KR101930582B1 - 혈장으로부터 면역글로빈의 분획 i-iv-1 침전 - Google Patents

Abstract

다른 측면들 중에서, 본 발명은 플링된 혈장으로부터 혈액 단백질 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 개시 혈장 샘플로부터 정제된 혈액 단백질의 수율에서 유의미한 증가를 허용하는 알코올 분획화 도식을 제공한다. 특정 구현예에서, 풀링된 혈장을 분획화하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 초기 낮은 pH, 높은 알코올 침전 단계를 포함한다. 본 발명은 또한, 치료적 혈액 단백질의 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

혈장으로부터 면역글로빈의 분획 I-IV-1 침전{FRACTION I-IV-1 PRECIPITATION OF IMMUNOGLOBINS FROM PLASMA}

출원에 대한 교차참조

본원은 2012년 2월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/602,488호의 우선권을 주장하며, 그의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 통합되어 있다.

인간 혈장 유래의 면역 글로불린 제품들이 면역 결핍을 치료하기 위해 1952년에 최초로 사용되었다. 처음에는, 혈장으로부터 분리된 면역글로불린 아이소타입 G (IgG)의 근육내 또는 피하 투여가 선택된 방법이었다. 그러나, 이들 방법은 다양한 질환의 효과적인 치료에 필요한 더 많은 양의 IgG의 투여가 불가능하였다. 따라서, 정맥내로 투여될 수 있는 IgG 제품이 개발되었다. 보통, 정맥내 면역글로불린 (IVIG)은 1000명이 넘는 혈액 공여자의 혈장 유래의 모아진 면역글로불린 G (IgG) 면역글로불린을 함유한다. 상기 제제는 보통 온전한 Fc-의존적 효과기 기능을 갖는 95%가 넘는 비변형된 IgG와 단지 미량의 면역글로불린 A (IgA) 및 면역글로불린 M (IgM)을 함유한다. 전형적으로, IVIG는 멸균 여과되며 그 제조 공정은 바이러스를 불활성화시키고/거나 제거하는 단계들을 함유한다. 이들 정제된 IgG 제품들은 3가지 주요 카테고리의 의학적 상태를 치료하는데 주로 사용된다: (1) 면역 결핍: 낮은 항체 수준을 특징으로 하는, X-연관된 무감마글로불린혈증, 저감마글로불린혈증 (일차 면역 결핍), 및 후천성 손상된 면역 상태 (2차 면역 결핍); (2) 염증성 및 자가면역 질환; 및 (3) 급성 감염.

구체적으로, 일차 면역결핍 장애가 있는 많은 사람들은 감염에 저항하는데 필요한 항체가 부족하다. 어떤 경우, 이들 결핍은 통상적으로 정맥내 투여 (즉, IVIG 요법)을 통한, 정제된 IgG의 주입에 의해 보충될 수 있다. X-연관된 무감마글로불린혈증 (XLA), 공통 가변성 면역결핍증 (CVID), 과도-IgM 증후군 (HIM), 중증 복합성 면역결핍증 (SCID), 및 일부 IgG 서브클래스 결핍증을 포함하는, 몇 가지 일차 면역결핍 장애들은 통상적으로 유행하는 방식으로 치료된다 (Blaese and Winkelstein, J. Patient & Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson, MD: Immune Deficiency Foundation; 2007).

IgG 치료가 일차 면역결핍 장애를 처리하는데 매우 효과적일 수 있지만, 이 요법은 질환의 치료라기보다는, 체내에서 생산되지 않는 항체에 대한 단지 일시적인 대체이다. 따라서, 환자들은 전형적으로 평생 매달 약 1회씩 IgG 요법의 반복된 용량에 의존한다. 이 요법은 IgG 조성물의 지속적인 생산을 강하게 요구한다. 그러나, 재조합 DNA 벡터의 시험관내 발현을 통해 생산되는 다른 생물제제와는 달리, IgG는 인간 혈액 및 혈장 기부물로부터 분획화된다. 따라서, 상업적으로 이용가능한 IgG의 수준은 혈액 및 혈장 기부물의 이용가능한 공급에 의해 제한된다.

IgG 치료의 허용, IgG 요법이 효과적인 부가적인 징후들의 확인, 및 환자 진단 및 IgG 처방의 증가를 포함하는, 몇 가지 인자들이 IgG에 대한 수요를 촉진한다. 특히, IgG에 대한 전 세계적인 수요는 1990년과 2009년 사이에 4배 이상 증가하였고, 매년 약 7% 및 10% 사이로 계속 증가하고 있다 (Robert P., Pharmaceutical Policy and Law, 11 (2009) 359-367). 예를 들면, 호주 국립 혈액 기구는 호주에서 IgG에 대한 수요가 2008-2009 회계 연도에 대해 10.6%까지 증가하였다고 보고하였다 (National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009).

면역글로불린 제품의 이용가능한 공급에서 전세계적인 수요 및 변동의 증가로 인해, 호주 및 영국을 포함하는 몇몇 국가들은 제품이 부족한 시간 동안 수요가 가장 높은 환자를 위해 이들 제품의 공급을 막는 수요 관리 프로그램을 시행하였다.

2007년에, 2650만 리터의 혈장이 분획화되어 75.2 미터 톤의 IgG가 생성되었고, 리터당 평균 생산 수율이 2.8 그램인 것으로 보고되었다 (상기 Robert P.). 이 동일한 보고서는 전세계적인 IgG 수율이 2012년에 리터당 약 3.43 그램까지 증가할 것으로 예상된다고 추정하였다. 그러나, 현재와 2015년 사이에 연간 약 7% 및 13% 사이로 예상되는, IgG에 대한 전세계적인 수요의 지속적인 성장으로 인해, 전세계적인 수요를 충족시키기 위해 전체 IgG 수율의 추가 개선이 필요할 것이다.

수많은 IgG 제조 방법들이 IgG 제품의 상업적 공급자들에 의해 사용된다. 현재 IgG 생산 방법의 공통적인 문제는 정제 공정 중 IgG의 실질적인 손실이며, 이는 출발 물질의 총 IgG 함량의 적어도 30% 내지 35%인 것으로 추정된다. 한 가지 도전은 IgG의 수율을 증가시키기 위해 공정 효율을 개선시키면서, 역반응을 야기할 수 있는 바이러스 불활성화 및 불순물 제거의 질을 유지하는 것이다. IgG의 현재 생산 수준에서, 수율에서의 작은 증가로 고려될 수 있는 것이 실제 매우 유의하다. 예를 들면 2007년 생산 수준에서, 리터 당 56 밀리그램 추가와 동일한, 2% 효율 증가는 1.5 추가 미터 톤의 IgG를 생성할 것이다.

혈청 및 혈장 단백질의 제조 및 특성에 대해 공개된 일련의 독창적인 논문들 중 4회분에서, Cohn 등 (J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475)은 인간 혈장 유래의 IgG가 농축된 분획의 분리를 가능하게 하는, 혈장 단백질의 알코올 분획화 방법을 최초로 기술하였다 (방법 6). 몇 년 후, Oncley 등 (J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550)은 더 순수한 IgG 제제의 분리를 야기한 방법 (방법 9)을 공개함으로써 Cohn 방법을 확장하였다.

이들 방법은, 비록 혈장 유도된 혈액 단백질의 전체 산업에 대한 기초를 다지긴 하지만, 카와사키 증후군, 면역 혈소판감소 자색반병, 및 일차 면역 결핍을 포함하는, 몇 가지 면역-관련 질환의 치료를 위해 충분히 높은 순도를 갖는 IgG 제제를 제공할 수 없다. 이와 같이, 이온 교환 크로마토그래피와 같은 다양한 기술을 이용하는 추가의 방법론이 더 높은 순도 IgG 제형을 제공하기 위해 개발되었다. Hoppe 등 (Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752), Falksveden (스웨덴 특허 제348942호), 및 Falksveden 및 Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)가 이러한 목적을 위해 이온 교환 크로마토그래피를 이용한 최초의 사람 중 하나였다.

혈장으로부터 면역글로불린을 정제하는 다양한 현대 방법들은 칼럼 크로마토그래피와 결합된 침전 단계, 예컨대 카프릴레이트 침전 (Lebing 등, Vox Sang 2003 (84):193-201) 및 Cohn 분획 (I+)II+III 에탄올 침전 (Tanaka 등, Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30)를 이용한다. 가장 최근에, Teschner 등 (Vox Sang, 2007 (92):42-55)은 10% IgG 제품의 생산 방법을 기술하였는데, 여기에서 동결-침전물이 먼저 모아진 혈장으로부터 제거된 다음, 변형된 Cohn-Oncley 차가운 에탄올 분획화가 수행된 후, 중간체의 S/D 처리, 이온 교환 크로마토그래피, 나노여과, 및 임의로 한외여과/정용여과가 수행된다.

이들 IgG 단리 방법에 의해 제공되는 순도, 안전성, 및 수율에도 불구하고, 혈장으로부터 회수된 IgG의 수율은 여전히 개선될 수 있다. 예를 들면, Teschner 등은 그들의 방법이 65%의 증가된 IgG 수율을 야기한다고 보고한다 (전술한 Teschner 등). 다양한 혈장 제품 미팅 동안 보고된 바와 같이, Baxter, CSL Behring, Upfront Technology, Cangene, Prometric BioTherapeutics, 및 the Finnish Red Cross 유래의 IgG의 대규모 제제에 대한 평균 수율은, 최종 용기 내에서 약 61% 내지 약 65%의 범위이다. 종래 이용된 방법보다 더 나음에도 불구하고, 이러한 양의 IgG 회수는 여전히 단리 공정 동안 모아진 혈장 분획 내에 존재하는 IgG의 적어도 약 1/3의 손실에 해당한다.

혈장-유래 제품의 제조에 이용가능한 혈장의 제한된 공급으로 인해, 공통의 출발 혈장 집합으로부터의 몇 가지 혈액 단백질의 분리는 정제들을 단일 뼈대로 통합함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, IgG는 통상적으로 Cohn 분획 II+III 침전물 또는 Kistler-Nitschmann 침전물 A의 형성을 통해 농축되며, 이들의 상응하는 상청액은 이후에 알파-1-항트립신 (A1PI) 및 알부민의 제조에 사용된다. 유사하게, WO 제2008/113589호 및 WO 제2011/011753호를 포함하는, IgG 면역글로불린의 제조 동안 형성된 부산물로부터 인자 H를 제조하는 몇 가지 방법이 기술되어 왔다.

이와 같이, 치료적 IgG 제품을 제조하기 위한 개선되고 보다 효율적인 방법이 요구된다. 더욱이, 이들 방법은 또한 단일 혈장 공급원으로부터 추가의 혈장-유래 제품을 제조하는 것을 허용하여야 한다. 본 발명은 현재 달성가능한 것보다 대략 20 내지 25% 더 높은 수율을 생산하는 IgG 단리 방법, 뿐만 아니라 이로부터 제공된 IgG 조성물을 제공함으로써 이들 및 다른 요구를 충족시킨다. 유익하게는, 본원에서 제공된 방법은 알파-1-항트립신 (A1PI), 인자 H, 인터-알파-억제제 단백질 (IaIp), 프롯트롬빈 복합체, 인자 VII (FVII), 인자 VIII (FVIII), 항트롬빈 III (ATIII), 피브리노겐, 부티릴콜린에스테라아제 등을 포함하는, 다른 치료적으로 중요한 혈장-유래 단백질의 공동-분리를 허용한다.

발명의 간단한 요약

IVIG 및 알파-1-항트립신 (A1PI)의 생산을 위한 현재의 방법들은 인간 혈장에서 발견되는 다른 성분들로부터 면역글로불린 IgG 및 A1PI를 분리하는 다수의 단백질 침전 단계에 의존한다. 예를 들면, 많은 제조는 Cohn-Oncley 방법 6의 변형을 사용하며, 여기에서 3번의 초기 알코올 침전 단계들이 이용된다. 분획 I 침전으로 지칭되는 제 1 침전 단계는 상청액에 유지되는, IgG 및 A1PI로부터 피브리노겐 및 인자 XIII와 같은 단백질을 침전시키기 위해 높은 pH (7.2) 및 낮은 에탄올 농도 (8-10% v/v)에서 수행된다. 이후, IgG가 중간 pH (6.8) 및 높은 에탄올 농도 (20%-25%)에서 수행되는, 분획 II+III 침전으로 지칭되는, 제 2 침전 반응에서 분획 I 상청액으로부터 침전된다. A1PI의 대부분은 분획 II+III 침전 반응의 상청액에 유지되며, 이는 이후에 낮은 pH (5.2) 및 중간 에탄올 농도 (18%)에서 수행되는, 분획 I-IV-1 침전으로 지칭되는, 제3 초기 침전 반응에서 알부민으로부터 분리된다.

불행하게도, 상기 기술된 Cohn-Oncley 방법, 뿐만 아니라 IgG 및 A1PI를 분획화하는 4번의 초기 침전을 이용하는, 대등한 Kistler-Nitschmann 공정이 복잡한 일련의 침전 반응들에서 개별 성분들을 분리하기 때문에, 상기 분획화는 비효율적이다. 이들 초기 침전 단계에서 IgG 및 A1PI의 수율에서의 유의한 손실은, 비-표적화된 분획 내로의 부분적인 침전 뿐만 아니라 표적화된 분획에서의 불완전한 침전에 기인할 수 있다. 예를 들면, 분획 I 침전물에서 피브리노겐 및 인자 XIII와의 어느 정도의 IgG 공동-침전물 및 일부IgG는 분획 II+III 침전에 의해 침전되지 않는다. 용해된 분획 II+III 침전물의 청징 후, IgG 수율은 시작하는 Cohn 풀 내에 존재하는 IgG의 75% 내지 85% 사이이다. 따라서, 출발 물질의 총 IgG 함량 중 15% 내지 25%가 이들 2번의 분획화 단계 후 손실된다.

본 개시내용은 다수의 초기 침전 단계에 대한 필요성을 제거함으로써 모아진 혈장으로부터 IgG 및 A1PI의 회수를 개선한다. 오히려, 본원에 기재된 방법들은 조합된 분획 I, 분획 II+III, 및 분획 IV-1 침전물에서 정상적으로 침전된 모든 단백질을 포획하는 단일 초기 침전 단계에 의존한다. 이러한 단일 침전 단계는 "분획 I+II+III+IV-1 침전," "분획 I-IV-1 침전," 또는 "초기 낮은 pH, 높은 알코올 침전"로서 본원에서 지칭된다. 유익하게는, IgG 및 A1PI는 차후의 단백질 침전을 사용하지 않고 분획 I-IV-1 침전물로부터 효율적으로 추출될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 분획 I-IV-1 침전물은 공급원 혈장의 거의 모든 IgG 및 A1PI 함량을 함유한 반면, 알부민은 상청액에 유지되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이들을 종합할 때, 이들 이점은 이들 중요한 상업적 제품들의 전체적 회수의 유의한 증가를 야기한다.

실시예예 나타난 바와 같이, 동결 결핍성 혈장으로부터 IgG의 정제에서의 초기 단계로서 낮은 pH, 높은 알코올 침전 단계 (분획 I-IV-1 침전)의 사용은, 4.3-4.7 g IgG/L 공급원 혈장의 전례없는 수율로 약제학적 등급의 IgG 조성물을 생산할 수 있게 한다. 이들 수율은 동일한 혈장 유형으로부터 GAMMAGARD LIQUID ^® (Baxter International; Deerfield, IL)를 제조하는데 사용된 것과 같은 최신 제조 공정과 비교하여 약 20% 내지 25%의 수율 증가를 나타낸다.

따라서, 다른 측면들 중에서, 본 발명은 초기 단계의 혈장 또는 동결 결핍성 혈장을 분획 I-IV-1 침전물 및 분획 I-IV-1 상청액으로 분리하는 신규 혈장 분획화 과정을 제공한다. 분획 I-IV-1 침전물은 거의 모든 면역글로불린 (예를 들면, IgG, IgA, 및 IgM) 및 알파 1 엘라스타제 억제제 (A1PI)을 함유하고, 한편 상기 상청액은 주로 알부민을 함유한다.

일 측면에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 Cohn 풀로부터 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 제 1 침전 단계에서, 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 동결 결핍성 혈장으로부터 공-침전시켜, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; (b) 상기 제 1 침전물에서 면역글로불린을 용해시켜, 면역글로불린을 포함하는 가용성 부분 및 A1PI을 포함하는 불용성 부분을 갖는 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; (c) 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계; 및 (d) 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 알코올 침전 단계이다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 알코올 침전 단계는 에탄올을 동결 결핍성 혈장에 부가하여 5 내지 6의 pH에서 20% 내지 30% 에탄올 (v/v)의 최종 농도를 달성하는 것을 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 침전 단계에서의 에탄올의 최종 농도는 25±4%이다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 에탄올의 최종 농도는 25±3%이다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 에탄올의 최종 농도는 25±2%이다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 에탄올의 최종 농도는 25±1%이다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 에탄올의 최종 농도는 25%이다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 침전 단계의 pH는 5.5±0.4이다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, pH는 5.5±0.3이다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, pH는 5.5±0.2이다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, pH는 5.5±0.1이다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, pH는 5.5이다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, pH는 제 1 침전 단계의 지속시간 동안에 유지된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 알코올 침전 단계는 분무에 의한 알코올의 부가를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 알코올 침전 단계는 임펠러에 인접한 부위에서 알코올의 부가를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 알코올은 하나 초과의 부위에서 용액에 도입된다. 일 구현예에서, 알코올은 복수의 작은 포트에서 용액에 도입된다. 특정 구현예에서, 알코올 부가의 다중 부위는 임펠러 또는 다른 분산 소자에서 또는 그 근처에서 위치한다. 또 하나의 구현예에서, 알코올은 복수의 개구들을 포함하는 살포기 포트를 통해 용액에 도입된다. 특정 구현예에서, 살포기 포트에서 복수의 개구들 중 각 개구들의 하나 이상은 임펠러 또는 다른 분산 소자에서 또는 그 근처에서 위치한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 -3℃ 내지 -10℃의 온도에서 수행된다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 -5℃ 내지 -9℃의 온도에서 수행된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 침전물은 4 L 내지 60 L의 완충제 / kg 침전물로 현탁된다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 침전물은 8 L 내지 15 L의 완충제 / kg 침전물로 현탁된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 서스펜션은 4.0 내지 5.4의 pH를 갖는다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 서스펜션은 4.7 내지 5.1의 pH를 갖는다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 서스펜션은 0 mS/cm 내지 4 mS/cm의 전도도를 갖는다. 상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 서스펜션은 0.5 mS/cm 내지 2 mS/cm의 전도도를 갖는다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 1 침전물은 아세테이트 및/또는 포스페이트를 포함하는 완충제에서 현탁된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분은 원심분리 또는 여과에 의해 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계는 하기를 포함한다: (i) 미분된 이산화규소 (SiO₂)을 상기 제 1 서스펜션과 혼합하는 단계; 및 (ii) 상기 SiO₂을 상기 서스펜션으로부터 분리하는 단계.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 미분된 이산화규소 (SiO₂)는 350 m²/g 내지 410 m²/g의 평균 표면적을 갖는다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 미분된 이산화규소 (SiO₂)는 15 g/kg 제 1 침전물 내지 80 g/kg 제 1 침전물의 최종 농도에서 상기 제 1 서스펜션에 부가된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 5.3 내지 5.7의 pH 및 -6℃ 내지 -8℃의 온도에서 24% 내지 26% 알코올로 제 1 침전 단계에서, 면역글로불린을 동결 결핍성 혈장으로부터 침전시켜, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; (b) 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; (c) 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소 (SiO₂)로 처리하는 단계; (d) 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 분리하는 단계; 및 (e) 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 단계 (a)에서 사용된 Cohn 풀에서 존재하는 IgG의 면역글로불린 함량의 적어도 90%를 함유한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 단계 (a)에서 사용된 Cohn 풀에서 존재하는 IgG의 면역글로불린 함량의 적어도 95%를 함유한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 하기의 단계를 포함한다: (f) 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획으로부터 침전시켜, 제 2 침전물 및 제 2 상청액을 얻는 단계; (g) 상기 제 2 침전물을 현탁시켜 제 2 서스펜션을 형성하는 단계; 및 (h) 상기 제 2 서스펜션의 가용성 분획을 회수하고, 그렇게 함으로써 추가의 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 2 침전 단계는 알코올 침전 단계이다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 2 알코올 침전 단계는 6.5 내지 7.5의 pH에서 22% 내지 28% 에탄올의 최종 부가를 달성하기 위해 에탄올을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획에 부가하는 것을 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 2 알코올 침전 단계는 분무에 의한 알코올의 부가를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 2 알코올 침전 단계는 임펠러에 인접한 부위에서 알코올의 부가를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 알코올은 하나 초과의 부위에서 용액에 도입된다. 일 구현예에서, 알코올은 복수의 작은 포트에서 용액에 도입된다. 특정 구현예에서, 알코올 부가의 다중 부위는 임펠러 또는 다른 분산 소자에서 또는 그 근처에서 위치한다. 또 하나의 구현예에서, 알코올은 복수의 개구들을 포함하는 살포기 포트를 통해 용액에 도입된다. 특정 구현예에서, 살포기 포트에서 복수의 개구들 중 각 개구들의 하나 이상은 임펠러 또는 다른 분산 소자에서 또는 그 근처에서 위치한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 제 2 침전 단계는 -3℃ 내지 -10℃의 온도에서 수행된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 단계 (a)에서 사용된 동결 결핍성 혈장에서 존재하는 IgG 함량의 적어도 90%를 함유한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 단계 (a)에서 사용된 동결 결핍성 혈장에 존재하는 IgG 함량의 적어도 95%를 함유한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 음이온 교환 크로마토그래피 풍부함 단계를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 양이온 교환 크로마토그래피 풍부함 단계를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 바이러스 불활성화 또는 제거 단계를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 용매/세제 (S/D) 바이러스 불활성화 단계를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 나노여과 단계를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 4.0 내지 5.0의 pH 및 20℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 1 주 동안 상기 조성물을 인큐베이트하는 단계를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 최종 풍부한 IgG 조성물은 적어도 98% IgG를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 최종 풍부한 IgG 조성물은 적어도 99% IgG를 포함한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 적어도 4 g의 IgG per L의 단계 (a)에서 사용된 동결 결핍성 혈장을 산출한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 적어도 4.25 g의 IgG per L의 단계 (a)에서 사용된 동결 결핍성 혈장을 산출한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 적어도 4.5 g의 IgG per L의 단계 (a)에서 사용된 동결 결핍성 혈장을 산출한다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 알파-1-항트립신 (A1PI)은 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 추가로 정제된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 피브리노겐은 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 추가로 정제된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 인자 H는 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 추가로 정제된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 인터-알파-트립신 억제제 단백질 (IαIp)은 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 추가로 정제된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획은 미분된 이산화규소 (SiO₂)로 처리된다.

상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 알부민은 제 1 상청액으로부터 추가로 정제된다.

일 측면에서, 본 발명은 청구항 1 내지 63 중 어느 하나의 항에 따른 방법으로 제조된 풍부한 면역글로불린 조성물을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 치료가 필요한 개인에서 면역 결핍, 염증성 질환, 자가면역 질환, 또는 급성 감염을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 청구항 64의 풍부한 면역글로불린 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

도 1. 본원에서 기재된 일 구현예에 따른 혈장 분획화 도식의 도표.

