CN102459331B - 生产用于皮下使用的高度浓缩的免疫球蛋白制品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于由汇集的血浆制备用于皮下注射的高度浓缩的免疫球蛋白组合物的新的改进的方法。还描述了一种包含20％以上免疫球蛋白的组合物，适合于皮下使用。

Description

生产用于皮下使用的高度浓缩的免疫球蛋白制品的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年5月27日申请的美国临时申请No.61/181,606的优先权，明确地将其全部内容并入本文以供参考以用于所有目的。

背景技术

来自人血浆的免疫球蛋白产品首先在1952年被使用，来治疗免疫缺陷。最初，IgG的肌内或者皮下给药是选择的方法。然而，为了注射为有效治疗多种疾病所必需的大量IgG，人们开发了具有较低浓度IgG(50mg/mL)的静脉内给药产品。静脉内免疫球蛋白(IVIG)通常含有来自超过一千个血液供体的血浆的汇集的免疫球蛋白G(IgG)型免疫球蛋白。IVIG典型地含有超过95％未修饰的IgG，其具有完整的Fc依赖性效应子功能、以及仅为痕量的免疫球蛋白A(IgA)或者免疫球蛋白M(IgM)，IVIG被灭菌，提纯的IgG产品主要用于治疗如下三个主要类型的医学适应症：1.免疫缺陷，比如X-连锁无丙种球蛋白血症、低丙种球蛋白血症(原发性免疫缺陷)、以及获得性损害免疫状况(继发性免疫缺陷)，特征是低抗体水平；2.炎症性疾病和自身免疫疾病；以及3.急性感染。

许多IVIG商品供应商提供了多种IVIG产品。与先前的在再溶解之后溶液中仅含有50mg/mL蛋白质的冷冻干燥IVIG产品相比，最近开发的产品是含有100mg/mL即用型灭菌的、高度提纯和浓缩的人IgG抗体的液体制品。因为IgG产品比如IVIG是用汇集的人血浆制造的，所以来自供体血液的病菌(尤其是可在人身上引起多种疾病的已知病毒)污染是生产工艺中的严重问题。在IgG产品中另一个重要的考虑项目是它们、尤其是作为即用型制品在储存期间的稳定性。与IVIG相比，皮下给药的免疫球蛋白制品在家庭护理治疗可行性和较小副作用方面占优势。为了减少每位点小注射体积的缺点，更高浓度的IgG(例如，含有200mg/mL而不是100mg/mL)将具有明显优势。

在一系列发表的关于血清和血浆蛋白制备方法和特性的重要论文的第四期中，Cohn等(J.Am.Chem.Soc.，1946，68(3)：459-475)首次描述了一种用于醇分级分离血浆蛋白的方法(方法6)，该方法允许用于分离来自人血浆的富含IgG的组分。几年之后，Oncley等(J.Am.Chem.Soc.，1949，71(2)：541-550)发展了Cohn方法，公开了一种可导致分离出更纯的IgG制品的方法(方法9)。

这些方法虽然为整个血浆来源血液因子工业奠定了基础，但不能提供出具有足够高浓度的IgG制品来用于治疗数种与免疫相关的疾病，包括川崎综合症、免疫性血小板减少性紫癜、以及原发性免疫缺陷。这种情况下，人们使用多种技术比如离子交换层析开发出附加的方法来提供更高纯度和更高浓度的IgG剂型。Hoppe等(Munch MedWochenschr 1967(34)：1749-1752)和Falksveden(瑞典专利No.348942)、以及Falksveden和Lundblad(Methods of Plasma Protein Fractionation(血浆蛋白质分级分离方法)1980)首先使用离子交换层析法用于该目的。

多种现代方法采用沉淀步骤，比如与柱层析相结合的辛酸盐沉淀法(Lebing etal.，Vox Sang 2003(84)：193-201)和Cohn组分(I+)II+III乙醇沉淀法(Tanaka et al.，Braz JMed Biol Res 2000(33)37-30)。最近，Teschner等(Vox Sang，2007(92)：42-55)描述了一种生产10％IVIG产品的方法，其中首先从汇集的血浆中除去冷冻沉淀物，然后进行改进的Cohn-Oncley冷乙醇分级分离，接着进行中间体的S/D处理、离子交换层析、纳滤、以及任选的超滤/渗滤。

然而，尽管通过这些IgG生产方法可得到提高的纯度、安全、以及产率，但仍然需要适用于皮下和/或肌内给药的高度浓缩的IgG制品。本发明可满足这些其他的需要，并且描述了制造具有高浓度IgG的稳定的、高度提纯的、病毒灭活的、即用型的产品的方法。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种含水组合物，其每升组合物包含超过大约180克的蛋白质，并且至少95％的蛋白质是IgG比如人IgG。在一些实施方式中，该组合物是通过用于获得适用于皮下和静脉内给药的产品的方法制造的，并且能够在最终容器中在升高的温度下进行处理，以使病毒灭活，而其浓度可在10至22％蛋白质的范围之间任意调节。在某些情况下，在组合物中的蛋白质浓度为20％(w/v)或者大约20％(w/v)。在其他情况下，组合物可以进一步包含大约0.1-0.3M的甘氨酸。本发明的组合物的pH可以变化，比如大约3-6、或大约4-6。

在另一个方面，本发明提供一种用于由血浆制备浓缩IgG的组合物的方法，改进之处包括下述步骤：(1)通过超滤，将血浆制品中的蛋白质浓缩至5％(w/v)或者大约5％(w/v)；以及(2)通过渗滤，将制品中的蛋白质进一步浓缩为20％(w/v)或者大约20％(w/v)。组合物中至少95％的蛋白质指的是IgG，比如人IgG。在一些实施方式中，通过使用标称截止分子量(NMWCO)为100kDa以下的超滤膜进行步骤(1)。在其他实施方式中，相对于pH 4.2±0.1的甘氨酸渗滤缓冲液进行步骤(2)。在一些情况中，渗滤缓冲液具有0.25M的甘氨酸和pH 4.0。在一些特定的实施方式中，在步骤(2)之后的蛋白质浓度高于20％(w/v)，并且随后用渗滤缓冲液调节为20％(w/v)或者大约20％(w/v)。

在另一个方面，本发明提供了一种用于由血浆制备浓缩IgG的组合物的方法，其包括下述步骤：

(1)通过离心，从血浆中分离出液体和沉淀物；

(2)将预冷的乙醇与来自步骤(1)的液体混合，从而形成混合物，其乙醇浓度为8％(v/v)或者大约8％(v/v)；

(3)通过离心，从来自步骤(2)的混合物中分离出液体和沉淀物；

(4)将来自步骤(3)的液体的pH和乙醇浓度分别调节为7.0或者大约7.0和20-25％(v/v)或者大约20-25％(v/v)，借此形成混合物；

(5)通过离心，从来自步骤(4)的混合物中分离出液体和沉淀物；

(6)将来自步骤(5)的沉淀物用缓冲液以1比15或者大约1比15的重量比再悬浮，从而形成悬浮液；

(7)将二氧化硅(SiO₂)与来自步骤(6)的悬浮液相混合，并通过过滤得到滤液；

(8)将洗涤剂和冷的醇与来自步骤(7)的滤液相混和，并通过离心得到沉淀物；

(9)将沉淀物溶解于含有溶剂或者洗涤剂的水溶液中，并保持溶液至少60分钟；

(10)在步骤(9)之后，使溶液通过阳离子交换层析柱，并且将吸附在柱子上的蛋白质洗脱于洗脱液中；

(11)使来自步骤(10)的洗脱液通过阴离子交换层析柱，产生流出液；

(12)使流出液通过纳滤器，产生纳滤滤液；

(13)使纳滤滤液通过超滤膜，产生超滤液；

(14)相对于渗滤缓冲液对超滤液进行渗滤，产生蛋白质浓度为20％(w/v)或者大约20％(w/v)的溶液；以及

(15)通过使溶液通过0.2μm以下的过滤器进行过滤，来对来自步骤(14)的溶液进行灭菌，借此得到浓缩IgG的组合物。

在一些实施方式中，步骤(2)在大约-2至0℃的温度下进行；或者步骤(2)的混合物被混合至少15分钟，然后在大约-2至0℃的温度下保持至少2小时。在一些实施方式中，步骤(4)被混合至少15分钟，然后在-7℃或者大约-7℃的温度下保持至少8小时。在一些实施方式中，步骤(6)的悬浮液在2℃至8℃的温度和5.0或者大约5.0的pH下被搅拌大约40-160分钟；或者步骤(7)中二氧化硅的浓度为40g/kg步骤(6)的悬浮液，并且在大约2-8℃的温度下进行混合至少大约50分钟。在一些实施方式中，步骤(8)在大约-5至-10℃的温度下进行。在一些实施方式中，步骤(9)的溶液包含1.0％(v/v)的TRITON X-100、0.3％(v/v)的吐温-80、以及0.3％(v/v)的磷酸三(正丁)酯(TNBP)。在一些实施方式中，步骤(9)的溶液在大约18至25℃的温度下被保持。在一些实施方式中，步骤(10)的阳离子交换层析柱用pH 5.5±0.1的10mM醋酸缓冲溶液洗涤，并且用35mM磷酸二氢钠、10mM Tris、pH 8.5±0.1、导电率5.0±0.2mS/cm的缓冲液洗脱。在一些实施方式中，在步骤(11)之前，来自步骤(10)的洗脱液被调节至pH为6.4±0.2、导电率为约1.5至2.5mS/cm。在一些实施方式中，在步骤(12)之前，使步骤(11)的流出液穿过孔径为0.2μm或更小的过滤器。在一些实施方式中，步骤(13)的超滤液的蛋白质浓度为5±1％(w/v)或者大约5±1％(w/v)。在其他实施方式中，步骤(13)的超滤膜具有50kDa以下的标称截止分子量(NMWCO)。在一些实施方式中，步骤(14)的渗滤缓冲液是pH为4.2±0.1的0.25M甘氨酸溶液。在其他实施方式中，来自步骤(14)的溶液的蛋白质浓度大于20％(w/v)，并且随后被用渗滤缓冲液调节至20.4±0.4％(w/v)或者大约20.4±0.4％(w/v)。在一些实施方式中，步骤(13)和(14)是在大约2至8℃的温度下进行。在其他实施方式中，制备方法还包括如下步骤：在容器被密封之前，在灭菌条件下，将步骤(15)的灭菌溶液分配入容器中。

在其他的实施方式中，如上所述方法可以进一步包含如下步骤：在大约30至32℃下将密封后的容器储存大约21至22天；或者该方法可以进一步包含配制步骤，从而使20％IgG产品与含量为10％的现有技术静脉内剂型一样稳定。

