件下，可以最初从沉淀物中提取的A1PI、因子H和IaIp结合细碎二氧化硅，随后将其与悬浮液的不溶性部分移除。分离所得的上清液(即，悬浮液的可溶性级分)提供含有起始Cohn级分的大部分免疫球蛋白含量的富集溶液。

一方面，本发明提供用于从Cohn池制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中从Cohn池中共沉淀免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)以形成第一沉淀物和第一上清液；将第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；和回收第一悬浮液的可溶性级分，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。通常，可以使用任何化学方法用于沉淀免疫球蛋白和A1PI，所述方法包括但不限于醇沉淀(例如，使用乙醇或甲醇)、使用水溶性聚合物的沉淀(例如，PEG或葡聚糖)和盐析(例如，使用磷酸铵、硫酸铵、柠檬酸钠等)。在优选的实施方案中，所述沉淀是醇沉淀，优选乙醇沉淀。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在一个实施方案中，通过在pH 5.0和6.0之间将乙醇与Cohn池混合至终浓度为20％至30％(v/v)来进行第一沉淀步骤。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±2％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±1％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25％(v/v)。同样，在一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.5下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.4下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.3下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.2下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.1下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5下进行。在其它实施方案中，第一沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

本文提供的方法提供与依赖于初始低醇沉淀步骤(即，级分I沉淀)的最先进的纯化方法相比，由于在起始沉淀反应中起始Cohn池的大部分免疫球蛋白含量的沉淀，在最终富集的产物中免疫球蛋白回收的显著提高的产率。

因此，在本文提供的方法的一个实施方案中，起始Cohn池的至少90％的免疫球蛋白含量在初始沉淀反应中沉淀。在优选的实施方案中，起始Cohn池的至少95％的免疫球蛋白含量在初始沉淀反应中沉淀。在更优选的实施方案中，起始Cohn池的至少99％的免疫球蛋白含量在初始沉淀反应中沉淀。在某些实施方案中，起始Cohn池的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的免疫球蛋白含量在初始沉淀反应中沉淀。在一个具体的实施方案中，起始Cohn池的免疫球蛋白含量是指起始Cohn池的IgG含量。

如本文提供的实施例所示，使用初始低pH、高醇沉淀步骤(即，级分I-IV-1沉淀)导致起始Cohn池的至少99％的IgG含量沉淀。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的99％至100％的IgG含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；和从第一沉淀物中回收IgG，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。

如表15和表31中存在的数据所证实，Cohn池的超过97％的α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)含量也通过初始低pH、高醇沉淀步骤沉淀。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；和回收第一悬浮液的可溶性级分，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

此外，发现Cohn池的超过90％的白蛋白含量不能通过初始低pH、高醇沉淀步骤(表33)沉淀，并且因此可以从上清液中回收。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；和回收第一悬浮液的可溶性级分，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

2.免疫球蛋白的提取和分离

与Cohn级分II+III沉淀物或Kistler-Nitschmann沉淀物A相比，通过本文提供的方法形成的初始沉淀物含有显著较高水平的非免疫球蛋白的蛋白质，包括A1PI和纤维蛋白原。例如，如表30所示，在初始低pH、高醇沉淀反应中起始Cohn池的几乎100％的纤维蛋白原含量与免疫球蛋白共沉淀。这与Cohn-Oncley和Kistler-Nitschmann纯化方案相反，其中在初始低醇沉淀步骤(级分I沉淀)除去大部分纤维蛋白原。同样，如表15和表31所示，在初始低pH、高醇沉淀反应中起始Cohn池的超过97％的α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)含量与免疫球蛋白共沉淀。相反，在Cohn-Oncley和Kistler-Nitschmann纯化方案中大部分A1PI与免疫球蛋白不能共沉淀。相反，A1PI发现于级分II+III上清液或上清液A。

因此，为了提供药用级免疫球蛋白组合物，存在于初始沉淀物中的污染物诸如A1PI和纤维蛋白原需要从免疫球蛋白组合物中除去。这可以实现，例如，通过进一步分级分离第一沉淀物(例如，通过使用醇、非离子亲水聚合物的差示沉淀或盐析)、色谱方法或过滤方法。

在一个实施方案中，将第一沉淀物悬浮于适合于从沉淀物中提取免疫球蛋白的注射用水(WFI)或低离子强度缓冲液中。在某些实施方案中，然后用细碎二氧化硅(SiO₂)处理悬浮液，并且从含有大部分A1PI和纤维蛋白原的悬浮液的不溶性部分中分离含有免疫球蛋白的悬浮液的可溶性部分。

用于提取第一沉淀物的合适溶液将通常具有pH为4.0和5.5之间。在某些实施方案中，溶液将具有pH为4.5和5.0之间，在其它实施方案中，提取溶液将具有pH为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.7±0.1。在另一个优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.8±0.1。在另一个优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.9±0.1。通常，使用选自，例如，乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、其混合物等的缓冲剂可以满足这些pH需要。合适的缓冲液浓度通常范围为5mM至100mM，或10mM至50mM，或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mM缓冲剂。

提取缓冲液将优选具有电导率为0.5mS/cm至2.0mS/cm。例如，在某些实施方案中，提取缓冲液的电导率将为0.5±0.1mS/cm，或0.6±0.1mS/cm、0.7±0.1mS/cm、0.8±0.1mS/cm、0.9±0.1mS/cm、1.0±0.1mS/cm、1.1±0.1mS/cm、1.2±0.1mS/cm、1.3±0.1mS/cm、1.4±0.1mS/cm、1.5±0.1mS/cm、1.6±0.1mS/cm、1.7±0.1mS/cm、1.8±0.1mS/cm、1.9±0.1mS/cm或2.0±0.1mS/cm。一个本领域的普通技术人员将知道如何产生具有适当电导率的提取缓冲液。在一个特定的实施方案中，提取缓冲液在pH为4.8±0.2和电导率为0.7mS/cm至0.9mS/cm下含有5mM磷酸二氢钠和5mM乙酸盐。

在一个实施方案中，在过滤前将细碎二氧化硅与级分I-IV-1悬浮液混合。在一个实施方案中，此预处理步骤包括加入细碎二氧化硅颗粒(例如，热解法二氧化硅；)，然后进行40分钟至80分钟的孵育期，在此期间持续混合悬浮液。在某些实施方案中，培养期将在约50分钟和约70分钟之间，或约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90分钟或更长时间。通常，将在0℃和10℃之间，或在2℃和8℃之间进行处理。在某些实施方案中，可以在约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃进行处理。在特定实施方案中，在2℃和10℃之间进行处理。在优选的实施方案中，在5℃和10℃之间进行处理。

在一个实施方案中，以20g/kg级分I-IV-1沉淀物和100g/kg级分I-IV-1沉淀物之间的浓度加入热解法二氧化硅。在另一个实施方案中，以30g/kg级分I-IV-1沉淀物和80g/kg级分I-IV-1沉淀物之间的浓度加入热解法二氧化硅。在某些实施方案中，可以以约20g/kg级分I-IV-1沉淀物或约25g/kg、30g/kg、35g/kg、40g/kg、45g/kg、50g/kg、55g/kg、60g/kg、65g/kg、70g/kg、75g/kg、80g/kg、85g/kg、90g/kg、95g/kg或100g/kg级分I-IV-1沉淀物的浓度加入热解法二氧化硅。在一个具体的实施方案中，将热解法二氧化硅(例如，Aerosil380或等效物)加至级分I-IV-1悬浮液中至终浓度为40±20g/kg级分I-IV-1沉淀物。在另一个具体的实施方案中，将热解法二氧化硅加至级分I-IV-1悬浮液中至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀物。混合发生在2℃至8℃至少50分钟至70分钟。

在某些实施方案中，以0.01g/g总蛋白至10g/g总蛋白的浓度向免疫球蛋白组合物中加入SiO₂。在另一个实施方案中，以0.01g/g总蛋白至5g/g总蛋白的浓度向免疫球蛋白组合物中加入SiO₂。在另一个实施方案中，以0.02g/g总蛋白至4g/g总蛋白的浓度向免疫球蛋白组合物中加入SiO₂。在一个实施方案中，以0.1g/克总蛋白的终浓度加入SiO₂。在另一个具体的实施方案中，以至少0.2g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在另一个具体的实施方案中，以至少0.25g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在其它具体的实施方案中，以至少1g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在另一个具体的实施方案中，以至少2g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在另一个具体的实施方案中，以至少2.5g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在又一其它具体的实施方案中，以至少0.01g/g总蛋白或至少0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、0.07g、0.08g、0.09g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g、4.5g、5.0g、5.5g、6.0g、6.5g、7.0g、7.5g、8.0g、8.5g、9.0g、9.5g、10.0g或更多/克总蛋白的浓度加入细碎二氧化硅。

因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

此外，发现Cohn池的超过90％的白蛋白含量不能通过初始低pH、高醇沉淀步骤(表33)沉淀，并且因此可以从上清液中回收。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，并且进一步其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，存在于悬浮液的可溶性部分的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的纤维蛋白原进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的因子H进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的IaIp进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

3.分级分离

在一个实施方案中，将从第一悬浮液(I-IV-1膏状悬浮液)的可溶性部分回收的免疫球蛋白通过分级分离进一步富集。通常，可以使用任何分级分离方法(例如，醇或聚合物沉淀、盐析等)。在优选的实施方案中，通过乙醇沉淀通过将第一悬浮液的可溶性部分分级分离将免疫球蛋白进一步富集。在一个实施方案中，通过向第一悬浮液的可溶性部分以适合将免疫球蛋白沉淀的终浓度和pH加入乙醇来富集免疫球蛋白，而至少一种污染物不沉淀。在另一个实施方案中，通过向第一悬浮液的可溶性部分以适合将至少一种污染物沉淀的终浓度和pH加入乙醇来富集免疫球蛋白，而免疫球蛋白不沉淀。

将从初始低pH、高醇沉淀步骤回收的材料另外分级分离是可选的。在某些实施方案中，使用本文所述的一个或多个各种下游处理步骤可以进一步富集从初始低pH、高醇沉淀步骤回收的免疫球蛋白组合物。在其它实施方案中，通过使用一个或多个另外的沉淀步骤可以进一步处理从初始低pH、高醇沉淀步骤回收的组合物。在某些实施方案中，另外的免疫球蛋白沉淀步骤可用于浓缩免疫球蛋白组合物、制备免疫球蛋白用于储存和/或制备免疫球蛋白组合物用于运输。

在一个实施方案中，本发明提供用于从Cohn池制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中从Cohn池中共沉淀免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)以形成第一沉淀物和第一上清液；将第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；在第二沉淀步骤中使第一悬浮液的免疫球蛋白沉淀以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从第一悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在示例性实施方案中，在终浓度为22％至28％(v/v)下在pH为6.5和7.5之间时通过使乙醇与第二悬浮液的可溶性部分(例如，过滤或离心后形成的悬浮液的滤液或上清液)混合来进行第二沉淀步骤。在一个实施方案中，使乙醇混合至终浓度为25±3％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇混合至终浓度为25±2％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇混合至终浓度为25±1％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇混合至终浓度为25％(v/v)。同样，在一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.5下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.4下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.3下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.2下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.1下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0下进行。在特定的实施方案中，使用最终乙醇浓度为25±3％(v/v)在pH为7.0±0.3下进行第二沉淀步骤。

在优选的实施方案中，在进行第二沉淀步骤之前用去污剂处理第一悬浮液或其可溶性级分。在一个实施方案中，在进行第二沉淀步骤之前用柠檬酸进一步处理第一悬浮液或其可溶性级分。在特定实施方案中，将聚山梨醇酯-80加至第一悬浮液或其可溶性级分中并且将组合物孵育至少30分钟。在另一个具体的实施方案中，将二水合柠檬酸钠(Sodiumcitrate dihydrade)进一步加至第一悬浮液或其可溶性级分中并且将组合物另外孵育至少30分钟。在一个实施方案中，以约0.2％(w/v)的终浓度加入聚山梨醇酯-80。在一个实施方案中，然后以约8g/L的终浓度将二水合柠檬酸钠混合至溶液中。在特定的实施方案中，在约2℃至8℃之间的温度在连续搅拌下进行孵育。

在特定的实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的99％至100％的IgG含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在具体的实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的99％至100％的IgG含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液混合从第一悬浮液中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；回收第一悬浮液的可溶性级分；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在一个实施方案中，从第一悬浮液分离的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，在第一沉淀步骤中Cohn池的99％和100％之间的IgG含量沉淀。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在具体的实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；回收第一悬浮液的可溶性级分；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液混合从第一悬浮液中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在一个实施方案中，从第一悬浮液分离的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，在第一沉淀步骤中Cohn池的99％和100％之间的IgG含量沉淀。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的99％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；回收第一悬浮液的可溶性级分；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在一个实施方案中，从第一悬浮液分离的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，第一上清液中存在的白蛋白进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，在第一沉淀步骤中Cohn池的99％和100％之间的IgG含量沉淀。在优选的实施方案中，Cohn池的90％和100％之间的白蛋白含量存在于第一上清液中。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的99％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；回收第一悬浮液的可溶性部分；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3时以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液的可溶性部分混合从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在一个实施方案中，从第一悬浮液分离的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，第一上清液中存在的白蛋白进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，在第一沉淀步骤中Cohn池的99％和100％之间的IgG含量沉淀。在优选的实施方案中，Cohn池的90％和100％之间的白蛋白含量存在于第一上清液中。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，回收第一悬浮液的可溶性部分；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在具体的实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，回收第一悬浮液的可溶性部分；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液的可溶性部分混合从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，存在于悬浮液的可溶性部分的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的纤维蛋白原进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的因子H进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的IaIp进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液的可溶性部分混合从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收免疫球蛋白，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，存在于悬浮液的可溶性部分的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的纤维蛋白原进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的因子H进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的IaIp进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在一个实施方案中，通过用冷的提取缓冲液使沉淀物悬浮来从第二沉淀物中回收免疫球蛋白。例如，以1份沉淀物对2-15份注射用水(WFI)或低电导率缓冲液的比率使第二沉淀物悬浮。在优选的实施方案中，第二沉淀物以1份沉淀物对4-5份(优选3.5份)WFI的比率悬浮。在一个实施方案中，在0℃和8℃之间的温度下进行悬浮步骤。在一个实施方案中，将溶液的最终pH调节至4.5至5.6，优选至5.2±0.2。在一个实施方案中，用乙酸进行此pH调整。在一个实施方案中，将悬浮液的电导率增加至2.5mS/cm和6.0mS/cm之间以增加免疫球蛋白的溶解度。在一个实施方案中，通过加入氯化钠增加电导率。