발명의 상세한 설명

I. 도입

다른 측면들 중에서, 본 발명은 모아진 혈장으로부터 치료 단백질을 분리하는 보다 효율적인 방법을 제공한다. 모아진 혈장을 분획화하기 위한 본원에 제공된 방법들은 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 포함하는 다수의 치료적으로 중요한 혈장-유래 혈액 단백질들의 더 높은 수율을 제공한다. 특히 중요한 측면에서, 본 발명은 치료적 IgG 조성물의 제조를 위해 사용된 최신 방법과 비교하여, 혈장으로부터 분리된 면역글로불린 G (IgG)의 수율을 유의하게 증가시키는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 이들 개선된 수율은 낮은 pH, 높은 알코올 조건 하에서, 출발 혈장 샘플 (본원에서 "Cohn 풀"로서 지칭됨)로부터 면역글로불린 및 AIP1을 침전시킴으로써 달성된다. 낮은 pH, 높은 알코올 침전 단계는 출발 Cohn 풀의 면역글로불린 조성물의 질량 포획을 야기한다. 최신 면역글로불린 제조 공정들과 비교하여, 본원에서 제공된 방법은 혈장의 업스트림 분획화 동안 손실되는 면역글로불린의 양을 유의하게 감소시킨다.

본 발명의 방법은 치료적 투여를 위해 충분히 높은 순도로 인간 혈장으로부터 단백질을 분리하는데 필요한 단백질 침전 단계의 수를 줄이면서, 동시에 면역글로불린 G (IgG)와 같은 치료적으로 중요한 혈액 단백질의 회수 수율을 증가시킨다. 구체적으로, 본 방법은 Cohn-Oncley, Kistler-Nitschmann, 및 Deutsch 분획화 도식으로부터 유래된 제조 공정에서 사용되는, 통상 분획 I 침전으로 지칭된, 초기 높은 pH, 낮은 알코올 침전 단계에 대한 필요성을 제거한다. 대신에, 본원에서 제공된 방법은 침전물 내의 혈장의 IgG, IgA, IgM, 및 알파-1-항트립신 (A1PI) 함량의 대부분 및 상청액 내의 알부민 대부분을 분할하는 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계 (본원에서 분획 I-IV-1 침전으로서 지칭됨)를 이용한다. 그리고 나서, IgG는 다양한 수단을 통해 IgA, IgM, 및 A1PI로부터 분리되어 고수율 IgG 조성물을 야기한다. 분획 I 침전 단계를 이용하는 방법과 비교하여, 초기 분획 I-IV-1 침전 단계에서 IgG의 질량 포획은 제조 공정의 최종 수율을 최소 10 내지 25%까지 증가시킨다.

E. J. Cohn은 1946년에 염보다도 에탄올을 이용한 혈장의 분획화 방법을 처음으로 확립하였다. 이 시점 이후, 에탄올 침전은 혈장-유래 제품, 예컨대 IgG 및 A1PI의 대규모 제조를 위해 선택되는 방법이 되었다. 전형적으로, 이들 제조 공정은 일련의 에탄올 분획화 단계를 이용하여 다양한 혈장-유래 혈액 단백질의 조질 분획을 제공하며, 이는 다양한 상이한 다운스트림 절차/기술에 의해 추가 농축된다.

Cohn 절차는 초기에는 알코올을 이용한 분별 침전에 의해 상대적으로 높은 (95%) 순도로 알부민을 얻기 위해 개발되었다. 그러나, Cohn 방법 6번에서의 특정한 단백질 침전물 (분획 II+III)이 고농축된 면역글로불린 조성물을 정제하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다는 것이 Oncley 등, Deutsch 등, 및 Kistler 및 Nitschmann에 의해 빠르게 실현되었다. IgG 조성물의 정맥내 투여에 필요한 더 높은 순도 및 안전성을 달성하기 위해, 몇 가지 정제 및 연마 단계 (예를 들면 일반적으로 흡착 또는 모든 상이한 크로마토그래피 기술, 교차-유동-여과, 등.)가 알코올 분획화 단계 후 IgG 제조 공정에 추가되었다.

전형적으로, IgG 제조는 다운스트림 처리를 위한 출발 물질로서 Cohn 방법 6 분획 II+III 침전물 또는 Kistler-Nitschmann 침전물 A에 의존한다. 두 분획들은 두 단계 공정에 의해 형성되며, 여기서: i.) 피브리노겐 및 인자 XIII과 같은 단백질은 낮은 에탄올 농도 (8-10% v/v)를 갖는 높은 pH (7.2)에서 수행된 초기 침전 단계 (분획 I 침전)에 의해 제거되고; ii.) IgG는 20-25% (v/v) 에탄올 (분획 II+III)을 갖는 pH 6.8 또는 19% 에탄올 (v/v) 에탄올 (침전물 A)을 갖는 pH 5.85의 분획 I 상청액으로부터 침전되는 반면, 알부민 및 상당 부분의 AIPI는 상청액에 유지된다. 그러나, IgG 조성물을 제조하기 위해 출발 물질로서 분획 II+III 침전물 또는 침전물 A를 사용하면 상기에서 기재된 바와 같이 공정 내 몇 가지 단계에서 IgG 손실이 야기된다.

이들 사안을 극복하기 위해, 발명자들은, 알부민이 상청액에 남아 있는 동안 공급원 혈장의 거의 모든 IgG 및 A1PI 함량을 함유하는 개시 물질을 제공하기 위해 면역글로불린 및 A1PI를 공-침전시키는 초기 정제 단계를 개발했다. 이러한 분획화 단계는 본질적으로 분별 침전 단계 I, II+III, 및 IV-1 (Oncley 등 (위에) 기재)를 분획 I+II+III+IV-1 (또는 분획 I-IV-1) 침전로서 본원에서 칭해지는 단일 침전 반응으로 붕괴시킨다.

일 측면에서, 본 발명은 분획 I-IV-1 침전물을 개시 물질로서 사용하여 정맥내, 피하, 또는 근육내 투여용 고수율 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 방법은 추가로, 분획 I-IV-1 침전물로부터 면역글로불린의 추출 동안에 형성된 서스펜션의 불용성 분획으로의 알파-1-항트립신 (A1PI)의 분리를 포함한다. 분리된 불용성 분획은 혈장-유도된 A1PI 조성물의 제조를 위해 개시 물질로서 사용된다.

일 구현예에서, 본 발명은 풀링된 혈장으로부터 단리된 단백질의 치료적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이들 제조 방법은 전통적 방법과 비교하여 다양한 혈액 단백질의 회수를 증가시키는 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 (예를 들면, 에탄올) 침전 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 면역글로불린 (예를 들면, IgG), 알부민, 알파-1-항트립신 (A1PI), 부티릴콜린에스테라아제, 인자 H, 또는 인간 혈액, 혈장, 또는 그의 유도체로부터 단리된 인터-알파-트립신 억제제 (IαI) 단백질을 함유하는 하나 이상의 치료적 조성물을 제조하는데 유용하다.

II . 정의

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IgG 치료"는 일반적으로, 수많은 병태 예컨대 면역 결핍, 염증성 질환, 및 자가면역 질환을 치료하기 위해 IgG 면역글로불린의 조성물을 환자에게 정맥내로, 피하로, 또는 근육내로 투여하는 치료 방법을 의미한다. IgG 면역글로불린은 전형적으로 풀링되고 혈장으로부터 제조된다. 전체의 항체 또는 단편이 사용될 수 있다. IgG 면역글로불린은 피하 투여를 위해 고농도 (예를 들면, 10% 초과)로 제형될 수 있거나 근육내 투여를 위해 제형될 수 있다. 이것은, 특이적 항원 (예를 들면, Rho D 인자, 백일해 독소, 테타누스독소증 독소, 보툴리눔독소증 독소, 광견병, 등)에 대해 평균보다 더 높은 역가로 제조된 전문 IgG 제제에 대해 특히 일반적이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "동결 결핍성 혈장"은 동결 근저의 온도, 예를 들면, 약 10℃ 미만의 온도, 바람직하게는 약 6℃ 이하의 온도에서 융해 혈장 또는 풀링된 혈장에 의해 형성된 동결-침전물의 제거 후 만들어진 상청액을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 혈장은 상호교환적으로 회수된 혈장 (즉, 생체외에서 전혈로부터 분리된 혈장) 또는 공급원 혈장 (즉, 혈장분리반출술을 통해 수집된 혈장)을 의미할 수 있다. 동결-침전은, 예를 들면, 안전성 및 품질 고려에 대해 이미 검정된 미리 냉동된 풀링된 혈장을 융해시켜 통상적으로 수행되지만, 신선한 혈장이 또한 사용될 수 있다. 저온에서 냉동된 혈장의 완전한 융해 후, 액체 상청액으로부터 고체 동결-침전물의 분리는 원심분리 또는 여과에 의해 차가운 곳 (예를 들면, ≤ 6℃)에서 수행된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "Cohn 풀"은 혈장 샘플의 분획화 또는 혈장 샘플의 풀을 위해 사용된 개시 물질을 의미한다. Cohn 풀은, 전체의 혈장, 동결 결핍성 혈장, 및 전-처리 단계가 수행된 동결 결핍성 혈장 중 하나 이상을 포함한다. 어떤 구현예에서, Cohn 풀은, 하나 이상의 혈액 인자가 전-처리 단계, 예를 들면, 고체상 (예를 들면, 알루미늄 하이드록사이드, 미분된 이산화규소, 등)에의 흡착, 또는 크로마토그래피 단계 (예를 들면, 이온 교환 또는 헤파린 친화성 크로마토그래피)에서 제거된 동결 결핍성 혈장 샘플이다. 인자 8 억제제 우회 활성 (FEIBA), 인자 IX-복합물, 인자 VII, 프로트롬빈 복합체, 및/또는 항트롬빈 III를 비제한적으로 포함하는 다양한 혈액 단백질은, 분획화 전에 동결 결핍성 혈장 샘플로부터 단리될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "풍부한 조성물"은, 단백질의 순도가 개시 혈장 샘플 중 단백질의 순도보다 더 높은 혈장 샘플로부터 단리된 단백질 조성물을 의미한다. 일 구현예에서, 풍부한 조성물 중 단백질은 개시 혈장 샘플에서보다 적어도 25% 더 순수하다. 다른 구현예에서, 풍부한 조성물은 개시 혈장 샘플보다 적어도 50%, 75%, 100%, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 또는 그 초과 순수하다. 예를 들면, 단백질의 70%가 IgG인 풍부한 IgG 조성물은, 총 단백질의 10%가 IgG인 개시 혈장 샘플과 비교하여 7-배 풍부하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "확산 부가"는 비국재화된 방식으로 물질을 액체 시스템에 부가하는 수단을 의미한다. 확산 부가는, 예를 들면, 액체 (예를 들면, 알코올, pH 조정제, 용매, 세제, 또는 다른 액체)를 액체 시스템 (예를 들면, 혈장 분획)에 분무 또는 부옇게 하고, 다중 부위에서 액체를 시스템에 도입하고, 살포기 포트를 사용하여 액체를 시스템에 도입하고, 임펠러 또는 다른 분산 소자에서 또는 그 근처에서 액체를 도입하거나, 액체 시스템의 확장된 면 위에 고체상으로 존재하는 화학물질을 분배하여 달성될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분무"는 예를 들면 액체 물질의 미세 소적 또는 미스트의 형태로 알코올 침전 단계, 예컨대 분획 I-IV-1 침전 단계 동안에 액체 물질을 시스템으로 전달하는 수단을 의미한다. 분무는 임의의 가압된 디바이스, 예컨대 용기 (예를 들면, 분무 병)에 의해 달성될 수 있고, 이 용기는 분무 헤드 또는 노즐을 가지며 액체로부터 미세 미스트를 생성하기 위해 수작업으로 또는 자동으로 작동된다. 전형적으로, 분무는, 액체 물질을 수용하는 시스템이 시스템 내의 액체의 빠른 및 동등한 분포를 보장하기 위해 연속적으로 교반되거나 달리 혼합되면서, 수행된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "용매"는 하나 이상의 다른 물질을 용해시키거나 분산시킬 수 있는 임의의 액체 물질을 포함한다. 용매는 물과 같이 본성이 무기성일 수 있거나, 유기 액체, 예컨대 에탄올, 아세톤, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 헥산, 휘발유 에테르, 등일 수 있다. 용어 "용매 세제 처리"에서 사용된 바와 같이, 용매는 유기 용매 (예를 들면, 트리-N-부틸 포스페이트)를 나타내고, 이 용매는 용액 중 지질-외피보유 바이러스를 불활성화시키기 위해 사용된 용매 세제 혼합물의 일부이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세제"는 용어 "계면활성제" 또는 "표면 작용제"와 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 계면활성제는 전형적으로, 양친매성, 즉, 유기 용매 및 물에서 계면활성에 가용성을 부여하는 소수성 그룹 ("테일") 및 친수성 그룹 ("헤드") 둘 모두를 함유하는 유기 화합물이다. 계면활성제는 그것의 헤드에서 정식으로 충전된 그룹의 존재에 의해 분류될 수 있다. 비-이온성 계면활성제는 그것의 헤드에 전하 그룹을 갖지 않으며, 반면에 이온성 계면활성제는 그것의 헤트에 순전하를 가지고 있다. 쯔비터이온 계면활성제는 2 개의 반대 전하 그룹을 갖는 헤드를 함유한다. 공통의 계면활성제의 일부 예는 하기를 포함한다: 음이온성 (설페이트, 설포네이트 또는 카복실레이트 양이온 기반): 퍼플루오로옥타노에이트 (PFOA 또는 PFO), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (PFOS), 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 암모늄 라우릴 설페이트, 및 다른 알킬 설페이트 염, 나트륨 라우레쓰 설페이트 (로도 공지됨 나트륨 라우릴 에테르 설페이트, 또는 SLES), 알킬 벤젠 설포네이트; 양이온성 (사급 암모늄 양이온 기반): 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 로도 알려짐 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드, 및 다른 알킬트리메틸암모늄 염, 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC), 폴리에톡실화된 탈로우 아민 (POEA), 벤즈알코늄 클로라이드 (BAC), 벤즈에토늄 클로라이드 (BZT); 하기를 포함하는 장쇄 지방산 및 그의 염: 카프릴레이트, 카프릴산, 헵탄귀리, 헥산산, 헵탄산, 나논산, 데카노산, 등; 쯔비터이온 (양쪽성): 도데실 베타인; 코카미도프로필 베타인; 코토 암포 글리시네이트; 비이온성: 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리(프로필렌 옥사이드) (폴록사머 또는 폴록사민으로서 상업적으로 공지됨)의 코폴리머, 옥틸 글루코사이드를 포함하는 알킬 폴리글루코사이드, 데실 말토사이드, 지방 알코올 (예를 들면, 세틸 알코올 및 올레일 알코올), 코카마이드 MEA, 코카마이드 DEA, 폴리소르베이트 (Tween 20, Tween 80, 등), Triton 세제, 및 도데실 디메틸아민 옥사이드.

"치료적 효과량 또는 용량" 또는 "충분한/효과적인 양 또는 용량"이란, 투여되는 효과를 생성하는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료의 목적에 의존할 것이고, 공지된 기술을 사용하여 당해분야의 숙련가에 의해 확인될 것이다 (참고, 예를 들면, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전" 및 "분획 I-IV-1 침전"은 상호교환적으로 20% 내지 30% (v/v)의 최종 알코올 농도 (전형적으로 에탄올) 및 5.0 내지 6.0의 pH에서 Cohn 풀로부터의 단백질의 침전을 의미한다. 일반적으로, 수득한 분획 I-IV-1 침전물은 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%을 함유한다. 바람직한 구현예에서, 면역글로불린은 IgG 면역글로불린을 포함한다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 알파-1-항트립신 (A1PI)는 분획 I-IV-1 침전에서 면역글로불린과 공-침전된다.

III . 혈장의 분획화

일 측면에서, 본 발명은 초기 침전 단계를 이용하여 풀링된 혈장으로부터 치료적 단백질을 분획화하는 방법을 제공하고, 여기서 개시 혈장의 대다수의 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI) 함량은 침전되고 개시 혈장의 대다수의 알부민 함량은 상청액에서 유지된다. 이러한 초기 침전 단계로부터 개시하여, 수많은 치료적으로 중요한 혈액 단백질은 높은 회수 수율로 제조될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 혈장 샘플에서 혈액 단백질을 분획화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 낮은 pH의, 고급 알코올 조건 하에서 면역글로불린 및 A1PI를 상기 개시 혈장으로부터 침전시키는 것을 포함한다. 이러한 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계로 침전물 (분획 I-IV-1 침전물로서 본원에서 칭함) 및 상청액 (분획 I-IV-1 상청액로서 본원에서 칭함)이 형성된다.

분획 I-IV-1 상청액은 개시 혈장의 알부민 함량의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%를 함유할 것이다. 따라서, 이러한 상청액은 약제학적 알부민 조성물의 제조를 위해 개시 물질로서 사용될 수 있다.

분획 I-IV-1 침전물은 개시 혈장의 면역글로불린 함량의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%를 함유할 것이다. 특정 구현예에서, 분획 I-IV-1 침전물은 개시 혈장의 IgG 함량의 적어도 98%, 바람직하게는 99%를 함유한다. 따라서, 이러한 침전물은 약제학적 면역글로불린 조성물의 제조를 위해 개시 물질로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 분획 I-IV-1 침전물을 약제학적 IgG 조성물의 제조를 위해 개시 물질로서 사용된다. 또 하나의 구현예에서, 분획 I-IV-1 침전물은 1 초과 면역글로불린 아형을 함유하는 약제학적 면역글로불린 조성물의 제조를 위해 개시 물질로서 사용된다.

마찬가지로, 분획 I-IV-1 침전물은 개시 혈장의 A1PI 함량의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 97%, 가장 바람직하게는 적어도 98%를 함유할 것이다. 따라서, 이러한 침전물은 약제학적 A1PI 조성물의 제조를 위해 개시 물질로서 사용될 수 있다.

분획 I-IV-1 침전물은 개시 혈장의 인자 H 함량의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 또한 함유할 수 있다. 따라서, 이러한 침전물은 약제학적 인자 H 조성물의 제조를 위해 개시 물질로서 사용될 수 있다.

분획 I-IV-1 침전물은 개시 혈장의 인터-알파-억제제 (IaIp) 함량의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 또한 함유할 것이다. 따라서, 이러한 침전물은 약제학적 IaIp 조성물의 제조를 위해 개시 물질로서 사용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 면역글로불린을 분획 I-IV-1 침전물에서 발견된 A1PI로부터 분리하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 방법은 A1PI을 상기 서스펜션의 불용성 부분에서 보유하면서 가용화 면역글로불린을 분획 I-IV-1 침전물의 서스펜션에서 용해시키고, 및 그 다음 가용성 및 불용성 부분을, 예를 들면 여과 또는 원심분리로 분리하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 분리는 가용성 및 불용성 부분을 분리하기 전에 분획 I-IV-1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리함으로써 도움이 된다. 이론에 구속되지 않으면서, 이산화규소는 면역글로불린과 함께 용해된 A1PI에 결합할 수 있고, 이것은 상기 서스펜션의 불용성 부분으로 분할된 A1PI의 양을 향상시킨다.

더욱이, 인자 H 및 IaIp가 어떤 조건 하에서 미립자 이산화규소에 결합하는 것은 공지되어 있다 (참고, WO/2011/011753, PCT/US2011/45099, 및 PCT/US2011/038247; 그의 개시내용은 그의 전체가 다목적으로 본원에 참조로 분명히 편입되어 있다). 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린을 분획 I-IV-1 침전물에서 발견된 A1PI, 인자 H, 및 IaIp로부터 분리하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 면역글로불린을 용해시키는데 충분한 물 또는 낮은 전도도 완충제에서 분획 I-IV-1 침전물을 현탁시키는 단계; 상기 서스펜션을 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 불용성 부분으로부터 분리하는 단계를 포함하고, 여기서 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 불용성 부분은 A1PI, 인자 H, 및 IaIp를 함유한다.

상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 분획 I-IV-1 서스펜션의 분리된 가용성 부분은 개시 혈장 샘플의 IgG 함량의 적어도 80%를 함유한다. 바람직한 구현예에서, 분획 I-IV-1 서스펜션의 분리된 가용성 부분은 개시 혈장 샘플의 IgG 함량의 적어도 90%를 함유한다. 더 바람직한 구현예에서, 분획 I-IV-1 서스펜션의 분리된 가용성 부분은 개시 혈장 샘플의 IgG 함량의 적어도 95%를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 분획 I-IV-1 서스펜션의 가용성 부분은 개시 혈장 샘플의 IgG 함량의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과를 함유한다.

상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 분획 I-IV-1 서스펜션의 분리된 불용성 부분은 개시 혈장 샘플의 A1PI 함량의 적어도 70%를 함유한다. 바람직한 구현예에서, 분획 I-IV-1 서스펜션의 분리된 불용성 부분은 개시 혈장 샘플의 A1PI 함량의 적어도 80%를 함유한다. 더 바람직한 구현예에서, 분획 I-IV-1 서스펜션의 분리된 불용성 부분은 개시 혈장 샘플의 A1PI 함량의 적어도 90%를 함유한다. 더 바람직한 구현예에서, 분획 I-IV-1 서스펜션의 분리된 불용성 부분은 개시 혈장 샘플의 A1PI 함량의 적어도 95%를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 분획 I-IV-1 서스펜션의 분리된 불용성 부분은 개시 혈장 샘플의 A1PI 함량의 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과를 함유한다.

초기 질량 침전 단계 (예를 들면, 분획 I-IV-1 침전)을 사용하여 분획화된 혈액 단백질은 적당한 절차, 예를 들면, 침전 (예를 들면, 알코올 분획화 또는 폴리에틸렌 글리콜 분획화), 크로마토그래피 방법 (이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 등), 여과 (한외여과/정용여과, 나노여과), 초원심분리, 전기영동 제조, 등에 의해 추가로 풍부해질 수 있다.

A. 동결 결핍성 혈장의 제조

농축된 IgG 조성물의 제조에 사용된 개시 물질은 일반적으로 회수된 혈장 (즉, 전혈 생체외에서 전혈로부터 분리된 혈장) 또는 공급원 혈장 (즉, 혈장분리반출술을 통해 수집된 혈장)으로 이루어진다. 정제 공정은 전형적으로 안전성 및 품질 고려에 대해 이미 검정된 미리 냉동된 풀링된 혈장의 융해와 함께 개시한다. 융해는 전형적으로 6℃ 이하의 온도에서 수행된다. 저온에서 냉동된 혈장의 완전한 융해 후, 원심분리는 고체 동결-침전물을 액체 상청액으로부터 분리하기 위해 차가운 곳 (예를 들면, ≤ 6℃)에서 수행된다. 대안적으로, 분리 단계는 원심분리보다는 여과로 수행될 수 있다. 그 다음 액체 상청액 (또한 일명 "동결 결핍성 혈장," 차가운-불용성 단백질이 신선한 녹은 혈장으로부터 원심 분리에 의해 제거된 후)는 다음 단계에서 가공된다. 다양한 추가의 단계는 인자 8 억제제 우회 활성 (FEIBA), 인자 IX-복합물, 인자 VII, 항트롬빈 III, 프로트롬빈 복합체, 등의 단리에 의해 이러한 시점에서 취해질 수 있다.

B. 제 1 침전 이벤트 - 분획 I- IV -1 침전

일 구현예에서, 본 발명은 혈장 샘플에서 혈액 단백질을 분획화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 낮은 pH의, 고급 알코올 조건 하에서 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 A1PI를 상기 개시 혈장으로부터 침전시키는 것을 포함한다. 이러한 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계로 침전물 (분획 I-IV-1 침전물) 및 상청액 (분획 I-IV-1 상청액)이 형성된다.

일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.0 내지 6.0의 pH에서 20% 내지 30% (v/v)의 최종 농도로 에탄올을 개시 혈장 풀 (Cohn 풀)과 혼합하여 수행된다. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±2% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±1% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 마찬가지로, 일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.5의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.4의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.3의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.2의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.1의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5의 pH에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 최종 에탄올 농도 및 제 1 침전 단계의 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

표 1. Cohn 풀의 낮은 pH의, 고급 알코올 침전에 유용한 pH 및 최종 에탄올 농도의 조합.

표 2. Cohn 풀의 낮은 pH의, 고급 알코올 침전에 유용한 pH 및 최종 에탄올 농도의 조합.