在另一个方面，本发明提供一种通过如上所述制备方法生产的含水组合物，并且包含至少18％(w/v)的免疫球蛋白，例如至少20％(w/v)的免疫球蛋白。

在另一个方面，本发明提供一种用于治疗罹患免疫缺陷、自身免疫病、或急性感染的病人的方法，包括将有效量的如上所述组合物给药于病人。

附图说明

图1是新的超滤/渗滤体系的图解说明。

定义

术语“抗体”指的是基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽、或者其片段，其可特异性地结合并识别分析物(抗原)。被识别的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、Δ、ε和μ恒定区基因，以及种种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为κ或者λ类。重链被分为γ、μ、α、Δ、或ε类，它们依次分别限定免疫球蛋白类为IgG、IgM、IgA、IgD、以及IgE。

一个示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每个配对都具有一个“轻链”(大约25kD)和一个“重链”(大约50-70kD)。每个链的N-端限定一个可变区，该可变区包含主要决定着抗原识别的约100至110个以上氨基酸。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指的是这些轻链和重链。

术语“超滤(UF)”包括多种膜滤方法，其中朝向半透膜向液体施加流体静压力。悬浮的固体和高分子量溶解物被保留，而水和低分子量溶解物则穿过滤膜。该分离过程经常被用于提纯和浓缩大分子(10³-10⁶Da)溶液，尤其是蛋白质溶液。许多超滤膜是可利用的，取决于它们要保留的分子的尺寸。超滤典型的特征在于滤膜孔径大小在1和1000kDa之间，工作压力在0.01和10bar之间，并且对于将胶体比如蛋白质与小分子比如蔗糖和盐分离开来特别有用。

可使用与超滤一样的滤膜进行术语“渗滤”，后者是切向流(tangential flow)过滤。在渗滤期间，缓冲液被导入再循环罐，同时滤液被从单元操作中移去。在产品存在于滞留物中(例如IgG)的工艺中，渗滤从产品汇集液中洗出组分进入滤液，借此交换缓冲液并降低不期望有的物质种类的浓度。

在此使用的用语“大约”表示从给定值加或减10％的近似范围。例如，用语“大约20％”包括18-22％的范围。

术语“混合”描述了一种通过任何形式搅拌以引起两种以上不同的化合物或者物质在溶液或者悬浮液中相等分布的行为。在本申请中使用的术语“混合”的结果并不需要所有组分在溶液或者悬浮液中完全相等的分布。

在本申请中，术语“溶剂”包括任何能够溶解或者分散一种以上其他物质的液体物质。溶剂可以是性质上无机的溶剂，比如水；或者可以是有机液体，比如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。在此使用的术语“溶剂洗涤剂处理”中，溶剂表示有机溶剂(例如磷酸三丁酯)，其是用于灭活溶液中脂质包膜病毒的溶剂洗涤剂混合物的一部分。

在本申请中使用的术语“洗涤剂”可与术语“表面活性剂”或者“表面活性试剂”互换。表面活性剂典型地是有机化合物，其是两亲性的，即，同时含有疏水基团(“尾部”)和亲水基团(“头部”)，它们使得表面活性剂可溶于有机溶剂和水。表面活性剂能够通过其头部存在的形式上带电基团被分类。非离子型表面活性剂在其头部没有电荷基团，而离子型表面活性剂在其头部携带有净电荷。两性离子表面活性剂含有具有两个相反带电基团的头部。普通表面活性剂的一些实施例包括：阴离子型(以硫酸根、磺酸根或者羧酸根阴离子为基础)：全氟辛酸盐(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、月桂烷硫酸铵、以及其他的烷基硫酸盐、月桂基醚硫酸钠(亦称月桂基乙醚硫酸钠、或SLES)、烷基苯磺酸盐；阳离子型(以季铵阳离子为基础)：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，亦称溴化十六烷基三甲铵)、以及其他的烷基三甲基铵盐、十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)、聚乙氧基化牛油脂肪胺类(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、氯化苄乙氧铵(BZT)；长链脂肪酸和它们的盐：包括辛酸盐、辛酸、庚酸盐、己酸、庚酸、壬酸、癸酸等；两性离子型(两性型)：十二基甜菜碱；椰油酰胺丙基甜菜碱；椰油两性甘氨酸酯(coco ampho glycinate)；非离子型：烷基聚环氧乙烷，烷基酚聚环氧乙烷，聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的共聚物(已知商品有Poloxamers或Poloxamines)，烷基多葡糖苷，包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷、脂肪醇(例如，鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨酸酯(吐温20、吐温80等)，TRITON洗涤剂、以及十二基二甲胺氧化物。

在此使用的术语“静脉内IgG”或者“IVIG”治疗一般是指通过静脉内、皮下、或肌内将IgG免疫球蛋白组合物给药于病人以便用于治疗许多适应症比如免疫缺陷、炎性疾病、以及自身免疫疾病的治疗方法。IgG免疫球蛋白典型是由血浆汇集并制备的。能够使用完整抗体或者片段。IgG免疫球蛋白能够被配制成较高的浓度(例如，大于10％)用于皮下给药，或者被配制呈用于肌内给药。这对于特异性IgG制品而言特别平常，其是以高于特异性抗原(例如，Rho D因子、百日咳毒素、破伤风毒素、肉毒杆菌毒素、狂犬病等)的平均滴度来制备。为便于论述，在本申请中，这些皮下或者肌内剂型的IgG组合物也被包含在术语“IVIG”中。

术语“治疗有效(的)量或剂量”或者“足够(的)量/有效(的)量或剂量”是指对给药对象产生效果的剂量。精确的剂量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域的技术人员通过使用已知的技术而确定(参见，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，Dosage Calculations(1999)；和Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第20版，2003，Gennaro编，Lippincott，Williams & Wilkins。在此将其公开内容全部并入本文以供参考以用于所有目的)。

具体实施方式

根据现代医学中的惯常实践，浓缩的免疫球蛋白(尤其是IgG)的灭菌制品被用于治疗归入三个主要种类的医学适应症：免疫缺陷、炎性疾病和自身免疫疾病、以及急性感染。一种通常使用的IgG产品--静脉内免疫球蛋白或者IVIG，被配制得例如以10％的浓度用于静脉内给药。浓缩的免疫球蛋白还可以被配制得例如以20％或者大约20％的浓度用于皮下或肌内给药。

在一个方面，本发明涉及一种新的和改进的方法，用于由汇集的血浆生产高度提纯并高度浓缩的免疫球蛋白组合物。与此前使用的IgG纯化和浓缩方法相比，本发明人合并了超滤和配制步骤，可得到更高的IgG浓度而没有造成显著的IgG损失，并且在最终的配方中保持低pH。典型地，该产品的蛋白质浓度为至少18％重量/体积(w/v)，其中大多数蛋白质(通常不少于95％)是IgG，并且pH在pH 3-6的范围内，这样便于病原体比如可能存在于血浆的病毒的灭活。由于本发明的产品的较高IgG浓度和因此减小的体积，它们适合于皮下和/或肌内给药。在一些实施方式中，IgG产品的粘度不大于18毫帕斯卡-秒(mPascal-second)，并且可以因此同样适合于静脉内给药。由于有可能将用于静脉内产品的质量属性与皮下用产品和肌内用产品所需要的高浓度相结合，所以简单的稀释也能够进行静脉内给药。本发明的IgG组合物的进一步优点是，它们在储存期间具有出色的稳定性。

在某些方面，本发明提供了用于制备高度浓缩的IgG制品的方法，该制品的最终蛋白质浓度为大于大约17％并且IgG纯度为至少大约95％。在特定的实施方式中，该制品具有延长的稳定性，并且被配制成用于静脉内、皮下、和/或肌内给药。

在另一个方面，本发明提供了根据在此提供的改进的制造方法而制备的药物组合物和IgG组合物配方。在特定的实施方式中，这些该组合物和配方可给出与目前市场上的其他IVIG组合物相比改进的特性。例如，在特定的实施方式中，在此提供的组合物和配方在延长的时间内是稳定的。在另一个实施方式中，在此提供的组合物和配方具有与目前市场上的其他IVIG组合物相比更高的IgG浓度。在其他的实施方式中，在此提供的组合物和配方具有更高的IgG浓度，并且在延长的时间内是稳定的。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗免疫缺陷、炎性疾病和自身免疫疾病、以及急性感染的方法，包括给药通过使用在此提供的改进方法制备的IgG组合物。

I.生产浓缩的、提纯的IgG制品

已经描述了包含完整抗体的IVIG组合物被用于治疗特定的自身免疫状况(参见，例如，美国专利公开US 2002/0114802、US 2003/0099635、以及US 2002/0098182)。在这些参考文献中公开的IVIG组合物包括多克隆抗体。

一般地，根据本发明的免疫球蛋白制品能够由任何合适的起始原料例如回收的血浆或者原料血浆来制备。在典型实例中，由健康的供体收集血液或血浆。通常，由与免疫球蛋白制品给药对象相同的种类的动物收集血液(典型地被称作“同源”免疫球蛋白)。可通过合适的工艺将免疫球蛋白从血液中分离出来，这些工艺比如是沉淀法(醇分级分离或者聚乙二醇分级分离)、层析法(离子交换层析、亲和层析法、免疫亲和层析法)，超速离心法、以及电泳制备法等(参见，例如，Cohn等，J.Am.Chem.Soc.，68：459-75(1946)；Oncley等，J.Am.Chem.Soc.，71：541-50(1949)；Barundern等，Vox Sang，7：157-74(1962)；Koblet等，Vox Sang，13：93-102(1967)；美国专利Nos.5,122,373和5,177,194；在此将它们的全部公开内容并入本文以供参考以用于所有目的)。

不同于如上所述的方法，在一个方面，本发明提供了利用缺少冷冻的(cryo-poor)起始原料制备浓缩的IgG组合物的方法。一般来讲，在此提供的方法同时利用改进的Cohn-Oncley醇分级分离步骤和离子交换层析来提供优良的IgG产率，同时保持与在目前市售商品IVIG制品中发现的相同的(未进行改进时的)质量。

在很多情况下，通过本领域技术人员熟知的醇分级分离和/或离子交换和亲和层析方法，由含有γ球蛋白的产品制备免疫球蛋白。通常使用纯化的Cohn组分II。起始Cohn组分II糊剂典型地为95％或者大约95％的IgG，并且由四个IgG亚型组成。这些不同的亚型大致以与在汇集的人血浆中发现的相同的比率存在于组分II中，所述亚型由所述人血浆中获得。组分II在配制成可给药的产品之前被进一步提纯。例如，能够将组分II糊剂溶于冷的提纯的酒精水溶液中，并且经由沉淀和过滤除去杂质。在最终过滤后，免疫球蛋白悬浮液能够进行透析或者渗滤(例如，使用标称分子量限制为小于或等于100,000道尔顿的超滤膜)来除去醇。该溶液能够被浓缩或者稀释，从而得到期望的蛋白质浓度，并且能够通过本领域技术人员熟知的技术被进一步纯化。