用于提取第二沉淀物的合适溶液包括WFI和低电导率缓冲液。在一个实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约10mS/cm。在其它实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约9mS/cm、8mS/cm、7mS/cm、6mS/cm、5mS/cm、4mS/cm、3mS/cm、2mS/cm或1mS/cm。在优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约6mS/cm。在另一个优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约4mS/cm。在另一个优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约2mS/cm。

在一个实施方案中，从不溶性部分中分离含有免疫球蛋白的悬浮液的可溶性部分。在一个实施方案中，这通过用具有标称孔径为0.1μm和0.4μm的深层过滤器过滤悬浮液来完成。在一个实施方案中，深层过滤器的标称孔径为0.2μm(例如，Cuno VR06过滤器或等效物)。在一个实施方案中，过滤后过滤器用WFI或合适的缓冲液洗涤以回收另外的免疫球蛋白并将后洗液加至滤液中。在优选的实施方案中，使用电导率为约2.5mS/cm和约6.0mS/cm之间的氯化钠溶液进行过滤器的后洗。在另一个实施方案中，将第二悬浮液离心以回收可溶性部分。

B.下游处理

使用沉淀免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)而非白蛋白的初始沉淀步骤分级分离后获得的免疫球蛋白级分，可根据本领域公知的方法进一步富集，所述方法包括但不限于：色谱(例如，离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水性相互作用色谱(HIC)、羟磷灰石色谱(HAP)、蛋白质A亲和色谱、免疫亲和色谱、尺寸排阻色谱等)；过滤(例如，超滤和/或渗滤)；和一个或多个病毒减少步骤(例如，纳米过滤、溶剂和去污剂处理、UV照射、热处理、低pH培养等)。

在一个实施方案中，本发明提供用于从Cohn池制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，该方法包括初始低pH、高醇沉淀步骤和至少一个下游处理步骤(例如，色谱)。在某些实施方案中，该方法还包括在至少一个下游处理步骤(例如，PptG沉淀步骤)之前的第二沉淀步骤。第二沉淀步骤是可选的，因为初始低pH、高醇沉淀物的悬浮液可以直接用于下游纯化。

在一个实施方案中，通过进行至少一次色谱步骤进一步富集存在于使用初始低pH、高醇沉淀步骤制备的血浆来源的组合物中的免疫球蛋白。在一个实施方案中，色谱步骤选自阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱(HIC)、羟磷灰石色谱(HAP)、蛋白A亲和色谱、免疫亲和色谱和尺寸排阻色谱。在特定的实施方案中，通过进行阴离子交换色谱来富集免疫球蛋白。在另一个实施方案中，通过进行阳离子交换色谱进一步富集免疫球蛋白。在具体的实施方案中，通过进行阳离子和阴离子交换色谱进一步富集免疫球蛋白。

在特定的实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，将免疫球蛋白结合至阳离子交换树脂上；从阳离子交换上洗脱免疫球蛋白以形成阳离子交换洗脱物；使阳离子交换洗脱物和阴离子交换树脂接触；和回收不与树脂结合的免疫球蛋白，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从阴离子交换色谱步骤回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在另一个实施方案中，Cohn池的80％和100％之间(优选90％和100％之间)的白蛋白含量存在于第一上清液中。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，该方法还包括至少一个病毒减少/灭活步骤。在优选的实施方案中，该方法还包括至少两个病毒减少/灭活步骤。在更优选的实施方案中，该方法还包括至少三个病毒减少/灭活步骤。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在特定的实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，回收第一悬浮液的可溶性部分；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液的可溶性部分混合从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀免疫球蛋白，以形成包含免疫球蛋白的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；从第二沉淀物中回收免疫球蛋白；将免疫球蛋白结合至阳离子交换树脂上；从阳离子交换上洗脱免疫球蛋白以形成阳离子交换洗脱物；使阳离子交换洗脱物和阴离子交换树脂接触；和回收不与树脂结合的免疫球蛋白，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从阴离子交换色谱步骤回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在另一个实施方案中，Cohn池的80％和100％之间(优选90％和100％之间)的白蛋白含量存在于第一上清液中。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，该方法还包括至少一个病毒减少/灭活步骤。在优选的实施方案中，该方法还包括至少两个病毒减少/灭活步骤。在更优选的实施方案中，该方法还包括至少三个病毒减少/灭活步骤。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在一个特定的实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在低pH、高醇沉淀步骤中使Cohn池的免疫球蛋白和A1PI沉淀；分离沉淀的免疫球蛋白和A1PI；通过进行阳离子交换色谱富集免疫球蛋白组合物；和通过进行阴离子交换色谱进一步富集免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在一个实施方案中，该方法还包括至少一个病毒减少/灭活步骤。在优选的实施方案中，该方法还包括至少两个病毒减少/灭活步骤。在更优选的实施方案中，该方法还包括至少三个病毒减少/灭活步骤。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在低pH、高醇沉淀步骤中使Cohn池的免疫球蛋白和A1PI沉淀；分离沉淀的免疫球蛋白和A1PI；在第二沉淀步骤中使分离的免疫球蛋白沉淀；通过进行阳离子交换色谱富集免疫球蛋白组合物；和通过进行阴离子交换色谱进一步富集免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在一个实施方案中，该方法还包括至少一个病毒减少/灭活步骤。在优选的实施方案中，该方法还包括至少两个病毒减少/灭活步骤。在更优选的实施方案中，该方法还包括至少三个病毒减少/灭活步骤。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供用于制备富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在低pH、高醇沉淀步骤中使Cohn池的免疫球蛋白和A1PI沉淀；分离沉淀的免疫球蛋白和A1PI；在第二沉淀步骤中使分离的免疫球蛋白沉淀；用溶剂和去污剂处理免疫球蛋白组合物以使病毒失活；通过进行阳离子交换色谱富集免疫球蛋白组合物；通过进行阴离子交换色谱进一步富集免疫球蛋白组合物；和纳米过滤免疫球蛋白组合物以除去病毒。在一个实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在一个实施方案中，该方法还包括通过超滤/渗滤使免疫球蛋白组合物浓缩至最终蛋白浓度为5g/L至25g/L。在特定的实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物的终浓度为5±1％(w/v)。在另一个特定的实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物的终浓度为10±1％(w/v)。在另一个特定的实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物的终浓度为15±1％(w/v)。在另一个特定的实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物的终浓度为20±2％(w/v)。在另一个特定的实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物的终浓度为25±2％(w/v)。在一个实施方案中，富集的免疫球蛋白组合物是IgG组合物。

C.IgG从级分I-IV-1沉淀物中的示例性富集

1.级分I-IV-1沉淀物的提取

为了溶解级分I-IV-1沉淀物的IgG含量，冷的提取缓冲液用于以1份沉淀物对15份提取缓冲液的典型比率再悬浮分级分离II+III沉淀物。可使用其它合适的再悬浮比率，例如1:8至1:30、1:10至1:20、或1:12至1:18、或1:13至1:17、或1:14至1:16。在某些实施方案中，再悬浮比率可以是1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30或更高。

用于提取第一沉淀物的合适溶液将通常具有pH为4.0和5.5之间。在某些实施方案中，溶液将具有pH为4.5和5.0之间，在其它实施方案中，提取溶液将具有pH为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.7±0.1。在另一个优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.8±0.1。在另一个优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.9±0.1。通常，使用选自，例如，乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、其混合物等的缓冲剂可以满足这些pH需要。合适的缓冲液浓度通常范围为5mM至100mM，或10mM至50mM，或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mM缓冲剂。

提取缓冲液将优选具有电导率为0.5mS/cm至2.0mS/cm。例如，在某些实施方案中，提取缓冲液的电导率将为0.5±0.1mS/cm，或约0.6±0.1mS/cm、0.7±0.1mS/cm、0.8±0.1mS/cm、0.9±0.1mS/cm、1.0±0.1mS/cm、1.1±0.1mS/cm、1.2±0.1mS/cm、1.3±0.1mS/cm、1.4±0.1mS/cm、1.5±0.1mS/cm、1.6±0.1mS/cm、1.7±0.1mS/cm、1.8±0.1mS/cm、1.9±0.1或2.0±0.1mS/cm。一个本领域的普通技术人员将知道如何产生具有适当电导率的提取缓冲液。

在示例性实施方案中，使用含有5mM磷酸二氢钠和5mM乙酸盐的提取缓冲液以1:15的膏对缓冲液比率提取级分I-IV-1沉淀物，提取缓冲液的pH用乙酸调节至4.8±0.2。在一个实施方案中，在提取过程持续期间溶液的pH保持在pH为4.8±0.3。在具体的实施方案中，在提取过程持续期间溶液的pH保持在pH为4.8±0.2。

通常，在温度0℃和10℃之间或2℃和8℃之间进行提取。在某些实施方案中，可以在0±1℃、1±1℃、2±1℃、3±1℃、4±1℃、5±1℃、6±1℃、7±1℃、8±1℃、9±1℃或10±1℃进行提取。在特定的实施方案中，在2℃和10℃之间进行提取。典型地，提取过程将进行60分钟和300分钟之间、或120分钟和240分钟之间、或150分钟和210分钟之间，同时连续搅拌悬浮液。在某些实施方案中，提取过程将进行约60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、130分钟、140分钟、150分钟、160分钟、170分钟、180分钟、190分钟、200分钟、210分钟、220分钟、230分钟、240分钟、250分钟、260分钟、270分钟、280分钟、290分钟、300分钟或更长。在优选的实施方案中，提取过程将进行至少160分钟，同时连续搅拌。

2.二氧化硅(SiO₂)处理

与Cohn-Oncley和Kistler-Nitschmann纯化相比，通过本文提供的方法形成的含有初始免疫球蛋白的沉淀物，含有显著较高水平的非免疫球蛋白的蛋白质，包括A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp。已知因子H和IaIp可以被细碎二氧化硅结合，并随后从细碎二氧化硅洗脱(参见，WO 2011/011753和PCT/US2011/045099，它们的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文)。有利的是，发现在提取级分I-IV-1沉淀物后和过滤级分I-IV-1悬浮液前包含SiO₂处理步骤，有助于将A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp分离至在过滤级分I-IV-1悬浮液期间形成的不溶性滤饼中。

因此，在一个实施方案中，在过滤前将细碎二氧化硅与级分I-IV-1悬浮液混合。在一个实施方案中，此预处理步骤包括加入细碎二氧化硅颗粒(例如，热解法二氧化硅；)，然后进行40分钟至80分钟的孵育期，在此期间持续混合悬浮液。在某些实施方案中，培养期将在约50分钟和约70分钟之间，或约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90分钟或更长时间。通常，将在0℃和10℃之间，或在2℃和8℃之间进行处理。在某些实施方案中，可以在约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃进行处理。在特定实施方案中，在2℃和10℃之间进行处理。在优选的实施方案中，在5℃和10℃之间进行处理。

在某些实施方案中，以20g/kg级分I-IV-1沉淀物和100g/kg级分I-IV-1沉淀物之间的浓度加入热解法二氧化硅。在某些实施方案中，可以以约20g/kg级分I-IV-1沉淀物或约25g/kg、30g/kg、35g/kg、40g/kg、45g/kg、50g/kg、55g/kg、60g/kg、65g/kg、70g/kg、75g/kg、80g/kg、85g/kg、90g/kg、95g/kg或100g/kg级分I-IV-1沉淀物的浓度加入热解法二氧化硅。在一个具体的实施方案中，将热解法二氧化硅(例如，Aerosil 380或等效物)加至级分I-IV-1悬浮液中至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀物。混合发生在2℃至8℃至少50分钟至70分钟。

在某些实施方案中，以0.01g/g总蛋白至10g/g总蛋白的浓度向IgG组合物中加入SiO₂。在另一个实施方案中，以0.01g/g总蛋白至5g/g总蛋白的浓度向IgG组合物中加入SiO₂。在另一个实施方案中，以0.02g/g总蛋白至4g/g总蛋白的浓度向IgG组合物中加入SiO₂。在一个实施方案中，以0.1g/克总蛋白的终浓度加入SiO₂。在另一个具体的实施方案中，以至少0.2g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在另一个具体的实施方案中，以至少0.25g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在其它具体的实施方案中，以至少1g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在另一个具体的实施方案中，以至少2g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在另一个具体的实施方案中，以至少2.5g/克总蛋白的浓度加入热解法二氧化硅。在又一其它具体的实施方案中，以至少0.01g/g总蛋白或至少0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、0.07g、0.08g、0.09g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g、4.5g、5.0g、5.5g、6.0g、6.5g、7.0g、7.5g、8.0g、8.5g、9.0g、9.5g、10.0g或更多/克总蛋白的浓度加入细碎二氧化硅。

3.级分I-IV-1悬浮液的过滤

为了从含有纤维蛋白原、A1PI、因子H和IaIp的不溶性部分中分离含有免疫球蛋白的级分I-IV-1悬浮液的可溶性部分，通常使用深层过滤过滤悬浮液。在本文提供的方法中可以采用的深层过滤器包括金属、玻璃、陶瓷、有机(诸如硅藻土)深层过滤器等。合适的过滤器的实例包括但不限于Cuno 50SA、Cuno 90SA和Cuno VR06过滤器(3M)。或者，通过离心而不是过滤可以进行所述分离步骤。

在某些实施方案中，在二氧化硅处理后将例如Celpure C300(AdvancedMinerals)或Hyflo-Super-Cel(World Minerals)的助滤剂加至悬浮液中以促进深层过滤。以0.1kg/kg级分I-IV-1沉淀物至1.0kg/kg级分I-IV-1沉淀物、或0.2kg/kg级分I-IV-1沉淀物至0.8kg/kg级分I-IV-1沉淀物、或0.3kg/kg级分I-IV-1沉淀物至0.7kg/kg级分I-IV-1沉淀物的终浓度加入助滤剂。在其它实施方案中，可以以0.1kg/kg级分I-IV-1沉淀物至0.7kg/kg级分I-IV-1沉淀物、或0.2kg/kg级分I-IV-1沉淀物至0.6kg/kg级分I-IV-1沉淀物、或约0.3kg/kg级分I-IV-1沉淀物至约0.05kg/kg级分I-IV-1沉淀物的终浓度加入助滤剂。在某些实施方案中，将以约0.01kg/kg级分I-IV-1沉淀物或约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0kg/kg级分I-IV-1沉淀物的终浓度加入助滤剂。