표 3. Cohn 풀의 낮은 pH의, 고급 알코올 침전에 유용한 pH 및 최종 에탄올 농도의 조합.

표 4. Cohn 풀의 낮은 pH의, 고급 알코올 침전에 유용한 pH 및 최종 에탄올 농도의 조합.

표 5. Cohn 풀의 낮은 pH의, 고급 알코올 침전에 유용한 pH 및 최종 에탄올 농도의 조합.

표 6. Cohn 풀의 낮은 pH의, 고급 알코올 침전에 유용한 pH 및 최종 에탄올 농도의 조합.

표 7. Cohn 풀의 낮은 pH의, 고급 알코올 침전에 유용한 pH 및 최종 에탄올 농도의 조합.

표 8. Cohn 풀의 낮은 pH의, 고급 알코올 침전에 유용한 pH 및 최종 에탄올 농도의 조합.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 혈장 샘플에서 혈액 단백질을 분획화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하기 위해 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 면역글로불린 및 A1PI를 침전시키는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 여기서 상기 제 1 상청액은 Cohn 풀의 알부민 함량의 적어도 75%를 함유한다. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다.

본원에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 적어도 90%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 적어도 95%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 더 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 적어도 99%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과는 초기 침전 반응에서 침전된다. 더 특정 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량은 개시 Cohn 풀의 IgG, IgA, 및 IgM 함량을 의미한다. 하나의 특정 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량은 개시 Cohn 풀의 IgG 함량을 의미한다.

본원에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 알파-1-항트립신 (A1PI) 함량의 적어도 80%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 90%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 더 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 95%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과는 초기 침전 반응에서 침전된다.

본원에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 인자 H 함량의 적어도 70%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 인자 H 함량의 적어도 80%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 인자 H 함량의 적어도 90%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 더 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 인자 H 함량의 적어도 95%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 인자 H 함량적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과는 초기 침전 반응에서 침전된다.

본원에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 인터-알파-억제제 (IaIp) 함량의 적어도 70%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 IaIp 함량의 적어도 80%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 IaIp 함량의 적어도 90%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 더 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 IaIp 함량의 적어도 95%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 IaIp 함량의 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과는 초기 침전 반응에서 침전된다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 Cohn 풀에서 혈액 단백질을 분획화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하기 위해 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계 면역글로불린, A1PI, 인자 H, 및 IaIp을 침전시키는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 여기서 상기 제 1 침전물은 i.) 개시 Cohn 풀의 IgG 함량의 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 99%, ii.) 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 97%, iii.) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 개시 Cohn 풀의 인자 H 함량의 적어도 95%, 및 iv.) 개시 Cohn 풀의 IaIp 함량의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%를 함유하고, 추가로 여기서 상기 제 1 상청액은 Cohn 풀의 알부민 함량의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%를 함유한다. 일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 22% 내지 28% (v/v)의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 개시 혈장 풀 (Cohn 풀)과 혼합하여 수행된다. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±2% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±1% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 마찬가지로, 일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.5의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.4의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.3의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.2의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.1의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5의 pH에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 최종 에탄올 농도 및 제 1 침전 단계의 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

IV . 면역글로불린 조성물의 제조

일반적으로, 본 발명에 따른 면역글로불린 제제는 임의의 적당한 개시 혈장 물질, 예를 들면, 회수된 혈장 또는 공급원 혈장으로부터 제조될 수 있다. 전형적인 예에서, 혈액 또는 혈장은 건강한 공여체로부터 수집된다. 보통, 혈액은, 면역글로불린 제제가 투여될 대상체로서 동일한 종의 동물로부터 수집된다 (전형적으로 "상동" 면역글로불린이라 칭함). 회수된 또는 공급원 혈장은 동결 결핍성 혈장을 제공하기 위해 동결 침전되거나 그렇지 않을 수 있다. 더욱이, 혈장 또는 동결 결핍성 혈장은 흡착, 이온 교환 크로마토그래피, 또는 다른 크로마토그래피 방법에 의해 1 이상의 혈액 인자를 제거하기 위해 또한 처리될 수 있다. 그 다음 면역글로불린은 분획 I-IV-1 침전물을 형성하기 위해 낮은 pH의, 고급 알코올 조건 하에서 "Cohn 풀"로 불리는 혈장 또는 동결 결핍성 혈장 개시 물질로부터 침전될 수 있다.

면역글로불린은 또한 하기 예의 적당한 절차에 의해 분획 I-IV-1 침전물로부터 풍부해질 수 있다: 침전 (알코올 분획화 또는 폴리에틸렌 글리콜 분획화), 크로마토그래피 방법 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 등), 여과 (한외여과/정용여과, 나노여과), 초원심분리, 전기영동 제제, 등. (참고, 예를 들면, Cohn 등, J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Oncley 등, J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundern 등, Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet 등, Vox Sang. 13:93-102 (1967); 미국 특허 번호 5,122,373 및 5,177,194; PCT/US2010/036470; 및 PCT/US2011/038247; 그의 개시내용은 다목적으로 그의 전체가 참조로 본원에 편입되어 있다).

A. 업스트림 처리

다른 측면들 중에서, 본 발명은 개시 혈장의 대다수의 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 함량을 침전시키는 초기 침전 단계를 수행하여 풀링된 혈장에 존재하는 단백질을 분획하는 방법을 제공한다. 초기 침전 단계의 침전물 및 상청액에서 발견된 개별적인 혈장 단백질 (예를 들면, IgG, A1PI, 인자 H, IaIp, 등)의 순도를 추가로 증가시키기 위해서, 이들 조성물은 분획화 (예를 들면, 알코올 침전, PEG 침전, 염석, 등), 크로마토그래피, 여과, 또는 다른 방법에 의해 추가로 풍부해질 수 있다. 혈장-유도된 단백질의 풍부함을 위한 이들 다양한 기술의 사용이 임의의 순서로 수행될 수 있지만, 특정 구현예에서, 제 1 침전물 및/또는 상청액은 (예를 들면, 에탄올 침전)에 의해 먼저 분획화되고 그 다음 크로마토그래피 및/또는 여과 기술을 사용하여 풍부해진다. 본 발명의 문맥에서, 초기 침전 반응 및 차후의 분획화는 모두 합쳐서 "업스트림 처리" 단계라고 부르고, 한편 크로마토그래피 및 여과 단계는 모두 합쳐서 "다운스트림 처리" 단계라고 부른다.

1. 질량 면역글로불린 침전

본원에 기재된 바와 같이, 발명자들은, 치료적으로 유익한 혈액 단백질 예컨대 면역글로불린, 알파-1-항트립신 (A1PI), 인자 H, 인터-알파-억제제 단백질 (IaIp), 알부민, 피브리노겐, 등을 정제하기 위해 인간 혈장을 분획화하는 개선된 방법을 발견했다. 이러한 방법은 초기 정제 단계를 포함하고, 여기서 개시 Cohn 풀의 대다수의 면역글로불린, A1PI, 인자 H, IaIp, 및 피브리노겐 함량 (즉, 혈액, 혈장, 및/또는 전처리된 혈장)는 침전되고 개시 Cohn 풀의 대다수의 알부민 함량은 상청액에 남아 있다. 유익하게는, 발명자들은 다른 단백질이 아닌 면역글로불린을 초기 침전물로부터 추출하여 면역글로불린을 A1PI, 인자 H, 및 IaIp로 분리하는 방법을 개발했다. 특히, 발명자들은, 초기 침전물의 서스펜션을 미분된 이산화규소 (SiO₂)로 처리하면 불용성 분획 중 A1PI, 인자 H, 및 IaIp의 체류를 개선할 수 있다는 것을 발견했다. 이론에 구속되지 않으면서, 발명자들은, 어떤 조건 하에서, 침전물로부터 처음에 추출될 수 있는 A1PI, 인자 H, 및 IaIp는 미분된 이산화규소에 결합하고, 이것은, 상기 서스펜션의 불용성 부분으로 차후에 제거되는 것으로 믿는다. 수득한 상청액 (즉, 서스펜션의 가용성 분획)의 분리는 개시 Cohn 분획의 대다수의 면역글로불린 함량을 함유하는 풍부한 용액을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 Cohn 풀로부터 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 Cohn 풀로부터 공-침전시켜, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 및 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일반적으로, 면역글로불린 및 A1PI의 침전을 위한 임의의 화학적 수단이 사용될 수 있고, 그 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 알코올 침전 (예를 들면, 에탄올 또는 메탄올 사용), 수용성 폴리머 (예를 들면, PEG 또는 덱스트란)을 사용하는 침전, 및 염석 (예를 들면, 암모늄 포스페이트, 암모늄 설페이트, 나트륨 시트레이트, 등 사용). 바람직한 구현예에서, 침전은 알코올 침전, 바람직하게는 에탄올 침전이다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 20% 내지 30% (v/v)의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀과 혼합하여 수행된다. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±2% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±1% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 마찬가지로, 일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.5의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.4의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.3의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.2의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.1의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5의 pH에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 최종 에탄올 농도 및 제 1 침전 단계의 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

본원에서 제공된 방법은 초기 낮은 알코올 침전 단계 (즉, 분획 I 침전)에 의존하는 종래의 정제 절차와 비교하여, 초기 침전 반응에서 개시 Cohn 풀의 대다수의 면역글로불린 함량의 침전으로 인해 최종 풍부한 생성물 유의미하게 더 높은 수율의 면역글로불린 회수를 제공한다.

따라서, 본원에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 적어도 90%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 적어도 95%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 더 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 적어도 99%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과는 초기 침전 반응에서 침전된다. 하나의 특정 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 면역글로불린 함량은 개시 Cohn 풀의 IgG 함량을 의미한다.

본원에서 제공된 실시예에서 보는 바와 같이, 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계 (즉, 분획 I-IV-1 침전)의 사용으로 개시 Cohn 풀의 IgG 함량의 적어도 99%가 침전된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 함량의 99% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 및 IgG을 상기 제 1 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다.

하기에서 제공된 데이터에 의해 입증된 바와 같이: 표 15 및 표 31, Cohn 풀의 알파-1-항트립신 (A1PI) 함량의97% 초과는 또한 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에 의해 침전된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 및 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

더욱이, Cohn 풀의 알부민 함량의 90% 초과는 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계 (표 33)에 의해 침전되지 않고 따라서 상청액으로부터 회수될 수 있다는 것을 발견했다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 및 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하고 단계로서, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

2. 면역글로불린의 추출 및 분리

Cohn 분획 II+III 침전물 또는 Kistler-Nitschmann 침전물 A와 비교하여, 본원에서 제공된 방법에 의해 형성된 초기 침전물은 실질적으로 높은 수준의 비-면역글로불린 단백질을 함유하고, 이 단백질은 A1PI 및 피브리노겐을 포함한다. 예를 들면, 표 30, 개시 Cohn 풀의 피브리노겐 함량의 거의 100%는 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 반응에서 면역글로불린과 함께 공-침전된다. 이것은 Cohn-Oncley 및 Kistler-Nitschmann 정제 도식과 반대이고, 이 도식에서 피브리노겐의 벌크는 초기 낮은 알코올 침전 단계에서 제거된다 (분획 I 침전). 마찬가지로, 표 15 및 표 31, 개시 Cohn 풀의 알파-1-항트립신 (A1PI) 함량의 97% 초과는 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 반응에서 면역글로불린과 함께 공-침전된다. 그에 반해서, A1PI의 벌크는 Cohn-Oncley 및 Kistler-Nitschmann 정제 도식에서 면역글로불린과 함께 공-침전되지 않는다. 오히려, A1PI는 분획 II+III 상청액 또는 상청액 A에서 발견된다.

따라서, 약품 등급 면역글로불린 조성물을 제공하기 위해, 초기 침전물에 존재하는 오염물질 예컨대 A1PI 및 피브리노겐은 면역글로불린 조성물로부터 제거될 필요가 있다. 이것은, 예를 들면, 제 1 침전물의 추가 분획화 (예를 들면, 알코올, 비-이온성 친수성 폴리머, 또는 염석을 사용하는 개별적인 침전에 의해), 크로마토그래피 방법론, 또는 여과 방법론에 의해 달성될 수 있다.

일 구현예에서, 제 1 침전물은 면역글로불린을 침전물로부터 추출하는데 적당한 주입 (WFI) 또는 낮은 이온성 강도 완충제를 위해 물에서 현탁된다. 어떤 구현예에서, 그 다음 서스펜션은 미분된 이산화규소 (SiO₂)로 처리되고, 면역글로불린을 함유하는 상기 서스펜션의 가용성 부분은 A1PI 및 피브리노겐의 벌크를 함유하는 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리된다.

제 1 침전물의 추출을 위한 적당한 용액은 일반적으로 4.0 내지 5.5의 pH를 가질 것이다. 어떤 구현예에서, 용액은 4.5 내지 5.0의 pH를 가질 것이고, 다른 구현예에서, 추출 용액은 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 또는 5.5의 pH를 가질 것이다. 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.7±0.1이다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.8±0.1이다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.9±0.1이다. 일반적으로, 이들 pH 요건은 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트, 1염기성 포스페이트, 이염기성 포스페이트, 그의 혼합물, 등으로부터 선택된 완충제를 사용하는 것에 부합할 수 있다. 적당한 완충제 농도는 전형적으로 5 내지 100 mM, 또는 10 내지 50 mM, 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 mM 완충제의 범위이다.

추출 완충제는 바람직하게는 0.5 mS/cm 내지 2.0 mS/cm의 전도도를 가질 것이다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 추출 완충제의 전도도는 0.5±0.1 mS/cm, 또는 0.6±0.1, 0.7±0.1, 0.8±0.1, 0.9±0.1, 1.0±0.1, 1.1±0.1, 1.2±0.1, 1.3±0.1, 1.4±0.1, 1.5±0.1, 1.6±0.1, 1.7±0.1, 1.8±0.1, 1.9±0.1, 또는 2.0±0.1 mS/cm일 것이다. 당해분야의 숙련가는 적절한 전도도를 갖는 추출 완충제를 어떻게 산출하는 지를 알 것이다. 하나의 특별한 구현예에서, 추출 완충제는 4.8 ± 0.2의 pH 및 0.7 내지 0.9 mS/cm의 전도도에서 5 mM 1염기성 나트륨 포스페이트 및 5 mM 아세테이트를 함유한다.

일 구현예에서, 미분된 이산화규소는 여과 전에 분획 I-IV-1 서스펜션과 혼합된다. 일 구현예에서, 이러한 전처리 단계는 미분된 실리카 디옥사이드 입자 (예들 들면, 발연 실리카; Aerosil®)의 부가 그 다음 서스펜션이 일정하게 혼합된 40 내지 80 분 인큐베이션 기간을 포함한다. 어떤 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 50 분 내지 약 70 분, 또는 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 그 초과 분일 것이다. 일반적으로, 처리는 0℃ 내지 10℃, 또는 2℃ 내지 8℃에서 수행될 것이다. 어떤 구현예에서, 처리는 약 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃에서 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 처리는 2℃ 내지 10℃에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 처리는 5℃ 내지 10℃에서 수행된다.

일 구현예에서, 발연 실리카는 20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 100 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 부가된다. 또 하나의 구현예에서, 발연 실리카는 30 g/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 80 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 부가된다. 어떤 구현예에서, 발연 실리카는 약 20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물, 또는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 부가될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카 (예를 들면, Aerosil 380 또는 이와 동등물)는 40±20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 분획 I-IV-1 서스펜션에 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 분획 I-IV-1 서스펜션에 부가된다. 혼합은 2℃ 내지 8℃에서 적어도 50 내지 70 분 동안 일어난다.

어떤 구현예에서, SiO₂는 0.01 g/g 총 단백질 내지 10 g/g 총 단백질의 농도에서 면역글로불린 조성물에 부가된다. 또 하나의 구현예에서, SiO₂는 0.01 g/g 총 단백질 내지 5 g/g 총 단백질의 농도에서 면역글로불린 조성물에 부가된다. 또 하나의 구현예에서, SiO₂는 0.02 g/g 총 단백질 내지 4 g/g 총 단백질의 농도에서 면역글로불린 조성물에 부가된다. 일 구현예에서, SiO₂는 적어도 0.1 g / 총 단백질 그램의 최종 농도에서 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 0.2 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 0.25 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 다른 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 1 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 2 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 2.5 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 또 다른 특정 구현예에서, 미분된 이산화규소는 적어도 0.01 g/g 총 단백질 또는 적어도 0.02 g, 0.03 g, 0.04 g, 0.05 g, 0.06 g, 0.07 g, 0.08 g, 0.09 g, 0.1 g, 0.2 g, 0.3 g, 0.4 g, 0.5 g, 0.6 g, 0.7 g, 0.8 g, 0.9 g, 1.0 g, 1.5 g, 2.0 g, 2.5 g, 3.0 g, 3.5 g, 4.0 g, 4.5 g, 5.0 g, 5.5 g, 6.0 g, 6.5 g, 7.0 g, 7.5 g, 8.0 g, 8.5 g, 9.0 g, 9.5 g, 10.0 g, 또는 그 초과 / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

더욱이, Cohn 풀의 알부민 함량의 90% 초과는 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계 (표 33)에 의해 침전되지 않고 따라서 상청액으로부터 회수될 수 있다는 것을 발견했다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 또한 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 상기 서스펜션의 가용성 부분에 존재하는 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 피브리노겐은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 인자 H는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 IaIp는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

3. 분획화

일 구현예에서, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분 (I-IV-1 페이스트 서스펜션)로부터 회수된 면역글로불린은 분획화에 의해 추가로 풍부하다. 일반적으로, 분획화 (예를 들면, 알코올 또는 폴리머 침전, 염석, 등.)의 임의의 방법이 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 면역글로불린은 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 에탄올 침전으로 분획화하여 추가로 풍부한다. 일 구현예에서, 면역글로불린은 면역글로불린을 침전시키는데 적당한 최종 농도 및 pH에서 에탄올의 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에의 부가에 의해 풍부해지고, 한편 적어도 1이 오염물질은 침전되지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 면역글로불린은 적어도 하나의 오염물질을 침전시키는데 적당한 최종 농도 및 pH에서 에탄올의 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에의 부가에 의해 풍부하고, 한편 면역글로불린은 침전되지 않는다.

초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계로부터 회수된 물질의 추가의 분획화는 임의적이다. 어떤 구현예에서, 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계로부터 회수된 면역글로불린 조성물은 본원에서 기재된 다양한 다운스트림 처리 단계 중 1 이상을 사용하여 추가로 풍부할 수 있다. 다른 구현예에서, 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계로부터 회수된 조성물은 1 이상 추가의 침전 단계의 사용을 통해 추가로 처리될 수 있다. 어떤 구현예에서, 추가의 면역글로불린 침전 단계는 면역글로불린 조성물을 농축하고 보관용 면역글로불린을 제조하고/거나 수송용 면역글로불린 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 Cohn 풀로부터 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 Cohn 풀로부터 공-침전시켜, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜서, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 제거된 A1PI는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

예시적인 구현예에서, 제 2 침전 단계는 22% 내지 28% (v/v)의 최종 농도에서 6.5 내지 7.5의 pH에서 에탄올을 제 2 서스펜션의 가용성 부분 (예를 들면, 여과 또는 원심분리 후에 형성된 서스펜션의 여과물 또는 상청액)에 혼합하여 수행된다. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±2% (v/v)의 최종 농도로 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±1% (v/v)의 최종 농도로 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25% (v/v)의 최종 농도로 혼합된다. 마찬가지로, 일 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.5의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.4의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.3의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.2의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.1의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0의 pH에서 수행된다. 특정 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.3의 pH에서 25±3% (v/v)의 최종 에탄올 농도를 사용하여 수행된다.

바람직한 구현예에서, 제 1 서스펜션 또는 그의 가용성 분획은 제 2 침전 단계를 수행하기 전에 세제로 처리된다. 일 구현예에서, 제 1 서스펜션 또는 그의 가용성 분획은 제 2 침전 단계를 수행하기 전에 시트레이트로 추가로 처리된다. 특정 구현예에서, 폴리소르베이트-80은 상기 제 1 서스펜션 또는 그의 가용성 분획에 부가되고 본 조성물은 적어도 30 분 동안 인큐베이션된다. 또 하나의 특별한 구현예에서, 나트륨 시트레이트 2수화물은 상기 제 1 서스펜션 또는 그의 가용성 분획에 추가로 부가되고 본 조성물은 적어도 추가 30 분 동안 인큐베이션된다. 일 구현예에서, 폴리소르베이트-80은 약 0.2% (w/v)의 최종 농도에서 부가된다. 일 구현예에서, 그 다음 나트륨 시트레이트 디히드레이트는 약 8 g/L의 최종 농도에서 용액에 혼합된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 약 2 내지 8℃의 온도에서 연속적 교반과 함께 수행된다.

특정 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 함량의 99% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 혈장 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜서, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

특정 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 함량의 99% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 혈장 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

일 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하는 단계; 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜서, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 분리된 A1PI는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

특정 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 분리된 A1PI는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

또 하나의 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 IgG 및 A1PI 함량의 99% 내지 100%를 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 회수하는 단계; 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하는 단계로서, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 분리된 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에 존재하는 알부민은 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 알부민 함량의 90% 내지 100%는 제 1 상청액에서 존재한다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

또 하나의 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 IgG 및 A1PI 함량의 99% 내지 100%를 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 회수하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하는 단계로서, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 분리된 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에 존재하는 알부민은 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 알부민 함량의 90% 내지 100%는 제 1 상청액에서 존재한다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 회수하는 단계; 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 회수하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하는 단계; 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하는 단계로서, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 상기 서스펜션의 가용성 부분에 존재하는 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 피브리노겐은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 인자 H는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 IaIp는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하는 단계로서, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 상기 서스펜션의 가용성 부분에 존재하는 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 피브리노겐은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 인자 H는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 IaIp는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

일 구현예에서, 면역글로불린은 상기 침전물을 차가운 추출 완충제로 현탁시켜 제 2 침전물로부터 회수된다. 예를 들면, 제 2 침전물은 1 부 침전물 대 2-15 부 주사용 물 (WFI) 또는 낮은 전도도 완충제의 비로 현탁된다. 바람직한 구현예에서, 제 2 침전물은 1 부 침전물 대 4-5 부, 바람직하게는 3.5 부, WFI의 비로 현탁된다. 일 구현예에서, 서스펜션 단계는 0℃ 내지 8℃의 온도에서 수행된다. 일 구현예에서, 용액의 최종 pH은 조정되어 4.5 내지 5.6, 바람직하게는 내지 5.2 ± 0.2를 형성한다. 일 구현예에서, 이러한 pH 조정은 아세트산으로 수행된다. 일 구현예에서, 서스펜션의 전도도는 2.5 내지 6.0 mS/cm로 증가되어 면역글로불린의 용해도를 증가시킨다. 일 구현예에서, 전도도는 염화나트륨의 부가에 의해 증가된다.

제 2 침전물의 추출을 위한 적당한 용액은 WFI 및 낮은 전도도 완충제를 포함한다. 일 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 10 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 다른 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 4 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 2 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다.

일 구현예에서, 면역글로불린을 함유하는 상기 서스펜션의 가용성 부분은, 불용성 부분으로부터 분리된다. 일 구현예에서, 이것은 0.1 μm 내지 0.4 μm의 명목 기공 크기를 갖는 심층 필터로 상기 서스펜션을 여과하여 행해진다. 일 구현예에서, 심층 필터의 명목 기공 크기는 0.2 μm이다 (예를 들면, Cuno VR06 필터 또는 이와 동등물). 일 구현예에서, 필터는 여과 후 WFI 또는 적당한 완충제로 세정되어 추가의 면역글로불린을 회수하고 후-세척물은 여과물에 부가된다. 바람직한 구현예에서, 필터의 후-세척은 약 2.5 내지 약 6.0 mS/cm의 전도도를 갖는 나트륨 클로라이드 용액을 사용하여 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 서스펜션은 원심분리되어 가용성 부분을 회수한다.