制备步骤能够被用于富集免疫球蛋白的特定同种型或者亚型。例如，蛋白质A、蛋白质G或者蛋白质H琼脂糖凝胶层析法能够被用于富集IgG、或者特定IgG亚型的免疫球蛋白混合物(一般可参见Harlow和Lane，Using Antibodies，冷泉港实验室出版社(1999)；Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体实验手册)，冷泉港实验室出版社(1988)；美国专利No.5,180,810)。

如同在下文进行的详细描述，通过具有与在生产IVIG的工艺中许多相同或者相似步骤的工艺，可生产本发明的高浓度IgG产品。具有特别设计的后洗涤和接近生产工艺结束时的配制的使用开放通道型膜(open channel membranes)的附加超滤/渗滤步骤，使得所得到的IgG组合物中蛋白质浓度与现有技术IVIG(例如GAMMAGARDLIQUID)相比要高大约两倍(200mg/mL)，且不影响产率和储存稳定性。大多数可商业购买的超滤膜不能够在没有较大蛋白质损失的情况下达到200mg/mL IgG的浓度。这些滤膜早期会被阻塞，并且因此难以实现充分的后洗涤。因此不得不使用开放通道型膜构造。即使具有开放通道型膜，也不得不使用特定设计的后洗涤工序，以用于在没有显著的蛋白质损失的情况下(损失小于2％)得到所需要的浓度。甚至更令人惊奇的事实是，较高的蛋白质浓度200mg/mL并不影响低pH储存步骤中的病毒灭活能力。生产高浓度IgG组合物的一般工艺包括如下步骤：

A.分离冷冻沉淀物

纯化工艺典型地从解冻此前被冷冻的汇集的血浆开始，该血浆已经进行过安全检查和质量考察。解冻典型地在不高于6℃的温度下进行。然后通常在与解冻时一样低的温度下，在血浆刚一解冻就于冷却下进行离心或过滤以便分离固体和液体。液体部分(也称作“缺少冷冻的血浆”，在通过离心或者过滤将冷不溶性蛋白从刚解冻血浆中除去以后得到)然后在下一步骤中被加工。在此时可以采用不同的附加步骤，用于分离因子VIII抑制剂旁路活性(FEIBA)、因子IX-复合物、因子VII-浓缩物、或者抗凝血酶III-复合物，在实施例1中有详细描述。

B.获得分级分离I的上清液

在这一步骤中，缺少冷冻的血浆典型地被冷却至0±1℃或者大约0±1℃，并且其pH被调节至7.0或者大约7.0。在特定的实施方式中，pH被调节至大约7.0和大约7.5之间、优选在7.1或者大约7.1与7.3或者大约7.3之间、最优选7.2或者大约7.2。在一种实施方式中，pH被调节至7.0或者大约7.0。在另一个实施方式中，pH被是调节至7.1或者大约7.1。在另一个实施方式中，pH被调节至7.2或者大约7.2。在另一个实施方式中，pH被是调节至7.3或者大约7.3。在另一个实施方式中，pH被是调节至7.4或者大约7.4。在另一个实施方式中，pH被是调节至7.5或者大约7.5。然后加入预冷的乙醇，同时搅拌血浆至乙醇为8％v/v的目标浓度。同时，温度被进一步降低至大约-4和大约0℃之间、优选大约-2℃，从而沉淀出污染物比如α₂-巨球蛋白、β_1A-球蛋白和β_1C-球蛋白、纤维蛋白原、以及因子VIII。典型地，沉淀步骤将包括保持至少大约1小时的时间，虽然可以采用较短的或者较长的保持时间。接着，然后通过离心、过滤、或者另一种合适的方法，收集理想地含有在缺少冷冻的血浆中存在的全部IgG含量的上清液(上清液I)。

C.分级分离II+III的沉淀物

为了进一步提高级分的IgG含量和纯度，对上清液I进行第二次沉淀步骤。一般来讲，溶液的pH被是调节至pH在大约6.8和大约7.2之间、优选7.0或者大约7.0。然后将醇类、优选乙醇加入至溶液中，同时搅拌至终浓度在大约20％和大约25％(v/v)之间。在一种实施方式中，醇的终浓度为20％或者大约20％。在另一个实施方式中，醇的终浓度为21％或者大约21％。在另一个实施方式中，醇的终浓度为22％或者大约22％。在另一个实施方式中，醇的终浓度为23％或者大约23％。在另一个实施方式中，醇的终浓度为24％或者大约24％。在另一个实施方式中，醇的终浓度为25％或者大约25％。液体部分，也称作组分II+III上清液，能够被进一步加工，以提取(凝血)因子V。来自该步骤的沉淀物在下一步骤中被进一步加工。在一种实施方式中，步骤B和C还可以一起进行。

D.从分级分离II和III沉淀物中提取

冷萃取缓冲液被用于以在15份萃取缓冲液中1份沉淀物的典型比率来再悬浮组分II+III沉淀物。一种示例性的萃取缓冲液含有5mM磷酸二氢钠和5mM醋酸盐，pH为4.5±0.2或者大约4.5±0.2，并且电导率为0.7-0.9mS/cm或者大约0.7-0.9mS/cm。在一种实施方式中，萃取缓冲液的电导率为0.7mS/cm或者大约0.7mS/cm。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的电导率为0.8mS/cm或者大约0.8mS/cm。在又一个实施方式中，萃取缓冲液的电导率为0.9mS/cm或者大约0.9mS/cm。该提取工艺在2-8℃或者大约2-8℃的温度下进行。

可以采用其他合适的再悬浮比率，例如从大约1∶8至大约1∶30、或者从大约1∶10至大约1∶20、或者从大约1∶12至大约1∶18、或者从大约1∶13至大约1∶17、或者从大约1∶14至大约1∶16。在特定的实施方式中，再悬浮比率可以为或者大约为1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25、1∶26、1∶27、1∶28、1∶29、1∶30、或者更高的比率。

用于提取II+III沉淀物的合适溶液一般具有在大约4.0和大约5.5之间的pH。在特定的实施方式中，溶液的pH在大约4.0和大约5.0之间。在另一个实施方式中，溶液的pH为大约4.5和大约5.0之间。在其他的实施方式中，萃取溶液的pH为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、或者5.5。在一种实施方式中，萃取缓冲液的pH为4.5或者大约4.5。在另一个实施方式中、萃取缓冲液的pH为4.6或者大约4.6。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的pH为4.7或者大约4.7。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的pH为4.8或者大约4.8。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的pH为4.9或者大约4.9。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的pH为5.0或者大约5.0。

萃取缓冲液将优选具有从大约0.5mS.cm^-1至大约2.0mS.cm^-1的电导率。例如，在特定的实施方式中，萃取缓冲液的电导率为0.5mS.cm^-1或者大约0.5mS.cm^-1，或者该电导率为或者大约为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、或大约2.0mS.cm^-1。本领域的普通技术人员应知道如何产生具有适当电导率的萃取缓冲液。

E.热解法二氧化硅处理和过滤

在一些实施方式中，将热解法二氧化硅(例如，Aerosil 380或等效物)加至来自最后步骤的悬浮液中，达到浓度为40g/kg悬浮液或者大约40g/kg悬浮液、或者相当于1.8g/升缺少冷冻的血浆。在大约2至8℃下发生混合至少50至70分钟。某些情况下，加入助滤剂(例如，购自World Minerals的Hyflo-Supper-Cel，使用浓度为0.5kg/kg悬浮液或者大约0.5kg/kg悬浮液)以便于随后的通过过滤进行液/固分离的步骤。萃取缓冲液被用于压滤的后洗涤。该过滤工序保持在大约2-8℃的温度。

F.沉淀物G的分级分离

然后在大约2℃至8℃温度下搅拌至少30分钟，将来自最后步骤的滤液与聚山梨酸酯-80混合至浓度为0.2％w/v或者大约0.2％w/v。然后在大约2℃至8℃温度下另外搅拌30分钟，将无水柠檬酸钠混合入溶液中，至浓度为8g/升或者大约8g/升。然后将溶液的pH调节至7.0±0.1或者大约7.0±0.1。在特定的实施方式中，用氢氧化钠或醋酸调节pH。然后将冷的醇加入溶液中，至浓度为25％v/v或者大约25％v/v，并且进行类似于Cohn II的沉淀步骤。

G.沉淀物G的悬浮

溶解来自最后步骤的沉淀物，并且用标称孔径为0.2μm的深度过滤器(例如，Cuno VR06过滤器或等效物)进行过滤，以得到清澈的滤液。在另一个实施方式中，溶解沉淀物，然后离心，以回收澄清的上清液。

H.溶剂和洗涤剂处理

来自最后步骤的滤液被用于溶剂/洗涤剂处理。典型的溶剂/洗涤剂处理混合物包含1.0％(v/v)的TRITON X-100、0.3％(v/v)的吐温-80、以及0.3％(v/v)的TNBP，并且该混合物被典型地在大约18℃至25℃的温度下保持至少60分钟。血浆来源组分的洗涤剂处理方法为本领域技术人员所熟知。一般来讲，任何标准的非离子型洗涤剂处理方法可以与在此提供的方法结合起来使用。

I.阳离子交换层析

为了进一步从S/D(溶剂/洗涤剂)处理的PptG(沉淀物G)滤液中纯化和浓缩IgG，可以使用阳离子交换和/或阴离子交换层析法。使用离子交换层析用于纯化和浓缩IgG的方法为本领域技术人员所熟知。例如，美国专利No.5,886,154描述了一种方法，其中组分II+III沉淀物在低pH(在大约3.8和4.5之间)下被萃取，接着使用辛酸来沉淀IgG，最后实施两个阴离子交换层析步骤。美国专利No.6,069,236描述了一种层析法IgG纯化流程图，根本不依赖于醇沉淀。PCT申请公开号WO 2005/073252描述了一种IgG纯化方法，其包括组分II+III沉淀物的提取、辛酸处理、PEG处理、以及单一阴离子交换层析步骤。美国专利No.7,186,410描述了一种IgG纯化方法，其包括提取组分I+II+III沉淀物或者组分II沉淀物两者之一、接着在碱性pH下进行单一阴离子交换步骤。美国专利No.7,553,938描述了一种方法，其包括提取组分I+II+III沉淀物或组分II+III沉淀物两者之一、辛酸盐处理、以及一个或两个阴离子交换层析步骤。美国专利No.6,093,324描述了一种纯化方法，其包括在大约6.0和大约6.6之间的pH下使用大孔阴离子交换树脂进行操作。美国专利No.6,835,379描述了一种纯化方法，其在没有醇分级分离的情况下依赖于阳离子交换层析。