在过滤期间为了使免疫球蛋白的损失最小化，应该用至少一个死体积、优选至少两个死体积、更优选至少三个死体积的悬浮缓冲液或其类似的缓冲液洗涤形成的滤饼，所述缓冲液不足以溶解存在于滤饼中的非免疫球蛋白蛋白质。在一个实施方案中，用至少3.0死体积的缓冲液后洗过滤器和滤饼。在另一个实施方案中，用至少3.6死体积的缓冲液后洗过滤器和滤饼。在另一个实施方案中，使用合适的缓冲液，用过滤的至少50％的悬浮液体积后洗过滤器和滤饼。在另一个实施方案中，使用合适的缓冲液，用过滤的至少75％的悬浮液体积后洗过滤器和滤饼。在另一个实施方案中，使用合适的缓冲液，用过滤的至少100％的悬浮液体积后洗过滤器和滤饼。通常，不超过200％的过滤的悬浮液体积应当用于洗涤过滤器和滤饼。

在具体的实施方案中，洗涤缓冲液在含有90mL至150mL冰醋酸/1000L的溶解缓冲液中。在一个实施方案中，后洗提取缓冲液的pH为约4.6和约5.3之间。在优选的实施方案中，后洗缓冲液的pH为约4.7和约5.2之间。在另一个优选的实施方案中，后洗缓冲液的pH为约4.8和约5.1之间。在又一个优选的实施方案中，后洗缓冲液的pH为约4.9和约5.0之间。

4.去污剂处理

为从级分I-IV-1滤液中除去其它污染物，接下来将样品经历去污剂处理。血浆衍生的级分的去污剂处理方法在本领域是公知的。通常，任何标准的非离子型去污剂处理可以与本文提供的方法结合使用。例如，去污剂处理的示例性方法提供如下。

在搅拌下以约0.2％(w/v)的终浓度将聚山梨醇酯-80加至级分I-IV-1滤液中，并在约2℃至8℃之间的温度下将样品孵育至少30分钟。然后以约8g/L的终浓度将二水合柠檬酸钠混合至溶液中，并在约2℃至8℃之间的温度下在连续搅拌下将样品再孵育30分钟。

在某些实施方案中，可以使用任何合适的非离子型去污剂。合适的非离子型去污剂包括但不限于辛基葡糖苷、洋地黄皂苷、C12E8、Lubrol、Triton X-100、Nonidet P-40、Tween-20(即，聚山梨醇酯-20)、Tween-80(即，聚山梨醇酯-80)、烷基聚(环氧乙烷)、Brij去污剂、烷基酚聚(环氧乙烷)、泊洛沙姆、辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷等。

在一个实施方案中，通过扩散加入通过加入去污剂试剂(例如，聚山梨醇酯-80和二水合柠檬酸钠)实现过程改进。相比在单一入口点加入，扩散加入这些试剂使醇浓度和pH的局部波动最小化。在一个实施方案中，扩散加入包括喷射而不是流体加入。在另一个实施方案中，扩散加入包括从多个端口加入试剂。在一个实施方案中，扩散加入包括从扩散器端口加入试剂。在某些实施方案中，用于将试剂引入系统的至少一个端口位于或靠近叶轮或其它分散元件。在其它实施方案中，去污剂试剂可以作为固体加至改进的级分II+III滤液中，同时混合样品以确保添加剂的快速分布。在某些实施方案中，通过将固体喷洒在滤液的离域比表面积上优选加入固体试剂，使得局部过浓度(overconcentration)不会在诸如流体加入中发生。

5.第二沉淀事件—沉淀G

为了除去残留的杂质，使用25％的醇在pH 6.5至7.5时进行第二次沉淀。简言之，用合适的pH调节溶液(例如，氢氧化钠或乙酸)将级分I-IV-1提取调节至pH为6.5至7.5、优选为6.8至7.2、更优选为6.9至7.1、最优选为7.0。然后将冷醇加至溶液中至终浓度为约25％(v/v)，并将混合物在搅拌下在约-6℃至约-10℃之间孵育至少1小时以形成第二沉淀物(即，沉淀G)。在一个实施方案中，将该混合物孵育至少2小时、或至少3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时或更多小时。在优选的实施方案中，将该混合物孵育至少2小时。在更优选的实施方案中，将该混合物孵育至少4小时。在甚至更优选的实施方案中，将该混合物孵育至少8小时。

在某些实施方案中，在向沉淀反应中加入醇期间和/或之后通过调节溶液的pH可以从I-IV-1提取中沉淀较高百分比的IgG。同样，由于在沉淀过程期间溶液pH的波动，在整个孵育期间可以监测和/或调节反应混合物的pH。在另一个实施方案中，通过扩散加入醇或pH调节剂通过加入用于调节混合物pH的沉淀醇和/或溶液实现IgG产率的提高。相比在单一入口点加入，扩散加入这些试剂使醇浓度和pH的局部波动最小化。在一个实施方案中，扩散加入包括喷射而不是流体加入。在另一个实施方案中，扩散加入包括从多个端口加入试剂。在一个实施方案中，扩散加入包括从扩散器端口加入试剂。在某些实施方案中，用于将试剂引入系统的至少一个端口位于或靠近叶轮或其它分散元件。

6.沉淀物G(Ppt G)的悬浮和过滤

为了溶解沉淀物G的IgG含量，冷的提取缓冲液用于再悬浮PptG。简言之，以1份沉淀物对2-5份注射用水(WFI)或低电导率缓冲液的比率使沉淀物G溶解。在优选的实施方案中，以1份沉淀物对1-15份(优选3.5份)WFI的比率使沉淀物G溶解。通常在0℃和8℃之间的温度下进行悬浮步骤以获得40至95的AU_280-320值。然后将搅拌至少2小时的溶液的最终pH调节至4.5至5.6、优选至5.2±0.2。在一个实施方案中，用乙酸进行此pH调整。为增加IgG的溶解度，将悬浮液的电导率增加至2.5mS/cm和6.0mS/cm之间。在一个实施方案中，通过加入氯化钠增加电导率。

用于提取沉淀物G的合适溶液包括WFI和低电导率缓冲液。在一个实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约10mS/cm。在其它实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约9mS/cm、8mS/cm、7mS/cm、6mS/cm、5mS/cm、4mS/cm、3mS/cm、2mS/cm或1mS/cm。在优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约6mS/cm。在另一个优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约4mS/cm。在另一个优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约2mS/cm。

然后用具有标称孔径为0.1μm和0.4μm之间的合适的深层过滤器过滤悬浮的PptG溶液以除去任何未溶解的颗粒。在一个实施方案中，深层过滤器的标称孔径为约0.2μm(例如，Cuno VR06过滤器或等效物)。在另一个实施方案中，将悬浮的PptG溶液离心以回收澄清的上清液。过滤后过滤器用WFI或合适的缓冲液洗涤以回收另外的IgG并将后洗液加至滤液中。在优选的实施方案中，使用电导率为约2.5和约6.0mS/cm之间的氯化钠溶液进行过滤器的后洗。

7.溶剂和去污剂(S/D)处理

为了使存在于血浆衍生的产物中的各种病毒污染物灭活，接下来将澄清的PptG过滤液经历溶剂去污剂(S/D)处理。血浆衍生的级分的去污剂处理方法在本领域是公知的(综述参见，Pelletier JP et al.,Best Pract Res Clin Haematol.2006；19(1):205-42)。通常，任何标准的S/D处理可以与本文提供的方法结合使用。例如，S/D处理的示例性方法提供如下。

将Triton X-100、Tween-20和三(正丁基)磷酸酯(TNBP)分别以约1.0％、0.3％和0.3％的终浓度加至澄清的PptG滤液中。然后将混合物在18℃和25℃之间的温度下搅拌至少一小时。

在一个实施方案中，通过扩散加入来加入S/D试剂(例如，Triton X-100、Tween-20和TNBP)。在具体的实施方案中，通过喷射而不是通过流体加入来加入S/D试剂。在另一个实施方案中，将去污剂试剂作为固体加至澄清的PptG滤液中，将滤液混合以确保S/D成分的快速分布。在某些实施方案中，通过将固体喷洒在滤液的离域比表面积上优选加入固体试剂，使得局部过浓度(overconcentration)不会在诸如流体加入中发生。

8.离子交换色谱

为了进一步纯化和浓缩IgG，可以采用阳离子交换和/或阴离子交换色谱。使用离子交换色谱纯化和浓缩IgG的方法是本领域公知的。例如，美国专利号5,886,154描述了其中在低pH(约3.8和4.5之间)提取级分II+III沉淀物，然后使用辛酸沉淀IgG，最后实现两个阴离子交换色谱步骤的方法。美国专利号6,069,236描述了不依赖于醇沉淀的色谱IgG纯化方案。PCT公开号WO 2005/073252描述了包括提取级分II+III沉淀物、辛酸处理、PEG处理和单个阴离子交换色谱步骤的IgG纯化方法。美国专利号7,186,410描述了包括提取级分I+II+III或级分II沉淀物、然后在碱性pH下进行的单个阴离子交换步骤的IgG纯化方法。美国专利号7,553,938描述了包括提取级分I+II+III或级分II+III沉淀物、辛酸盐处理以及一个或者两个阴离子交换色谱步骤的方法。美国专利号6,093,324描述了包括使用在pH为约6.0和约6.6之间操作的大孔阴离子交换树脂的纯化方法。美国专利号6,835,379描述了不存在醇分级分离时依赖于阳离子交换色谱的纯化方法。上述参考文献的公开内容出于所有目的在此通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以将S/D处理的PptG滤液经历阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。例如，在一个实施方案中，在合适条件下通过阳离子交换树脂接触S/D处理的PptG滤液以将IgG结合至树脂。然后可将S/D试剂从吸附的IgG上洗掉，随后用合适的洗脱缓冲液将IgG从树脂洗脱。以这种方式，阳离子交换色谱步骤可用于从制剂中除去S/D试剂、浓缩含有IgG的溶液和/或从组合物中除去杂质。

在一个实施方案中，使用具有pH为约8.0和9.0之间的洗脱缓冲液从阳离子交换树脂洗脱IgG。在某些实施方案中，pH洗脱缓冲液可以具有的pH为约8.2和约8.8之间、或约8.4和约8.6之间、或pH为约8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。在优选的实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.5±0.1。

同样，可以使用阴离子交换色谱以减少IgG组合物中的杂质。在一个实施方案中，在一种或多种杂质结合至阴离子交换树脂但IgG不结合的溶液条件下进行阴离子交换色谱。在具体的实施方案中，在弱酸性条件下(即，pH为5.0和7.0之间，优选5.5和6.5之间)在适合将污染物而非IgG结合至阴离子交换树脂的低离子强度下进行阴离子交换色谱。

在具体的实施方案中，可以将阳离子交换柱的洗脱物调节至较低的pH(例如约5.5和约6.5之间)，并用适当的缓冲液稀释以减少溶液的电导率。在某些实施方案中，可以将阳离子交换洗脱物的pH调节至pH为约5.7和约6.7之间、或约5.9和约6.5之间、或pH为约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6或6.7。在优选的实施方案中，将洗脱物的pH调节至pH为约6.4±0.1。然后将洗脱物上样至阴离子交换柱，该柱结合在制剂中发现的几种污染物。在上样和洗涤柱期间收集含有IgG级分的柱流过物。在某些实施方案中，本发明的离子交换色谱步骤可以以柱模式、分批模式或二者的组合进行。在一个实施方案中，在阴离子交换色谱之前用于调节IgG组合物的pH的溶液通过扩散加入而加入。在具体的实施方案中，通过喷射而不是通过流体加入来加入溶液。

9.纳米过滤

为了降低本文提供的IgG组合物的病毒负荷，使用合适的纳米过滤装置可以将该组合物纳米过滤。在某些实施方案中，纳米过滤装置将具有的平均孔径为约15nm和约200nm之间。适用于此用途的纳米过滤器的实例包括但不限于DVD、DV 50、DV 20(Pall)、Viresolve NFP、Viresolve NFR(Millipore)、Planova 15N、20N、35N和75N(Planova)。在具体的实施方案中，纳米过滤器可以具有的平均孔径为约15nm和约72nm之间、或约19nm和约35nm之间、或约15nm、19nm、35nm或72nm。在优选的实施方案中，纳米过滤器将具有的平均孔径为约35nm，诸如Asahi PLANOVA 35N过滤器或其等效物。在特定的实施方案中，使用具有孔径为30nm和40nm之间(优选35±2nm)的纳米过滤器将从阴离子交换步骤回收的IgG组合物进行纳米过滤。在另一个优选的实施方案中，纳米过滤器将具有的平均孔径为约19nm或20nm，诸如Asahi PLANOVA 20N过滤器(19±2nm)或其等效物。在特定的实施方案中，使用具有孔径为15nm和25nm之间(优选19±2nm)的纳米过滤器将从阴离子交换步骤回收的IgG组合物进行纳米过滤。

10.超滤/渗滤(UF/DF)

可以在纯化过程期间的任何步骤进行超滤/渗滤以浓缩IgG组合物。在一个实施方案中，纳米过滤物通过UF/DF浓缩。在一个实施方案中，可通过超滤将纳米过滤物浓缩至蛋白浓度为约2％和约10％(w/v)之间。在某些实施方案中，在具有开放通道筛选的盒中进行超滤并且超滤膜具有的标称分子量截留(NMWCO)小于约100kDa或小于约90kDa、80kDa、70kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa或更少的kDa。在优选的实施方案中，超滤膜具有的NMWCO不大于50kDa。

在一个实施方案中，接近最后的生产过程时开放通道膜与具体设计的后洗和制剂一起使用，以使得与最先进的IVIG(例如，LIQUID,10％IgG)相比，所得IgG组合物为约两倍高的蛋白浓度(200mg/mL)而不影响产率和储存稳定性。对于大多数市售超滤膜，IgG浓度不能达到200mg/mL而没有主要的蛋白质损失。这些膜被早期封闭，并且因此很难获得充分的后洗。因此，必须使用开放通道膜结构。即使具有开放通道膜，必须使用具体设计的后洗方法以获得所需浓度而没有显著的蛋白质损失(损失小于2％)。甚至更令人惊奇的事实是，200mg/mL的较高蛋白浓度不降低低pH储存步骤的病毒灭活能力。