B. 다운스트림 처리

알부민이 아니고 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI)를 침전시키는 초기 침전 단계를 사용하여 분획화한 후에 수득된 면역글로불린 분획은당해기술에서 잘 알려진 방법에 따라 추가로 풍부해질 수 있고, 상기 방법은 비제한적으로 하기를 포함한다: 크로마토그래피 (예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 하이드록시인회석 크로마토그래피 (HAP), 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 면역-친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 등.); 여과 (예를 들면, 한외여과 및/또는 정용여과); 및 1 이상 바이러스 감소 단계 (예를 들면, 나노여과, 용매 및 세제 처리, UV 조사, 열처리, 낮은 pH 인큐베이션, 등).

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 Cohn 풀로부터 제조하는 방법을 제공하고 상기 방법은 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계 및 적어도 1 다운스트림 처리 단계 (예를 들면, 크로마토그래피)를 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 1 다운스트림 처리 단계 전의 제 2 침전 단계 (예를 들면, PptG 침전 단계)를 포함한다. 제 2 침전은, 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전물의 서스펜션은 다운스트림 정제를 위해 직접적으로 사용될 수 있기 때문에, 임의적이다.

일 구현예에서, 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계를 사용하여 제조된 혈장-유도된 조성물에서 존재하는 면역글로불린은 적어도 1 크로마토그래피 단계룰 수행하여 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 크로마토그래피 단계는 하기로부터 선택된다: 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 하이드록시인회석 크로마토그래피 (HAP), 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 면역-친화성 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피. 특정 구현예에서, 면역글로불린은 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 추가로 풍부하다. 특정 구현예에서, 면역글로불린은 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 모두를 수행하여 추가로 풍부하다.

특정 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 면역글로불린을 양이온교환수지에 결합하는 단계; 면역글로불린을 상기 양이온 교환으로부터 용출하여 양이온 교환 용출물을 형성하는 단계; 상기 양이온 교환 용출물을 음이온 교환 수지와 접촉시키는 단계; 및 상기 수지에 결합하지 않는 면역글로불린을 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 또 하나의 구현예에서, Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%, 바람직하게는 90% 내지 100%는 제 1 상청액에서 존재한다. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 1 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 2 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 3 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 회수하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, 면역글로불린을 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 면역글로불린을 상기 제 2 침전물로부터 회수하는 단계; 면역글로불린을 양이온교환수지에 결합하는 단계; 면역글로불린을 상기 양이온 교환으로부터 용출하여 양이온 교환 용출물을 형성하는 단계; 상기 양이온 교환 용출물을 음이온 교환 수지와 접촉시키는 단계; 및 상기 수지에 결합하지 않는 면역글로불린을 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 또 하나의 구현예에서, Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%, 바람직하게는 90% 내지 100%는 제 1 상청액에서 존재한다. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 1 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 2 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 3 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

하나의 특별한 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 면역글로불린 및 A1PI를 Cohn 풀로부터 침전시키는 단계; 상기 침전된 면역글로불린 및 A1PI를 분리하는 단계; 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 면역글로불린 조성물을 풍부하게 하는 단계; 및 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 면역글로불린 조성물을 추가로 풍부하게 하는 단계. 일 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 1 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 2 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 3 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

또 하나의 특별한 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 면역글로불린 및 A1PI를 Cohn 풀로부터 침전시키는 단계; 상기 침전된 면역글로불린 및 A1PI를 분리하는 단계; 제 2 침전 단계에서 상기 분리된 면역글로불린을 침전시키는 단계; 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 면역글로불린 조성물을 풍부하게 하는 단계; 및 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 면역글로불린 조성물을 추가로 풍부하게 하는 단계. 일 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 1 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 2 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 3 바이러스 감소/불활성화 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

또 하나의 특별한 구현예에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 면역글로불린 및 A1PI를 Cohn 풀로부터 침전시키는 단계; 상기 침전된 면역글로불린 및 A1PI를 분리하는 단계; 제 2 침전 단계에서 상기 분리된 면역글로불린을 침전시키는 단계; 면역글로불린 조성물을 용매 및 세제로 처리하여 바이러스를 불활성화하는 단계; 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 면역글로불린 조성물을 풍부하게 하는 단계; 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 면역글로불린 조성물을 추가로 풍부하게 하는 단계; 및 면역글로불린 조성물을 나노여과하여 바이러스를 제거하는 단계. 일 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 5 g/L 내지 25 g/L의 최종 단백질 농도로 한외여과/정용여과하여 면역글로불린 조성물을 농축하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물의 최종 농도는 5±1% (w/v)이다. 또 하나의 특별한 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물의 최종 농도는 10±1% (w/v)이다. 또 하나의 특별한 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물의 최종 농도는 15±1% (w/v)이다. 또 하나의 특별한 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물의 최종 농도는 20±2% (w/v)이다. 또 하나의 특별한 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물의 최종 농도는 25±2% (w/v)이다. 일 구현예에서, 풍부한 면역글로불린 조성물은 IgG 조성물이다.

C. 분획 I- IV -1 침전물로부터 IgG 의 예시적인 풍부함

1. 분획 I- IV -1 침전물의 추출

분획 I-IV-1 침전물의 IgG 함량을 용해시키기 위해, 차가운 추출 완충제는 1 부 침전물 대 15 부 추출 완충제의 전형적인 비로 분획화 II+III 침전물을 재현탁시키기 위해 사용된다. 다른 적당한 재-서스펜션 비가 사용될 수 있고 그 예는 1:8 내지 1:30, 또는 1:10 내지 1:20, 또는 1:12 내지 1:18, 또는 1:13 내지 1:17, 또는 1:14 내지 1:16이다. 어떤 구현예에서, 재-서스펜션 비는 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 또는 그 초과일 수 있다.

제 1 침전물의 추출을 위한 적당한 용액은 일반적으로 4.0 내지 5.5의 pH를 가질 것이다. 어떤 구현예에서, 용액은 4.5 내지 5.0의 pH를 가질 것이고, 다른 구현예에서, 추출 용액은 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 또는 5.5의 pH를 가질 것이다. 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.7±0.1이다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.8±0.1이다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.9±0.1이다. 일반적으로, 이들 pH 요건은 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트, 1염기성 포스페이트, 이염기성 포스페이트, 그의 혼합물, 등으로부터 선택된 완충제를 사용하는 것에 부합할 수 있다. 적당한 완충제 농도는 전형적으로 5 내지 100 mM, 또는 10 내지 50 mM, 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 mM 완충제의 범위이다.

추출 완충제는 바람직하게는 0.5 mS/cm 내지 2.0 mS/cm의 전도도를 가질 것이다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 추출 완충제의 전도도는 0.5±0.1 mS/cm, 또는 약 0.6±0.1, 0.7±0.1, 0.8±0.1, 0.9±0.1, 1.0±0.1, 1.1±0.1, 1.2±0.1, 1.3±0.1, 1.4±0.1, 1.5±0.1, 1.6±0.1, 1.7±0.1, 1.8±0.1, 1.9±0.1, 또는 2.0±0.1 mS/cm일 것이다. 당해분야의 숙련가는 적절한 전도도를 갖는 추출 완충제를 어떻게 산출하는 지를 알 것이다.

예시적인 구현예에서, 분획 I-IV-1 침전물은 5 mM 1염기성 나트륨 포스페이트 및 5 mM 아세테이트를 함유하는 추출 완충제를 사용하여 1:15의 페이스트 대 완충제 비로 추출되고, 그의 pH는 아세트산으로 4.8 ± 0.2로 조정된다. 일 구현예에서, 용액의 pH는 추출 공정의 지속시간 동안 4.8 ± 0.3의 pH에서 유지된다. 특정 구현예에서, 용액의 pH는 추출 공정의 지속시간 동안 4.8 ± 0.2의 pH에서 유지된다.

일반적으로, 추출은 온도 0℃ 내지 10℃, 또는 2℃ 내지 8℃에서 수행된다. 어떤 구현예에서, 추출은 0±1℃, 1±1℃, 2±1℃, 3±1℃, 4±1℃, 5±1℃, 6±1℃, 7±1℃, 8±1℃, 9±1℃, 또는 10±1℃에서 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 추출은 2℃ 내지 10℃에서 수행된다. 전형적으로, 추출 공정은 60 내지 300 분, 또는 120 내지 240 분, 또는 150 내지 210 분 동안 진행할 것이고, 한편 서스펜션은 연속적으로 교반된다. 어떤 구현예에서, 추출 공정은 약 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 분, 또는 그 초과 동안 진행할 것이다. 바람직한 구현예에서, 추출 공정은 연속적 교반과 함께 적어도 160 분 동안 진행할 것이다.

2. 이산화규소 ( SiO ₂ ) 처리

Cohn-Oncley 및 Kistler-Nitschmann 정제와 비교할 때, 본원에서 제공된 방법에 의해 형성된 초기 면역글로불린-함유 침전물은 실질적으로 높은 수준의 비-면역글로불린 단백질을 함유하고, 이 단백질은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp을 포함한다. 인자 H 및 IaIp는 미분된 이산화규소에 의해 결합되고 차후에 그것에서 용출될 수 있다는 것은 공지되어 있다 (참고, WO 2011/011753 및 PCT/US2011/045099, 둘 모두의 개시내용은 그의 전체가 다목적으로 참조로 분명히 편입되어 있다). 유익하게는, 분획 I-IV-1 침전물의 추출 후 및 분획 I-IV-1 서스펜션의 여과 전의 SiO₂ 처리 단계의 포함은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp의 분획 I-IV-1 서스펜션의 여과 동안에 형성된 불용성 필터 케이크으로의 분리에 도움이 된다는 것을 발견했다.

따라서, 일 구현예에서, 미분된 이산화규소는 여과 전에 분획 I-IV-1 서스펜션과 혼합된다. 일 구현예에서, 이러한 전처리 단계는 미분된 실리카 디옥사이드 입자 (예들 들면, 발연 실리카; Aerosil®)의 부가 그 다음 서스펜션이 일정하게 혼합된 40 내지 80 분 인큐베이션 기간을 포함한다. 어떤 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 50 분 내지 약 70 분, 또는 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 그 초과 분일 것이다. 일반적으로, 처리는 0℃ 내지 10℃, 또는 2℃ 내지 8℃에서 수행될 것이다. 어떤 구현예에서, 처리는 약 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃에서 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 처리는 2℃ 내지 10℃에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 처리는 5℃ 내지 10℃에서 수행된다.

어떤 구현예에서, 발연 실리카는 20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 100 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 부가된다. 어떤 구현예에서, 발연 실리카는 약 20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물, 또는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 부가될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카 (예를 들면, Aerosil 380 또는 이와 동등물)는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 분획 I-IV-1 서스펜션에 부가된다. 혼합은 2℃ 내지 8℃에서 적어도 50 내지 70 분 동안 일어난다.

어떤 구현예에서, SiO₂는 0.01 g/g 총 단백질 내지 10 g/g 총 단백질의 농도에서 IgG 조성물에 부가된다. 또 하나의 구현예에서, SiO₂는 0.01 g/g 총 단백질 내지 5 g/g 총 단백질의 농도에서 IgG 조성물에 부가된다. 또 하나의 구현예에서, SiO₂는 0.02 g/g 총 단백질 내지 4 g/g 총 단백질의 농도에서 IgG 조성물에 부가된다. 일 구현예에서, SiO₂는 적어도 0.1 g / 총 단백질 그램의 최종 농도에서 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 0.2 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 0.25 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 다른 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 1 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 2 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 적어도 2.5 g / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다. 또 다른 특정 구현예에서, 미분된 이산화규소는 적어도 0.01 g/g 총 단백질 또는 적어도 0.02 g, 0.03 g, 0.04 g, 0.05 g, 0.06 g, 0.07 g, 0.08 g, 0.09 g, 0.1 g, 0.2 g, 0.3 g, 0.4 g, 0.5 g, 0.6 g, 0.7 g, 0.8 g, 0.9 g, 1.0 g, 1.5 g, 2.0 g, 2.5 g, 3.0 g, 3.5 g, 4.0 g, 4.5 g, 5.0 g, 5.5 g, 6.0 g, 6.5 g, 7.0 g, 7.5 g, 8.0 g, 8.5 g, 9.0 g, 9.5 g, 10.0 g, 또는 그 초과 / 총 단백질 그램의 농도에서 부가된다.

3. 분획 I- IV -1 서스펜션의 여과

면역글로불린을 함유하는 분획 I-IV-1 서스펜션의 가용성 부분을 피브리노겐, A1PI, 인자 H, 및 IaIp을 함유하는 불용성 부분으로부터 분리하기 위해, 서스펜션은 심층 여과를 사용하여 전형적으로 여과된다. 본원에서 제공된 방법에서 이용될 수 있는 심층 필터는, 금속, 유리, 세라믹, 유기 (예컨대 규조토) 심층 필터, 등을 포함한다. 적당한 필터의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: Cuno 50SA, Cuno 90SA, 및 Cuno VR06 필터 (3M). 대안적으로, 분리 단계는 여과보다는 원심분리에 의해 수행될 수 있다.

어떤 구현예에서, 여과 조제, 예를 들면 Celpure C300 (Advanced Minerals) 또는 Hyflo-Super-Cel (World Minerals)은 심층 여과를 촉진하기 위해 실리카 디옥사이드 처리 후에 서스펜션에 부가된다. 여과 조제는 0.1 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 1.0 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물, 또는 0.2 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 0.8 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물, 또는 0.3 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 0.7 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도에서 부가된다. 다른 구현예에서, 여과 조제는 0.1 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 0.7 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물, 또는 0.2 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 0.6 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물, 또는 약 0.3 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 약 0.05 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도에서 부가될 수 있다. 어떤 구현예에서, 여과 조제는 약 0.01 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물, 또는 약 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1.0 kg/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도에서 부가될 것이다.

여과 동안에 면역글로불린의 손실을 최소화하기 위해, 형성된 필터 케이크는 서스펜션 완충제 또는 그것과 유사한 완충제의 적어도 1 불용 용적, 바람직하게는 적어도 2 불용 용적, 더 바람직하게는 적어도 3 불용 용적으로 세정되어야 하고, 이것은 필터 케이크에서 존재하는 비-면역글로불린 단백질을 용해하는데 충분하지 않다. 일 구현예에서, 필터 및 필터 케이크는 완충제의 적어도 3.0 불용 용적으로 후세정된다. 또 하나의 구현예에서, 필터 및 필터 케이크는 완충제의 적어도 3.6 불용 용적으로 후세정된다. 또 하나의 구현예에서, 필터 및 필터 케이크는 적당한 완충제를 사용하여 여과된 서스펜션 용적의 적어도 50%로 후세정된다. 또 하나의 구현예에서, 필터 및 필터 케이크는 적당한 완충제를 사용하여 여과된 서스펜션 용적의 적어도 75%로 후세정된다. 또 하나의 구현예에서, 필터 및 필터 케이크는 적당한 완충제를 사용하여 여과된 서스펜션 용적의 적어도 100%로 후세정된다. 전형적으로, 여과된 서스펜션 용적의 200% 이하는 필터 및 필터 케이크를 세정하기 위해 사용되어야 한다.

특정 구현예에서, 세척 완충액은 90 내지 150 mL의 빙초산 / 1000 L를 함유하는 용해 완충제이다. 일 구현예에서, 후-세척 추출 완충제의 pH는 약 4.6 내지 약 5.3이다. 바람직한 구현예에서, 후-세척 완충액의 pH은 약 4.7 내지 약 5.2이다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 후-세척 완충액의 pH은 약 4.8 내지 약 5.1이다 또 하나의 바람직한 구현예에서, 후-세척 완충액의 pH은 약 4.9 내지 약 5.0이다.

4. 세제 처리

추가의 오염물질을 분획 I-IV-1 여과물로부터 제거하기 위해, 샘플에 대해 세제 처리를 수행한다. 혈장 유도된 분획의 세제 처리의 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 일반적으로, 임의의 표준 비-이온성 세제 처리는 본원에서 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 세제 처리의 예시적인 프로토콜은 이하에서 제공된다.

폴리소르베이트-80은 약 0.2% (w/v)의 최종 농도에서 교반하면서 분획 I-IV-1 여과물에 부가되고 샘플은 적어도 30 분 동안 약 2 내지 8℃의 온도에서 인큐베이션된다. 그 다음 나트륨 시트레이트 디히드레이트는 약 8 g/L의 최종 농도에서 용액에 혼합되고 샘플은 약 2 내지 8℃의 온도에서 연속적 교반과 함께 추가의 30 분 동안 인큐베이션된다.

어떤 구현예에서, 임의의 적당한 비-이온성 세제가 사용될 수 있다. 적당한 비-이온성 세제의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 옥틸글루코사이드, 디기토닌, C12E8, 루브롤, Triton X-100, Nonidet P-40, Tween-20 (즉, 폴리소르베이트-20), Tween-80 (즉, 폴리소르베이트-80), 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), Brij 세제, 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴록사머, 옥틸 글루코사이드, 데실 말토사이드, 등.

일 구현예에서, 과정 개선은 확산 부가로 세제 시약 (예를 들면, 폴리소르베이트-80 및 나트륨 시트레이트 탈수화물)를 부가하여 실현된다. 이들 시약의 확산 부가는 단일 입구에서의 부가와 비교하여 알코올 농도 및 pH의 국소 변동을 최소화한다. 일 구현예에서, 확산 부가는 배출 부가보다는 분무를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 확산 부가는 다중 포트로부터 시약의 부가를 포함한다. 일 구현예에서, 확산 부가는 살포기 포트로부터 시약의 부가를 포함한다. 어떤 구현예에서, 시약을 시스템에 도입하기 위해 사용된 적어도 1 포트는 임펠러 또는 다른 분산 소자에서 또는 그 근처에서 위치한다. 다른 구현예에서, 세제 시약은 변형된 분획 II+III 여과물에 고형물로서 부가될 수 있고 한편 샘플은 첨가물의 빠른 분포를 보장하기 위해 혼합된다. 어떤 구현예에서, 여과물의 비국재화된 표면적 위에 고형물을 뿌려서 고체 시약을 부가하는 것이 바람직하고 이로써 국소 과도농도는 예컨대 배출 부가에서 일어나지 않는다.

5. 제 2 침전 이벤트 - 침전 G

잔류 불순물을 제거하기 위해, 제 2 침전은 25% 알코올을 사용하여 pH 6.5 내지 7.5에서 수행된다. 간단히 말해서, 분획 I-IV-1 추출은 적당한 pH 조정 용액 (예를 들면, 나트륨 하이드록사이드 또는 아세트산)로 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 6.8 내지 7.2, 더 바람직하게는 6.9 내지 7.1, 가장 바람직하게는 7.0의 pH로 조정된다. 그 다음 차가운 알코올은 약 25% (v/v)의 최종 농도로 용액에 부가되고 혼합물은 약 -6℃ 내지 약 -10℃에서 적어도 1 시간 동안 교반하면서 인큐베이션되어 제 2 침전물 (즉, 침전물 G)를 형성한다. 일 구현예에서, 혼합물은 적어도 2 시간, 또는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 그 초과 시간 동안 인큐베이션된다. 바람직한 구현예에서, 혼합물은 적어도 2 시간 동안 인큐베이션된다. 더 바람직한 구현예에서, 혼합물은 적어도 4 시간 동안 인큐베이션된다. 또 더욱 더 바람직한 구현예에서, 혼합물은 적어도 8 시간 동안 인큐베이션된다.

어떤 구현예에서, 높은 백분율의 IgG는 알코올의 침전 반응에의 부가 동안 및/또는 후에 용액의 pH를 조정하여 I-IV-1 추출로부터 침전될 수 있다. 마찬가지로, 침전 과정 동안의 용액의 pH의 변동으로 인해, 반응 혼합물의 pH은 인큐베이션의 전체에 걸쳐 모니터링 및/또는 조정될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, IgG의 수율의 개선은은 알코올 또는 pH 조정제의 확산 부가에 의해 혼합물의 pH를 조정하기 위해 사용된 침전하는 알코올 및/또는 용액을 부가하여 달성된다. 이들 시약의 확산 부가는 단일 입구에서의 부가와 비교하여 알코올 농도 및 pH의 국소 변동을 최소화한다. 일 구현예에서, 확산 부가는 배출 부가보다는 분무를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 확산 부가는 다중 포트로부터 시약의 부가를 포함한다. 일 구현예에서, 확산 부가는 살포기 포트로부터 시약의 부가를 포함한다. 어떤 구현예에서, 시약을 시스템에 도입하기 위해 사용된 적어도 1 포트는 임펠러 또는 다른 분산 소자에서 또는 그 근처에서 위치한다.

6. 침전물 G ( Ppt G)의 서스펜션 및 여과

침전물 G의 IgG 함량을 용해시키기 위해, 차가운 추출 완충제는 PptG를 재현탁시키기 위해 사용된다. 간단히 말해서, 침전물 G는 1 부 침전물 대 2-5 부 주사용 물 (WFI) 또는 낮은 전도도 완충제의 비로 용해된다. 바람직한 구현예에서, 침전물 G는 1 부 침전물 대 1-15 부, 바람직하게는 3.5 부, WFI의 비로 용해된다. 서스펜션 단계는 40 내지 95의 AU_280-320 값을 달성하기 위해 온도 0℃ 내지 8℃에서 전형적으로 행해진다. 그 다음 적어도 2 시간 동안 교반된 용액의 최종 pH는, 조정되어 4.5 내지 5.6, 바람직하게는 내지 5.2 ± 0.2를 형성한다. 일 구현예에서, 이러한 pH 조정은 아세트산으로 수행된다. IgG의 용해도를 증가시키기 위해, 서스펜션의 전도도는 2.5 내지 6.0 mS/cm로 증가된다. 일 구현예에서, 전도도는 염화나트륨의 부가에 의해 증가된다.

침전물 G의 추출을 위한 적당한 용액은 WFI 및 낮은 전도도 완충제를 포함한다. 일 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 10 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 다른 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 4 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 2 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다.

그 다음, 현탁된 PptG 용액은 임의의 불용해된 입자를 제거하기 위해 0.1 μm 내지 0.4 μm의 명목 기공 크기를 갖는 적당한 심층 필터로 여과된다. 일 구현예에서, 심층 필터의 명목 기공 크기는 약 0.2 μm이다 (예를 들면, Cuno VR06 필터 또는 이와 동등물). 또 하나의 구현예에서, 현탁된 PptG 용액은 원심분리되어 정화된 상청액을 회수한다. 필터는 여과 후 WFI 또는 적당한 완충제로 세정되어 추가의 IgG를 회수하고 후-세척물은 여과물에 부가된다. 바람직한 구현예에서, 필터의 후-세척은 약 2.5 내지 약 6.0 mS/cm의 전도도를 갖는 나트륨 클로라이드 용액을 사용하여 수행된다.

7. 용매 및 세제 (S/D) 처리

혈장-유도된 생성물에서 존재하는 다양한 바이러스 오염물질을 불활성화시키기 위해, 정화된 PptG 여과물에 대해 그 다음 용매 세제 (S/D) 처리가 수행된다. 혈장 유도된 분획의 세제 처리 방법은 당해분야에서 잘 알려져 있다 (검토 참고, Pelletier JP 등., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42). 일반적으로, 임의의 표준 S/D 처리는 본원에서 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, S/D 처리의 예시적인 프로토콜은 이하에서 제공된다.

Triton X-100, Tween-20, 및 트리스(n-부틸)포스페이트 (TNBP)는 약 1.0%, 0.3%, 및 0.3%의 최종 농도 각각에서, 정화된 PptG 여과물에 부가된다. 그 다음 혼합물은 18℃ 내지 25℃의 온도에서 적어도 1 시간 동안 교반된다.