在一种实施方式中，使含有来自最后步骤的蛋白质溶液的溶剂/洗涤剂然后经过阳离子交换柱，以除去溶剂和洗涤剂。在洗出SD试剂(溶剂洗涤剂)后，被吸附的蛋白质然后被用高pH洗脱缓冲液洗脱。在一种实施方式中，洗脱缓冲液的pH在大约7.5和大约9.5之间。在另一个实施方式中，洗脱缓冲液的pH在大约8.0和大约9.0之间。在一种优选的实施方式中，洗脱缓冲液的pH为8.5±0.1或者为大约8.5±0.1。

J.阴离子交换层析

来自最后步骤的洗脱液被调节至pH 6，并且被稀释至适当的电导率，用于下述平衡后的阴离子交换柱。收集在加样和洗涤期间的柱子流过液(flow-through)，用于进一步加工。

K.纳滤

为了进一步降低在此提供的IgG组合物的病毒载量，可以使用合适的纳滤装置对阴离子交换柱流出液进行纳滤。在特定的实施方式中，纳滤装置将具有在大约15nm和大约200nm之间的平均孔径。适合这一应用的纳滤器的例子包括，但不限于：DVD、DV 50、DV 20(Pall)、Viresolve NFP、Viresolve NFR(Millipore公司)、Planova 15N、20N、35N、以及75N(Planova)。在一个特定的实施方式中，纳滤器的平均孔径可以在大约15nm和大约72nm之间、或者在大约19nm和大约35nm之间、或者为或大约为15nm、19nm、35nm或72nm。在一种优选实施方式中，纳滤器的平均孔径为35nm或者大约35nm，比如Asahi PLANOVA 35N过滤器或其等效物。

L.超滤和渗滤

在纳滤之后，通过超滤将滤液进一步浓缩至蛋白质浓度为5±1％w/v。在一些实施例中，在具有开放通道筛(open channel screen)的盒中进行超滤，并且超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)为50kDa以下。

在一种实施方式中，纳滤滤液可以通过超滤被浓缩至蛋白质浓度在大约2％(w/v)和大约10％(w/v)之间。在特定的实施方式中，在具有开放通道筛的盒中进行超滤，并且超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)小于大约100kDa或低于大约90、80、70、60、50、40、30、或更小kDa。在一种优选的实施方式中，超滤膜的NMWCO不超过50kDa。

当超滤步骤完成后，浓缩物可以相对于适合于静脉内给药或肌内给药的溶液经由渗滤被进一步浓缩。在特定的实施方式中，渗滤溶液可以包含稳定剂和/或缓冲剂。在一种优选实施方式中，稳定和缓冲剂是适当浓度的甘氨酸，该浓度例如在大约0.20M和大约0.30M之间、或者在大约0.22M和大约0.28M之间、或者在大约0.24M和大约0.26mM之间，或者该浓度为或者大约为2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或者3.0。在优选的实施方式中，渗滤缓冲液含有0.25M或者大约0.25M的甘氨酸。

在一种优选的实施方式中，在完成超滤步骤后，浓缩物相对于低pH的0.25M甘氨酸溶液进行渗滤。典型地，最小的交换体积是6倍于原始浓缩物的体积，并且溶液被浓缩至蛋白质浓度超过20％w/v。在渗滤和浓缩工艺结束时，溶液的pH典型地是在4.4至4.9之间。

典型地，最小交换体积是至少大约3倍于原始浓缩物体积、或者至少大约4、5、6、7、8、9倍、或者更多倍于原始浓缩物体积。IgG溶液可以被浓缩至最终蛋白质浓度在大约5％和大约22％(w/v)之间、或者在大约10％和大约22％(w/v)之间、或者在大约15％和大约22％(w/v)之间、或者在大约18％和大约22％(w/v)之间、或者在大约20％和大约22％之间，或者被浓缩至最终蛋白质浓度为或者大约为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、或更高。在一种优选实施方式中，IgG溶液将被浓缩至最终蛋白质浓度在20％或者大约20％和大约22％或者22％之间。典型地，在浓缩过程结束时，溶液的pH是在大约4.6至5.1之间。

M.配制

在渗滤步骤完成后，溶液的蛋白质浓度被用渗滤缓冲液调节至终浓度在大约5％和大约20％(w/v)之间、或者在大约10％和大约20％(w/v)之间、或者在大约15％和大约20％(w/v)之间、或者在大约18％和大约20％(w/v)之间，或者被调节至终浓度为大约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。在一种优选实施方式中，溶液的最终蛋白质浓度在19％或者大约19％和21％之间或者大约21％。在一种优选实施方式中，在渗滤完成后，溶液的蛋白质浓度被用渗滤缓冲液调节至稍微高于20％w/v，例如，为20.4±04％w/v或者大约20.4±04％w/v。

N.进一步灭菌

配制的整体溶液通过首次经过具有0.2微米以下绝对孔径的膜滤器过滤而被进一步灭菌。然后溶液被无菌地分配入最终的容器中，进行适当的密封，取样用于测试。最后的步骤是在30至32℃下将密封的容器储存一段延长的时间例如21至22天。

II.浓缩的IgG组合物

在一个方面，本发明涉及通过在此提供的方法制备的含水的IgG组合物。一般来讲，通过在此描述的新颖方法制备的IgG组合物将具有较高的IgG含量和纯度。例如，在此提供的IgG组合物可以具有至少大约15％(w/v)的蛋白质浓度，并且IgG含量大于90％纯度。这些高纯度IgG组合物适合于治疗性给药，例如，用于皮下给药和/或肌内给药。在一种实施方式中，在此提供的IgG组合物适合于例如在给药之前通过稀释用于静脉内给药。在一种实施方式中，IgG的浓度为20％或者大约20％，并且用于皮下给药或者肌内给药。

在一种实施方式中，本发明提供一种通过包括下述步骤的方法制备的含水的IgG组合物：

(1)通过离心，从血浆中分离出液体和沉淀物；

(2)将预冷的乙醇与来自步骤(1)的液体混合，从而形成混合物，其乙醇浓度为8％(v/v)或者大约8％(v/v)；

(3)通过离心，从来自步骤(2)的混合物中分离出液体和沉淀物；

(4)将来自步骤(3)的液体的pH和乙醇浓度分别调节为7.0或者大约7.0、和20-25％(v/v)或者大约20-25％(v/v)，借此形成混合物；

(5)通过离心，从来自步骤(4)的混合物中分离出液体和沉淀物；

(6)将来自步骤(5)的沉淀物用缓冲液以大约1比15的重量比再悬浮，从而形成悬浮液；

(7)将二氧化硅(SiO₂)与来自步骤(6)的悬浮液相混合，并通过过滤得到滤液；

(8)将洗涤剂和冷的醇与来自步骤(7)的滤液相混和，并通过离心得到沉淀物；

(9)将沉淀物溶解于含有溶剂或者洗涤剂的水溶液中，并维持溶液至少60分钟；

(10)在步骤(9)之后，使溶液通过阳离子交换层析柱，并且将吸附在柱子上的蛋白质洗脱于洗脱液中；

(11)使来自步骤(10)的洗脱液通过阴离子交换层析柱，产生流出液；

(12)使流出液通过纳滤器，产生纳滤滤液；

(13)使纳滤滤液通过超滤膜，产生超滤液；

(14)相对于渗滤缓冲液，对超滤液进行渗滤，产生蛋白质浓度为20％(w/v)或者大约20％(w/v)的溶液；以及

(15)通过使来自步骤(14)的溶液经过0.2μm以下的过滤器过滤来对溶液进行灭菌，借此获得浓缩IgG的组合物。

在一种实施方式中，本发明提供的含水的IgG组合物所包含的蛋白质浓度在大约150g/L和大约250g/L之间。在特定的实施方式中，IgG组合物的蛋白质浓度是在大约175g/L和大约225g/L之间、或者在大约200g/L和大约225g/L之间、或者是这些范围内的任何合适浓度，例如浓度为或者大约为150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L、200g/L、205g/L、210g/L、215g/L、220g/L、225g/L、230g/L、235g/L、240g/L、245g/L、250g/L、或更高。在一种优选实施方式中，含水的IgG组合物包含的蛋白质浓度为200g/L或者大约200g/L。在尤其优选的实施方式中，含水的IgG组合物包含的蛋白质浓度为204g/L或者大约204g/L。

在此提供的方法允许IgG组合物制品具有非常高水平的纯度。例如，在一种实施方式中，在此提供的组合物中至少大约95％的总蛋白是IgG。在其他实施方式中，至少大约96％的蛋白质是IgG，或者组合物的总蛋白中至少大约97％、98％、99％、99.5％、或者更多是IgG。

类似地，在此提供的方法允许IgG组合物制品含有极低水平的污染剂。例如，在特定的实施方式中，IgG组合物只含有少于大约100mg/L的IgA。在其他实施方式中，IgG组合物含有少于大约50mg/L的IgA、优选少于大约35mg/L的IgA、最优选少于大约20mg/L的IgA。

III.药物组合物

在另一个方面，本发明提供包含通过在此提供的方法制备的纯化IgG的药物组合物和配方。一般来讲，通过在此描述的新颖方法所制备的药物组合物和配方将具有较高的IgG含量和纯度。例如，在此提供的药物组合物和配方可以具有至少大约15％(w/v)的蛋白质浓度，并且IgG含量大于90％纯度。这些高纯度IgG组合物适合于治疗性给药，例如，用于皮下给药和/或肌内给药。在一种实施方式中，在此提供的IgG组合物适合于例如在给药之前通过稀释用于静脉内给药。在一种实施方式中，IgG的浓度为20％或者大约20％，并且用于皮下给药或者肌内给药。

在一种实施方式中，通过配制含水的IgG组合物制备出在此提供的药物组合物，所述含水的IgG组合物是通过使用在此提供的方法所分离出来的。一般来讲，配制的组合物已经经受过至少一个、优选至少两个、最优选至少三个灭活或除去病毒的步骤。在此提供的方法中可以使用的病毒灭活或除去步骤的非限制性例子包括：溶剂洗涤剂处理(Horowitz et al.，Blood Coagul Fibrinolysis，1994(5期增补3)：S21-S28和Kreil et al.，Transfusion，2003(43)：1023-1028，在此明确地将这两个文献的全部内容并入本文以供参考以用于所有目的)、纳滤(Hamamoto et al.，Vox Sang，1989(56)230-236和Yuasa et al.，J Gen Virol.1991(72(pt 8))：2021-2024，在此明确地将这两篇文献的全部内容并入本文以供参考以用于所有目的)、以及高温下低pH温育(Kempf et al.，Transfusion.1991(31)423-427和Louie et al.，Biologicals.1994(22)：13-19)。