超滤步骤完成后，通过渗滤适合静脉内或肌内施用的溶液可进一步将浓缩物浓缩。在某些实施方案中，渗滤溶液可以包含稳定剂和/或缓冲剂。在优选的实施方案中，稳定剂和缓冲剂是合适浓度的甘氨酸，例如约0.20M和约0.30M之间、或约0.22M和约0.28M之间、或约0.24M和约0.26M之间、或浓度为0.20±0.01M、0.21±0.01M、0.22±0.01M、0.23±0.01M、0.24±0.01M、0.25±0.01M、0.26±0.01M、0.27±0.01M、0.28±0.01M、0.29±0.01M或0.3±0.01M。在优选的实施方案中，渗滤缓冲液含有0.25±0.01M甘氨酸。

通常，渗滤的最小交换体积为初始浓缩物体积的至少约3倍或初始浓缩物体积的至少约4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或更多倍。可以将IgG溶液浓缩至最终蛋白浓度为约5％和约25％(w/v)之间、或约6％和约18％(w/v)之间、或约7％和约16％(w/v)之间、或约8％和约14％(w/v)之间、或约9％和约12％之间、或至终浓度为约5％或6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％或更高。在一个实施方案中，不向浓缩溶液中加入后洗级分获得至少约23％的最终蛋白浓度。在另一个实施方案中，不向浓缩溶液中加入后洗级分获得至少约24％的最终蛋白浓度。在另一个实施方案中，不向浓缩溶液中加入后洗级分获得至少约24％的最终蛋白浓度。在一个实施方案中，渗滤后溶液的pH将为4.6至5.1。

在示例性实施方案中，在超滤之前将IgG组合物的pH调节至约4.5。通过超滤将溶液浓缩至蛋白浓度为5±2％w/v。UF膜具有的标称分子量截留(NMWCO)为50,000道尔顿或更小(例如，Millipore Pellicon聚醚砜膜)。然后通过0.25M甘氨酸溶液的十倍体积，pH 4.5±0.2将浓缩物渗滤。通过整个超滤-渗滤操作将溶液的温度保持在约2℃至约8℃之间。渗滤后，将溶液浓缩至蛋白浓度为至少11％(w/v)。

11.制剂

渗滤步骤完成后，用渗滤缓冲液将溶液的蛋白浓度调节至终浓度为约5％和约20％(w/v)之间、或约6％至约18％(w/v)之间、或约7％和约16％(w/v)之间、或约8％和约14％(w/v)之间、或约9％和约12％之间、或至终浓度为约5％或6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％。在一个实施方案中，溶液的最终蛋白浓度为约9％和约11％之间，更优选为约10％。

通过绝对孔径不大于约0.22微米(例如约0.2微米)的膜过滤器过滤，将配制的储备溶液进一步灭菌。然后将溶液无菌分配至最终容器中用于适当密封，提取样品用于测试。

在一个实施方案中，用渗滤缓冲液将IgG组合物进一步调节至浓度为10.2±0.2％(w/v)。在另一个实施方案中，将IgG组合物调节至浓度为15±1％(w/v)。在另一个实施方案中，将IgG组合物调节至浓度为20±1％(w/v)。在另一个实施方案中，将IgG组合物调节至浓度为25±1％(w/v)。如果需要的话，将pH调节至约4.4至约4.9。最后，将溶液无菌过滤并在约30℃孵育三周。

D.免疫球蛋白G(IgG)

一方面，本发明提供用于从Cohn池制备富集的免疫球蛋白G(IgG)组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中从Cohn池中共沉淀IgG和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)以形成第一沉淀物和第一上清液；将第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；和回收含有IgG的第一悬浮液的可溶性级分，从而形成富集的IgG组合物。通常，可以使用任何化学方法用于沉淀免疫球蛋白和A1PI，所述方法包括但不限于醇沉淀(例如，使用乙醇或甲醇)、使用水溶性聚合物的沉淀(例如，PEG或葡聚糖)和盐析(例如，使用磷酸铵、硫酸铵、柠檬酸钠等)。在优选的实施方案中，所述沉淀是醇沉淀，优选乙醇沉淀。

在一个实施方案中，本发明提供通过在低pH、高醇沉淀步骤中从冷冻-贫乏的血浆中沉淀IgG来制备富集的免疫球蛋白G(IgG)组合物的方法。在具体的实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向冷冻-贫乏的血浆中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间从冷冻-贫乏的血浆中沉淀IgG以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；和从第一沉淀物中回收IgG，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过向冷冻-贫乏的血浆中加入乙醇至选自变量1至2166的终浓度和pH而从冷冻-贫乏的血浆中沉淀IgG，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；和从第一沉淀物中回收IgG，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。

在一个实施方案中，通过在pH 5.0和6.0之间将乙醇与Cohn池混合至终浓度为20％至30％(v/v)来进行第一沉淀步骤。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±2％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±1％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25％(v/v)。同样，在一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.5下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.4下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.3下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.2下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.1下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5下进行。在其它实施方案中，第一沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。

本文提供的方法提供与依赖于初始低醇沉淀步骤(即，级分I沉淀)的最先进的纯化方法相比，由于在起始沉淀反应中起始Cohn池的大部分免疫球蛋白含量的沉淀，在最终富集的产物中IgG回收的显著提高的产率。

因此，在本文提供的方法的一个实施方案中，起始Cohn池的至少90％的IgG含量在初始沉淀反应中沉淀。在优选的实施方案中，起始Cohn池的至少95％的IgG含量在初始沉淀反应中沉淀。在更优选的实施方案中，起始Cohn池的至少99％的IgG含量在初始沉淀反应中沉淀。在某些实施方案中，起始Cohn池的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的IgG含量在初始沉淀反应中沉淀。

如本文提供的实施例所示，使用初始低pH、高醇沉淀步骤(即，级分I-IV-1沉淀)导致起始Cohn池的至少99％的IgG含量沉淀。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的99％至100％的IgG含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；和从第一沉淀物中回收IgG，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；和回收第一悬浮液的可溶性级分，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；和回收第一悬浮液的可溶性级分，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。

为了提供药用级IgG组合物，存在于初始沉淀物中的污染物诸如A1PI和纤维蛋白原需要从免疫球蛋白组合物中除去。这可以实现，例如，通过进一步分级分离第一沉淀物(例如，通过使用醇、非离子亲水聚合物的差示沉淀或盐析)、色谱方法或过滤方法。

在一个实施方案中，将第一沉淀物悬浮于适于从沉淀物中提取IgG的注射用水(WFI)或低离子强度缓冲液中，然后将悬浮液用细碎二氧化硅(SiO₂)处理，并且从含有大部分A1PI和纤维蛋白原的悬浮液的不溶性部分中分离含有IgG的悬浮液的可溶性部分。

用于提取第一沉淀物的合适溶液将通常具有pH为4.0和5.5之间。在某些实施方案中，溶液将具有pH为4.5和5.0之间，在其它实施方案中，提取溶液将具有pH为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.7±0.1。在另一个优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.8±0.1。在另一个优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.9±0.1。通常，使用选自，例如，乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、其混合物等的缓冲剂可以满足这些pH需要。合适的缓冲液浓度通常范围为5mM至100mM，或10mM至50mM，或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mM缓冲剂。

提取缓冲液将优选具有电导率为0.5mS/cm至2.0mS/cm。例如，在某些实施方案中，提取缓冲液的电导率将为0.5±0.1mS/cm，或0.6±0.1mS/cm、0.7±0.1mS/cm、0.8±0.1mS/cm、0.9±0.1mS/cm、1.0±0.1mS/cm、1.1±0.1mS/cm、1.2±0.1mS/cm、1.3±0.1mS/cm、1.4±0.1mS/cm、1.5±0.1mS/cm、1.6±0.1mS/cm、1.7±0.1mS/cm、1.8±0.1mS/cm、1.9±0.1mS/cm或2.0±0.1mS/cm。一个本领域的普通技术人员将知道如何产生具有适当电导率的提取缓冲液。在一个特定的实施方案中，提取缓冲液在pH为4.8±0.2和电导率为0.7mS/cm至0.9mS/cm下含有5mM磷酸二氢钠和5mM乙酸盐。

在一个实施方案中，在分离前(例如，过滤或离心)在浓度为20g/kg级分I-IV-1沉淀和100g/kg级分I-IV-1沉淀之间加入热解法二氧化硅。在另一个实施方案中，以30g/kg级分I-IV-1沉淀物和80g/kg级分I-IV-1沉淀物之间的浓度加入热解法二氧化硅。在某些实施方案中，可以以约20g/kg级分I-IV-1沉淀物或约25g/kg、30g/kg、35g/kg、40g/kg、45g/kg、50g/kg、55g/kg、60g/kg、65g/kg、70g/kg、75g/kg、80g/kg、85g/kg、90g/kg、95g/kg或100g/kg级分I-IV-1沉淀物的浓度加入热解法二氧化硅。在一个具体的实施方案中，将热解法二氧化硅(例如，Aerosil 380或等效物)加至级分I-IV-1悬浮液中至终浓度为40±20g/kg级分I-IV-1沉淀物。在另一个具体的实施方案中，将热解法二氧化硅加至级分I-IV-1悬浮液中至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀物。混合发生在2℃至8℃至少50分钟至70分钟。

因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有IgG并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，将SiO₂加至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有IgG并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，并且进一步其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，存在于悬浮液的可溶性部分的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的纤维蛋白原进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的因子H进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的IaIp进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，将SiO₂加至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀。

在一个实施方案中，从第一悬浮液的可溶性部分回收的IgG通过分级分离进一步富集。通常，可以使用任何分级分离方法(例如，醇或聚合物沉淀、盐析等)。在优选的实施方案中，通过乙醇沉淀通过将第一悬浮液的可溶性部分分级分离将IgG进一步富集。在一个实施方案中，通过向第一悬浮液的可溶性部分以适于将IgG沉淀而至少一种污染物不沉淀的终浓度和pH加入乙醇来富集IgG。在另一个实施方案中，通过向第一悬浮液的可溶性部分以适于将至少一种污染物沉淀而IgG不沉淀的终浓度和pH加入乙醇来富集IgG。

在一个实施方案中，本发明提供用于从Cohn池制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中从Cohn池中共沉淀IgG和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)以形成第一沉淀物和第一上清液；将第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；在第二沉淀步骤中使第一悬浮液的IgG沉淀以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从第一悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。

在示例性实施方案中，在终浓度为22％至28％(v/v)下在pH为6.5和7.5之间时通过使乙醇与第二悬浮液的可溶性部分(例如，过滤或离心后形成的悬浮液的滤液或上清液)混合来进行第二沉淀步骤。在一个实施方案中，使乙醇混合至终浓度为25±3％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇混合至终浓度为25±2％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇混合至终浓度为25±1％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇混合至终浓度为25％(v/v)。同样，在一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.5下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.4下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.3下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.2下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0±0.1下进行。在另一个实施方案中，第二沉淀步骤在pH为7.0下进行。在特定的实施方案中，使用最终乙醇浓度为25±3％(v/v)在pH为7.0±0.3下进行第二沉淀步骤。

在特定的实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的99％至100％的IgG含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。

在具体的实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的99％至100％的IgG含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液混合从第一悬浮液中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；回收第一悬浮液的可溶性级分；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在一个实施方案中，从第一悬浮液分离的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，在第一沉淀步骤中Cohn池的99％和100％之间的IgG含量沉淀。

在具体的实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；回收第一悬浮液的可溶性级分；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液混合从第一悬浮液中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在一个实施方案中，从第一悬浮液分离的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，在第一沉淀步骤中Cohn池的99％和100％之间的IgG含量沉淀。

在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的99％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；回收第一悬浮液的可溶性级分；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在一个实施方案中，从第一悬浮液分离的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，第一上清液中存在的白蛋白进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，在第一沉淀步骤中Cohn池的99％和100％之间的IgG含量沉淀。在优选的实施方案中，Cohn池的90％和100％之间的白蛋白含量存在于第一上清液中。

在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的99％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；从悬浮液中除去A1PI；回收第一悬浮液的可溶性部分；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3时以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液的可溶性部分混合从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在一个实施方案中，从第一悬浮液分离的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，第一上清液中存在的白蛋白进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，在第一沉淀步骤中Cohn池的99％和100％之间的IgG含量沉淀。在优选的实施方案中，Cohn池的90％和100％之间的白蛋白含量存在于第一上清液中。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有IgG并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，回收第一悬浮液的可溶性部分；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，将SiO₂加至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀。

在具体的实施方案中，本发明提供用于制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有IgG并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，回收第一悬浮液的可溶性部分；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液的可溶性部分混合从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，将SiO₂加至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有IgG并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp；在第二沉淀步骤中从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的纤维蛋白原进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的因子H进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的IaIp进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，将SiO₂加至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的IgG组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的95％至100％的IgG和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有IgG并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp；在第二沉淀步骤中通过在pH为7.0±0.3以25±3％(v/v)的终浓度使乙醇与第一悬浮液的可溶性部分混合从第一悬浮液的可溶性部分中沉淀IgG，以形成包含IgG的第二沉淀物和包含至少一种污染物的第二上清液；和从第二沉淀物中回收IgG，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的IgG组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第二沉淀物回收的IgG进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的纤维蛋白原进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的因子H进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的IaIp进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的IgG含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，第一沉淀步骤使用的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，将SiO₂加至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀。

在一个实施方案中，通过用冷的提取缓冲液使沉淀物悬浮来从第二沉淀物中回收IgG。例如，以1份沉淀物对2-5份注射用水(WFI)或低电导率缓冲液的比率使第二沉淀物悬浮。在优选的实施方案中，第二沉淀物以1份沉淀物对4-5份(优选3.5份)WFI的比率悬浮。在一个实施方案中，在0℃和8℃之间的温度下进行悬浮步骤。在一个实施方案中，将溶液的最终pH调节至4.8至5.6，优选至5.2±0.2。在一个实施方案中，用乙酸进行此pH调整。在一个实施方案中，将悬浮液的电导率增加至2.5mS/cm和6.0mS/cm之间以增加IgG的溶解度。在一个实施方案中，通过加入氯化钠增加电导率。