일 구현예에서, S/D 시약 (예를 들면, Triton X-100, Tween-20, 및 TNBP)은 확산 부가에 의해 부가된다. 특정 구현예에서, S/D 시약은 배출 부가에 의해서보다는 분무에 의해 부가된다. 또 하나의 구현예에서, 세제 시약은 S/D 성분의 빠른 분포를 보장하기 위해 혼합되고 있는 정화된 PptG 여과물에 고형물로서 부가된다. 어떤 구현예에서, 여과물의 비국재화된 표면적 위에 고형물을 뿌려서 고체 시약을 부가하는 것이 바람직하고 이로써 국소 과도농도는 예컨대 배출 부가에서 일어나지 않는다.

8. 이온 교환 크로마토그래피

IgG을 추가로 정제 및 농축하기 위해, 양이온 교환 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피가 이용될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 IgG를 정제 및 농축하는 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 5,886,154는, 분획 II+III 침전물이 낮은 pH (약 3.8 내지 4.5)에서 추출되고, 그 다음 카프릴산을 사용하여 IgG가 침전되고, 마지막으로 2 개의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 실행하는 방법을 기재하고 있다. 미국 특허 번호 6,069,236은 알코올 침전에 전혀 의존하지 않는 크로마토그래피 IgG 정제 도식을 기재한다. PCT 공개 번호 WO 2005/073252는 분획 II+III 침전물의 추출, 카프릴 산 처리, PEG 처리, 및 단일 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 수반하는 IgG 정제 방법을 기재한다. 미국 특허 번호 7,186,410는 분획 I+II+III 또는 분획 II 침전물의 추출 그 다음 알칼리성 pH 에서 수행된 단일 음이온 교환 단계를 수반하는 IgG 정제 방법을 기재한다. 미국 특허 번호 7,553,938은 분획 I+II+III 또는 분획 II+III 침전물의 추출, 카프릴레이트 처리, 및 1 또는 2 개의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 수반하는 방법을 기재한다. 미국 특허 번호 6,093,324는 약 6.0 내지 약 6.6의 pH에서 조작되는 거대다공성 음이온 교환 수지의 사용을 포함하는 정제 방법을 기재한다. 미국 특허 번호 6,835,379는 알코올 분획화의 부재에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의존하는 정제 방법을 기재한다. 상기 공보의 개시내용은 다목적으로 그의 전체가 참조로 본원에 편입되어 있다.

일 구현예에서, S/D 처리된 PptG 여과물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 둘 모두가 수행될 수 있다. 예를 들면, 일 구현예에서, S/D 처리된 PptG 여과물은 IgG를 수지에 결합하기 위한 적당한 조건 하에서 양이온교환수지에 의해 접촉된다. 그 다음 S/D 시약은 흡착된 IgG로부터 세정될 수 있고, 이것은 차후에, 적당한 용출 완충제로 수지에서 용출 제거된다. 이 방식에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 사용되어 S/D 시약을 제제로부터 제거하고, IgG 함유 용액을 농축하고/거나, 불순물을 상기 조성물로부터 제거할 수 있다.

일 구현예에서, IgG는 pH 약 8.0 내지 9.0를 갖는 용출 완충제를 사용하여 양이온교환수지로부터 용출된다. 어떤 구현예에서, pH 용출 완충제는 pH 약 8.2 내지 약 8.8, 또는 약 8.4 내지 약 8.6, 또는 pH 약 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 용출 완충제의 pH는 약 8.5 ± 0.1이다.

마찬가지로, 음이온 교환 크로마토그래피는 IgG 조성물에서 불순물을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는, 1 이상 불순물이 음이온 교환 수지에 결합하지만 IgG는 그렇지 않은 용액 조건 하에서 수행된다. 특정 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 약산성 조건에서, 즉, pH 5.0 내지 7.0, 바람직하게는 5.5 내지 6.5에서, IgG가 아닌 오염물질이 음이온 교환 수지에 결합하는데 적당한 낮은 이온성 강도에서 수행된다.

특정 구현예에서, 양이온 교환 칼럼으로부터의 용출물은 낮은 pH, 예를 들면 약 5.5 내지 약 6.5로 조정될 수 있고, 적절한 완충제로 희석될 수 있고 이로써 용액의 전도도는 감소된다. 어떤 구현예에서, pH 양이온 교환 용출물은 pH 약 5.7 내지 약 6.7, 또는 약 5.9 내지 약 6.5, 또는 pH 약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 또는 6.7로 조정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 용출물의 pH는 pH 약 6.4 ± 0.1로 조정된다. 그 다음 용출물은 제조에서 발견된 몇 개의 오염물질을 결합하는 음이온 교환 칼럼 상에 로딩된다. IgG 분획을 함유하는 칼럼 통과액은 칼럼 부하 및 세정 동안에 수집된다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 이온 교환 크로마토그래피 단계는 칼럼 방식, 배치식, 또는 이 둘의 조합으로 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 전에 IgG 조성물의 pH를 조정하기 위해 사용된 용액 는 확산 부가에 의해 부가된다. 특정 구현예에서, 용액은 배출 부가에 의해서보다는 분무에 의해 부가된다.

9. 나노여과

본원에서 제공된 IgG 조성물의 바이러스 부하를 감소시키기 위해, 조성물은 적당한 나노여과 디바이스를 사용하여 나노여과될 수 있다. 어떤 구현예에서, 나노여과 디바이스는 약 15 nm 내지 약 200 nm의 평균 기공 크기를 가질 것이다. 이러한 용도에 적당한 나노필터의 예는 비제한적으로, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (밀리포어), Planova 15N, 20N, 35N, 및 75N (Planova)를 포함한다. 특정 구현예에서, 나노필터는 약 15 nm 내지 약 72 nm, 또는 약 19 nm 내지 약 35 nm, 또는 약 15 nm, 19 nm, 35 nm, 또는 72 nm의 평균 기공 크기를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 나노필터는 약 35 nm의 평균 기공 크기를 가질 것이고, 그 예는 Asahi PLANOVA 35N 필터 또는 그의 동등물이다. 특정 구현예에서, 음이온 교환 단계로부터 회수된 IgG 조성물은 30 nm 내지 40 nm, 바람직하게는 35±2 nm의 기공 크기를 갖는 나노필터를 사용하여 나노여과된다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 나노필터는 약 19 또는 20 nm의 평균 기공 크기를 가질 것이고, 그 에는 Asahi PLANOVA 20N 필터 (19±2 nm) 또는 그의 동등물이다. 특정 구현예에서, 음이온 교환 단계로부터 회수된 IgG 조성물은 15 nm 및 25 nm, 바람직하게는 19±2 nm의 기공 크기를 갖는 나노필터를 사용하여 나노여과된다.

10. 한외여과 / 정용여과 ( UF / DF )

한외여과/정용여과는 정제 공정 동안 임의의 단계에서 IgG 조성물을 농축하기 위해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 나노여과물은 UF/DF에 의해 농축된다. 일 구현예에서, 나노여과물은 약 2% 내지 약 10% (w/v)의 단백질 농도로 한외여과에 의해 농축될 수 있다. 어떤 구현예에서, 한외여과는 개방 채널 스크린을 갖는 카세트에서 수행되고 한외여과 막은 약 100 kDa 미만 또는 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 또는 그 미만의 kDa의 명목 분자량 컷오프 (NMWCO)를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 한외여과 막은 50 kDa 이하의 NMWCO를 갖는다.

일 구현예에서, 개방 채널 막은 수율 및 보관 안정성에 영향을 주지 않으면서 종래기술의 IVIGs (예를 들면, GAMMAGARD^® LIQUID, 10% IgG)와 비교하여 약 2 배 높은 단백질 농도 (200 mg/mL)를 수득한 IgG 조성물에 부여하기 위해 생산 과정의 끝 근처에서 특이적으로 디자인된 후-세척 및 제형과 함께 사용된다. 대부분의 상업적 이용가능한 한외여과 막으로 200 mg/mL IgG의 농도는 주요한 단백질 손실없이 도달될 수 없다. 이들 막은 초기에 차단되고 따라서 적절한 후-세척은 달성하기 어렵다. 따라서 개방 채널 막 배치가 사용되어야 한다. 개방 채널 막에 의해서조차, 특이적으로 디자인된 후-세척 절차는 유의미한 단백질 손실 (2% 손실 미만) 없이 필요한 농도를 얻기 위해 사용되어야 한다. 더욱더 놀라운 것은, 200 mg/mL의 높은 단백질 농도가 낮은 pH 보관 단계 바이러스 불활성화 용량을 감소시키지 못한다는 사실이다.

한외여과 단계의 완료시, 농축물은 정맥내 또는 근육내 투여에 적당한 용액에 대항하여 정용여과를 통해 또한 농축될 수 있다. 어떤 구현예에서, 정용여과 용액은 안정화제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 안정제 및 완충제는 적절한 농도, 예를 들면 약 0.20 M 내지 약 0.30 M, 또는 약 0.22 M 내지 약 0.28 M, 또는 약 0.24 M 내지 약 0.26 M, 또는 0.20±0.01 M, 0.21±0.01 M, 0.22±0.01 M, 0.23±0.01 M, 0.24±0.01 M, 0.25±0.01 M, 0.26±0.01 M, 0.27±0.01 M, 0.28±0.01 M, 0.29±0.01 M, 또는 0.3±0.01 M의 농도의 글리신이다. 바람직한 구현예에서, 정용여과 완충제는 0.25±0.01 M 글리신를 함유한다.

전형적으로, 정용여과의 최소 교환 용적은 최초 농축물 용적의 적어도 약 3 배 또는 최초 농축물 용적의 적어도 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 그 초과 배이다. IgG 용액은 약 5% 내지 약 25% (w/v), 또는 약 6% 내지 약 18% (w/v), 또는 약 7% 내지 약 16% (w/v), 또는 약 8% 내지 약 14% (w/v), 또는 약 9% 내지 약 12%의 최종 단백질 농도, 또는 약 5%, 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% 또는 그 초과의 최종 농도로 농축될 수 있다. 일 구현예에서, 적어도 약 23%의 최종 단백질 농도는 후-세척 분획을 농축된 용액에 부가하지 않고 달성된다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 약 24%의 최종 단백질 농도는 후-세척 분획을 농축된 용액에 부가하지 않고 달성된다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 약 24%의 최종 단백질 농도는 후-세척 분획을 농축된 용액에 부가하지 않고 달성된다. 일 구현예에서, 용액의 pH는 정용여과 후 4.6 내지 5.1일 것이다.

예시적인 구현예에서, IgG 조성물의 pH은 한외여과 전 약 4.5로 조정된다. 용액은 한외여과를 통해 5 ± 2% w/v의 단백질 농도로 농축된다. UF 막은 50,000 달톤 이하의 명목 분자량 컷오프 (NMWCO)를 갖는다 (예를 들면, 밀리포어 펠리콘 폴리에테르 설폰 막). 그 다음 농축물은 pH 4.5 ± 0.2의 0.25 M 글리신 용액의 10 용적에 대항하여 정용여과된다. 한외-정용여과 내내 조작 용액은 약 2℃ 내지 약 8℃의 농도에서 유지된다. 정용여과 후, 용액은 적어도 11 % (w/v)의 단백질 농도로 농축된다.

11. 제형

정용여과 단계의 완료 시, 용액의 단백질 농도는 약 5% 내지 약 20% (w/v), 또는 약 6% 내지 약 18% (w/v), 또는 약 7% 내지 약 16% (w/v), 또는 약 8% 내지 약 14% (w/v), 또는 약 9% 내지 약 12%의 최종 농도, 또는 약 5%, 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 또는 25%의 최종 농도로 정용여과 완충제로 조정된다. 일 구현예에서, 최종 용액의 단백질 농도는 약 9% 내지 약 11%, 더 바람직하게는 약 10%이다.

제형된 벌크 용액은 약 0.22 마이크론 이하, 예를 들면 약 0.2 마이크론의 절대 기공 크기를 갖는 막 필터를 통해 여과하여 추가로 멸균된다. 그 다음 용액은 무균처리로 시험용으로 취한 샘플로, 적당한 밀봉을 위해 최종 용기로 분배된다.

일 구현예에서, IgG 조성물은 정용여과 완충제로 10.2 ± 0.2% (w/v)의 농도로 추가로 조정된다. 또 하나의 구현예에서, IgG 조성물은 15±1% (w/v)의 농도로 조정된다. 또 하나의 구현예에서, IgG 조성물은 20±1% (w/v)의 농도로 조정된다. 또 하나의 구현예에서, IgG 조성물은 25±1% (w/v)의 농도로 조정된다. pH는 필요하면 약 4.4 내지 약 4.9로 조정된다. 마지막으로, 용액은 약 30℃에서 3 주 동안 멸균 여과되고 인큐베이션된다.

D. 면역글로불린 G ( IgG )

일 측면에서, 본 발명은 풍부한 면역글로불린 G (IgG) 조성물을 Cohn 풀로부터 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 IgG 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 Cohn 풀로부터 공-침전시켜서, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 및 IgG를 함유하는 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 획수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일반적으로, 면역글로불린 및 A1PI의 침전을 위한 임의의 화학적 수단이 사용될 수 있고, 그 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 알코올 침전 (예를 들면, 에탄올 또는 메탄올 사용), 수용성 폴리머 (예를 들면, PEG 또는 덱스트란)을 사용하는 침전, 및 염석 (예를 들면, 암모늄 포스페이트, 암모늄 설페이트, 나트륨 시트레이트, 등 사용). 바람직한 구현예에서, 침전은 알코올 침전, 바람직하게는 에탄올 침전이다.

일 구현예에서, 본 발명은 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 IgG를 동결 결핍성 혈장으로부터 침전시켜 풍부한 면역글로불린 G (IgG) 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 상기 동결 결핍성 혈장에 부가하여 제 1 침전 단계에서 IgG을 동결 결핍성 혈장으로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 및 IgG을 상기 제 1 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다.

일 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: 하기 표에서 열거된 바와 같이 변화 1 내지 2166으로부터 선택된 최종 농도 및 pH로 에탄올을 동결 결핍성 혈장에 부가하여 제 1 침전 단계에서 IgG을 동결 결핍성 혈장으로부터 침전시켜: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 및 IgG을 상기 제 1 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다.

일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 20% 내지 30% (v/v)의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀과 혼합하여 수행된다. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±2% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±1% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 마찬가지로, 일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.5의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.4의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.3의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.2의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.1의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5의 pH에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 최종 에탄올 농도 및 제 1 침전 단계의 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

본원에서 제공된 방법은 초기 낮은 알코올 침전 단계 (즉, 분획 I 침전)에 의존하는 당해기술의 정제 절차와 비교하여, 초기 침전 반응에서 개시 Cohn 풀의 대다수의 면역글로불린 함량의 침전으로 인해 최종 풍부한 생성물에서 유의미하게 더 높은 수율의 IgG 회수를 제공한다.

따라서, 본원에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 IgG 함량의 적어도 90%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 IgG 함량의 적어도 95%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 더 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 IgG 함량의 적어도 99%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 IgG 함량의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과는 초기 침전 반응에서 침전된다.

본원에서 제공된 실시예에서 보는 바와 같이, 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계 (즉, 분획 I-IV-1 침전)의 사용으로 개시 Cohn 풀의 IgG 함량의 적어도 99%가 침전된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 함량의 99% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 및 IgG을 상기 제 1 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 및 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 및 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하고 단계로서, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

약품 등급 IgG 조성물을 제공하기 위해, 초기 침전물에 존재하는 오염물질 예컨대 A1PI 및 피브리노겐은 면역글로불린 조성물로부터 제거될 필요가 있다. 이것은, 예를 들면, 제 1 침전물의 추가 분획화 (예를 들면, 알코올, 비-이온성 친수성 폴리머, 또는 염석을 사용하는 개별적인 침전에 의해), 크로마토그래피 방법론, 또는 여과 방법론에 의해 달성될 수 있다.

일 구현예에서, 제 1 침전물은 IgG를 침전물로부터 추출하는데 적당한 주사용 물 (WFI) 또는 낮은 이온성 강도 완충제에서 현탁되고, 그 다음 서스펜션은 미분된 이산화규소 (SiO₂)로 처리되고, IgG를 함유하는 상기 서스펜션의 가용성 부분은 A1PI의 벌크 및 피브리노겐의 벌크를 함유하는 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리된다.

제 1 침전물의 추출을 위한 적당한 용액은 일반적으로 4.0 내지 5.5의 pH를 가질 것이다. 어떤 구현예에서, 용액은 4.5 내지 5.0의 pH를 가질 것이고, 다른 구현예에서, 추출 용액은 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 또는 5.5의 pH를 가질 것이다. 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.7±0.1이다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.8±0.1이다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.9±0.1이다. 일반적으로, 이들 pH 요건은 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트, 1염기성 포스페이트, 이염기성 포스페이트, 그의 혼합물, 등으로부터 선택된 완충제를 사용하는 것에 부합할 수 있다. 적당한 완충제 농도는 전형적으로 5 내지 100 mM, 또는 10 내지 50 mM, 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 mM 완충제의 범위이다.

추출 완충제는 바람직하게는 0.5 mS/cm 내지 2.0 mS/cm의 전도도를 가질 것이다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 추출 완충제의 전도도는 0.5±0.1 mS/cm, 또는 0.6±0.1, 0.7±0.1, 0.8±0.1, 0.9±0.1, 1.0±0.1, 1.1±0.1, 1.2±0.1, 1.3±0.1, 1.4±0.1, 1.5±0.1, 1.6±0.1, 1.7±0.1, 1.8±0.1, 1.9±0.1, 또는 2.0±0.1 mS/cm일 것이다. 당해분야의 숙련가는 적절한 전도도를 갖는 추출 완충제를 어떻게 산출하는 지를 알 것이다. 하나의 특별한 구현예에서, 추출 완충제는 4.8 ± 0.2의 pH 및 0.7 내지 0.9 mS/cm의 전도도에서 5 mM 1염기성 나트륨 포스페이트 및 5 mM 아세테이트를 함유한다.

일 구현예에서, 발연 실리카는 20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 100 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 분리 (예를 들면, 여과 또는 원심분리) 전에 부가된다. 또 하나의 구현예에서, 발연 실리카는 30 g/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 80 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 부가된다. 어떤 구현예에서, 발연 실리카는 약 20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물, 또는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 부가될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카 (예를 들면, Aerosil 380 또는 이와 동등물)는 40±20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 분획 I-IV-1 서스펜션에 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 분획 I-IV-1 서스펜션에 부가된다. 혼합은 2℃ 내지 8℃에서 적어도 50 내지 70 분 동안 일어난다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 상기 서스펜션의 가용성 부분은 IgG를 함유하고 상기 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, SiO₂는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 부가된다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 상기 서스펜션의 가용성 부분은 IgG를 함유하고 상기 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 또한 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 상기 서스펜션의 가용성 부분에 존재하는 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 피브리노겐은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 인자 H는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 IaIp는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, SiO₂는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 부가된다.

일 구현예에서, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 회수된 IgG는 분획화에 의해 추가로 풍부하다. 일반적으로, 분획화 (예를 들면, 알코올 또는 폴리머 침전, 염석, 등.)의 임의의 방법이 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, IgG는 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 에탄올 침전으로 분획화하여 추가로 풍부한다. 일 구현예에서, IgG는 IgG를 침전시키는데 적당한 최종 농도 및 pH 에탄올의 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에의 부가에 의해 풍부하고, 한편 적어도 1이 오염물질은 침전되지 않는다. 또 하나의 구현예에서, IgG는 적어도 하나의 오염물질을 침전시키는데 적당한 최종 농도 및 pH에서 에탄올의 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에의 부가에 의해 풍부하고, 한편 IgG는 침전되지 않는다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 Cohn 풀로부터 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 IgG 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 Cohn 풀로부터 공-침전시켜서, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 제 2 침전 단계에서 IgG를 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜서, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 제거된 A1PI는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

예시적인 구현예에서, 제 2 침전 단계는 22% 내지 28% (v/v)의 최종 농도에서 6.5 내지 7.5의 pH에서 에탄올을 제 2 서스펜션의 가용성 부분 (예를 들면, 여과 또는 원심분리 후에 형성된 서스펜션의 여과물 또는 상청액)에 혼합하여 수행된다. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±2% (v/v)의 최종 농도로 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±1% (v/v)의 최종 농도로 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25% (v/v)의 최종 농도로 혼합된다. 마찬가지로, 일 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.5의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.4의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.3의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.2의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.1의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0의 pH에서 수행된다. 특정 구현예에서, 제 2 침전 단계는 7.0±0.3의 pH에서 25±3% (v/v)의 최종 에탄올 농도를 사용하여 수행된다.

특정 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 함량의 99% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 혈장 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 제 2 침전 단계에서 IgG를 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜서, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

특정 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 함량의 99% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 혈장 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 IgG를 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

일 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하는 단계; 제 2 침전 단계에서 IgG를 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜서, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 분리된 A1PI는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다.

특정 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 상기 제 1 서스펜션의 가용성 분획을 회수하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 IgG를 제 1 서스펜션으로부터 침전시켜, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 분리된 A1PI는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다.

또 하나의 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 IgG 및 A1PI 함량의 99% 내지 100%를 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 회수하는 단계; 제 2 침전 단계에서 IgG를 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 분리된 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에 존재하는 알부민은 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 알부민 함량의 90% 내지 100%는 제 1 상청액에서 존재한다.

또 하나의 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 IgG 및 A1PI 함량의 99% 내지 100%를 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 A1PI를 상기 서스펜션으로부터 제거하는 단계; 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 회수하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 IgG을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 제 1 서스펜션으로부터 분리된 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에 존재하는 알부민은 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 알부민 함량의 90% 내지 100%는 제 1 상청액에서 존재한다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 상기 서스펜션의 가용성 부분은 IgG를 함유하고 상기 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 회수하는 단계; 제 2 침전 단계에서 IgG를 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, SiO₂는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 부가된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 상기 서스펜션의 가용성 부분은 IgG를 함유하고 상기 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 회수하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 IgG을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 IgG가 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, SiO₂는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 부가된다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 상기 서스펜션의 가용성 부분은 IgG를 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하는 단계; 제 2 침전 단계에서 IgG를 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 피브리노겐은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 인자 H는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 IaIp는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, SiO₂는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 부가된다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 IgG 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 IgG 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 상기 서스펜션의 가용성 부분은 IgG를 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하는 단계; 25±3% (v/v)의 최종 농도에서 7.0±0.3의 pH에서 에탄올을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분에 혼합하여 제 2 침전 단계에서 IgG을 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 침전시켜, IgG를 포함하는 제 2 침전물 및 적어도 하나의 오염물질을 포함하는 제 2 상청액을 형성하는 단계; 및 IgG를 상기 제 2 침전물로부터 회수하고, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 2 침전물로부터 회수된 IgG는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 피브리노겐은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 인자 H는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 IaIp는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 IgG 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 제 1 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, SiO₂는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 부가된다.

일 구현예에서, IgG는 상기 침전물을 차가운 추출 완충제로 현탁시켜 제 2 침전물로부터 회수된다. 예를 들면, 제 2 침전물은 1 부 침전물 대 2-5 부 주사용 물 (WFI) 또는 낮은 전도도 완충제의 비로 현탁된다. 바람직한 구현예에서, 제 2 침전물은 1 부 침전물 대 4-5 부, 바람직하게는 3.5 부, WFI의 비로 현탁된다. 일 구현예에서, 서스펜션 단계는 0℃ 내지 8℃의 온도에서 수행된다. 일 구현예에서, 용액의 최종 pH은 조정되어 4.8 내지 5.6, 바람직하게는 내지 5.2 ± 0.2을 형성한다. 일 구현예에서, 이러한 pH 조정은 아세트산으로 수행된다. 일 구현예에서, 서스펜션의 전도도는 2.5 내지 6.0 mS/cm로 증가되어 IgG의 용해도를 증가시킨다. 일 구현예에서, 전도도는 염화나트륨의 부가에 의해 증가된다.

제 2 침전물의 추출을 위한 적당한 용액은 WFI 및 낮은 전도도 완충제를 포함한다. 일 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 10 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 다른 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 4 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 2 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다.