在特定的实施方式中，提供的药物配方具有在大约175g/L IgG和大约225g/LIgG之间的IgG含量。一般来讲，通过使用在此描述的方法从血浆中分离IgG组合物、浓缩组合物、以及在适合静脉内给药的溶液中配制浓缩物组合物，制备出这些IVIG配方。可以使用本领域的技术人员已知的任何合适的方法来浓缩IgG组合物。在一种实施方式中，组合物通过超滤/渗滤进行浓缩。在一些实施方式中，用于浓缩组合物的超滤装置将使用标称截止分子量(NMWCO)小于大约100kDa或低于大约90、80、70、60、50、40、30、或更小kDa的超滤膜。在一种优选的实施方式中，超滤膜的NMWCO不超过50kDa。可以通过使用本领域的技术人员已知的任何合适的技术来实现缓冲液交换。在一个特定的实施方式中，通过渗滤实现缓冲液交换。

在一个特定的实施方式中，提供IgG的药物组合物，其中，通过使用包括下述步骤的方法从血浆中纯化IgG组合物：

(1)通过离心，从血浆中分离出液体和沉淀物；

(2)将预冷的乙醇与来自步骤(1)的液体混合，从而形成混合物，其乙醇浓度为8％(v/v)或者大约8％(v/v)；

(3)通过离心，从来自步骤(2)的混合物中分离出液体和沉淀物；

(4)将来自步骤(3)的液体的pH和乙醇浓度分别调节为7.0或者大约7.0、和20-25％(v/v)或者大约20-25％(v/v)，借此形成混合物；

(5)通过离心，从来自步骤(4)的混合物中分离出液体和沉淀物；

(6)将来自步骤(5)的沉淀物用缓冲液以大约1比15的重量比再悬浮，从而形成悬浮液；

(7)将二氧化硅(SiO₂)与来自步骤(6)的悬浮液相混合，并通过过滤得到滤液；

(8)将洗涤剂和冷的醇与来自步骤(7)的滤液相混和，并通过离心得到沉淀物；

(9)将沉淀物溶解于含有溶剂或者洗涤剂的水溶液中，并维持溶液至少60分钟；

(10)在步骤(9)之后，使溶液通过阳离子交换层析柱，并且将吸附在柱子上的蛋白质洗脱于洗脱液中；

(11)使来自步骤(10)的洗脱液通过阴离子交换层析柱，产生流出液；

(12)使流出液通过纳滤器，产生纳滤滤液；

(13)使纳滤滤液通过超滤膜，产生超滤液；

(14)相对于渗滤缓冲液，对超滤液进行渗滤，产生蛋白质浓度为大约20％(w/v)的溶液；以及

(15)通过0.2μm以下的过滤器过滤来自步骤(14)的溶液来对该溶液进行灭菌，借此获得浓缩IgG的组合物。

在一种实施方式中，本发明提供的药物IgG组合物所包含的蛋白质浓度在大约150g/L和大约250g/L之间。在特定的实施方式中，IgG组合物的蛋白质浓度是在大约175g/L和大约225g/L之间、或者在大约200g/L和大约225g/L之间、或者是这些范围内的任何合适浓度，例如浓度为或者大约为150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L、200g/L、205g/L、210g/L、215g/L、220g/L、225g/L、230g/L、235g/L、240g/L、245g/L、250g/L、或更高。在一种优选实施方式中，含水的IgG组合物包含的蛋白质浓度为200g/L或者大约200g/L。在尤其优选的实施方式中，含水的IgG组合物包含的蛋白质浓度为204g/L或者大约204g/L。

在此提供的方法允许IgG药物组合物制品具有非常高水平的纯度。例如，在一种实施方式中，在此提供的组合物中至少大约95％的总蛋白是IgG。在其他实施方式中，至少大约96％的蛋白质是IgG，或者组合物的总蛋白中至少大约97％、98％、99％、99.5％、或者更多是IgG。

类似地，在此提供的方法允许IgG药物组合物制品含有极低水平的污染剂。例如，在特定的实施方式中，IgG组合物只含有少于大约100mg/L的IgA。在其他实施方式中，IgG组合物含有少于大约50mg/L的IgA、优选少于大约35mg/L的IgA、最优选少于大约20mg/L的IgA。

在此提供的药物组合物将典型地包含一种以上适合静脉内给药的缓冲剂或者pH稳定剂。适合于配制在此提供的IgG组合物的缓冲剂的非限制性例子包括甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、谷氨酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、组氨酸或者其他的氨基酸、葡糖酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐、丙酸盐、碳酸盐、或者它们的调节至适当pH的任何组合物。一般来讲，缓冲剂将在延长的时间内足以保持配方中合适的pH。在一种优选实施方式中，缓冲剂是甘氨酸。

在一些实施方式中，在配方中缓冲剂的浓度是在大约100mM和大约400mM之间、优选在大约150mM和大约350mM之间、更优选在大约150mM和大约300mM之间、最优选在大约175mM和大约225mM之间。在尤其优选的实施方式中，浓缩的IgG组合物将包含在大约150mM和大约250mM之间的甘氨酸、最优选大约200mM的甘氨酸。在另一种优选的实施方式中，浓缩的IgG组合物将含有250mM或者大约250mM的甘氨酸。

在特定的实施方式中，配方的pH将是在大约4.1和大约5.6之间、优选在大约4.4和大约5.3之间、最优选在大约4.6和大约5.1之间。在具体的实施方式中，配方的pH可以是大约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、或5.6。

在一些实施方式中，在此提供的药物组合物可以任选地进一步包含用于调节组合物摩尔渗透压浓度的试剂。摩尔渗透压浓度试剂的非限制性例子包括甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、蔗糖、葡萄糖、右旋糖、果糖、左旋糖、乳糖、聚乙二醇、磷酸盐、氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡糖酸葡庚糖酸钙(calcium gluconoglucoheptonate)、二甲基砜等。

典型地，在此提供的配方将具有与生理学摩尔渗透压浓度相当的摩尔渗透压浓度，大约为285至295mOsmol/kg(Lacy et al.，Drug Information Handbook-Lexi-Comp，1999：1254)。在特定的实施方式中，配方的摩尔渗透压浓度将是在大约200mOsmol/kg和大约350mOsmol/kg之间、优选在大约240和大约300mOsmol/kg之间。在具体的实施方式中，配方的摩尔渗透压浓度将是大约200mOsmol/kg、或者210mOsmol/kg、220mOsmol/kg、230mOsmol/kg、240mOsmol/kg、245mOsmol/kg、250mOsmol/kg、255mOsmol/kg、260mOsmol/kg、265mOsmol/kg、270mOsmol/kg、275mOsmol/kg、280mOsmol/kg、285mOsmol/kg、290mOsmol/kg、295mOsmol/kg、300mOsmol/kg、310mOsmol/kg、320mOsmol/kg、330mOsmol/kg、340mOsmol/kg、340mOsmol/kg、或者350mOsmol/kg。

在此提供的IgG配方一般呈液体形式，在延长的时间内是稳定的。在特定的实施方式中，在室温下配方可稳定至少大约3个月、或者在室温下可稳定至少大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个月。在冷藏条件下(典型地在大约2℃和大约8℃之间)该配方一般可稳定至少大约18个月，或者在冷藏条件下可稳定至少大约21、24、27、30、33、36、39、42或45个月。

IV.IgG制品的给药

根据现代医学中的惯常实践，浓缩的免疫球蛋白(尤其是IgG)的灭菌制品被用于治疗归入三个主要种类的医学适应症：免疫缺陷、炎性疾病和自身免疫疾病、以及急性感染。这些IgG制品还可以用于治疗多发性硬化(尤其复发-缓解型多发性硬化或RRMS)、阿尔茨海默氏病、以及帕金森氏症。本发明的纯化的IgG制品适合于这些目的，以及其他临床接受的IgG制品的用途。

FDA(美国食品与药物管理局)已经批准IVIG治疗多种适应症的用途，这些适应症包括：异源骨髓移植、慢性淋巴细胞性白血病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、小儿HIV、原发性免疫缺陷、川崎氏病、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、以及具有高抗体受体或者具有ABO不相容供体的肾移植。在特定的实施方式中，在此提供的IVIG组合物可用于治疗或处置这些疾病和适应症。

此外，用于IVIG的标示外使用通常被提供给病人用于治疗或处置多种适应症，例如：慢性疲劳综合症、顽固梭状芽孢杆菌结肠炎(clostridium difficile colitis)、皮肤肌炎和多肌炎、格雷夫氏眼病(Graves′ophthalmopathy)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barré)、肌肉萎缩、包含体肌炎、兰伯特-伊顿综合症(Lambert-Eaton syndrome)、红斑狼疮、多灶性运动神经病、多发性硬化(MS)、重症肌无力、新生儿同种免疫血小板减少症、细小病毒B19感染、天疱疮、输血后紫癜、肾移植排斥、自然流产/流产、僵硬人综合症(stiff person syndrome)、眼阵挛肌阵挛、成年危重病人的严重脓毒病和脓毒性休克、中毒性表皮坏死溶解、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、X-连锁无丙种球蛋白血症、以及低丙种球蛋白血症。在特定的实施方式中，在此提供的IVIG组合物可用于治疗或处置这些疾病和适应症。

最后，IVIG用于治疗或处置包括原发性免疫缺陷、RRMS、阿尔茨海默氏病、以及帕金森氏症在内的疾病的试验性应用已经被建议(参见美国专利申请公开No.2009/0148463，在此其全部内容并入本文以供参考以用于所有目的)。在特定的实施方式中，在此提供的IVIG组合物可用于治疗或处置原发性免疫缺陷、RRMS、阿尔茨海默氏病、或者帕金森氏症。在包含每天给药的特定实施方式中，给药于个体的有效量可以由内科医师确定，还应考虑到在年龄、体重、罹病度、给药途径(例如，是静脉内还是皮下)和对治疗的反应中的个体差异。在特定的实施方式中，能够将本发明的免疫球蛋白制品以每天大约5mg/公斤至大约2000mg/公斤的剂量给药于个体。在附加的实施方式中，免疫球蛋白制品能够以至少大约10mg/公斤、至少15mg/公斤、至少20mg/公斤、至少25mg/公斤、至少30mg/公斤、或者至少50mg/公斤的量被给药。在附加的实施方式中，能够将免疫球蛋白制品以直至每天大约100mg/公斤、大约150mg/公斤、大约200mg/公斤、大约250mg/公斤、大约300mg/公斤、大约400mg/公斤的剂量给药于个体。在其他实施方式中，免疫球蛋白制品的剂量能够更大或更小。进一步地，能够以每天一个以上剂量给药该免疫球蛋白制品。熟悉通过IgG制品治疗的疾病的临床医生能够根据本技术领域已知的标准来确定用于病人的合适剂量。