用于提取第二沉淀物的合适溶液包括WFI和低电导率缓冲液。在一个实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约10mS/cm。在其它实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约9mS/cm、8mS/cm、7mS/cm、6mS/cm、5mS/cm、4mS/cm、3mS/cm、2mS/cm或1mS/cm。在优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约6mS/cm。在另一个优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约4mS/cm。在另一个优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约2mS/cm。

在一个实施方案中，从不溶性部分中分离含有IgG的第一悬浮液的可溶性部分。在一个实施方案中，这通过用具有标称孔径为0.1μm和0.4μm的深层过滤器过滤悬浮液来完成。在一个实施方案中，深层过滤器的标称孔径为0.2μm(例如，Cuno VR06过滤器或等效物)。在一个实施方案中，过滤后过滤器用WFI或合适的缓冲液洗涤以回收另外的IgG并将后洗液加至滤液中。在优选的实施方案中，使用电导率为约2.5和约6.0mS/cm之间的氯化钠溶液进行过滤器的后洗。在另一个实施方案中，将第二悬浮液离心以回收可溶性部分。

在本发明的一个方面，提供的用于制备富集的IgG组合物的方法进一步包括从相同的Cohn池中纯化至少一种另外的血液因子。在一个实施方案中，该方法进一步包括从相同的Cohn池中纯化至少两种另外的血液蛋白质。在另一个实施方案中，该方法进一步包括从相同的Cohn池中纯化至少三种另外的血液蛋白质。在其它实施方案中，该方法进一步包括从相同的Cohn池中纯化至少四种、五种、六种或更多种另外的血液蛋白质。可以从与IgG相同的Cohn池中共纯化的示例性血液蛋白质包括但不限于白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、因子H、间-α-抑制剂蛋白质(IaIp)、凝血酶原复合物、因子VII(FVII)、因子VIII(FVIII)、抗凝血酶III(ATIII)、纤维蛋白原、丁酰胆碱酯酶等。

在一个实施方案中，从与IgG相同的Cohn池中进一步纯化α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)。在具体的实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中纯化A1PI。

在另一个实施方案中，从与IgG相同的Cohn池中进一步纯化纤维蛋白原。在具体的实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中纯化纤维蛋白原。在另一个具体的实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中纯化A1PI和纤维蛋白原。

在另一个实施方案中，从与IgG相同的Cohn池中进一步纯化因子H。在具体的实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中纯化因子H。在另一个具体的实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中纯化A1PI和因子H。

在另一个实施方案中，从与IgG相同的Cohn池中进一步纯化间-α-抑制剂蛋白质(IaIp)。在具体的实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中纯化IaIp。在另一个具体的实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分中纯化A1PI和IaIp。

在另一个实施方案中，从与IgG相同的Cohn池中进一步纯化白蛋白。在具体的实施方案中，从形成的第一上清液中纯化白蛋白。在具体的实施方案中，从形成的第一上清液中纯化白蛋白，同时从形成的第一悬浮液的不溶性部分中纯化至少一种另外的血液因子。

在一个实施方案中，根据下游Kistler-Nitschmann或Deutsch等分级分离进一步富集从初始低pH、高醇沉淀步骤回收的免疫球蛋白。例如，可以将回收的免疫球蛋白组合物经历类似于Kistler-Nitschmann B沉淀或Deutsch等β-球蛋白沉淀的步骤。用于这些步骤的条件导致α-球蛋白和β-球蛋白沉淀，而免疫球蛋白G保留在上清液中。

因此，本发明的一个方面提供用于制备富集的免疫球蛋白G(IgG)组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在初始低pH、高醇沉淀中从Cohn池共沉淀免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)；(ii)从沉淀物中回收免疫球蛋白；(iii)从第一沉淀物中回收的免疫球蛋白组合物中沉淀至少一种非-γ球蛋白；和(iv)从第二沉淀步骤中回收上清液。在某些实施方案中，这些方法可进一步包括另外的沉淀步骤(例如，沉淀物G沉淀)、阴离子和/或阳离子交换步骤、一个或多个超滤/渗滤步骤和一个或多个病毒减少或灭活步骤(例如，S/D处理、纳米过滤、低pH孵育等)。

V.α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)组合物的制备

用于从供体血浆生产血液蛋白质的现代方法来源于20世纪40年代和20世纪50年代的早期工作。由于这项工作主要集中在白蛋白和γ免疫球蛋白(IgG)的纯化，所以开发的分级分离方案对于另外的治疗上日益重要的血液蛋白质的回收并非最优。例如，血浆的初始高pH、低醇沉淀的使用(例如，级分I沉淀)导致级分I沉淀物中的因子H、IaIp和一定程度的免疫球蛋白的部分损失。此外，通过随后的沉淀步骤(例如，级分II+III沉淀或沉积A)获得的免疫球蛋白和A1PI的分离是不完全的，由于不完全沉淀免疫球蛋白损失在上清液中并且由于部分沉淀A1PI损失在沉淀物中。因此，需要能提供血液蛋白质更高产量的更新的分级分离方法。

本发明提供通过使用使初始沉淀物中的免疫球蛋白、A1PI和其它血液蛋白质和初始上清液中的白蛋白分级分离的初始沉淀步骤来满足这些需求的方法。在优选的实施方案中，在低pH、高醇条件下进行此初始沉淀。

一方面，本发明提供用于使用使Cohn池的大部分免疫球蛋白和A1PI含量沉淀的初始步骤从混合血浆中生产α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)的方法。在特定的实施方案中，此初始步骤是低pH、高醇沉淀步骤。如本文提供的实施例所示，在这些条件下起始Cohn池的大于95％的A1PI含量沉淀。此外，本发明提供在此初始沉淀中有效分离A1PI和免疫球蛋白的方法。

一方面，本发明提供用于从Cohn池制备富集的α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中使Cohn池的免疫球蛋白和A1PI共沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使存在于第一沉淀物中的免疫球蛋白溶解，以形成具有包含免疫球蛋白的可溶性部分和包含A1PI的不溶性部分的第一悬浮液；分离第一悬浮液的可溶性部分和不溶性部分；和从第一悬浮液的不溶性部分回收A1PI，从而形成富集的A1PI组合物。通常，可以使用任何化学方法用于沉淀免疫球蛋白和A1PI，所述方法包括但不限于醇沉淀(例如，使用乙醇或甲醇)、使用水溶性聚合物的沉淀(例如，PEG或葡聚糖)和盐析(例如，使用磷酸铵、硫酸铵、柠檬酸钠等)。在优选的实施方案中，所述沉淀是醇沉淀，优选乙醇沉淀。

在一个实施方案中，本发明提供通过在低pH、高醇沉淀步骤中从冷冻-贫乏的血浆中沉淀A1PI来制备富集的A1PI组合物的方法。在具体的实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向冷冻-贫乏的血浆中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间从冷冻-贫乏的血浆中沉淀A1PI以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；和从第一沉淀物中回收A1PI，从而形成富集的A1PI组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的A1PI进一步富集。

在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过向Cohn池中加入乙醇至选自变量1至2166的终浓度和pH而从Cohn池中沉淀A1PI，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7，以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；和从第一沉淀物中回收A1PI，从而形成富集的A1PI组合物。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的A1PI进一步富集。

在一个实施方案中，通过在pH 5.0和6.0之间将乙醇与Cohn池混合至终浓度为22％至28％(v/v)来进行第一沉淀步骤。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±2％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±1％(v/v)。在另一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25％(v/v)。同样，在一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.5下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.4下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.3下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.2下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5±0.1下进行。在另一个实施方案中，第一沉淀步骤在pH为5.5下进行。在其它实施方案中，第一沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。

本文提供的方法提供与依赖于初始低醇沉淀步骤(即，级分I沉淀)的最先进的纯化方法相比，由于在起始沉淀反应中起始Cohn池的大部分A1PI含量的沉淀，在最终富集的产物中A1PI回收的显著提高的产率。

因此，在本文提供的方法的一个实施方案中，起始Cohn池的至少80％的α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)含量在初始沉淀反应中沉淀。在优选的实施方案中，起始Cohn池的至少90％的A1PI含量在初始沉淀反应中沉淀。在更优选的实施方案中，起始Cohn池的至少95％的A1PI含量在初始沉淀反应中沉淀。在最优选的实施方案中，起始Cohn池的至少97％的A1PI含量在初始沉淀反应中沉淀。在某些实施方案中，起始Cohn池的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的A1PI含量在初始沉淀反应中沉淀。

如本文提供的实施例所示，使用初始低pH、高醇沉淀步骤(即，级分I-IV-1沉淀)导致起始Cohn池的至少95％的A1PI含量沉淀。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的A1PI组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；从第一上清液中分离第一沉淀物；和从第一沉淀物中回收A1PI，从而形成富集的A1PI组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的A1PI组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的免疫球蛋白和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使存在于第一沉淀物中的免疫球蛋白溶解，以形成具有包含免疫球蛋白的可溶性部分和包含A1PI的不溶性部分的第一悬浮液；分离第一悬浮液的可溶性部分和不溶性部分；和从第一悬浮液的不溶性部分回收A1PI，从而形成富集的A1PI组合物。在一个实施方案中，从第一悬浮液的可溶性部分回收的免疫球蛋白进一步富集。在另一个实施方案中，从第一悬浮液的不溶性级分除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的免疫球蛋白含量在第一沉淀步骤中沉淀。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的A1PI组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的免疫球蛋白和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使存在于第一沉淀物中的免疫球蛋白溶解，以形成具有包含免疫球蛋白的可溶性部分和包含A1PI的不溶性部分的第一悬浮液；分离第一悬浮液的可溶性部分和不溶性部分；和从第一悬浮液的不溶性部分回收A1PI，其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中，从而形成富集的A1PI组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一悬浮液的可溶性部分回收的免疫球蛋白进一步富集。在另一个实施方案中，从第一悬浮液的不溶性部分除去的A1PI进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的免疫球蛋白含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。

在一个实施方案中，将第一沉淀物悬浮于适于从沉淀物中提取免疫球蛋白的注射用水(WFI)或低离子强度缓冲液中，然后将悬浮液用细碎二氧化硅(SiO₂)处理，并且从含有大部分A1PI含量的悬浮液的不溶性部分中分离含有免疫球蛋白的悬浮液的可溶性部分。

用于从第一沉淀物中提取免疫球蛋白的合适溶液将通常具有pH为4.0和5.5之间。在某些实施方案中，溶液将具有pH为4.5和5.0之间，在其它实施方案中，提取溶液将具有pH为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.7±0.1。在另一个优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.8±0.1。在另一个优选的实施方案中，提取缓冲液的pH为4.9±0.1。通常，使用选自，例如，乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、其混合物等的缓冲剂可以满足这些pH需要。合适的缓冲液浓度通常范围为5mM至100mM，或10mM至50mM，或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mM缓冲剂。

提取缓冲液将优选具有电导率为0.5mS/cm至2.0mS/cm。例如，在某些实施方案中，提取缓冲液的电导率将为0.5±0.1mS/cm，或0.6±0.1mS/cm、0.7±0.1mS/cm、0.8±0.1mS/cm、0.9±0.1mS/cm、1.0±0.1mS/cm、1.1±0.1mS/cm、1.2±0.1mS/cm、1.3±0.1mS/cm、1.4±0.1mS/cm、1.5±0.1mS/cm、1.6±0.1mS/cm、1.7±0.1mS/cm、1.8±0.1mS/cm、1.9±0.1mS/cm或2.0±0.1mS/cm。一个本领域的普通技术人员将知道如何产生具有适当电导率的提取缓冲液。在一个特定的实施方案中，提取缓冲液在pH为4.8±0.2和电导率为0.7mS/cm至0.9mS/cm下含有5mM磷酸二氢钠和5mM乙酸盐。

在一个实施方案中，在分离前(例如，过滤或离心)在浓度为20g/kg级分I-IV-1沉淀和100g/kg级分I-IV-1沉淀之间加入热解法二氧化硅。在另一个实施方案中，以30g/kg级分I-IV-1沉淀物和80g/kg级分I-IV-1沉淀物之间的浓度加入热解法二氧化硅。在某些实施方案中，可以以约20g/kg级分I-IV-1沉淀物或约25g/kg、30g/kg、35g/kg、40g/kg、45g/kg、50g/kg、55g/kg、60g/kg、65g/kg、70g/kg、75g/kg、80g/kg、85g/kg、90g/kg、95g/kg或100g/kg级分I-IV-1沉淀物的浓度加入热解法二氧化硅。在一个具体的实施方案中，将热解法二氧化硅(例如，Aerosil 380或等效物)加至级分I-IV-1悬浮液中至终浓度为40±20g/kg级分I-IV-1沉淀物。在另一个具体的实施方案中，将热解法二氧化硅加至级分I-IV-1悬浮液中至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀物。混合发生在2℃至8℃至少50分钟至70分钟。

因此，在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的A1PI组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％和30％之间使Cohn池的95％至100％的免疫球蛋白和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI；并去从第一悬浮液的不溶性部分回收A1PI，从而形成富集的A1PI组合物。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，从第一沉淀物回收的免疫球蛋白进一步富集。在另一个实施方案中，从悬浮液除去的A1PI进一步富集。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的免疫球蛋白含量在第一沉淀步骤中沉淀。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，将SiO₂加至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备富集的A1PI组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0向Cohn池中加入乙醇至终浓度为20％至30％使Cohn池的95％至100％的免疫球蛋白和A1PI含量沉淀以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；用细碎二氧化硅处理第一悬浮液；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分，其中悬浮液的可溶性部分含有免疫球蛋白并且悬浮液的不溶性部分含有A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp，并且进一步其中Cohn池的80％至100％的白蛋白含量存在于第一上清液中。在一个实施方案中，使乙醇与Cohn池混合至终浓度为25±3％(v/v)。在一个实施方案中，存在于悬浮液的可溶性部分的免疫球蛋白进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的A1PI进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的纤维蛋白原进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的因子H进一步富集。在另一个实施方案中，存在于悬浮液的不溶性部分的IaIp进一步富集。在又一个实施方案中，在第一上清液中发现的白蛋白进一步富集。。在优选的实施方案中，Cohn池的99％至100％的免疫球蛋白含量在第一沉淀步骤中沉淀。在某些实施方案中，用于低pH、高醇沉淀步骤的最终乙醇浓度和pH选自变量1至变量2166，如表1、表2、表3、表4、表5、表6，和表7。在具体实施方案中，第一悬浮液的可溶性和不溶性部分通过过滤分离。在一个实施方案中，将SiO₂加至终浓度为40±10g/kg级分I-IV-1沉淀。