일 구현예에서, IgG를 함유하는 제 1 서스펜션의 가용성 부분은 불용성 부분으로부터 분리된다. 일 구현예에서, 이것은 0.1 μm 내지 0.4 μm의 명목 기공 크기를 갖는 심층 필터로 상기 서스펜션을 여과하여 행해진다. 일 구현예에서, 심층 필터의 명목 기공 크기는 0.2 μm이다 (예를 들면, Cuno VR06 필터 또는 이와 동등물). 일 구현예에서, 필터는 여과 후 WFI 또는 적당한 완충제로 세정되어 추가의 IgG를 회수하고 후-세척물은 여과물에 부가된다. 바람직한 구현예에서, 필터의 후-세척은 약 2.5 내지 약 6.0 mS/cm의 전도도를 갖는 나트륨 클로라이드 용액을 사용하여 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 2 서스펜션은 원심분리되어 가용성 부분을 회수한다.

본 발명의 일 측면에서, 풍부한 IgG 조성물을 제조하기 위해 제공된 본 방법은 추가로, 적어도 하나의 추가의 혈액 인자를 동일한 Cohn 풀로부터 정제하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 2의 추가의 혈액 단백질을 동일한 Cohn 풀로부터 정제하는 것을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 3의 추가의 혈액 단백질을 동일한 Cohn 풀로부터 정제하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 추가로, 적어도 4, 5, 6, 또는 그 초과 추가의 혈액 단백질을 동일한 Cohn 풀로부터 정제하는 것을 포함한다. IgG와 동일한 Cohn 풀로부터 공정제될수 있는 예시적인 혈액 단백질은, 비제한적으로, 알부민, 알파-1-항트립신 (A1PI), 인자 H, 인터-알파-억제제 단백질 (IaIp), 프로트롬빈 복합체, 인자 VII (FVII), 인자 VIII (FVIII), 항트롬빈 III (ATIII), 피브리노겐, 부티릴콜린에스테라아제, 및 다른 것들을 포함한다.

일 구현예에서, 알파-1-항트립신 (A1PI)는 IgG와 동일한 Cohn 풀로부터 추가 정제된다. 특정 구현예에서, A1PI는 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획로부터 정제된다.

또 하나의 구현예에서, 피브리노겐은 IgG와 동일한 Cohn 풀로부터 추가 정제된다. 특정 구현예에서, 피브리노겐은 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획로부터 정제된다. 또 하나의 특정 구현예에서, A1PI 및 피브리노겐 둘 모두는 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획로부터 정제된다.

또 하나의 구현예에서, 인자 H는 IgG와 동일한 Cohn 풀로부터 추가 정제된다. 특정 구현예에서, 인자 H는 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획로부터 정제된다. 또 하나의 특정 구현예에서, A1PI 및 인자 H 둘 모두는 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 정제된다.

또 하나의 구현예에서, 인터-알파-억제제 단백질 (IaIp)은 IgG와 동일한 Cohn 풀로부터 추가 정제된다. 특정 구현예에서, IaIp는 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획로부터 정제된다. 또 하나의 특정 구현예에서, A1PI 및 IaIp 둘 모두는 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획로부터 정제된다.

또 하나의 구현예에서, 알부민은 IgG와 동일한 Cohn 풀로부터 추가 정제된다. 특정 구현예에서, 알부민은 형성된 제 1 상청액로부터 정제된다. 특정 구현예에서, 알부민은 형성된 제 1 상청액으로부터 정제되고, 한편 적어도 1 추가의 혈액 인자는 상기 형성된 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 정제된다.

일 구현예에서, 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계로부터 회수된 면역글로불린은 다운스트림 Kistler-Nitschmann 또는 Deutsch 등. 분획화에 따라 추가로 풍부해진다. 예를 들면, 회수된 면역글로불린 조성물에 대해 Kistler-Nitschmann B 침전 또는 Deutsch 등. β-글로불린 침전와 유사한 단계가 수행될 수 있다. 이들 단계에서 사용된 조건으로 α- 및 β-글로불린이 침전되고, 한편 면역글로불린 G은 상청액에 남아 있다.

따라서, 일 측면에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 풍부한 면역글로불린 G (IgG) 조성물을 제조하는 방법을 제공한다: (i) 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 Cohn 풀로부터 공-침전시키는 단계; (ii) 면역글로불린을 상기 침전물로부터 회수하는 단계; (iii) 적어도 1 비-감마 글로불린 단백질을, 제 1 침전물로부터 회수된 면역글로불린 조성물로부터 침전시키는 단계; 및 (iv) 상기 상청액을 상기 제 2 침전 단계로부터 회수하는 단계. 어떤 구현예에서, 이들 방법은 추가로 하기를 포함할 수 있다: 추가의 침전 단계 (예를 들면, 침전물 G 침전), 음이온 및/또는 양이온 교환 단계, 1 이상 한외여과/정용여과 단계, 및 1 이상 바이러스 감소 또는 불활성화 단계 (예를 들면, S/D 처리, 나노여과, 낮은 pH에서의 인큐베이션, 등).

V. 알파-1- 항트립신 (A1PI) 조성물의 제조

혈액 단백질을 증여된 혈장으로부터 제조하는 현대적인 방법은 1940 및 1950년대에서 행해진 초기 작업으로부터 유도된다. 이러한 작업은 알부민 및 감마 면역글로불린 (IgG)의 정제에 주로 초점이 맞춰지기 때문에 개발된 분획화 도식은 추가의 혈액 단백질의 회수에 대해 최적화되지 않았고, 이것은 점점 더 치료적으로 중요하게 되고 있다. 예를 들면, 혈장의 초기 높은 pH, 낮은 알코올 침전 (예를 들면, 분획 I 침전)의 사용으로 분획 I 침전물 중 인자 H, IaIp, 및 얼마간 면역글로불린이 부분적으로 손실된다. 더욱이, 차후의 침전 단계 (예를 들면, 분획 II+III 침전 또는 침전 A)에 의해 달성된 면역글로불린 및 A1PI의 분리는 불완전하고, 면역글로불린은 불완전한 침전으로 인해 상청액에서 손실되고 A1PI는 부분 침전으로 인해 침전물에서 손실된다. 따라서, 더 높은 수율의 다중 혈액 단백질을 제공하는 업데이트된 분획화 방법이 필요하다.

본 발명은 초기 침전물 중 면역글로불린, A1PI, 및 다른 혈액 단백질 및 초기 상청액 중 알부민을 분획화하는 초기 침전 단계의 사용을 통해 이들 요건을 만족시키는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 초기 침전은 낮은 pH의, 고급 알코올 조건 하에서 수행된다.

일 측면에서, 본 발명은 면역글로불린의 벌크 및 Cohn 풀의 A1PI 함량을 침전시키는 초기 단계를 사용하여 알파-1-항트립신 (A1PI)을 풀링된 혈장으로부터 제조하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 이러한 초기 단계는 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계이다. 본원에서 제공된 실시예에서 보는 바와 같이, 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 95% 초과는 이들 조건 하에서 침전된다. 더욱이, 본 발명은 이러한 초기 침전에서 A1PI 및 면역글로불린을 효율적으로 분리하는 방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 풍부한 알파-1-항트립신 (A1PI) 조성물을 Cohn 풀로부터 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 A1PI를 Cohn 풀로부터 공-침전시켜, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 제 1 침전물에 존재하는 면역글로불린을 용해시켜, 면역글로불린을 포함하는 가용성 부분 및 A1PI을 포함하는 불용성 부분을 갖는 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분을 분리하는 단계; 및 A1PI를 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 A1PI 조성물을 형성하는 단계. 일반적으로, 면역글로불린 및 A1PI의 침전을 위한 임의의 화학적 수단이 사용될 수 있고, 그 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 알코올 침전 (예를 들면, 에탄올 또는 메탄올 사용), 수용성 폴리머 (예를 들면, PEG 또는 덱스트란)을 사용하는 침전, 및 염석 (예를 들면, 암모늄 포스페이트, 암모늄 설페이트, 나트륨 시트레이트, 등 사용). 바람직한 구현예에서, 침전은 알코올 침전, 바람직하게는 에탄올 침전이다.

일 구현예에서, 본 발명은 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 A1PI를 동결 결핍성 혈장으로부터 침전시켜 풍부한 A1PI 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 상기 동결 결핍성 혈장에 부가하여 제 1 침전 단계에서 A1PI를 동결 결핍성 혈장으로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 및 A1PI를 상기 제 1 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 A1PI 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 A1PI는 추가로 풍부하다.

일 구현예에서, 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: 하기 표에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된 최종 농도 및 pH로 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 A1PI를 Cohn 풀로부터 침전시키는 단계: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 및 A1PI를 상기 제 1 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 A1PI 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 A1PI는 추가로 풍부하다.

일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 22% 내지 28% (v/v)의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀과 혼합하여 수행된다. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±2% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25±1% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 또 하나의 구현예에서, 에탄올은 25% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 마찬가지로, 일 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.5의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.4의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.3의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.2의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5±0.1의 pH에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 침전 단계는 5.5의 pH에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 최종 에탄올 농도 및 제 1 침전 단계의 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

본원에서 제공된 방법은 초기 낮은 알코올 침전 단계 (즉, 분획 I 침전)에 의존하는 종래의 정제 절차와 비교하여, 초기 침전 반응에서 대다수의 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 침전으로 인해 최종 풍부한 생성물 유의미하게 더 높은 수율의 A1PI 회수를 제공한다.

따라서, 본원에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 알파-1-항트립신 (A1PI) 함량의 적어도 80%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 90%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 더 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 95%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 가장 바람직한 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 97%는 초기 침전 반응에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과는 초기 침전 반응에서 침전된다.

본원에서 제공된 실시예에서 보는 바와 같이, 초기 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계 (즉, 분획 I-IV-1 침전)의 사용으로 개시 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 95%가 침전된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 A1PI 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 A1PI 함량의 95% 내지 100%를 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 상기 제 1 상청액으로부터 분리하는 단계; 및 A1PI를 상기 제 1 침전물로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 A1PI 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 A1PI는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 A1PI 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 회수하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 제 1 침전물에 존재하는 면역글로불린을 용해시켜, 면역글로불린을 포함하는 가용성 부분 및 A1PI을 포함하는 불용성 부분을 갖는 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분을 분리하는 단계; 및 A1PI를 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 A1PI 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 회수된 면역글로불린은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 제거된 A1PI는 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 A1PI 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%를 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 제 1 침전물에 존재하는 면역글로불린을 용해시켜, 면역글로불린을 포함하는 가용성 부분 및 A1PI을 포함하는 불용성 부분을 갖는 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분을 분리하는 단계; 및 A1PI을 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하고, 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 상기 제 1 상청액에서 존재하고, 그렇게 함으로써 풍부한 A1PI 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분으로부터 회수된 면역글로불린은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 제거된 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7.

일 구현예에서, 제 1 침전물은 면역글로불린을 침전물로부터 추출하는데 적당한 주사용 물 (WFI) 또는 낮은 이온성 강도 완충제에서 현탁되고, 그 다음 서스펜션은 미분된 이산화규소 (SiO₂)으로 처리되고, 및 면역글로불린을 함유하는 상기 서스펜션의 가용성 부분은 상기 A1PI 함량의 벌크를 함유하는 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리된다.

제 1 추출물로부터 면역글로불린을 추출하는 적당한 용액은 일반적으로 4.0 내지 5.5의 pH를 가질 것이다. 어떤 구현예에서, 용액은 4.5 내지 5.0의 pH를 가질 것이고, 다른 구현예에서, 추출 용액은 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 또는 5.5의 pH를 가질 것이다. 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.7±0.1이다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.8±0.1이다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 추출 완충제의 pH는 4.9±0.1이다. 일반적으로, 이들 pH 요건은 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트, 1염기성 포스페이트, 이염기성 포스페이트, 그의 혼합물, 등으로부터 선택된 완충제를 사용하는 것에 부합할 수 있다. 적당한 완충제 농도는 전형적으로 5 내지 100 mM, 또는 10 내지 50 mM, 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 mM 완충제의 범위이다.

추출 완충제는 바람직하게는 0.5 mS/cm 내지 2.0 mS/cm의 전도도를 가질 것이다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 추출 완충제의 전도도는 0.5±0.1 mS/cm, 또는 0.6±0.1, 0.7±0.1, 0.8±0.1, 0.9±0.1, 1.0±0.1, 1.1±0.1, 1.2±0.1, 1.3±0.1, 1.4±0.1, 1.5±0.1, 1.6±0.1, 1.7±0.1, 1.8±0.1, 1.9±0.1, 또는 2.0±0.1 mS/cm일 것이다. 당해분야의 숙련가는 적절한 전도도를 갖는 추출 완충제를 어떻게 산출하는 지를 알 것이다. 하나의 특별한 구현예에서, 추출 완충제는 4.8 ± 0.2의 pH 및 0.7 내지 0.9 mS/cm의 전도도에서 5 mM 1염기성 나트륨 포스페이트 및 5 mM 아세테이트를 함유한다.

일 구현예에서, 발연 실리카는 20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 100 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 분리 (예를 들면, 여과 또는 원심분리) 전에 부가된다. 또 하나의 구현예에서, 발연 실리카는 30 g/kg 분획 I-IV-1 침전물 내지 80 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 부가된다. 어떤 구현예에서, 발연 실리카는 약 20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물, 또는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 농도에서 부가될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카 (예를 들면, Aerosil 380 또는 이와 동등물)는 40±20 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 분획 I-IV-1 서스펜션에 부가된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 발연 실리카는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 분획 I-IV-1 서스펜션에 부가된다. 혼합은 2℃ 내지 8℃에서 적어도 50 내지 70 분 동안 일어난다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 A1PI 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%을 Cohn 풀로부터 회수하여 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 여기서 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI를 함유하는 단계; 및 A1PI를 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 회수하고, 그렇게 함으로써 풍부한 A1PI 조성물을 형성하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 제 1 침전물로부터 회수된 면역글로불린은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 서스펜션으로부터 제거된 A1PI가 추가로 풍부하다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, SiO₂는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 부가된다.

일 구현예에서, 본 발명은 풍부한 A1PI 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 20% 내지 30%의 최종 농도로 5.0 내지 6.0의 pH에서 에탄올을 Cohn 풀에 부가하여 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 A1PI 함량의 95% 내지 100%를 Cohn 풀로부터 침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소로 처리하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계로서, 상기 서스펜션의 가용성 부분은 면역글로불린을 함유하고 상기 서스펜션의 불용성 부분은 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp를 함유하고, 또한 여기서 Cohn 풀의 알부민 함량의 80% 내지 100%는 제 1 상청액에서 존재하는 단계. 일 구현예에서, 에탄올은 25±3% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀과 혼합된다. 일 구현예에서, 상기 서스펜션의 가용성 부분에 존재하는 면역글로불린은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 A1PI는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 피브리노겐은 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 인자 H는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서스펜션의 불용성 부분에 존재하는 IaIp는 추가로 풍부하다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 상청액에서 발견된 알부민은 추가로 풍부하다. 바람직한 구현예에서, Cohn 풀의 면역글로불린 함량의 99% 내지 100%는 제 1 침전 단계에서 침전된다. 어떤 구현예에서, 낮은 pH의, 고급 알코올 침전 단계에서 사용된 최종 에탄올 농도 및 pH는 하기에서 열거된 변화 1 내지 2166으로부터 선택된다: 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 및 표 7. 특정 구현예에서, 제 1 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분은 여과로 분리된다. 일 구현예에서, SiO₂는 40±10 g/kg 분획 I-IV-1 침전물의 최종 농도로 부가된다.

일 구현예에서, IgG를 함유하는 제 1 서스펜션의 가용성 부분은 서스펜션을 0.1 μm 내지 0.4 μm의 명목 기공 크기를 갖는 심층 필터로 여과하여 A1PI를 함유하는 불용성 부분으로부터 분리된다. 일 구현예에서, 심층 필터의 명목 기공 크기는 0.2 μm이다 (예를 들면, Cuno VR06 필터 또는 이와 동등물). 일 구현예에서, 필터는 여과 후 WFI 또는 적당한 완충제로 세정되어 추가의 IgG를 회수하고 후-세척물은 여과물에 부가된다. 또 하나의 구현예에서, 제 1 서스펜션은 원심분리되어 가용성 및 불용성 부분을 분리한다.

일 구현예에서, A1PI는 불용성 부분을 A1PI 추출 완충제에서 현탁시켜 분리된 불용성 부분으로부터 회수된다. 예를 들면, 일 구현예에서, 분리된 불용성 부분은 1 부 불용성 물질 내지 2-15 부 주사용 물 (WFI) 또는 낮은 전도도 완충제에서 현탁되어 제 2 서스펜션을 형성한다. 또 하나의 구현예에서, 분리된 불용성 부분은 1 부 불용성 물질 내지 2-10 부 주사용 물 (WFI) 또는 낮은 전도도 완충제의 비에서 현탁된다. 또 하나의 구현예에서, 분리된 불용성 부분은 1 부 불용성 물질 내지 3-7 부 주사용 물 (WFI) 또는 낮은 전도도 완충제의 비에서 현탁된다. 또 다른 구현예에서, 분리된 불용성 부분은 1 부 불용성 물질 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 초과 부 주사용 물 (WFI) 또는 낮은 전도도 완충제의 비에서 현탁된다. 일 구현예에서, 추출은 적어도 2 시간 동안 교반된다. 또 하나의 구현예에서, 추출은 적어도 4 시간 동안 교반된다. 또 하나의 구현예에서, 추출은 적어도 8 시간 동안 교반된다. 또 하나의 구현예에서, 추출은 6 내지 12 시간 동안 교반된다. 일 구현예에서, 추출은 10℃ 내지 25℃에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 추출은 17±5℃에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 추출은 17±4℃에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 추출은 17±3℃에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 추출은 17±2℃에서 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 추출은 17±1℃에서 수행된다. 일 구현예에서, A1PI를 함유하는 가용성 부분은 불용성 부분 여과로, 예를 들면, 심층 여과로부터 분리된다. 또 하나의 구현예에서, A1PI를 함유하는 가용성 부분은 원심불리에 의해 불용성 부분으로부터 분리된다.

A1PI의 추출용 적당한 용매는 WFI 및 낮은 전도도 완충제를 포함한다. 일 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 10 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 다른 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 4 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충제는 약 2 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 일 구현예에서, WFI 또는 낮은 전도도 완충제는 8.0 내지 9.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, A1PI 추출 완충제의 pH는 8.8±0.5이다. 특정 구현예에서, A1PI 추출 완충제의 pH는 8.8±0.4이다. 특정 구현예에서, A1PI 추출 완충제의 pH는 8.8±0.3이다. 특정 구현예에서, A1PI 추출 완충제의 pH는 8.8±0.2이다. 특정 구현예에서, A1PI 추출 완충제의 pH는 8.8±0.1이다. 또 다른 구현예에서, A1PI 추출 완충제의 pH는 8.0±0.2, 8.1±0.2, 8.2±0.2, 8.3±0.2, 8.4±0.2, 8.5±0.2, 8.6±0.2, 8.7±0.2, 8.8±0.2, 8.9±0.2, 9.0±0.2, 9.1±0.2, 9.2±0.2, 9.3±0.2, 9.4±0.2, 또는 9.5±0.2이다.

일 구현예에서, 상기 분리된 제 1 서스펜션의 불용성 부분은, A1PI 완충제를 사용하는 추출 전에 중간체 서스펜션을 형성하기 위해 A1PI를 추출하는데 적당하지 않는, WFI 또는 낮은 이온성 강도 완충제에서 현탁된다. 이 구현예에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: 7.0 이하의 pH에서 WFI 또는 낮은 이온성 강도 완충제에서 불용성 물질을 현탁시키는 단계; 중간체 서스펜션의 가용성 및 불용성 부분을 분리하는 단계; 및 중간체 서스펜션의 불용성 부분에서 A1PI를 회수하는 단계. 일 구현예에서, 중간체 서스펜션은 1 부 불용성 물질 내지 2-15 부 WFI 또는 완충제의 비로 불용성 물질을 현탁하여 형성된다. 일 구현예에서, WFI 또는 낮은 이온성 강도 완충제는 4.5 내지 6.5의 pH를 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 낮은 이온성 강도 완충제는 5.5±0.4의 pH를 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 낮은 이온성 강도 완충제는 5.5±0.3의 pH를 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 낮은 이온성 강도 완충제는 5.5±0.2의 pH를 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 낮은 이온성 강도 완충제는 5.5±0.1의 pH를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 낮은 이온성 강도 완충제는 4.5±0.2, 4.6±0.2, 4.7±0.2, 4.8±0.2, 4.9±0.2, 5.0±0.2, 5.1±0.2, 5.2±0.2, 5.3±0.2, 5.4±0.2, 5.5±0.2, 5.6±0.2, 5.7±0.2, 5.8±0.2, 5.9±0.2, 6.0±0.2, 6.1±0.2, 6.2±0.2, 6.3±0.2, 6.4±0.2, 또는 6.5±0.2의 pH를 갖는다. 일 구현예에서, 가용성 부분은 여과, 예를 들면, 심층 여과 A1PI를 함유하는 불용성 부분으로부터 분리된다. 또 하나의 구현예에서, 가용성 부분은 원심분리로 A1PI를 함유하는 불용성 부분으로부터 분리된다.

일 구현예에서, 제 1 서스펜션의 불용성 부분로부터 추출된 A1PI는 하기를 비제한적으로 포함하는, 당해기술에서 잘 알려진 방법에 따라 추가로 풍부하다: 크로마토그래피 (예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 하이드록시인회석 크로마토그래피 (HAP), 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 면역-친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 등.); 여과 (예를 들면, 한외여과 및/또는 정용여과); 및 1 이상 바이러스 감소 단계 (예를 들면, 나노여과, 용매 및 세제 처리, UV 조사, 열처리, 낮은 pH 인큐베이션, 등).

일 구현예에서, 제 1 서스펜션의 불용성 부분로부터 추출된 A1PI는 분획화에 의해 추가로 풍부하다. 일반적으로, 분획화 (예를 들면, 알코올 또는 폴리머 침전, 염석, 등.)의 임의의 방법이 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 조성물은 2가 양이온, 바람직하게는 아연을 사용하여 A1PI을 정화된 추출된 용액으로부터 침전시켜 추가로 풍부하다. 일 구현예에서, 아연 클로라이드는 1 mM 내지 15 mM의 최종 농도로 용액에 부가된다. 특정 구현예에서, 아연 클로라이드는 1 mM 내지 4 mM의 최종 농도로 용액에 부가된다. 더 특정 구현예에서, 아연 클로라이드는 2.0 mM 내지 3.0 mM의 최종 농도로 용액에 부가된다.

어떤 구현예에서, A1PI는 하기에서 기재된 것과 같은 당해분야에서 공지된 정제 방법에 따라 추가로 풍부하다: WO 1995/35306, WO 1998/00154, 및 미국 특허 번호 5,981,715; 7,807,435; 및 7,879,800, 그의 개시내용은 그의 전체가 다목적으로 본원에 참조로 분명히 편입되어 있다.

VI . 약제학적 조성물

일 측면에서, 본 발명은 본원에서 기재된 임의의 방법에 따라 제조된 혈장-유도된 단백질의 조성물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 이들 조성물은 약제학적 투여용으로 제형될 것이다 (즉, 약제학적 조성물).

일 구현예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 방법으로 제조된 혈장-유도된 단백질 조성물을 제공한다: 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 Cohn 풀로부터 공-침전시켜, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션으로부터 가용화하여 면역글로불린을 포함하는 서스펜션의 가용성 부분 및 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp을 포함하는 서스펜션의 불용성 부분을 형성하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 혈장-유도된 단백질을 포함하고, 이 단백질은 면역글로불린 (Ig), 알부민, 알파-1-항트립신 (A1PI), 부티릴콜린에스테라아제, 인자 H, 보체 시스템의 단백질, 및 인터-알파-트립신 억제제 (IαI) 단백질로부터 선택된다.