可配制一个通常使用的IgG产品--静脉内免疫球蛋白或IVIG以用于静脉内给药。因为本发明的IgG制品已经达到格外高的免疫球蛋白浓度(20％w/v以上)，其可显著地降低用于治疗性有效剂量的体积。本发明的组合物特别有利于皮下给药和/或肌内给药于病人，尽管静脉内给药仍然是可选择的给药方式。

术语“有效量”指的是免疫球蛋白制品、特别是IgG制品的量，该量可导致在个体中要治疗的医学状况(例如，原发性免疫缺陷、RRMS、阿尔茨海默氏病、帕金森氏症等)的改善或补救。给药于个体的有效量可以由内科医师确定，还应考虑到在年龄、体重、罹病度、给药途径(例如，是静脉内还是皮下)和对治疗的反应中的个体差异。在特定的实施方式中，能够将本发明的免疫球蛋白制品以每天大约5mg/公斤至大约2000mg/公斤的剂量给药于个体。在附加的实施方式中，免疫球蛋白制品能够以至少大约10mg/公斤、至少15mg/公斤、至少20mg/公斤、至少25mg/公斤、至少30mg/公斤、或者至少50mg/公斤的量被给药。在附加的实施方式中，能够将免疫球蛋白制品以直至每天大约100mg/公斤、大约150mg/公斤、大约200mg/公斤、大约250mg/公斤、大约300mg/公斤、大约400mg/公斤的剂量给药于个体。在其他实施方式中，免疫球蛋白制品的剂量能够更大或更小。进一步地，能够以每天一个以上剂量给药该免疫球蛋白制品。熟悉通过IgG制品治疗的疾病的临床医生能够根据本技术领域已知的标准来确定用于病人的合适剂量。

在特定的实施方式中，能够将浓缩IgG制品以每次给药约5mg/公斤至约2000mg/公斤的剂量给药于个体。在特定的实施方式中，剂量可以是至少大约5mg/kg，或者是至少大约10mg/kg，或者是至少大约20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg、1100mg/kg、1200mg/kg、1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600mg/kg、1700mg/kg、1800mg/kg、1900mg/kg、或至少大约2000mg/kg。

根据本发明，完成一个疗程所需要的时间可以由内科医师确定，并且其范围可以是短至一天至超过一个月。在特定的实施方式中，一个疗程可能是从1个月到6个月。

浓缩IgG治疗的剂量和频率尤其取决于如下因素：被治疗的疾病或症状、以及病人中疾病或症状的严重程度。一般来讲，对于原发性免疫机能障碍，大约每3至4周在大约100mg/kg和大约400mg/kg体重之间的剂量将被给药。对于神经学疾病和自身免疫疾病，在3个至6个月期间实施直至2g/kg体重的剂量，5天一疗程，一月一次。这一般补充有维持治疗，该维持治疗包括大约每3至4周一次给药在大约100mg/kg和大约400mg/kg体重之间的剂量。一般来讲，病人将会接受大约每14至35天一次、或者大约每21至28天一次的剂量或者治疗。治疗的频率尤其取决于如下因素：被治疗的疾病或症状、以及病人的疾病或症状的严重程度。

在一种优选的实施方式中，提供一种治疗在需要该治疗的人中的免疫缺陷、自身免疫病、或者急性感染的方法，该方法包括给药本发明的药物IgG组合物。

实施例

提供的下述实施例仅用于说明，并不用于限定。本领域的技术人员将容易地识别多种非关键性参数，这些参数能够被改变或者变化，以产生基本上相同或者相似的结果。

实施例1：各种IgG浓度和配方的稳定性研究

1.目的

该研究的目的是，将在较高蛋白质浓度下的低pH储存稳定性(0.25M甘氨酸，pH 4.4-4.9，如在浓缩溶液中所测量的)与目前可用于肌内注射和皮下注射的免疫球蛋白的中性pH配方(22.5g/l甘氨酸，3g/l NaCl pH 7)的储存稳定性相比较。

2.试验设计

所有轮次的试验都从将纳滤滤液浓缩至5％蛋白质开始。相对于0.15M甘氨酸(所研究的最低甘氨酸浓度)进行十倍的缓冲液交换，接着最后浓缩至高于20％蛋白质的目标值。而对于第一组实验，使用分子截止量为30K的0.5m²聚醚砜Millipore滤膜(普通筛子)。第二组实验使用具有开放筛的0.5m²聚醚砜Millipore滤膜来进行，该开放筛更适合于较高粘度的溶液，并且后洗涤组分通过具有较低滤膜表面(0.1m²，开放筛)的第二个超滤/渗滤装置被浓缩，以便降低产率损失。

最终的容器或者被以低pH配制并储存，或者以整体形式进行低pH储存，此后在储存之前它们被以中性pH配制。

表1：超滤/渗滤步骤(30K聚醚砜滤膜)和最终的容器pH的概要

					0.5m2超滤装置	标准筛	标准筛	开放筛	开放筛
0.1m2超滤装置	无	无	开放筛	开放筛
					最终容器pH	4.7	7	4.7	7

3.测试方法

pH：用配备有Mettler Toledo LoT405-DPA-SC-S8/120电极和PT 1000测温探头的Knick Portamess 911XPH型测试pH。

蛋白质：使用双缩脲测定蛋白质(浓度)值。

使用高性能大小排阻色谱法测试分子大小分布。

按照欧洲药典中描述的方法测试ACA滴度。

4.接受标准

接受标准限定如下：

·通过高效液体色谱测定的分子大小分布：

i.单体和寡聚/二聚体：≥90％

ii.聚集体：≤10％(≤％静脉内注射给药)

·ACA滴度：

对于静脉内注射给药，消耗少于50％CH50单位/mg蛋白。

5.结果和论述

5.1.在低pH(pH 4.7)下和在pH 7.0下配制的制品中的聚集体和片段含量及ACA滴度的对比

在下表2中，对于不同蛋白质浓度下的标准配方(pH 4.7、0.25M甘氨酸；或者pH 7.0、22.5g/L甘氨酸、3g/L NaCl)，在28至30℃下储存3个月后的聚集体和片段含量以及ACA滴度被显示出来。

表2：不同蛋白质浓度下、在低pH和pH 7.0下、在28至30℃下储存3个月后的片段、聚集体和ACA滴度值

数据清楚地表明，在28至30℃下储存3个月后低pH的配方具有较低的聚集体和较低的ACA滴度。pH 7配方的所有ACA滴度均高于为该测试限定的接受标准。在表2中，提供了在2至8℃下储存3个月后的数值。

表3：不同蛋白质浓度下、在低pH和pH 7.0下、在2至8℃下储存3个月后的片段、聚集体和ACA滴度值

在2至8℃下的结果证实了在28至30℃下看到的趋势。ACA滴度全部低于对接受标准限定的界限，虽然pH 7.0配方似乎具有更高的数值。蛋白质值并不影响测试的参数结果。

5.2不同的浓缩工艺对制品IGSC60(pH 4.7，A型筛)和IGSC62(pH 4.7，V型筛，用更小的超滤体系进行后洗涤液浓缩)中聚集体和片段含量和ACA滴度的影响

在下表4中，对于使用不同浓缩工艺的不同蛋白质浓度下的低pH配方在28至30℃下储存3个月后的聚集体和片段含量以及ACA滴度被显示出来。

表4：采用不同的蛋白质浓缩方法、在低pH下、在28至30℃下储存3个月后的片段、聚集体和ACA滴度值

对于两种浓缩模式，在储存3个月后，数据显示出相似的结果。在表5中，显示了在2至8℃下的对应数值。

表5：采用不同的蛋白质浓缩方法，在低pH下，在2至8℃下储存3个月后的片段、聚集体和ACA滴度值

在2至8℃下得到的数值证实了在28至30℃下获得的结果。浓缩方法并不影响产品的稳定性。

由于该方法具有两个体系：一个体系是主要的浓缩过程，而另一个体系是用于后洗涤液浓缩，可得到更高的产率，故判断这种方法更适合于大规模生产。

6.结论

由该研究中显示的结果能够得出下述结论：

●在2至8℃下和28至30℃下储存3个月后低pH配方给出较低的ACA滴度值、较低的聚集体含量和较低的片段含量。

●在28至30℃下储存3个月后，中性pH配方的ACA滴度值高于接受标准。

●蛋白质值并不影响测试的参数结果。

●浓缩方法并不影响产品的稳定性。

●足够的后洗涤液仅能够用开放筛滤膜获得。

基于这些结论，可以决定生产新的用于皮下给药的具有低pH配方的IgG产品，浓缩方法使用用于浓缩后洗涤液的第二个较小装置、即具有开放筛滤膜的超滤/渗滤装置，并且蛋白质含量为20％±2％。

实施例2：SUB Q NG的超滤和配制

1.背景

在放大试验生产和临床前20％批次期间收集该信息。用于制造20％批次直到纳滤步骤的工艺已在上文中描述。改进超滤/渗滤以便浓缩溶液至20％(限值：18至22％)。为了将产率损失减小到最少，通过配备有相同滤膜的第二个较小装置来浓缩在用于渗滤的超滤装置中的后洗涤液，并且此后将其加入整体溶液。

令人惊讶的是，可以表明在低pH储存期间的病毒灭活不受溶液蛋白质浓度的影响。在10％溶液(GAMMAGARDLIQUID)和20％溶液中实现了类似的病毒减少。因此对于20％的产品，保持作为病毒减少步骤的低pH储存。

2.工艺注解

超滤

纳滤滤液的甘氨酸浓度被调节至0.25M的目标。通过超滤(UF)，将该溶液浓缩至蛋白质浓度为6±2％w/v。典型地，通过AU_280-320测量法测定蛋白质浓度。使用14.1的消光系数。pH被调节到5.2±0.2。使用的UF滤膜的标称截止分子量(NMWCO)为50,000道尔顿以下，并且尤其被设计成用于高粘度产品(例如，购自Millipore的V型筛)。例如，NMWCO为50K道尔顿以下的Millipore Pellicon Biomax。滤膜材料是聚醚砜。