在一个实施方案中，通过用具有标称孔径为0.1μm和0.4μm的深层过滤器过滤悬浮液来从含有A1PI的不溶性部分中分离含有IgG的第一悬浮液的可溶性部分。在一个实施方案中，深层过滤器的标称孔径为0.2μm(例如，Cuno VR06过滤器或等效物)。在一个实施方案中，过滤后过滤器用WFI或合适的缓冲液洗涤以回收另外的IgG并将后洗液加至滤液中。在另一个实施方案中，将第一悬浮液离心以分离可溶性和不溶性部分。

在一个实施方案中，通过将不溶性部分悬浮于A1PI提取缓冲液中来从分离的不溶性部分中回收A1PI。例如，在一个实施方案中，以1份不溶性物质对2-15份注射用水(WFI)或低电导率缓冲液的比例将分离的不溶性部分悬浮，以形成第二悬浮液。在另一个实施方案中，以1份不溶性物质对2-10份注射用水(WFI)或低电导率缓冲液的比例将分离的不溶性部分悬浮。在另一个实施方案中，以1份不溶性物质对3-7份注射用水(WFI)或低电导率缓冲液的比例将分离的不溶性部分悬浮。在其它实施方案中，以1份不溶性物质对2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20份或更多份注射用水(WFI)或低电导率缓冲液的比例将分离的不溶性部分悬浮。在一个实施方案中，将提取搅拌至少2小时。在另一个实施方案中，将提取搅拌至少4小时。在另一个实施方案中，将提取搅拌至少8小时。在另一个实施方案中，将提取搅拌6小时至12小时。在一个实施方案中，在10℃至25℃进行提取。在另一个实施方案中，在17±5℃进行提取。在另一个实施方案中，在17±4℃进行提取。在另一个实施方案中，在17±3℃进行提取。在另一个实施方案中，在17±2℃进行提取。在另一个实施方案中，在17±1℃进行提取。在一个实施方案中，通过过滤，例如，深层过滤从不溶性部分中分离含有A1PI的可溶性部分。在另一个实施方案中，通过离心从不溶性部分中分离含有A1PI的可溶性部分。

用于提取A1PI的合适溶液包括WFI和低电导率缓冲液。在一个实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约10mS/cm。在其它实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约9mS/cm、8mS/cm、7mS/cm、6mS/cm、5mS/cm、4mS/cm、3mS/cm、2mS/cm或1mS/cm。在优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约6mS/cm。在另一个优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约4mS/cm。在另一个优选的实施方案中，低电导率缓冲液具有的电导率低于约2mS/cm。在一个实施方案中，WFI或低电导率缓冲液具有的pH为8.0和9.5之间。在特定的实施方案中，A1PI提取缓冲液的pH为8.8±0.5。在特定的实施方案中，A1PI提取缓冲液的pH为8.8±0.4。在特定的实施方案中，A1PI提取缓冲液的pH为8.8±0.3。在特定的实施方案中，A1PI提取缓冲液的pH为8.8±0.2。在特定的实施方案中，A1PI提取缓冲液的pH为8.8±0.1。在其它实施方案中，A1PI提取缓冲液的pH为8.0±0.2、8.1±0.2、8.2±0.2、8.3±0.2、8.4±0.2、8.5±0.2、8.6±0.2、8.7±0.2、8.8±0.2、8.9±0.2、9.0±0.2、9.1±0.2、9.2±0.2、9.3±0.2、9.4±0.2或9.5±0.2。

在一个实施方案中，在使用A1PI缓冲液提取之前，将第一悬浮液的分离的不溶性部分悬浮于不适于提取A1PI的WFI或低离子强度缓冲液中以形成中间体悬浮液。在此实施方案中，该方法包括使不溶性部分悬浮于WFI或pH不大于7.0的低离子强度缓冲液中；分离中间体悬浮液的可溶性和不溶性部分；和回收中间体悬浮液的不溶性部分的A1PI。在一个实施方案中，通过以1份不溶性物质对2-15份WFI或缓冲液的比例使不溶性物质悬浮来形成中间体悬浮液。在一个实施方案中，WFI或低离子强度缓冲液具有的pH为4.5至6.5。在另一个实施方案中，低离子强度缓冲液具有的pH为5.5±0.4。在另一个实施方案中，低离子强度缓冲液具有的pH为5.5±0.3。在另一个实施方案中，低离子强度缓冲液具有的pH为5.5±0.2。在另一个实施方案中，低离子强度缓冲液具有的pH为5.5±0.1。在其它实施方案中，低离子强度缓冲液具有的pH为4.5±0.2、4.6±0.2、4.7±0.2、4.8±0.2、4.9±0.2、5.0±0.2、5.1±0.2、5.2±0.2、5.3±0.2、5.4±0.2、5.5±0.2、5.6±0.2、5.7±0.2、5.8±0.2、5.9±0.2、6.0±0.2、6.1±0.2、6.2±0.2、6.3±0.2、6.4±0.2或6.5±0.2。在一个实施方案中，通过过滤，例如，深层过滤从含有A1PI的不溶性部分中分离可溶性部分。在另一个实施方案中，通过离心从含有A1PI的不溶性部分中分离可溶性部分。

在一个实施方案中，从第一悬浮液的不溶性部分提取的A1PI可根据本领域公知的方法进一步富集，所述方法包括但不限于：色谱(例如，离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水性相互作用色谱(HIC)、羟磷灰石色谱(HAP)、蛋白质A亲和色谱、免疫亲和色谱、尺寸排阻色谱等)；过滤(例如，超滤和/或渗滤)；和一个或多个病毒减少步骤(例如，纳米过滤、溶剂和去污剂处理、UV照射、热处理、低pH培养等)。

在一个实施方案中，通过分级分离进一步富集从第一悬浮液的不溶性部分提取的A1PI。通常，可以使用任何分级分离方法(例如，醇或聚合物沉淀、盐析等)。在优选的实施方案中，通过使用二价阳离子(优选锌)从澄清的提取溶液中沉淀A1PI来进一步富集组合物。在一个实施方案中，将氯化锌加至溶液中至终浓度为1mM至15mM。在具体的实施方案中，将氯化锌加至溶液中至终浓度为1mM至4mM。在更具体的实施方案中，将氯化锌加至溶液中至终浓度为2.0mM至3.0mM。

在某些实施方案中，根据本领域已知的纯化方法进一步富集A1PI，例如，描述于WO1995/35306、WO 1998/00154和美国专利号5,981,715；7,807,435；和7,879,800的那些方法，每个参考文献的公开内容出于所有目的据此以引用的方式整体特别并入本文。

VI.药物组合物

一方面，本发明提供根据本文所述的任何方法制备的血浆衍生的蛋白质的组合物。在某些实施方案中，这些组合物将被配制用于药物施用(即，药物组合物)。

在一个实施方案中，本发明提供通过由以下步骤组成的方法制备的血浆衍生的蛋白质组合物：在第一沉淀步骤中从Cohn池中共沉淀免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；使第一悬浮液的免疫球蛋白溶解以形成包含免疫球蛋白的悬浮液的可溶性部分以及包含A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp的悬浮液的不溶性部分；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分。在某些实施方案中，组合物包含血浆衍生的蛋白质，其选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白。

通常，可以使用任何化学方法用于沉淀免疫球蛋白和A1PI，所述方法包括但不限于醇沉淀(例如，使用乙醇或甲醇)、使用水溶性聚合物的沉淀(例如，PEG或葡聚糖)和盐析(例如，使用磷酸铵、硫酸铵、柠檬酸钠等)。在优选的实施方案中，所述沉淀是醇沉淀，优选乙醇沉淀。

在一个实施方案中，组合物被配制用于药物施用。在具体的实施方案中，组合物被配制用于静脉内施用。在另一个具体的实施方案中，组合物被配制用于肌内施用。在另一个实施方案中，组合物被配制用于皮下施用。在又一个实施方案中，组合物被配制用于眼内施用。

在一个实施方案中，通过配制使用本文提供的方法分离的血浆衍生的蛋白质组合物来制备本文提供的药物组合物。通常，配制的组合物将经历至少一个、优选至少两个、最优选至少三个病毒灭活或除去步骤。可以与本文提供的方法一起采用的病毒灭活或除去步骤的非限制性实例包括溶剂去污剂处理(Horowitz等人,Blood Coagul fibrinogenolysis1994(5增刊3):S21-S28和Kreil等人,Transfusion2003(43):1023-1028，二者均出于所有目的据此以引用的方式整体特别并入本文)、纳米过滤(Hamamoto等人,Vox Sang 1989(56)230-236和Yuasa等人,J Gen Virol.1991(72(8期)):2021-2024，二者均出于所有目的据此以引用的方式整体特别并入本文)和在高温下低pH培养(Kempf等人,Transfusion 1991(31)423-427和Louie等人,Biologicals1994(22):13-19)。在某些实施方案中，组合物包含血浆衍生的蛋白质，其选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白。

在一个实施方案中，本文提供的药物组合物将包含适用于静脉内、皮下、肌内和/或眼内施用的一种或多种缓冲剂或pH稳定剂。适用于配制本文提供的血浆衍生的蛋白质组合物的缓冲剂的非限制性实例包括调节至合适pH的甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、谷氨酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、组氨酸或其它氨基酸、葡萄糖酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐、丙酸盐、碳酸盐或其任何组合。通常，在一段延长的时间缓冲剂将足以保持制剂的适当pH。在优选的实施方案中，缓冲剂是甘氨酸。在某些实施方案中，组合物包含血浆衍生的蛋白质，其选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物可以任选地进一步包括用于调节组合物的同渗容摩的试剂。同渗容摩剂的非限制性实例包括甘露醇、山梨醇、甘油、蔗糖、葡萄糖、右旋糖、左旋糖、果糖、乳糖、聚乙二醇、磷酸盐、氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖庚酸钙(calcium gluconoglucoheptonate)、二甲基砜等。

通常，本文提供的制剂将具有类似于生理同渗容摩的同渗容摩，约285mOsmol/kg至295mOsmol/kg(Lacy等人,Drug Information Handbook–Lexi-Comp 1999:1254。在某些实施方案中，制剂的同渗容摩将为约200mOsmol/kg和约350mOsmol/kg之间、优选约240mOsmol/kg和约300mOsmol/kg之间。在特定的实施方案中，制剂的同渗容摩将为约200mOsmol/kg、或210mOsmol/kg、220mOsmol/kg、230mOsmol/kg、240mOsmol/kg、245mOsmol/kg、250mOsmol/kg、255mOsmol/kg、260mOsmol/kg、265mOsmol/kg、270mOsmol/kg、275mOsmol/kg、280mOsmol/kg、285mOsmol/kg、290mOsmol/kg、295mOsmol/kg、300mOsmol/kg、310mOsmol/kg、320mOsmol/kg、330mOsmol/kg、340mOsmol/kg、340mOsmol/kg或350mOsmol/kg。

本文提供的血浆衍生的制剂通常以液体形式稳定一段延长的时间。在某些实施方案中，在室温下制剂稳定至少约3个月，或在室温下稳定至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月。在冷冻条件下(通常约2℃和约8℃之间)制剂通常还将稳定6个月或至少约18个月，或在冷冻条件下稳定至少约21、24、27、30、33、36、39、42或45个月。

VII.治疗方法

一方面，本发明提供用于通过施用治疗有效量的根据本文提供的方法制备的血浆衍生的蛋白质来治疗有此需要的患者中与血液蛋白质缺乏或功能障碍有关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，组合物包含血浆衍生的蛋白质，其选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白。

一方面，本发明提供使用根据本文提供的方法制备的血浆衍生的蛋白质组合物来生产用于治疗与血液蛋白质缺乏或功能障碍有关的病状的药物。在某些实施方案中，血浆衍生的蛋白质选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白。

在一个实施方案中，通过由以下步骤组成的方法制备血浆衍生的蛋白质组合物：在第一沉淀步骤中从Cohn池中共沉淀免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)以形成第一沉淀物和第一上清液；使第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；使第一悬浮液的免疫球蛋白溶解以形成包含免疫球蛋白的悬浮液的可溶性部分以及包含A1PI、纤维蛋白原、因子H和IaIp的悬浮液的不溶性部分；和从悬浮液的不溶性部分中分离悬浮液的可溶性部分。在某些实施方案中，组合物包含血浆衍生的蛋白质，其选自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁酰胆碱酯酶、因子H、补体系统的蛋白质以及间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)蛋白。

VIII.实施例

实施例1–NG2C91

通过一系列沉淀反应使血浆分级分离可以商业生产免疫球蛋白G(IgG)组合物。在常见方法中，在第一醇沉淀步骤中杂质从含有免疫球蛋白的冷冻-贫乏的血浆沉淀出来。然后IgG免疫球蛋白从所得上清液中沉淀并且随后被进一步富集。为了提高在醇分级分离期间从人血浆回收的IgG的产率，在IgG沉淀反应中测试5.5至7.0的pH值和20％至25％的乙醇浓度。

简言之，通过在pH 7.2±0.2将乙醇以8％(v/v)的终浓度混合至冷冻-贫乏的血浆、将该混合物在0℃孵育和从上清液(级分I上清液)中分离形成的沉淀物(级分I)来形成级分I上清液，该上清液为用于商业生产血浆衍生的免疫球蛋白G(IgG)、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)和白蛋白产物的中间体。然后将所得级分I上清液等分成600g样品。将各个样品的pH调节至5.5至7.0并将乙醇混合至终浓度为20％至25％，如表9。

如表9，由于不完全沉淀，与用于制备用于生产GAMMAGARD(BaxterInternational；Deerfield,IL)的传统的Cohn级分II+III沉淀物(25％乙醇；pH 6.8)和修饰的级分II+III沉淀物的那些类似的条件，导致上清液中总IgG的损失为2.9％和6.7％。然而，已经发现通过将反应的pH降低至6.0或更低以及使用至少22.5％的最终乙醇浓度，IgG损失显著减少。例如，在pH 5.5使用22.5％的醇导致上清液中总IgG的损失仅为0.4％。类似地，在pH 6.0或pH 5.5使用25％的醇导致上清液中总IgG的损失仅为0.5％和0.1％。如表10，与传统的和修饰的级分II+III沉淀物相比，这等于沉淀物中分别增加超过300mg IgG/L血浆和125mg IgG/L血浆。