일반적으로, 면역글로불린 및 A1PI의 침전을 위한 임의의 화학적 수단이 사용될 수 있고, 그 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 알코올 침전 (예를 들면, 에탄올 또는 메탄올 사용), 수용성 폴리머 (예를 들면, PEG 또는 덱스트란)을 사용하는 침전, 및 염석 (예를 들면, 암모늄 포스페이트, 암모늄 설페이트, 나트륨 시트레이트, 등 사용). 바람직한 구현예에서, 침전은 알코올 침전, 바람직하게는 에탄올 침전이다.

일 구현예에서, 본 조성물은 약제학적 투여용으로 제형된다. 특정 구현예에서, 본 조성물은 정맥내 투여용으로 제형된다. 또 하나의 특정 구현예에서, 본 조성물은 근육내 투여용으로 제형된다. 또 하나의 구현예에서, 본 조성물은 피하 투여용으로 제형된다. 또 하나의 구현예에서, 본 조성물은 안구내 투여용으로 제형된다.

일 구현예에서, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 본원에서 제공된 방법을 사용하여 단리된 혈장-유도된 단백질 조성물을 제형하여 제조된다. 일반적으로, 제형된 조성물에 대해 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2, 가장 바람직하게는 적어도 3, 바이러스 불활성화 또는 제거 단계가 수행될 것이다. 본원에서 제공된 방법과 함께 이용될 수 있는 바이러스 불활성화 또는 제거 단계의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 용매 세제 처리 (Horowitz 등, Blood Coagul fibrinogenolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 및 Kreil 등, Transfusion 2003 (43):1023-1028, 이 둘 모두는 그 전체가 다목적으로 참고로 분명히 본원에 편입되어 있다), 나노여과 (Hamamoto 등, Vox Sang 1989 (56)230-236 및 Yuasa 등, J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, 이 둘 모두는 그 전체가 다목적으로 참고로 분명히 본원에 편입되어 있다), 및 낮은 pH 인큐베이션 고온에서 (Kempf 등, Transfusion 1991 (31)423-427 및 Louie 등, Biologicals 1994 (22):13-19). 어떤 구현예에서, 본 조성물은 혈장-유도된 단백질을 포함하고, 이 단백질은 면역글로불린 (Ig), 알부민, 알파-1-항트립신 (A1PI), 부티릴콜린에스테라아제, 인자 H, 보체 시스템의 단백질, 및 인터-알파-트립신 억제제 (IαI) 단백질로부터 선택된다.

일 구현예에서, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 정맥내, 피하, 근육내, 및/또는 안구내 투여에 적당한 1 이상 완충제 또는 pH 안정제를 포함할 것이다. 본원에서 제공된 혈장-유도된 단백질 조성물을 제형하는데 적당한 완충제의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 글리신, 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 글루타메이트, 타르트레이트, 벤조에이트, 락테이트, 히스티딘 또는 다른 아미노산, 글루코네이트, 말레이트, 석시네이트, 포르메이트, 프로피오네이트, 카보네이트, 또는 적절한 pH로 조정된 이들의 임의 조합. 일반적으로, 완충제는 연장된 기간 동안 제형에서 적당한 pH를 유지하는데 충분할 것이다. 바람직한 구현예에서, 완충제는 글리신이다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 혈장-유도된 단백질을 포함하고, 이 단백질은 면역글로불린 (Ig), 알부민, 알파-1-항트립신 (A1PI), 부티릴콜린에스테라아제, 인자 H, 보체 시스템의 단백질, 및 인터-알파-트립신 억제제 (IαI) 단백질로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 임의로 추가로, 조성물의 몰삼투압을 조정하기 위한 제제롤 포함할 수 있다. 몰삼투압 제제의 비-제한적인 예는 만니톨, 소르비톨, 글리세롤, 수크로오스, 글루코오스, 덱스트로오스, 레불로오스, 푸룩토오스, 락토오스, 폴리에틸렌 글리콜, 포스페이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 염화칼슘, 칼슘 글루코노글루코헵토네이트, 디메틸 설폰, 등을 포함한다.

전형적으로, 본원에서 제공된 제형은 생리적 몰삼투압, 약 285 내지 295 mOsmol/kg과 비교할만한 몰삼투압을 가질 것이다 (Lacy 등, Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999:1254. 어떤 구현예에서, 제형의 몰삼투압은 약 200 mOsmol/kg 내지 약 350 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 240 내지 약 300 mOsmol/kg일 것이다. 특별한 구현예에서, 제형의 몰삼투압은 약 200 mOsmol/kg, 또는 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 또는 350 mOsmol/kg일 것이다.

본원에서 제공된 혈장-유도된 제형은 연장된 기간 동안 액체 형태에서 일반적으로 안정하다. 어떤 구현예에서, 본 제형은 적어도 약 3 개월 동안 실온에서, 또는 적어도 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개월 동안 실온에서 안정하다. 제형은 또한 일반적으로, 6 또는 적어도 약 18 개월 동안 냉장 조건 하에서 (전형적으로 약 2℃ 내지 약 8℃), 또는 적어도 약 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 또는 45 개월 동안 냉장 조건 하에서 안정할 것이다.

VII . 치료 방법

일 측면에서, 본 발명은 치료적으로 효과적인 용량의, 본원에서 제공된 방법에 따라 제조된 혈장-유도된 단백질을 투여하여, 필요로 하는 대상체에서 혈액 단백질 결핍 또는 기능장애와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 혈장-유도된 단백질을 포함하고, 이 단백질은 면역글로불린 (Ig), 알부민, 알파-1-항트립신 (A1PI), 부티릴콜린에스테라아제, 인자 H, 보체 시스템의 단백질, 및 인터-알파-트립신 억제제 (IαI) 단백질로부터 선택된다.

일 측면에서, 본 발명은 혈액 단백질 결핍 또는 기능장애와 연관된 병태의 치료에서 사용하기 위한 약제의 제조에서의, 본원에서 제공된 방법에 따라 제조된 혈장-유도된 단백질 조성물의 용도를 제공한다. 어떤 구현예에서, 혈장-유도된 단백질은 면역글로불린 (Ig), 알부민, 알파-1-항트립신 (A1PI), 부티릴콜린에스테라아제, 인자 H, 보체 시스템의 단백질, 및 인터-알파-트립신 억제제 (IαI) 단백질로부터 선택된다.

일 구현예에서, 혈장-유도된 단백질 조성물은 하기의 단계를 포함하는 방법으로 제조된다: 제 1 침전 단계에서 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 Cohn 풀로부터 공-침전시켜, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계; 상기 제 1 침전물을 현탁시켜 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 면역글로불린을 상기 제 1 서스펜션으로부터 가용화하여 면역글로불린을 포함하는 서스펜션의 가용성 부분 및 A1PI, 피브리노겐, 인자 H, 및 IaIp을 포함하는 서스펜션의 불용성 부분을 형성하는 단계; 및 상기 서스펜션의 가용성 부분을 상기 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 혈장-유도된 단백질을 포함하고, 이 단백질은 면역글로불린 (Ig), 알부민, 알파-1-항트립신 (A1PI), 부티릴콜린에스테라아제, 인자 H, 보체 시스템의 단백질, 및 인터-알파-트립신 억제제 (IαI) 단백질로부터 선택된다.

VIII . 실시예

실시예 1 - NG2 C91

면역글로불린 G (IgG) 조성물은 일련의 침전 반응을 통해 혈장을 분획화함으로써 상업적으로 제조된다. 공통적인 방법론에서, 불순물들은 제 1 알코올 침전 단계에서 면역글로불린-함유 동결 결핍성 혈장으로부터 침전된다. 그리고 나서, 상기 수득한 상청액으로부터 IgG 면역글로불린이 침전되고 차후에 추가 농축된다. 알코올 분획화 동안 인간 혈장으로부터 회수된 IgG의 수율을 증가시키기 위한 시도로, 5.5 내지 7.0의 pH 값 및 20% 내지 25%의 에탄올 농도가 IgG 침전 반응에서 시험되었다.

요약하면, pH 7.2±0.2에서 동결 결핍성 혈장에 8% (v/v)의 최종 농도로 에탄올을 첨가하고, 상기 혼합물을 0℃에서 배양하고, 상청액 (분획 I 상청액)으로부터 상기 형성된 침전물(분획 I)을 분리함으로써, 혈장-유래 면역글로불린 G (IgG), 알파-1-항트립신 (A1PI), 및 알부민 제품의 상업적 제조에 사용되는 중간체인 분획 I 상청액이 형성되었다. 그리고 나서, 수득한 분획 I 상청액을 600 g 샘플로 분주하였다. 하기 표 9에서 보고된 바와 같이 각 샘플의 pH를 5.5 내지 7.0로 조정하고 에탄올을 20% 내지 25%의 최종 농도로 혼합하였다.

표 9에서 보고된 바와 같이, 전통적 Cohn 분획 II+III 침전물 (25% 에탄올; pH 6.8) 및 GAMMAGARD LIQUID ^® (Baxter International; Deerfield, IL)의 제조에 사용된 변형된 분획 II+III 침전물을 제조하는데 사용된 것과 유사한 조건들은, 불완전한 침전으로 인해, 상청액 내의 총 IgG의 2.9% 및 6.7%의 손실을 야기한다. 그러나, 반응의 pH를 6.0 이하로 감소시키고 적어도 22.5%의 최종 에탄올 농도를 사용함으로써, IgG 손실이 유의하게 감소되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, pH 5.5에서 22.5% 알코올의 사용은 상청액 내에서 총 IgG의 단지 0.4%의 손실을 야기하였다. 유사하게, pH 6.0 또는 5.5에서 25% 알코올의 사용은 상청액 내에서 총 IgG의 단지 0.5% 및 0.1%의 손실을 야기하였다. 표 10에서 보고된 바와 같이, 이것은 전통적 및 변형된 분획 II+III 침전물과 비교하여, 침전물 내에서 혈장 L당 각각 300 mg 및 125 mg이 넘는 IgG 증가에 해당한다.

표 9. 출발 물질 (분획 I 상청액)의 단백질 함량의 퍼센트로서 표시된, 침전 상청액 내 단백질 수율.

표 10. g/L 혈장으로서 표시된, 침전 상청액 내의 단백질 수율.

실시예 2 - NG2 C96

실시예 1에서 개괄된 바와 같이, 낮은 pH (5.5), 높은 에탄올 (25%) 침전을 이용하여 IgG 회수를 더 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 초기 8% 에탄올 침전을 이용/이용하지 않고 수행된 IgG 정제 도식의 실험 비교를 착수하였다.

요약하면, 100 kg의 동결 결핍성 혈장을 pH 7.4 및 0℃에서 8% (v/v) 최종 농도 에탄올을 이용하여 수행되는 초기 침전 단계 (분획 I)로 처리하거나(NG2C96/1) 처리하지 않았다(NG2C96/2). 동결 결핍성 혈장 (NG2C96/1) 또는 분획 I 상청액 (NG2C96/2)의 pH를 pH 5.5±0.1로 조정하고 에탄올을 25% (v/v)의 최종 농도로 혼합하였다. 그리고 나서, 상기 혼합물을 -5±2℃에서 5시간 동안 배양하여 단백질을 침전시켰다. 수득한 침전물 (침전물 (I)+II+III) 및 상청액 (상청액 (I)+II+III)을 원심분리에 의해 분리하였다. 침전 반응의 크기로 인해, 각 반응에 대해 두 번의 원심분리가 필요하였다. 각 원심분리로부터의 수득한 침전물을 별도로 가공하였다.

상기 침전물을 15부 완충제 당 1부 침전물의 비율로 5 mM 모노소디움 포스페이트, 5 mM 소디움 아세테이트, 및 600 mg/L 빙초산을 함유하는 완충제에 현탁시키고, pH를 4.8±0.2로 조정하고, 4℃ 및 8℃ 사이에서 2시간 동안 교반하여 단백질을 추출하였다. 추출 배양 후, 침전물 (I)+II+III의 kg 당 40 g의 발연 실리카 (SiO₂)를 상기 반응에 혼합하고, 4℃ 및 8℃에서 50분간 교반하였다. 그리고 나서, 침전물 (I)+II+III의 kg당 400 g Cellpure 필터 에이드를 혼합화고, 상기 반응을 Cuno 50SA 막을 통해 여과하여 불용성 물질을 제거하여, (I)+II+III 여과물 및 필터케이크를 형성하였다. 상기 필터케이크를 5 mM 모노소디움 포스페이트, 5 mM 소디움 아세테이트, 및 150 mg/L 빙초산을 함유하는 완충제로 세정하고, 그 여과물을 (I)+II+III 여과물에 첨가하였다.

상기 여과물에 폴리소르베이트 80을 0.2% (w/w)의 최종 농도로 첨가하고 상기 용액을 30분간 배양하였다. 그리고 나서, 상기 용액에 소디움 시트레이트 디히드레이트를 0.8% (w/w)의 최종 농도로 첨가하고 상기 용액을 추가 30분간 배양하였다. 2차 배양 후, 수산화나트륨을 이용하여 용액의 pH를 7.0으로 조정하고, 에탄올을 25%의 최종 농도로 혼합하였다 침전을 위해 온도를 0℃ 및 -10℃ 사이로 낮췄다. 침전물 (PptG) 및 상청액 (PptG 상청액)을 원심분리에 의해 분리하였다.

정제 반응의 각 하부-단계의 IgG, IgA, 및 IgM 면역글로불린 함량을 결정하였다. 표 11에 나타난 바와 같이, 초기 분획 I 침전 단계의 제거는 최종 조성물에서 IgG의 유의하게 더 큰 수율을 야기하였다 (PptG 용해된 NG2C96/2 (분획 I 침전 없음)를 NG2C96/1 (분획 I 침전 이용)와 비교). 마찬가지로, 용해된 PptG 분획의 IgA (표 12) 및 IgM (표 13) 함량은 초기 분획 I 침전 단계 없이 형성되었다.

현저히, 분획 I 침전 단계는 면역글로불린-함유 조성물로부터 피브리노겐을 제거하기 위해 일부 사용된다. 초기 분획 I 침전 단계 없이 형성된 용해된 PptG 분획의 최종 피브리노겐 함량이 초기 분획 I 침전 단계를 이용하여 형성된 PptG 분획의 함량보다 대략 6배 더 크긴 하지만, 분획화 도식은 동결 결핍성 형장 출발 물질에서 존재하는 피브로니겐을 99% 넘게 제거한다 (표 14).

표 11. 초기 8% 에탄올 분획 I 침전 단계를 이용한 그리고 이용하지 않은 낮은 pH, 고급 알코올 침전 반응을 이용한 혈장의 분획화 동안 형성된 다양한 분획들의 IgG 함량(g/L 출발 혈장으로서 표현됨).

표 12. 초기 8% 에탄올 분획 I 침전 단계를 이용하고 및 이용하지 않은 낮은 pH, 고급 알코올 침전 반응을 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 다양한 분획의 IgA 함량(g/L 출발 혈장으로서 표현됨).

표 13. 초기 8% 에탄올 분획 I 침전 단계를 이용한 그리고 이용하지 않은 낮은 pH, 고급 알코올 침전 반응을 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 다양한 분획의 IgM 함량(g/L 출발 혈장으로서 표시됨).

표 14. 초기 8% 에탄올 분획 I 침전 단계를 이용한 및 이용하지 않은 낮은 pH, 고급 알코올 침전 반응을 이용한 혈장의 분획화 동안 형성된 다양한 분획의 피브리노겐 함량(g/L 출발 혈장으로서 표현됨).

실시예 3 - NG2 C99

전통적 업스트림 Cohn-Oncley 및 Kistler-Nitschmann 알코올 분획 단계 (즉, Cohn 분획 I 및 II; Cohn 분획 I 및 II+III; 또는 Kistler Nitschmann 8-10% 에탄올, 침전물 A, 및 침전물 B)를 대신에 낮은 pH, 고급 알코올 침전을 이용하는 것을 추가 탐색하기 위하여, NG2C96/2 및 NG2C96/2B PptG 침전물을 조합하고, IgG 면역글로불린을 추가 농축하였다.

요약하면, 조합된 NG2C96/2 및 NG2C96/2B PptG 침전물을 아세트산으로 pH 4.75±0.75 및 염화나트륨으로 4.5±1.5 mS/cm의 전도도로 조정된 주사용 물(WFI)에 현탁시켰다. 필터 에이드를 첨가하고, 상기 현탁액을 Cuno VR06 막을 통해 여과시켜 정화된 PptG 여과물 (VR06)을 형성시켰다. 그리고 나서, 상기 정화된 여과물을 표준 절차에 따라 용매 및 세제로 처리 (S/D 처리)하였다.

상기 S/D 처리된 여과물을 10 mM 나트륨 아세테이트 (pH 5.0)를 함유하는 완충액으로 평형화된 CM 세파로오스 칼럼에 로딩하고 상기 유동 (CM D/N)을 수집하였다. 그리고 나서, 상기 칼럼을 10 mM 나트륨 아세테이트 (pH 5.5)를 함유하는 완충제로 세정하고 세정물 (CM W)을 수집하였다. 55 mM 모노소디움 포스페이트 및 10 mM 트리스 (pH 8.5)를 함유하는 용출 완충액을 이용하여 칼럼으로부터 면역글로불린을 용출시켰다. 상기 용출액을 세 분획으로 수집하였다: 100 mAU 미만의 OD₂₈₀을 갖는 용출액의 제1 부분을 포함하는 분획 1 (CM E-VL); 용출 피크의 앞부분 가장자리에 100 mAU를 초과하는 OD₂₈₀ 및 용출 피크의 뒤쪽 가장자리에 400 mAU를 초과하는 OD280을 갖는 용출액의 피크를 포함하는 분획 2 (CM E); 및 400 mAU 미만의 OD280을 갖는 피크의 뒤쪽 면에 용출액의 부분을 포함하는 분획 3 (CM E-NL).

분획 2 용출액의 pH 및 전도도를 각각 빙초산 및 주사용 물(WFI)을 이용하여 6.4 및 2.3 mS/cm로 조정하였다. 그리고 나서, 분획 2 용출액을 100 mg 단백질/mL 수지의 로드 농도로 15 mM 모노소디움 포스페이트 (pH 6.4)를 함유하는 완충액으로 평형화된 ANX 세파로오스 패스트 플로우 음이온 교환 수지 상에 로딩하였다. 대부분의 IgG를 함유하는 음이온 교환 유체를 수집하였다 (ANX D/N). 음이온 교환 수지에 결합하는 단백질을 2 M 염화나트륨 (ANX 2M NaCl)을 함유하는 용액을 이용하여 컬럼으로부터 용출시켰다.

상기 음이온 교환 유체 분획에 글리신을 첨가하고 상기 샘플을 5%의 단백질 농도가 달성될 때까지 0.25 M 글리신을 함유하는 용액에 대해 Pellicon^® 2 Mini (Millipore)를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UF/DF)하였다. 상기 면역글로불린 용액을 10%의 최종 단백질 농도로 추가 농축하였고 pH를 4.5 (디아-농축물)로 조정하였다. 그리고 나서, 10% 면역글로불린 용액을 Millipak 20 (밀리포어)를 이용하여 멸균 여과시켜 최종 면역글로불린 조성물 (최종 용기)을 형성시켰다.

정제 반응의 각 하부-단계를 위한 생화학적 프로파일을 결정하였다 (표 15 및 표 16). 데이터에 나타난 바와 같이, 최종 조성물은 약제학적 투여를 위한 허용가능한 파라미터 내에서, 단지 낮은 수준의 비-IgG 단백질을 함유하였다.

표 15. 초기 8% 에탄올 분획 I 침전 단계 없이 낮은 pH, 고급 알코올 침전 반응을 이용하여 혈장 분획화 동안 형성된 다양한 분획의 생화학적 특성규명.

표 16. 초기 8% 에탄올 분획 I 침전 단계 없이 낮은 pH, 고급 알코올 침전 반응을 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 다양한 분획의 추가 생화학적 특성규명.

실시예 4 - NG2 C100

피브리노겐을 제거하는 초기 낮은 알코올 침전 단계 없이 낮은 pH, 고급 알코올 침전의 사용을 평가하기 위해, 공정에 대해 1쌍의 변형과 더불어, 실시예 2 및 3에서 샘플 NG2C96/2에 대해 기술된 대로 200 kg의 동결 결핍성 혈장을 분획화하고 농축하였다. 첫 번째로, 낮은 pH, 고급 알코올 침전 단계 (I-IV1 침전)를 pH 5.5보다 pH 5.1에서 25% 에탄올 이용하여 수행하였다. 두 번째로, 현탁된 I-IV1 침전물을 40 g SiO₂/kg 침전물보다 33 g의 발연 실리카 (SiO₂)/kg 침전물 I-IV1로 처리하였다. 세 번째로, CM 양이온 교환 용출액을 100 mg/mL ANX 수지보다 150 mg 단백질/mL ANX 수지의 농도로 ANX 음이온 교환 수지 상에 로딩하였다. 마지막으로, Cuno VR06 여과된 음이온 교환 유체를 PLANOVA^® 35N (Asahi Kasei Medical Co., Ltd.; Tokyo, Japan)을 통과시켜 한외여과/정용여과에 앞서 나노여과 단계를 수행하였다.

정제의 각 단계의 IgG 함량을 결정하였고 그 결과가 표 17에 제공되어 있다. GAMMAGARD LIQUID^® 제조 공정에 대한 평균 IgG 수율과 비교하여 (3.7 g IgG/L 공급원 혈장), 본 실시예에 사용된 정제 방법은 4.4 g IgG/L 공급원 혈장의 유의하게 더 높은 수율을 야기한다. 이것은 거의 20%의 IgG 수율 증가에 해당한다. 최종 IgG 조성물의 생화학적 특성규명이 표 10에 보고되어 있다. 표에 나타난 바와 같이, 최종 IgG 조성물은 99%보다 큰 순도를 가지며 IgG 단량체/이량체 함량이 99.8%보다 크다. 최종 용기는 단지 미량의 불순물을 함유하며, 이 수준은 규제 표준 범위 내이다.

표 17. 초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전 단계를 이용하여 동결 결핍성 혈장으로부터 농축 동안 형성된 분획들의 IgG 함량.

표 18. 초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전 단계를 이용하여 200 L의 동결 결핍성 혈장으로부터 농축된 최종 IgG 조성물의 생화학적 특성규명.

실시예 5 - P02910NG2

100 g 단백질/mL ANX 수지 및 150 g 단백질/mL ANX 수지의 부하 농도로 ANX 음이온 교환 칼럼에 CM 양이온 교환 용출액을 통과시키는 효과를 비교하기 위해, 200 L의 동결 결핍성 혈장을 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25%) 침전 단계를 통해 분획화하고 가공하여 실시예 2 및 3에서 샘플 NG2C96/2에 대해 기술된 바와 같이 PptG 침전물을 형성시켰다. 형성된 업스트림 분획의 IgG, IgA, 및 IgM 함량을 결정하고 표 19, 표 20, 및 표 21에 각각 보고되어 있다보고되어 있다.

수득한 PptG 침전물을 2개의 1.8 kg 샘플로 나누었고, 이를 하나의 샘플을 100 mg 단백질/mL ANX 수지 (P03010NG2)의 부하 농도로 ANX 음이온 교환 수지를 통과시키고, 다른 것은 150 mg 단백질/mL ANX 수지 (P03110NG2)의 부하 농도로 ANX 음이온 교환 수지를 통과시키는 것을 제외하고, 실시예 2 및 3에서 샘플 NG2C96/2에 대해 기재된 바와 같이 최종 용기로 농축시켰다.