浓缩液被相对于0.25M甘氨酸溶液、pH 4.2±0.2进行渗滤。最小交换体积是10倍于初始浓缩液体积。在整个超滤/渗滤操作中，溶液保持在4℃至20℃。

在渗滤后，溶液被浓缩至蛋白质浓度为最低22％w/v。溶液温度被调节到2℃至8℃。通过使用14.1的消光系数值，可以通过紫外线读数测定蛋白质浓度。

为了回收在体系中全部的残余蛋白质，以再循环模式、至少2倍于死体积进行第一个较大超滤系统的后洗涤，以保证所有的蛋白质被洗出。然后使用第二超滤/渗滤体系将第一个超滤系统的后洗涤液浓缩至蛋白质浓度为至少22％w/v，所述第二超滤/渗滤体系配备有相同类型的滤膜，滤膜尺寸是第一个超滤系统滤膜的十分之一以下。将后洗涤浓缩物加至整体溶液。第二超滤系统然后进行后洗涤。该后洗涤液用于调节步骤14中最终整体溶液的蛋白质浓度。溶液温度被调节到2℃至8℃。

配制

用第二个较小超滤系统的后洗涤液和/或用渗滤缓冲液将蛋白质浓度进一步调节至20.4±0.4％w/v。必要时，将pH调节到4.4至4.9。

实施例3：制造20％批次

1.介绍

该报告描述了临床前生产，并且总结了巴克斯特公司新研究的免疫球蛋白制品“SUBQ NG，20％”的结果，其是20％(w/v)(蛋白含量)的液体多价人免疫球蛋白制品，用于皮下使用。

采用如上所述浓缩方法，按“具体实施方式”描述中的方法进行制造(制备、生产)。分级分离从分离冷冻沉淀物开始。然后在后继的冷醇分级分离之前，未经冷冻的血浆可以用于分离各种粗的凝血因子和抑制剂。在SUBQ NG，20％纯化之前，可选择7个路径用于从未经冷冻的血浆中分批吸附粗的凝血因子和抑制剂，并被称为下表中的路径1到7。

表6

对于临床前SUBQ NG，20％的生产，选择来源于路径1、3和6的Cohn起始原料以便覆盖较宽种类的不同的吸附选项。各种吸附工艺下述文献中被描述：Teschner et al.，2007，Vox Sang.92：42-55；Polsler et al.，2008，Vox Sang.94：184-192；美国专利No.6,395,880和5,409,990；以及Prothrombin complex.Brummelhuis in Methods ofPlasma ProteinFractionation(J.M.Curling Editor，Academic Press(学术出版社)，1980)。

改进的Cohn醇分级分离可得到主要的中间体IgG组分，称作沉淀物G，其通过使用层析法纯化被进一步加工成最终产品。下游制备包括阳离子交换层析(CM-琼脂糖凝胶快速流动)和阴离子交换层析(ANX-琼脂糖凝胶快速流动)，并且包括三个独立的病毒灭活或除去步骤，即

·溶剂/洗涤剂处理(1％TRITON X-100、0.3％磷酸三丁酯和0.3％聚山梨酸酯-80的混合物)，

·纳滤(Asahi Planova 35nm)，以及

·在升高的温度下低pH储存3周。

为了达到更高的蛋白质浓度用于皮下应用，不得不在超滤/渗滤步骤使用开放通道筛。优选第二个超滤/渗滤装置被用于浓缩后洗涤组分，以便回收来自第一个装置的所有蛋白质。

SUBQ NG，20％是一种免疫球蛋白G(IgG)的液体配方，其中至少95％的蛋白质是γ球蛋白。该产品是等渗的，并且在低pH下配制。在10％蛋白质浓度下，在最后浓缩步骤期间，pH是4.4至4.9。可在可获得延长稳定性研究的结果之后，确定20％溶液的最终pH。最终溶液含有每升溶液180至220g蛋白质和仅有的赋形剂0.1至0.3摩尔甘氨酸。该液体制品清澈，略微浅黄色，基本上不含可见的粒子。

2.临床前批次的数据和质量平衡

1.临床前批次：SC00107NG

吸附选项1：选项6：F IX、F VII、AT-III

起始原料批号：沉淀物G VNELG171(US来源)

最终容器批号：SC00107NG

2.临床前批次：SC00207NG

吸附选项3：FEIBA、AT-III

起始原料批号：沉淀物G VNELG173(US来源)

最终容器批号：SC00207NG

3.临床前批次：SC00307NG

吸附选项1：无吸附步骤

起始原料批号：沉淀物G LB0790301(US来源)

最终容器批号：SC00307NG

表7

在最终整体水平上，制品的纯度被通过低水平的主要杂质显示出来，杂质水平也低于总IgG的0.1％。在工艺的最后阶段，在20％产品中的分子大小分布与GAMMAGARDLIQUID/KIOVIG最终容器的分子大小分布相似。这表明，浓缩至20％蛋白质对整体IgG分子没有负面影响。

3.表征临床前批次所带来的附加结果

在当局对于皮下注射人免疫球蛋白要求、用于皮下给药的目前产品的最终容器规格和GAMMAGARDLIQUID/KIOVIG规格的基础上，来限定初步的最终容器释放标准。进行附加的质量控制测试来评估产品和/或与工艺相关的杂质的水平。

此外，进行最终容器的相关抗体谱的表征，并且与临床前IVIG，10％TVR批次的结果相比较。

结果被提供于下表(表8)中

对于3个临床前SUBQ NG 20％最终容器以及对于临床前GAMMAGARDLIQUID/KIOVIG批次，抗体滴度和富集因子的数量级相同。

SUBQ NG 20％最终容器的质量控制测试(表9)

对于所有的三个批次，产品和与工艺相关的杂质的移去令人满意。

4.结论

三个SUBQ NG 20％的最终容器批次被成功地以200升的规模制造出来。在醇分级分离之前，选择3个吸附路径来覆盖较广种类的吸附步骤，即：

-选项1，US来源的血浆，没有吸附步骤；

-选项3，US来源的血浆，在FEIBA、AT-III吸附后；

-选项6，US来源的血浆，在F-IX、F-VII、AT-III吸附后。

在临床前生产和中间体及最终产品的表征期间监控的工艺参数中表明，在三个批次之间没有显而易见的可检测差异。

所有的最终容器满足与产品相关的初步规格，与选择的起始原料种类无关。

实施例4：20％制品的储存研究

1.介绍

SUBQ NG，20％是一种20％(w/v)液体多价人免疫球蛋白制品，用于皮下注射用途。按如上所述方法生产出SUBQ NG，20％。

该研究总结了在2至8℃下和在28至30℃(仅对于可行性批次)下3个临床前批次和一个可行性批次的直到6个月的储存数据。

2.目的

该研究的目的是评估在2至8℃下和28至30℃下SUB Q NG 20％最终容器的储存稳定性。

3.稳定性指示参数

初级降解模式是变性、聚集和分裂，导致样品的分子大小分布产生变化。因此，通过高效大小排阻色谱法分析的分子大小分布是主要的稳定性指示参数。

4.检验的批次和初级包装

该报告中给出的稳定性数据是用临床前批次SC00107NG、SC00207NG和SC00307NG以及用可行性批次IgGSC 62/1做出的。

5.结果

在下表11中，显示了在储存直至12个月后，临床前最终容器的结果。

表10：临床前Sub Q 20％批次在2至8℃下的稳定性

表11：可行性批次IgGSC 62/1在2至8℃下和28至30℃下的稳定性

6.结论

数据证实，对于研究在2至8℃和28至30℃下储存直到18个月的参数，产品符合预先限定的规格。

实施例5：用于病毒灭活的低pH处理

目的和原理

介绍

皮下用免疫球蛋白(人类)，14％-20％，三联病毒消减(Triple Virally Reduced，TVR)溶液，在下文中称为Subcuvia NG溶液，被从汇集的人血浆制造出来。在实施大规模捕获步骤以除去凝血因子/抑制剂之后，Subcuvia NG的纯化从改进的Cohn醇分级分离法开始，得到主要的中间体沉淀物G，接着进行包含层析纯化和3个不同的病毒灭活/移去步骤的下游过程。在该研究中，详细地研究了最终容器的低pH储存的病毒减少能力。

下游提纯过程包含如下步骤：对再悬浮的沉淀物G进行溶剂/洗涤剂(S/D)处理、使用羧甲基(CM)-琼脂糖凝胶(CM-Sepharose)快速流动的阳离子交换层析和使用ANX-Sepharose快速流动的阴离子交换层析、纳滤、超渗滤、pH调节、以及无菌过滤和灌装。在无菌灌装后，在最终容器中对Subcuvia NG溶液进行低pH储存(对于制造工艺的流程示意图，请参见下述工艺流程图)。

工艺流程

工艺流程图A，如图2所示，其提供了用于Subcuvia NG溶液的制造流程图中从步骤10开始的下游部分的概要。在本研究中使用的定制的(custom-made)中间体等于工艺步骤“最终容器、预储存”。

工艺流程图B，如图2所示，其提供了在本研究中使用的缩小规模的工艺的概要，包括抽样用于病毒滴定。

目的

为了提供一种就可能的病毒传染而言的高安全限度，将3个专门用于病毒灭活/除去的步骤以彼此间作用相辅相成的方式整合入Subcuvia NG溶液的制造工艺中：

●溶剂/洗涤剂处理(步骤11)，

●纳滤(步骤14)，

●在(无菌灌装后的)最终容器中在升高的温度下低pH储存。

在此前的研究过程中已经研究了就病毒灭活而言的在低pH和升高的温度下储存的能力和稳定性，其中使用IGIV 10％TVR，这是一种调节至10％蛋白质的与用于静脉内应用的Subcuvia NG等效的产品。由该研究获得的结果显示，研究的所有脂包膜病毒都被有效而强力地灭活，而牛病毒性腹泻病毒(BVDV)显示出最慢的灭活动力学。另外，可以表明，就小的非脂包膜DNA病毒而言，该工艺步骤还对制造工艺中的病毒安全性做出了贡献。Subcuvia ng和IGIV 10％TVR是免疫球蛋白产品，其中Subcuvia NG是用于皮下给药的变化形式，而IGIV 10％TVR是用于静脉内应用的产品变化形式。两者都共用相同的制造工艺直到超滤/渗滤和配制步骤，其中唯一的差别是，Subcuvia NG的蛋白质浓度被调节至14％至20％的范围而不是10％。

因此，就灭活BVDV和MMV而言，通过将选取的关键工艺参数设定成为制造工艺限定的上下限(即，时间、温度：下限；pH：上限)，评估了在制造Subcuvia NG中于低pH和升高的温度下储存步骤的能力和稳定性(参见，欧洲药品评价署人用药物评价部(The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Evaluation of Medicinesfor Human Use)(2001)：CPMP生物技术工作小组-源于血浆的药物产品指南注解(Notefor Guidance on Plasma-Derived Medicinal Products)，CPMP/BWP/269/95(第3修订版))。另外，为了进一步研究该病毒灭活步骤的稳定性，在缩小规模的试验期间，温度被降低给定的时间周期。