表9.沉淀上清液中蛋白质的产率表示为起始材料(级分I上清液)的蛋白质含量百分比。

表10.沉淀上清液中蛋白质的产率，表示为g/L血浆。

实施例2–NG2C96

将IgG纯化方案在有和没有初始8％乙醇沉淀下进行实验对比，以确定使用低pH(5.5)、高乙醇(25％)沉淀是否可以获得IgG回收的进一步增加，如实施例1所述。

简言之，在pH 7.4和0℃将100kg冷冻-贫乏的血浆在有(NG2C96/1)或没有(NG2C96/2)使用8％(v/v)最终浓度乙醇进行的初始沉淀步骤(级分I)下进行处理。将冷冻-贫乏的血浆(NG2C96/1)或级分I上清液(NG2C96/2)的pH调节至pH 5.5±0.1并将乙醇混合至终浓度为25％(v/v)。然后将混合物在-5±2℃下孵育5小时以允许蛋白质沉淀。将所得沉淀物(沉淀(I)+II+III)和上清液(上清液(I)+II+III)通过离心分离。由于沉淀反应的尺寸，每个反应需要两次离心。单独处理每次离心所得的沉淀物。

将沉淀物以1份沉淀物/15份缓冲液的比例悬浮于含有5mM磷酸二氢钠、5mM乙酸钠和600mg/L冰醋酸的缓冲液中，将pH调节至4.8±0.2，并在4℃和8℃之间搅拌2小时以提取蛋白质。提取孵育后，将40g的热解法二氧化硅(SiO₂)/kg沉淀物(I)+II+III混合至反应中并在4℃和8℃之间搅拌50分钟。然后将400g Cellpure助滤剂/kg沉淀物(I)+II+III混合并将反应通过Cuno 50SA膜进行过滤以除去不溶性物质，形成(I)+II+III滤液和滤饼。将滤饼用含有5mM磷酸二氢钠、5mM乙酸钠和150mg/L冰醋酸的缓冲液洗涤，将其滤液加至(I)+II+III滤液中。

将聚山梨醇酯80加至滤液中至终浓度为0.2％(w/w)并将溶液孵育30分钟。然后将二水合柠檬酸钠加至溶液中至终浓度为0.8％(w/w)，并将溶液再孵育30分钟。第二次孵育后，使用氢氧化钠将溶液的pH调节至7.0并将乙醇混合至终浓度为25％。将温度降低至0℃和-10℃之间以允许沉淀。通过离心分离沉淀物(PptG)和上清液(PptG上清液)。

确定纯化反应的每个子步骤的IgG、IgA和IgM免疫球蛋白含量。如表11所示，除去初始级分I沉淀步骤导致在最终组合物中IgG的产量显著更高(比较PptG溶解的NG2C96/2(没有级分I沉淀)和NG2C96/1(具有级分I沉淀)。同样，溶解的PptG级分的IgA(表12)和IgM(表13)含量在没有初始级分I沉淀步骤下形成。

值得注意的是，级分I沉淀步骤用于从含有免疫球蛋白的组合物中部分除去纤维蛋白原。虽然没有初始级分I沉淀步骤而形成的溶解的PptG级分的最终纤维蛋白原含量高于具有初始级分I沉淀步骤而形成的PptG级分的含量大约6倍，但是分级分离方案除去存在于冷冻-贫乏的血浆起始材料中的大于99％的纤维蛋白原含量(表14)。

表11.使用有和没有初始8％乙醇级分I沉淀步骤的低pH、高醇沉淀反应在血浆分级分离期间形成各种级分的IgG含量(表示为g/L起始血浆)。

表12.使用有和没有初始8％乙醇级分I沉淀步骤的低pH、高醇沉淀反应在血浆分级分离期间形成各种级分的IgA含量(表示为g/L起始血浆)。

表13.使用有和没有初始8％乙醇级分I沉淀步骤的低pH、高醇沉淀反应在血浆分级分离期间形成各种级分的IgM含量(表示为g/L起始血浆)。

表14.使用有和没有初始8％乙醇级分I沉淀步骤的低pH、高醇沉淀反应在血浆分级分离期间形成各种级分的纤维蛋白原含量(表示为g/L起始血浆)。

实施例3–NG2C99

为了进一步开发使用低pH、高醇沉淀代替传统的上游Cohn-Oncley和Kistler-Nitschmann醇分级分离步骤(即，Cohn级分I和II；Cohn级分I和II+III；或KistlerNitschmann 8-10％乙醇、沉淀物A和沉淀物B)，将NG2C96/2和NG2C96/2B PptG沉淀物合并并进一步富集成IgG免疫球蛋白。

简言之，将合并的NG2C96/2和NG2C96/2B PptG沉淀物悬浮于用乙酸将pH调节至4.75±0.75和用氯化钠将电导率调节至4.5±1.5mS/cm的注射用水(WFI)中。加入助滤剂并将该悬浮液通过Cuno VR06膜过滤以形成澄清的PptG滤液(VR06)。然后根据标准方法用溶剂和去污剂(S/D处理)处理澄清的滤液。

将S/D处理过的滤液上样至用含有10mM乙酸钠(pH 5.0)的缓冲液平衡的CM琼脂糖凝胶柱上并收集流过物(CM D/N)。然后将柱用含有10mM乙酸钠(pH 5.5)的缓冲液洗涤并收集洗液(CM W)。使用含有55mM磷酸二氢钠和10mM TRIS(pH 8.5)的洗脱缓冲液使免疫球蛋白从柱上洗脱下来。将洗脱物收集成三个级分：包括具有OD₂₈₀小于100mAU的洗脱物的第一部分的级分1(CM E-VL)；包括具有洗脱峰前沿的OD₂₈₀大于100mAU的和洗脱峰后沿的OD280大于400mAU的洗脱物峰的级分2(CM E)；和包括具有OD280小于400mAU的峰的后侧的洗脱物部分的级分3(CM E-NL)。

分别使用冰醋酸和注射用水(WFI)将级分2洗脱物的pH和电导率调节至6.4和2.3mS/cm。然后将级分2洗脱物以100mg蛋白质/mL树脂的负载浓度上样至用含有15mM磷酸二氢钠(pH 6.4)的缓冲液平衡的ANX琼脂糖快速流动阴离子交换树脂上。收集含有大部分IgG的阴离子交换流过物(ANX D/N)。使用含有2M氯化钠(ANX 2M NaCl)的溶液将结合至阴离子交换树脂的蛋白质从柱上洗脱下来。

将甘氨酸加至阴离子交换流过物级分中并且使用2Mini(Millipore)将样品从含有0.25M甘氨酸(pH 5.2)的溶液中超滤和渗滤(UF/DF)直至获得蛋白质浓度为5％。将免疫球蛋白溶液进一步浓缩至最终蛋白浓度为10％并将pH调节至4.5(渗滤-浓缩物)。然后使用Millipak 20(Millipore)将10％免疫球蛋白溶液无菌过滤以形成最终免疫球蛋白组合物(最终容器)。

确定纯化反应的每个子步骤的生化特征(表15和表16)。如数据所示，最终组合物仅含有药物施用可接受的参数内的低含量的非IgG蛋白质。

表15.使用没有初始8％乙醇级分I沉淀步骤的低pH、高醇沉淀反应在血浆分级分离期间形成各种级分的生化特征。

表16.使用没有初始8％乙醇级分I沉淀步骤的低pH、高醇沉淀反应在血浆分级分离期间形成各种级分的进一步的生化特征。

实施例4–NG2C100

为了验证使用没有初始低醇沉淀步骤的低pH、高醇沉淀以除去纤维蛋白原，将200kg冷冻-贫乏的血浆分级分离并富集，如实施例2和3中样品NG2C96/2所述，过程有几个改变。首先，使用25％乙醇在pH 5.1而不是5.5时进行低pH、高醇沉淀步骤(I-IV1沉淀)。其次，用33g热解法二氧化硅(SiO₂)/kg沉淀物I-IV1而不是40g SiO₂/kg沉淀物处理悬浮的I-IV1沉淀物。第三，以150mg蛋白质/mL ANX树脂而不是100mg/mL ANX树脂的浓度将CM阳离子交换洗脱物上样至ANX阴离子交换树脂。最后，Cuno VR06过滤的离子交换流过物通过35N(Asahi Kasei Medical Co.,Ltd.；Tokyo,Japan)以在超滤-/渗滤之前进行纳米过滤步骤。

确定纯化的每个步骤的IgG含量并将结果提供于表17。与GAMMAGARD生产过程的平均IgG产率(3.7g IgG/L原料血浆)相比，此实施例使用的纯化方法导致4.4gIgG/L原料血浆的明显提高的产率。这表示IgG产率几乎增加20％。最终IgG组合物的生化特征报道于表10。从表中可以看出，最终IgG组合物具有大于99％的纯度并且IgG单体/二聚体含量大于99.8％。最终容器仅含有微量杂质，该杂质水平在规定标准内。

表17.使用初始低pH、高醇沉淀步骤在从冷冻-贫乏的血浆富集期间形成级分的IgG含量。

表18.使用初始低pH、高醇沉淀步骤从200L冷冻-贫乏的血浆中富集的最终IgG组合物的生化特征。

实施例5–P02910NG2

为了比较CM阳离子交换洗脱物以100g蛋白质/mL ANX树脂和150g蛋白质/mL ANX树脂的上样浓度流经ANX阴离子交换柱的影响，将200L冷冻-贫乏的血浆通过初始低pH(5.4)、高醇(25％)沉淀步骤分级分离并处理以形成PptG沉淀物，如在实施例2和3中样品NG2C96/2所述。确定形成的上游级分的IgG、IgA和IgM含量并分别报道于表19、表20，和表21。

将所得PptG沉淀物分成两个1.8kg样品，将其富集到如实施例2和3中样品NG2C96/2所述的最终容器中，除了一个样品以100mg蛋白质/mL ANX树脂(P03010NG2)的上样浓度流经ANX阴离子交换树脂和另一个样品以150mg蛋白质/mL ANX树脂(P03110NG2)的上样浓度流经ANX阴离子交换树脂。

确定纯化的每个下游富集步骤的IgG含量并将结果提供于表22和表23。与GAMMAGARD生产过程的平均IgG产率(3.7g IgG/L原料血浆)相比，此实施例使用的纯化方法导致4.3g IgG/L原料血浆的明显提高的产率。这表示IgG产率增加16％。最终IgG组合物的生化特征报道于表16和表17。从表中可以看出，最终IgG组合物具有大于99％的纯度并且IgG单体/二聚体含量大于99.8％。最终容器仅含有微量杂质，该杂质水平在规定标准内。

表19.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％乙醇)沉淀反应在血浆分级分离期间形成的上游级分的IgG含量。

表20.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％乙醇)沉淀反应在血浆分级分离期间形成的上游级分的IgA含量。

表21.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％乙醇)沉淀反应在血浆分级分离期间形成的上游级分的IgM含量。

表22.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％乙醇)沉淀反应和100mg/mL ANX树脂(P03010NG2)的ANX阴离子交换上样浓度在血浆分级分离期间形成的下游级分的IgG含量。

表23.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％乙醇)沉淀反应和150mg/mL ANX树脂(P03110NG2)的ANX阴离子交换上样浓度在血浆分级分离期间形成的下游级分的IgG含量。

表24.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％乙醇)沉淀反应和100mg/mL ANX树脂(P03010NG2)的ANX阴离子交换上样浓度从冷冻贫乏的血浆中富集的最终IgG组合物的生化特征。

表25.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％乙醇)沉淀反应和150mg/mLANX树脂(P03110NG2)的ANX阴离子交换上样浓度从冷冻贫乏的血浆中富集的最终IgG组合物的生化特征。

实施例6–NG2C107B

研究了从用于生产IgG免疫球蛋白的低pH、高醇沉淀物的不溶性部分中提取α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)的可行性。简言之，在7±2℃将在过滤提取的级分I-IV-1沉淀物期间形成的不溶性滤饼的两个500kg样品(#1和#3)首先悬浮于2.8份水(w/w)中并将样品的pH调节至5.5±0.1。将悬浮液通过CUNO 10CP膜过滤，形成滤液(滤液1)和第二滤饼。然后将第二滤饼悬浮于5份水(w/w)中，将悬浮液的温度调节至17±2℃，将样品的pH调节至8.8±0.2，然后将样品搅拌8小时，同时保持温度和pH以从不溶性物质中提取A1PI。

孵育后，将10mmol Tris和150mmol氯化钠/kg悬浮液加至样品中并将pH调节至8.0±0.1。将176g PEG 3350/kg悬浮液加至样品中，将样品在17±2孵育1小时。然后将悬浮液过滤以从含有提取的A1PI的上清液(滤液2)中除去不溶性物质。

然后通过加入0.35g氯化锌/kg滤液(2.5mM ZnCl；样品#1)或0.54g/kg氯化锌/kg滤液(4.0mM ZnCl；样品#3)从第二滤液中沉淀粗A1PI，将pH调节至7.5±0.2，并将样品在7±2℃下孵育3小时。通过离心回收氯化锌沉淀物(ZnCl₂％)。用50mM EDTA钠(Zn-EDTA-conz)从氯化锌沉淀物中提取A1PI。

在富集过程中的每个步骤测定A1PI(a1A)含量和活性并示于表26。在EDTA提取步骤中回收约400mg活性A1PI/L原料血浆。值得注意的是，当在38±2℃和pH为约9.2下提取A1PI时，回收大约600mg活性A1PI/L原料血浆。

表26.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％乙醇)沉淀反应和锌沉淀在血浆分级分离期间形成的下游级分的α-1-抗胰蛋白酶含量。

实施例7–P03410NG2A和B

研究了从冷冻贫乏的血浆的低pH、高醇沉淀中回收IgG的pH的影响。简言之，通过吸附以除去因子IX、因子VII和抗凝血酶III(ATIII)的已经处理的100L冷冻-贫乏的血浆，通过在pH 5.4(样品A；P03410NG2A)或pH 5.6(样品B；P03410NG2B)使用25％乙醇的沉淀分级分离。然后将样品处理以形成如实施例2所述的沉淀物G沉淀物(PptG沉淀物)和上清液(PptG上清液)，除了将50g SiO₂/kg沉淀物I-IV-1而不是40g/kg沉淀物与沉淀物I-IV-1悬浮液混合。