정제의 각 다운스트림 농축 단계의 IgG 함량을 결정하고 그 결과가 표 22 및 표 23에 제공되어 있다. GAMMAGARD LIQUID^® 제조 공정에 대한 평균 IgG 수율과 비교하여 (3.7 g IgG/L 공급원 혈장), 본 실시예에 사용된 정제 방법은 4.3 g IgG/L 공급원 혈장의 유의하게 더 높은 수율을 야기한다. 이것은 16%의 IgG 수율 증가에 해당한다. 최종 IgG 조성물의 생화학적 특성규명이 표 16 및 표 17에 보고되어 있다. 표에 나타난 바와 같이, 최종 IgG 조성물은 99%보다 큰 순도를 가지며 IgG 단량체/이량체 함량은 99.8%보다 더 크다. 최종 용기는 단지 미량의 불순물을 함유하며, 이 수준은 규제 표준 범위 내이다.

표 19. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25% 에탄올) 침전 반응을 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 IgG 함량.

표 20. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25% 에탄올) 침전 반응을 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 IgA 함량.

표 21. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25% 에탄올) 침전 반응을 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 IgM 함량.

표 22. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25% 에탄올) 침전 반응을 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 다운스트림 분획의 IgG 함량, 및 100 mg/mL ANX 수지 (P03010NG2)의 ANX 음이온 교환 부하 농도.

표 23. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25% 에탄올) 침전 반응을 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 다운스트림 분획의 IgG 함량, 및 150 mg/mL ANX 수지 (P03110NG2)의 ANX 음이온 교환 부하 농도.

표 24. 벌크 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25% 에탄올) 침전 반응을 이용하여 동결 결핍성 혈장으로부터 농축된 최종 IgG 조성물의 생화학적 특성규명, 및 100 mg/mL ANX 수지 (P03010NG2)의 ANX 음이온 교환 부하 농도.

표 25. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25% 에탄올) 침전 반응을 이용하여 동결 결핍성 혈장으로부터 농축된 최종 IgG 조성물의 생화학적 특성규명, 및 150 mg/mL ANX 수지 (P03110NG2)의 ANX 음이온 교환 부하 농도.

실시예 6 - NG2C107B

IgG 면역글로불린의 제조에 사용된 낮은 pH, 고급 알코올 침전물의 불용성 부분으로부터 알파-1-항트립신 (A1PI)을 추출하는 실현가능성을 조사하였다. 요약하면, 추출된 분획 I-IV-1 침전물의 여과 동안 형성된 불용성 필터케이크의 2개의 500 kg 샘플 (#1 및 #3)을 7±2℃에서 2.8부 물 (w/w)에 먼저 현탁시키고 샘플의 pH를 5.5±0.1로 조정하였다. 상기 현탁액을 CUNO 10CP 막을 통해 여과시켜, 여과물 (1.여과물) 및 제 2 필터케이크를 형성시켰다. 그리고 나서, 제2 필터케이크를 5부 물 (w/w)에 현탁시키고, 현탁액의 온도를 17±2℃로 조정하고, 샘플의 pH를 8.8±0.2로 조정한 다음, 온도 및 pH를 유지시키면서 8시간 동안 교반하여 불용성 물질로부터 A1PI를 추출하였다.

배양 후, 상기 샘플에 현탁액 kg 당 10 mmol 트리스 및 150 mmol 염화나트륨을 첨가하고, pH를 8.0±0.1로 조정하였다. 샘플에 현탁액 kg 당 176 g의 PEG 3350을 첨가하여, 17±2℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 상기 현탁액을 여과하여 추출된 A1PI를 함유하는 상청액 (2.여과물)으로부터 불용성 물질을 제거하였다.

그리고 나서, 0.35 g 염화아연/kg 여과물 (2.5 mM ZnCl; 샘플 #1) 또는 0.54 g/kg 염화아연/kg 여과물 (4.0 mM ZnCl; 샘플 #3)을 첨가하고, pH를 7.5±0.2로 조정하고, 샘플을 7±2℃에서 3시간 동안 배양함으로써 제2 여과물로부터 조질 A1PI를 침전시켰다. 염화아연 침전물을 원심분리에 의해 회수하였다 (ZnCl₂ cent). 50 mM 소디움 EDTA를 이용하여 염화아연 침전물로부터 A1PI를 추출하였다 (Zn-EDTA-conz).

농축 공정에서 각 단계에 대해 A1PI (a1A) 함량 및 활성을 결정하였고, 이것이 표 26에 나타나 있다. 약 400 mg의 활성 A1PI/L 공급원 혈장을 EDTA 추출 단계에서 회수하였다. 주목할만하게도, A1PI가 38±2℃ 및 약 9.2의 pH에서 추출될 때, 공급원 혈장 L당 대략 600 mg의 활성 A1PI가 회수되었다.

표 26. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25% 에탄올) 침전 반응, 및 아연 침전을 이용한 혈장의 분획화 동안 형성된 다운스크림 분획의 알파-1-항트립신 함량.

실시예 7 - P03410NG2A 및 B

동결 결핍성 혈장의 낮은 pH, 고급 알코올 침전으로부터 IgG의 회수에 미치는 pH의 효과를 조사하였다. 요약하면, 흡착에 의해 인자 IX, 인자 VII, 및 항트롬빈 III (ATIII)을 제거하기 위해 처리된 100 L의 동결 결핍성 혈장을 5.4 (샘플 A; P03410NG2A) 또는 5.6 (샘플 B; P03410NG2B)의 pH에서 25% 에탄올을 이용한 침전에 의해 분획화하였다. 그리고 나서, 40 g/kg 침전물보다, 50 g SiO₂/kg 침전물 I-IV-1을 침전물 I-IV-1 현탁액과 혼합하는 것을 제외하고, 실시예 2에 기재된 대로 샘플을 가공하여 침전물 G 침전물 (PptG 침전물) 및 상청액 (PptG 상청액)을 형성시켰다.

형성된 분획의 IgG, IgA, 및 IgM 함량을 결정화였고 이것은 각각 표 27, 표 28, 및 표 29에보고되어 있다. 주목할만하게도, pH 5.4 (93.8%) 또는 pH 5.6 (88.8%)에서 초기 침전이 수행될 때 공급원 혈장의 IgG 함량 중 약 90%가 분획 I-IV-1 CUNO 여과물에서 회수된다. 유사하게, 공급원 혈장의 거의 모든 IgA 및 IgM 함량은 분획 I-IV-1 현탁액에서 회수된다.

표 27. 낮은 pH (A = 5.4; B = 5.6), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 IgG 함량.

표 28. 낮은 pH (A = 5.4; B = 5.6), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 IgA 함량.

표 29. 낮은 pH (A = 5.4; B = 5.6), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 IgM 함량.

분획화 도식를 더 규명하기 위해, 피브리노겐 (표 30), A1PI (표 31), 알파-2-매크로글로불린 (표 32), 알부민 (표 33), 트랜스페린 (표 34), 및 C3 (표 35의 함량을 다양한 업스트림 분획에 대해 결정하였다.

표 30. 낮은 pH (A = 5.4; B = 5.6), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림의 피브리노겐 함량.

표 31. 낮은 pH (A = 5.4; B = 5.6), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 알파-1-항트립신 함량.

표 32. 낮은 pH (A = 5.4; B = 5.6), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 알파-2-매크로글로불린 함량.

표 33. 낮은 pH (A = 5.4; B = 5.6), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 알부민 함량.

표 34. 낮은 pH (A = 5.4; B = 5.6), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 트랜스페린 함량.

표 35. 낮은 pH (A = 5.4; B = 5.6), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 보체 성분 3 (C3) 함량.

실시예 8 - P03510NG2 및 P03610NG2

초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전 단계를 이용하여 형성된 PptG 침전물의 다운스크림 처리 동안 100 g 단백질/mL ANX 수지 및 150 g 단백질/mL ANX 수지의 부하 농도로 ANX 음이온 교환 칼럼에 CM 양이온 교환 용출액을 통과시키는 효과를 추가 조사하였다. 요약하면, 2 kg의 P03410NG2A PptG 침전물을 실시예 4에 기술된 대로 처리하였고, 제1 샘플 (P03510NG2)을 157 mg 단백질/mL ANX 수지의 농도로 ANX 음이온 교환 수지 상에 로딩하였고 제2 샘플 (P03610NG2)을 106 mg 단백질/mL ANX 수지의 농도로 ANX 음이온 교환 수지 상에 로딩하였다.

정제의 각 다운스트림 단계의 IgG 함량을 결정하였고 그 결과가 표 22 및 표 23에 제공되어 있다. GAMMAGARD LIQUID^® 제조 공정에 대한 평균 IgG 수율과 비교하여 (3.7 g IgG/L 공급원 혈장), 본 실시예에 사용된 정제 방법은 공급원 혈장 L당 4.72 g IgG 및 4.67 g IgG의 유의하게 더 높은 수율을 야기한다. 이것은 25%가 넘는 IgG 수율 증가에 해당한다. 최종 IgG 조성물의 생화학적 특성규명이 표 38 및 표 39에 보고되어 있다. 표에 나타난 바와 같이, 최종 IgG 조성물은 99%보다 큰 순도를 가지고 IgG 단량체/이량체 함량은 99.8%보다 크다. 최종 용기는 단지 미량의 불순물을 함유하며, 이 수준은 규제 표준 범위 내이다.

표 36. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 IgG 함량 및 157 mg/mL ANX 수지 (P03510NG2)의 음이온 교환 부하 농도.

표 37. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 혈장의 분획화 동안 형성된 업스트림 분획의 IgG 함량 및 106 mg/mL ANX 수지 (P03610NG2)의 음이온 교환 부하 농도.

표 38. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 동결 결핍성 혈장으로부터 농축된 최종 IgG 조성물의 생화학적 특성규명 및 157 mg/mL ANX 수지 (P03510NG2)의 음이온 교환 부하 농도.

표 39. 초기 낮은 pH (5.4), 고급 알코올 (25%) 초기 침전 단계를 이용하여 동결 결핍성 혈장으로부터 농축된 최종 IgG 조성물의 생화학적 특성규명 및 106 mg/mL ANX 수지 (P03610NG2)의 음이온 교환 부하 농도.

실시예 9 - 분획화 생성물의 추가 특성규명

초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전을 포함하는 정제 방법을 이용하여 달성된 면역글로불린 G 수율 및 순도를 전통적 Cohn 침전 I 및 침전 II+III 중간체를 이용하여 달성된 것과 비교하였다.

초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전을 이용한 세 가지 대규모 IgG 정제 - 실시예 5 ("P03010NG2")에 기재된 바와 같은 롯트 3010; 실시예 8 ("P03610NG2")에 기재된 바와 같은 롯트 3610; 및 롯트 3010 및 3610과 유사하게 제조된 세 번째 롯트 1111의 수율 및 순도를, 2010년에 단일 제조 공장에서 제조된 GAMMAGARD LIQUID (10% 면역 글로불린 주입 (인간), Baxter International)에 대한 평균 수율과 비교하였다. GAMMAGARD LIQUID 정제 공정은 GAMMAGARD LIQUID 공정이 초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전보다 Cohn 분획 I 및 Cohn 분획 II+III 중간체를 통해 진행되는 점을 제외하면, 롯트 3010, 3610, 및 1111을 제조하는데 사용된 공정들과 실질적으로 유사하였다. 실험 롯트의 제조 동안 형성되고 GAMMAGARD LIQUID에 대해 평균을 매긴 침전물 G 생성물의 특성규명이 표 40에서 보는 바와 같이.

표 40. 초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전 단계를 통해 진행되는 실험 IgG 롯트 3010, 3610, 및 1111의 제조 동안 형성되고, Cohn 분획 I 및 II+III 침전 단계를 통해 진행되며, 2010년에 단일 제조 공장으로서 GAMMAGARD LIQUID 제조에 대해 평균을 매긴 침전물 G (Ppt G) 중간체의 생화학적 특성규명.

표 40에서 보는 바와 같이, 초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전 단계의 사용은 Cohn 분획 I 및 II+III 침전 단계를 통해 진행되는 GAMMAGARD LIQUID 정제 방법과 비교하여 침전물 G 중간 단계에서 IgG 회수의 유의한 증가를 야기하였다 (초기 고급 알코올, 낮은 pH 침전 단계에 대해 88.9-96.6% IgG 회수 대 Cohn 분획 I 및 II+III 침전 단계에 대해 82.9%).

실험 롯트 3010, 3610, 및 1111에서 형성된 IgG 침전물 G 중간체들은, 이들 중간체들의 피브리노겐 함량이 여전히 GAMMAGARD LIQUID 제조에서 관찰된 값들의 범위 내에 있음에도 불구하고, 더 높은 수준의 보체 성분 3 (C3) 및 피브리노겐에 의해 입증된 바와 같이, 평균 GAMMAGARD LIQUID 침전물 G 중간체보다 약간 더 낮은 순도를 갖는다. 그러나, 실험 롯트가 전술한 바와 같이 더 가공될때, 최종 IgG 생성물은 표 41에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 제조 설명서를 충족시켰다.

표 41. 초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전 단계를 통해 진행되는, 실험 롯트 3010, 3610, 및 1111에 대한 최종 모아진 인간 IgG 조성물의 생화학적 특성규명.

실시예 10 - 알부민 조성물의 특성규명

본원에 기재된 새로운 면역글로불린 G 제조 공정 (예를 들면, 초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전 단계를 통해 진행되는 것)이 혈장 단백질 부산물의 제조를 뒷받침할 수 있다는 것을 추가 입증하기 위해, 낮은 pH, 고급 알코올 상청액으로부터 알부민을 정제하였다.

Cohn 분획 IV-1 및 IV-4 상청액으로부터 알부민을 정제하는 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 전형적으로, Cohn 분획 IV-1 및 IV-4 상청액은 Cohn 분획 I 및 Cohn 분획 II+III 침전과 같이, 중간체 알코올 침전 단계를 통해 진행되는 공정에서 형성된다. 본 실시예에서, 분획 IV-1 상청액 대신에 초기 낮은 pH, 고급 알코올 침전으로부터의 상청액을 사용한 것을 제외하고, 표준 방법에 따라 알부민을 제조하였다. 표 42에 나타난 바와 같이, 낮은 pH, 고급 알코올 상청액으로부터의 정제는 고수율의 알부민 (18.92 g/L 혈장)을 야기하였고, 이는 시험된 모든 품질관리 요건을 만족하였다.

표 42. 전술한 바와 같이, 대규모 낮은 pH, 고급 알코올 침전 상청액으로부터 제조된 알부민 조성물의 생화학적 특성규명.

본원에 기재된 실시예 및 구현예들은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당해분야의 숙련가에게 제안될 것이고 이것은 본원의 사상 및 영역과 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 원에 참조로 통합되어 있다.

Claims (61)

1. Cohn 풀로부터 풍부한 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법으로서,
   (a) 5.0 내지 6.0의 pH에서 20% 내지 30% (v/v)의 최종 농도로 Cohn 풀에 에탄올을 부가함에 의한 제 1 침전 단계에서, 면역글로불린 및 알파-1-항트립신 (A1PI)을 Cohn 풀로부터 공-침전시켜 침전된 A1PI 및 침전된 면역글로불린을 포함하는 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계 - 상기 제 1 침전물은 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 85%를 함유 -;
   (b) 상기 제 1 상청액으로부터 상기 제 1 침전물을 분리하는 단계;
   (c) 상기 제 1 침전물에서 면역글로불린을 용해시켜, 용해된 면역글로불린을 포함하는 가용성 부분 및 불용해된 A1PI을 포함하는 불용성 부분을 갖는 제 1 서스펜션을 형성하는 단계; 및
   (d) 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하여 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계를 포함하고,
   상기 Cohn 풀은 단계 (a) 이전에는 에탄올과 접촉하지 않는 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 에탄올의 최종 농도는 25±4% 인 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 에탄올의 최종 농도는 25±3% 인 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 에탄올의 최종 농도는 25±2% 인 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 에탄올의 최종 농도는 25±1%인 방법.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 에탄올의 최종 농도는 25% 인 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 pH는 5.5 인 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 pH는 5.5±0.4 인 방법.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 pH는 5.5±0.3 인 방법.
10. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 pH는 5.5±0.2인 방법.
11. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 pH는 5.5±0.1인 방법.
12. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 pH는 제 1 침전 단계의 지속시간 동안에 유지되는 방법.
13. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 알코올 침전 단계는 확산 부가에 의한 알코올의 부가를 포함하는 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 확산 부가는 분무를 포함하는 방법.
15. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 알코올 침전 단계는 임펠러에 인접한 부위에서 알코올의 부가를 포함하는 방법.
16. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 침전 단계는 -3℃ 내지 -10℃의 온도에서 수행되는 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 상기 제 1 침전 단계는 -5℃ 내지 -9℃의 온도에서 수행되는 방법.
18. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 침전물은 4 L 내지 60 L의 완충제 / kg 침전물로 현탁되는 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 제 1 침전물은 8 L 내지 15 L의 완충제 / kg 침전물로 현탁되는 방법.
20. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 서스펜션은 4.0 내지 5.4의 pH를 갖는 방법.
21. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 서스펜션은 4.7 내지 5.1의 pH를 갖는 방법.
22. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 서스펜션은 0 mS/cm 내지 4 mS/cm의 전도도를 갖는 방법.
23. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 서스펜션은 0.5 mS/cm 내지 2 mS/cm의 전도도를 갖는 방법.
24. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 침전물은 아세테이트 및/또는 포스페이트를 포함하는 완충제에서 현탁되는 방법.
25. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분은 원심분리 또는 여과에 의해 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리되는 방법.
26. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 서스펜션의 가용성 부분을 상기 제 1 서스펜션의 불용성 부분으로부터 분리하는 단계는
    (i) 미분된 이산화규소 (SiO₂)을 상기 제 1 서스펜션과 혼합하여 처리된 서스펜션을 형성하는 단계; 및
    (ii) 상기 SiO₂을 상기 처리된 서스펜션으로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법.
27. 청구항 26에 있어서, 상기 미분된 이산화규소 (SiO₂)는 350 m²/g 내지 410 m²/g의 평균 표면적을 갖는 방법.
28. 청구항 26에 있어서, 상기 미분된 이산화규소 (SiO₂)는 15 g/kg 제 1 침전물 내지 80 g/kg 제 1 침전물의 최종 농도에서 상기 제 1 서스펜션에 부가되는 방법.
29. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서,
    (a) 5.3 내지 5.7의 pH 및 -6℃ 내지 -8℃의 온도에서 24% 내지 26%의 최종 농도로 Cohn 풀에 에탄올을 부가함에 의한 제 1 침전 단계에서, 면역글로불린 및 A1PI를 Cohn 풀로부터 공-침전시켜 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 형성하는 단계;
    (b) 상기 제 1 상청액으로부터 상기 제 1 침전물을 분리하는 단계;
    (c) 상기 분리된 제 1 침전물에서 면역글로불린을 용해시켜, 용해된 면역글로불린을 포함하는 가용성 부분 및 불용해된 A1PI을 포함하는 불용성 부분을 갖는 제 1 서스펜션을 형성하는 단계;
    (d) 상기 제 1 서스펜션을 미분된 이산화규소 (SiO₂)로 처리하여 처리된 서스펜션을 형성하는 단계; 및
    (e) 상기 처리된 서스펜션의 가용성 분획을 상기 처리된 서스펜션의 불용성 분획으로부터 분리하여, 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
30. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 풍부한 면역글로불린 조성물은 단계 (a)에서 사용된 Cohn 풀에서 존재하는 적어도 하나의 면역글로불린 부류의 면역글로불린 함량의 적어도 90%를 함유하는 방법.
31. 청구항 30에 있어서, 상기 풍부한 면역글로불린 조성물은 단계 (a)에서 사용된 Cohn 풀에서 존재하는 적어도 하나의 면역글로불린 부류의 면역글로불린 함량의 적어도 95%를 함유하는 방법.
32. 청구항 30에 있어서, 상기 면역글로불린 부류는 IgG인 방법.
33. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 추가로,
    (f) 제 2 침전 단계에서 면역글로불린을 상기 풍부한 면역글로불린 조성물로부터 침전시켜, 제 2 침전물 및 제 2 상청액을 얻는 단계;
    (g) 상기 제 2 침전물을 현탁시켜 면역글로불린을 포함하는 가용성 부분 및 불용성 부분을 갖는 제 2 서스펜션을 형성하는 단계; 및
    (h) 상기 제 2 서스펜션의 가용성 분획을 회수하여, 추가의 풍부한 면역글로불린 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
34. 청구항 33에 있어서, 상기 제 2 침전 단계는 알코올 침전 단계인 방법.
35. 청구항 34에 있어서, 상기 알코올 침전 단계는 상기 풍부한 면역글로불린 조성물에, 6.5 내지 7.5의 pH에서 22% 내지 28% 에탄올의 최종 농도로 에탄올을 부가하는 것을 포함하는 방법.
36. 청구항 34에 있어서, 상기 알코올 침전 단계는 확산 부가에 의한 알코올의 부가를 포함하는 방법.
37. 청구항 36에 있어서, 상기 확산 부가는 분무를 포함하는 방법.
38. 청구항 34에 있어서, 상기 알코올 침전 단계는 임펠러에 인접한 부위에서 알코올의 부가를 포함하는 방법.
39. 청구항 34에 있어서, 상기 제 2 침전 단계는 -3℃ 내지 -10℃의 온도에서 수행되는 방법.
40. 청구항 34에 있어서, 상기 풍부한 면역글로불린 조성물은 단계 (a)에서 사용된 Cohn 풀에 존재하는 면역글로불린 G 함량의 적어도 90%를 함유하는 방법.
41. 청구항 40에 있어서, 상기 풍부한 면역글로불린 조성물은 단계 (a)에서 사용된 Cohn 풀에 존재하는 면역글로불린 G 함량의 적어도 95%를 함유하는 방법.
42. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 추가로, 양이온 교환 크로마토그래피 풍부함 단계를 포함하는 방법.
43. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 추가로, 음이온 교환 크로마토그래피 풍부함 단계를 포함하는 방법.
44. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 추가로, 바이러스 불활성화 및/또는 제거 단계를 포함하는 방법.
45. 청구항 44에 있어서, 상기 방법은 용매/세제 (S/D) 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 방법.
46. 청구항 44에 있어서, 상기 방법은 나노여과 단계를 포함하는 방법.
47. 청구항 44에 있어서, 상기 방법은 4.0 내지 5.0의 pH 및 20℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 1 주 동안 상기 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
48. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 풍부한 면역글로불린 조성물에서 면역글로불린을 추가로 풍부하게 하는 단계를 포함하여, 적어도 98% IgG를 포함하는 최종 풍부한 IgG 조성물을 형성하는 방법.
49. 청구항 48에 있어서, 최종 풍부한 IgG 조성물은 적어도 99% IgG를 포함하는 방법.
50. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 4 g의 IgG / 단계 (a)에서 사용된 Cohn 풀의 L를 산출하는 방법.
51. 청구항 50에 있어서, 상기 방법은 적어도 4.25 g의 IgG / 단계 (a)에서 사용된 Cohn 풀의 L을 산출하는 방법.
52. 청구항 50에 있어서, 상기 방법은 적어도 4.5 g의 IgG / 단계 (a)에서 사용된 Cohn 풀의 L을 산출하는 방법.
53. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 알파-1-항트립신 (A1PI)은 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 추가로 정제되는 방법.
54. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 피브리노겐은 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 추가로 정제되는 방법.
55. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 인자 H는 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 추가로 정제되는 방법.
56. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 인터-알파-트립신 억제제 단백질 (IαIp)은 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획으로부터 추가로 정제되는 방법.
57. 청구항 53에 있어서, 상기 제 1 서스펜션의 불용성 분획은 미분된 이산화규소 (SiO₂)로 처리되는 방법.
58. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 알부민은 제 1 상청액으로부터 추가로 정제되는 방법.
59. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 Cohn 풀은 냉동 결핍성 혈장인 방법.
60. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 침전물은 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 90%를 함유하는 방법.
61. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제 1 침전물은 Cohn 풀의 A1PI 함량의 적어도 95%를 함유하는 방법.

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