确定形成的级分的IgG、IgA和IgM含量并分别报道于表27、表28，和表29。值得注意的是，当在pH 5.4(93.8％)或pH 5.6(88.8％)进行初始沉淀时，在级分I-IV-1CUNO滤液中回收原料血浆的约90％的IgG含量。类似地，在级分I-IV-1悬浮液中回收原料血浆的几乎所有的IgA和IgM含量。

表27.使用低pH(A＝5.4；B＝5.6)、高醇(25％)初始沉淀步骤在血浆分级分离期间形成的上游级分的IgG含量。

表28.使用低pH(A＝5.4；B＝5.6)、高醇(25％)初始沉淀步骤在血浆分级分离期间形成的上游级分的IgA含量。

表29.使用低pH(A＝5.4；B＝5.6)、高醇(25％)初始沉淀步骤在血浆分级分离期间形成的上游级分的IgM含量。

为了进一步表征分级分离方案，确定纤维蛋白原(表30)、A1PI(表31)、α-2-巨球蛋白(表32)、白蛋白(表33)、转铁蛋白(表34)和C3(表35)的含量用于各种上游分级分离。

表30.使用低pH(A＝5.4；B＝5.6)、高醇(25％)初始沉淀步骤在血浆分级分离期间形成的上游级分的纤维蛋白原含量。

表31.使用低pH(A＝5.4；B＝5.6)、高醇(25％)初始沉淀步骤在血浆分级分离期间形成的上游级分的α-1-抗胰蛋白酶含量。

表32.使用低pH(A＝5.4；B＝5.6)、高醇(25％)初始沉淀步骤在血浆分级分离期间形成的上游级分的α-2-巨球蛋白含量。

表33.使用低pH(A＝5.4；B＝5.6)、高醇(25％)初始沉淀步骤在血浆分级分离期间形成的上游级分的白蛋白含量。

表34.使用低pH(A＝5.4；B＝5.6)、高醇(25％)初始沉淀步骤在血浆分级分离期间形成的上游级分的转铁蛋白含量。

表35.使用低pH(A＝5.4；B＝5.6)、高醇(25％)初始沉淀步骤在血浆分级分离期间形成的上游级分的补体成分3(C3)含量。

实施例8–P03510NG2和P03610NG2

进一步研究在使用初始低pH、高醇沉淀步骤形成的PptG沉淀物的下游处理期间以100g蛋白质/mL ANX树脂和150g蛋白质/mL ANX树脂的上样浓度使CM阳离子交换洗脱物流经ANX阴离子交换柱的影响。简言之，如实施例4所述处理2kg P03410NG2A PptG沉淀物，其中将第一样品(P03510NG2)以157mg蛋白质/mL ANX树脂的浓度上样至ANX阴离子交换树脂并且将第二样品(P03610NG2)以106mg蛋白质/mL ANX树脂的浓度上样至ANX阴离子交换树脂。

测定纯化的每个下游步骤的IgG含量并将结果提供于表22和表23。与GAMMAGARD生产过程的平均IgG产率(3.7g IgG/L原料血浆)相比，此实施例使用的纯化方法导致4.72g IgG和4.67g IgG/L原料血浆的明显提高的产率。这表示IgG产率增加大于25％。最终IgG组合物的生化特征报道于表38和表39。从表中可以看出，最终IgG组合物具有大于99％的纯度并且IgG单体/二聚体含量大于99.8％。最终容器仅含有微量杂质，该杂质水平在规定标准内。

表36.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％)初始沉淀步骤和157mg/mL ANX树脂(P03510NG2)的阴离子交换上样浓度在血浆分级分离期间形成的上游级分的IgG含量。

表37.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％)初始沉淀步骤和106mg/mLANX树脂(P03610NG2)的阴离子交换上样浓度在血浆分级分离期间形成的上游级分的IgG含量。

表38.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％)初始沉淀步骤和157mg/mLANX树脂(P03510NG2)的阴离子交换上样浓度从冷冻贫乏的血浆中富集的最终IgG组合物的生化特征。

表39.使用初始低pH(5.4)、高醇(25％)初始沉淀步骤和106mg/mLANX树脂(P03610NG2)的阴离子交换上样浓度从冷冻-贫乏的血浆中富集的最终IgG组合物的生化特征。

实施例9–分级分离产物的另外特征

将使用包括初始低pH、高醇沉淀的纯化方法获得的免疫球蛋白G产率和纯度与使用传统的Cohn沉淀I和沉淀II+III中间体获得的那些免疫球蛋白G产率和纯度做对比。

在2010年，将采用初始低pH、高醇沉淀的三个大规模IgG纯化的产率和纯度-如实施例5所述(“P03010NG2”)的批次3010；如实施例8所述(“P03610NG2”)的批次3610；和类似于批次3010和3610制备的第三批次1111，与在单个生产厂制备的GAMMAGARD LIQUID(10％免疫球蛋白注射液(人),Baxter International)的平均产率做对比。GAMMAGARD LIQUID纯化过程基本上类似于用于制备批次3010、3610和1111的过程，除了GAMMAGARD LIQUID过程通过Cohn级分I和Cohn级分II+III中间体而不是初始低pH、高醇沉淀来进行。在制备GAMMAGARD LIQUID的实验批次和取平均值期间形成的沉淀物G产物的特征示于表40。

表40.通过初始低pH、高醇沉淀步骤进行，如在2010年单个生产厂的GAMMAGARDLIQUID制剂取平均值，通过Cohn级分I和II+III沉淀步骤进行，在制备实验IgG批次3010、3610和1111期间形成的沉淀物G(Ppt G)中间体的生化特征。

如表40所示，与通过Cohn级分I和II+III沉淀步骤进行的GAMMAGARD LIQUID纯化方法相比，使用初始低pH、高醇沉淀步骤导致沉淀物G中间体步骤的IgG回收显著增加(初始高醇、低pH沉淀步骤的88.9-96.6％IgG回收率对Cohn级分I和II+III沉淀步骤的82.9％IgG回收率)。

在实验批次3010、3610和1111中形成的IgG沉淀物G中间体比GAMMAGARD LIQUID沉淀物G中间体平均值具有稍低的纯度，如更高水平的补体成分3(C3)和纤维蛋白原所证实，尽管这些中间体的纤维蛋白原含量仍在GAMMAGARD LIQUID生产的可见值范围内。然而，当如上所述进一步处理实验批次时，最终的IgG产物符合所有测试的生产说明书，如表41所示。

表41.通过初始低pH、高醇沉淀步骤进行的实验批次3010、3610和1111的最终混合的人IgG组合物的生化特征。

实施例10-白蛋白组合物的特征

为进一步证实本文所述的新的免疫球蛋白G生产过程(例如，通过初始低pH、高醇沉淀步骤进行的那些过程)可以支持血浆蛋白质副产物的生产，将白蛋白从低pH、高醇上清液中纯化。

从Cohn级分IV-1和IV-4上清液中纯化白蛋白的方法是本领域公知的。通常，Cohn级分IV-1和IV-4上清液在通过中间体醇沉淀步骤(诸如Cohn级分I和Cohn级分II+III沉淀)进行的过程中形成。在本实施例中，根据标准方法制备白蛋白，除了来自初始低pH、高醇沉淀的上清液代替级分IV-1上清液使用。如表42所示，从低pH、高醇上清液中纯化导致高产率的白蛋白(18.92g/L血浆)，其满足测试的所有质量控制要求。

表42.如上所述由大规模低pH、高醇沉淀上清液制备的白蛋白组合物的生化特征。

应理解，本文所述的实施例和实施方案仅为了举例说明的目的，并且本领域技术人员将想到根据本发明的各种修改或变化，这些均包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的据此通过引用整体并入。

Claims (62)

1.一种用于从Cohn池生产富集的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在第一沉淀步骤中通过在pH为5.0至6.0以20％至30％v/v的终浓度向所述Cohn池中加入乙醇，从Cohn池中共沉淀免疫球蛋白和α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)，以形成第一沉淀物和第一上清液；

(b)使所述第一沉淀物中的免疫球蛋白溶解，以形成具有包含免疫球蛋白的可溶性部分和包含A1PI的不溶性部分的第一悬浮液；

(c)从所述第一悬浮液的不溶性部分中分离所述第一悬浮液的可溶性部分；和

(d)回收所述第一悬浮液的所述可溶性级分，从而形成富集的免疫球蛋白组合物，

其中，在步骤(a)之前不执行醇沉淀。

2.根据权利要求1所述的方法，其中乙醇的终浓度为25±4％v/v。

3.根据权利要求1所述的方法，其中乙醇的终浓度为25±3％v/v。

4.根据权利要求1所述的方法，其中乙醇的终浓度为25±2％v/v。

5.根据权利要求1所述的方法，其中乙醇的终浓度为25±1％v/v。

6.根据权利要求5所述的方法，其中乙醇的终浓度为25％v/v。

7.根据权利要求1所述的方法，其中乙醇的终浓度为25±2％v/v，以及所述pH为5.5±0.2。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述pH为5.5±0.4。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述pH为5.5±0.3。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述pH为5.5±0.2。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述pH为5.5±0.1。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述pH为5.5。

13.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀步骤的持续时间保持所述pH。

14.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀步骤包括通过扩散加入来加入所述乙醇。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述扩散加入包括喷雾。

16.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀步骤包括在邻近叶轮的位点加入所述乙醇。

17.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀步骤在-3℃至-10℃的温度下进行。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一沉淀步骤在-5℃至-9℃的温度下进行。

19.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀物用4L至60L缓冲液/kg沉淀物来悬浮。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一沉淀物用8L至15L缓冲液/kg沉淀物来悬浮。

21.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮液具有的pH为4.0至5.4。

22.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮液具有的pH为4.7至5.1。

23.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮液具有的电导率为0mS/cm至4mS/cm。

24.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮液具有的电导率为0.5mS/cm至2mS/cm。

25.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀物悬浮于包含乙酸盐和/或磷酸盐的缓冲液中。

26.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过离心或过滤从所述第一悬浮液的所述不溶性部分中分离所述第一悬浮液的所述可溶性部分。

27.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中从所述第一悬浮液的所述不溶性部分中分离所述第一悬浮液的所述可溶性部分的所述步骤包括：

(i)使细碎二氧化硅(SiO₂)与所述第一悬浮液混合；和

(ii)从所述悬浮液中分离所述SiO₂。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述细碎二氧化硅(SiO₂)具有的平均比表面积为350m²/g至410m²/g。

29.根据权利要求27所述的方法，其中以15g/kg第一沉淀物至80g/kg第一沉淀物的终浓度下将所述细碎二氧化硅(SiO₂)加至所述第一悬浮液中。

30.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)在第一沉淀步骤中在pH为5.3和5.7之间并且温度在-6℃和-8℃之间用24％和26％v/v之间的乙醇从Cohn池中沉淀免疫球蛋白以形成第一沉淀物和第一上清液；

(b)使所述第一沉淀物悬浮以形成第一悬浮液；

(c)用细碎二氧化硅(SiO₂)处理所述第一悬浮液；

(d)从所述第一悬浮液的不溶性级分中分离所述第一悬浮液的可溶性级分；和

(e)回收所述第一悬浮液的所述可溶性级分，从而形成富集的免疫球蛋白组合物。

31.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述富集的免疫球蛋白组合物含有存在于所述Cohn池用于步骤(a)的至少一种免疫球蛋白类型的至少90％的所述免疫球蛋白含量。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述富集的免疫球蛋白组合物含有存在于所述Cohn池用于步骤(a)的至少一种免疫球蛋白类型的至少95％的所述免疫球蛋白含量。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫球蛋白类型是IgG。

34.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：

(f)在第二沉淀步骤中从步骤(d)形成的富集的免疫球蛋白组合物中沉淀免疫球蛋白以得到第二沉淀物和第二上清液；

(g)使所述第二沉淀物悬浮以形成第二悬浮液；和

(h)回收所述第二悬浮液的所述可溶性级分，从而形成进一步富集的免疫球蛋白组合物。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二沉淀步骤是醇沉淀步骤。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述醇沉淀步骤包括在pH为6.5和7.5之间将乙醇加至步骤(d)形成的富集的免疫球蛋白组合物中以得到22％和28％v/v乙醇之间的终浓度。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述醇沉淀步骤包括通过扩散加入来加入所述乙醇。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述扩散加入包括喷雾。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述醇沉淀步骤包括在邻近叶轮的位点加入所述乙醇。

40.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二沉淀步骤在-3℃和-10℃之间的温度下进行。

41.根据权利要求36所述的方法，其中所述富集的免疫球蛋白组合物含有存在于所述Cohn池用于步骤(a)的至少90％的所述免疫球蛋白G含量。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述富集的免疫球蛋白组合物含有存在于所述Cohn池用于步骤(a)的至少95％的所述免疫球蛋白G含量。

43.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括阳离子交换色谱富集步骤。

44.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括阴离子交换色谱富集步骤。

45.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括病毒灭活和/或除去步骤。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述方法包括溶剂/去污剂(S/D)病毒灭活步骤。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述方法包括纳米过滤步骤。

48.根据权利要求45所述的方法，其中所述方法包括在pH为4.0至5.0并且温度为20℃至40℃下将所述组合物孵育至少一周的步骤。

49.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中最终富集的IgG组合物包含至少98％IgG。

50.根据权利要求49所述的方法，其中最终富集的IgG组合物包含至少99％IgG。

51.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法产生用于步骤(a)的至少4gIgG/L Cohn池。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述方法产生用于步骤(a)的至少4.25g IgG/LCohn池。

53.根据权利要求51所述的方法，其中所述方法产生用于步骤(a)的至少4.5g IgG/LCohn池。

54.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中从第一悬浮液的不溶性级分中进一步纯化α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)。

55.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中从第一悬浮液的不溶性级分中进一步纯化纤维蛋白原。

56.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中从第一悬浮液的不溶性级分中进一步纯化因子H。

57.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中从第一悬浮液的不溶性级分中进一步纯化间-α-胰蛋白酶抑制剂蛋白质(IαIp)。

58.根据权利要求54所述的方法，其中用细碎二氧化硅(SiO₂)处理第一悬浮液的不溶性级分。

59.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中从所述第一上清液中进一步纯化白蛋白。

60.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述Cohn池是冷冻-贫乏的血浆。

61.一种通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法制备的富集的免疫球蛋白组合物。

62.如权利要求61所述的富集的免疫球蛋白组合物在制备用于治疗免疫缺陷、炎性疾病、自身免疫性疾病或急性感染的药物中的应用。