正如以上的讨论，使用下述包膜病毒和非包膜病毒。

●牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，用作丙型肝炎病毒(HCV)和其他小的脂包膜RNA病毒的模型。

●小鼠细小病毒(MMV)，用作人类细小病毒B19(B19V)和用于其他小的非包膜DNA病毒的模型。

按照CPMP指南268/95(欧洲药品评价署人用药物评价部(1996)：CPMP生物技术工作小组-病毒验证研究指南注解：验证病毒灭活和去除的研究的设计、贡献和解释，CPMP/BWP/268/95(修订版))，使用各个制造步骤缩小规模的模型进行该研究。就病毒灭活而言，通过大规模生产工艺中该制造步骤的限定参数与缩小规模的模型的工艺参数的对比，在Subcuvia NG溶液制造中使用缩小规模的制造步骤“在低pH和升高的温度下的储存”获得的结果的有效性被显示来。另外，监控选取的生化参数，并且与大规模工艺的各个参数相比较。

材料、方法和设备

病毒和细胞

使用的BVDV是由美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，马里兰州)得到的菌株NADL(生物学克隆，ATCC VR-1422)。根据标准操作程序，该病毒在MDBK细胞(ATCC CCL-22)上被增殖，并且在BT细胞(ATCC CRL-1390)上滴定。

从位于马里兰州罗克韦尔市的美国典型培养物保藏中心得到了MMV，其为原型菌株(ATCC VR-1346)。根据标准操作程序增殖该病毒，并且在A9细胞(ATCC CCL-1.4)上滴定。

测试项目

在“在低pH和升高的温度下的储存”之前，即，在制造步骤中无菌灌装之后，由奥地利维也纳工业大街131号的巴克斯特公司PPD产品服务部得到了定制的SubcuviaNG中间体的下述批次：

批号IGSC64，具有13.5％的蛋白质浓度，

批号IGSC64，具有20.9％的蛋白质浓度。

在+2℃至+8℃下，材料被装入最终的容器中，并且在6个月内使用。

缓冲液/溶液

用于调节pH的溶液

使用0.5M NaOH或者0.5M盐酸(两种溶液都在室温下储存并且在12个月内使用)来调节pH。

0.5M盐酸(HCl)的制备

组分	每升溶液组分	保存期限	储存
				HCl 37％	41.4±0.4ml	12个月	23±5℃

在室温下合并试剂，即蒸馏水和HCl。

0.5M氢氧化钠(NaOH)的制备

组分	每kg蒸馏水的组分	保存期限	储存
				NaOH	20.0±0.2g	12个月	±5℃

室温下将各含量的NaOH溶于蒸馏水中。

用于测量pH的溶液

直接测量pH，并且根据欧洲药典(EP)在稀溶液中测量pH。对于根据EP方法测量pH，使用0.9％NaCl溶液将蛋白质浓度稀释至1％。

0.9％NaCl溶液按如下所述方法制备：将9.0±0.9g NaCl溶于1000mL蒸馏水中。该溶液经0.2μm过滤、在室温下储存，并且在12个月内使用。

细胞培养基

使用的用于细胞培养或者病毒滴定的培养基根据BVDV和MMV病毒滴定的标准操作程序制备。

病毒滴定测定

TCID₅₀测试

根据标准操作程序，通过TCID₅₀测试来滴定含有病毒的样品。简言之，在各个组织培养基中制备1/2Log梯度稀释的样品，并且将100μL的每个稀释液加至8孔微孔板的每个孔中，微孔板已接种了各个指示细胞系。微孔板在润湿的和调控CO₂的储存单元中于36℃±2℃温度下储存。在储存7天以后，通过在显微镜下肉眼观察细胞，完成细胞病变效应的评估。

根据泊松分布计算出半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)，并且表示为log₁₀[TCID₅₀/ml]。

BVDV整体滴定

在掺加了MMV的样品上进行研究。为了降低取自在低pH下储存20和27天后的Subcuvia NG中间体的掺加了BVDV的样品的检测极限，按如下所述方法滴定这些样品：除标准的TCID₅₀测试之外，还将1∶3.16稀释(0.5log)以及之后两个1/2Log稀释(各个细胞培养基被用于稀释)的样品加至96孔微孔板的所有孔(100μL每孔)中，该96孔板已经接种了各个指示细胞系。按如上所述方法(TCID₅₀测试)进行细胞的储存和各个病毒的细胞病变效应的评估。按如下所述方法计算出结果：计算出在整体滴定中滴定的体积与在普通的TCID₅₀测试中滴定的体积的比率R_体积。从在TCID₅₀测试中测定的病毒滴度中减去R_体积的log₁₀值，并且给出结果作为通过整体滴定法测定的病毒滴度。

实施例：

-在以0.5Log梯度稀释(全部12列)的微孔板上测试样品(TCID₅₀测试)，并且观察到这些孔从稀释度0(即未稀释)起皆呈阴性。根据泊松分布的计算给出了＜0.11log₁₀[TCID₅₀/ml]的病毒滴度。被测定的样品的对应总体积是1.17ml。

-将相同的样品(稀释度0)施加到微孔板的所有孔上(整体滴定)。因此，施加的总试样体积是9.6ml。

-体积比率是：R_体积＝9.6：1.17＝8.21；log₁₀(R_体积)＝0.91。

-则计算的病毒滴度是＜0.11-0.91；即-0.80。同样计算出病毒滴度的置信区间上限。

在连续的动力学样品中当评为无传染性时病毒滴度的计算

在完成低pH储存之后，如果在连续的动力学样品、直到最终样品中都没有检测出病毒传染性，则在具有明确阴性结果的TCID₅₀测试中用于各孔的所有连续阴性样品的体积被考虑，用于计算测定检测极限。为此，使用下述公式(参见附录1)：

其中

XI(i＝1，2，3…n)为n个连续阴性样品中的个别病毒滴度[log₁₀(TCID₅₀/ml)]

如果所有的阴性样品具有相同的滴度，即x，该公式可简化为：

细胞毒性

在用于测定细胞毒性的每个细胞系上，由掺加模拟物(即，掺加用于感染细胞的BT培养基(5％马血清)^*来代替病毒保藏液)的Subcuvia NG中间体，以及由掺加模拟物的、调节pH的(pH 4.9±0.1)并且0.45μm过滤的起始原料，来确定工艺中间体对于使用的病毒指示细胞系的细胞毒性。像测定含有病毒的样品那样来测定样品，即将它们逐次稀释，并且与指示细胞系一起储存。在储存后，测定最高非细胞毒性浓度。关于这些生物系统中的变化形式，当掺加病毒的样品与掺加模拟物的样品比较细胞毒性时，±0.5对数位数(log step)的偏差被认为是非显著的。

^*用于感染细胞的BT培养基的组成如下所述：DMEM(含有4.5g/L右旋葡萄糖)+1％(v/v)L-谷氨酰胺(200mM)+1％(v/v)硫酸庆大霉素(10mg/ml)+1％(v/v)丙酮酸钠+2％(v/v)碳酸氢钠(7.5％)+1％(v/v)非必需氨基酸+5％(v/v)马血清。

干扰

对于具有低病毒滴度的样品，需要评估样品基质对传染性测定性能的影响。对于含有高病毒滴度的样品，稀释系列中的相关部分，即其中能够评为病毒阳性孔和病毒阴性孔的部分，会出现在高样品稀释度处。因此，也被稀释几个log₁₀位数样品基质对病毒传染性检测的影响能够被忽略。按如下方法测量对含有Subcuvia NG中间体的样品的低病毒滴度测定的干扰：从掺加模拟物的、调节pH(pH 4.9±0.1)并且0.45μm过滤的起始原料(Subcuvia NG中间体)中抽取样品，用适当的组织培养基按1∶3.16进行稀释，并且按1∶100掺加预稀释(在适当的组织培养基，即用于BT细胞/BVDVBT的培养基和用于A9细胞/MMV的A9培养基中预稀释)的病毒保藏液悬浮液直至2或3log₁₀[TCID₅₀/ml]的标称滴度，并且按如上所述方法进行滴定。将掺加工艺中间体获得的滴度与掺加细胞培养基对照物获得的滴度相比较。

计算病毒减少因数

使用下述公式，根据CPMP指南268/95[3]，进行该工艺的病毒灭活能力分析：

$R=\log \left(\frac{V_{1}x{T}_1}{V_{2}x{T}_2}\right)$

其中，

R＝病毒减少因数，

V₁＝起始原料体积，

T₁＝起始原料中的病毒浓度[TCID₅₀/ml]，

V₂＝在所述步骤之后材料的体积，

T₂＝在所述步骤之后病毒的浓度[TCID₅₀/ml]。

每个被掺料后的样品在处理之前和之后的体积和滴度被用于计算R。当病毒不能被检测到时，将检测极限作为病毒滴度用于计算。根据标准操作程序进行计算，病毒滴度(log₁₀[TCID₅₀/ml])设定为两个小数位；减少因数四舍五入到第一个小数位。

验证参数的测定

时间、温度[℃]

用计时器测量储存时间；用Pt-100传感器测量温度并且连续地记录。

pH值

根据标准操作程序，用标准的实验室用pH计通过直接测量，以及实施欧洲药典(EP)限定的方法，即在用0.9％NaCl溶液稀释至1％蛋白质之后，来测定pH值。在下文中，具有后缀(EP)的pH是指根据EP方法的pH测量值，而没有后缀的“pH”是指直接测量值。

其他参数的测定

分子大小分布(MSD)

由位于奥地利维也纳的巴克斯特公司的分析生物化学部，根据标准操作程序，进行分子大小分布的HPLC-SEC(高效液相色谱-大小排阻色谱)分析。根据该测试，对所有“放大规模”批次的样品(在位于奥地利维也纳的巴克斯特公司的PPD产品支持部中生产)进行HPLC-SEC分析。因此，为了保证在掺加模拟物试验(在该研究过程中在缩小规模的工艺中累积的)的样品试验结果与“放大规模”批次的试验结果之间的可比较性，在同一部门中根据相同的测试对掺加模拟物试验的样品进行MSD分析。

醋酸纤维素电泳

根据标准操作程序，由位于奥地利维也纳的巴克斯特公司ACV化学部进行醋酸纤维素电泳(CAE)。

四舍五入

根据如下标准操作规程进行四舍五入：

●按照对于制造工艺各个参数的限定、或者按照确定的测定精确度，测定结果被四舍五入成相同的小数位号。

●在不对测定结果进行四舍五入的情况下进行计算，并且仅对最终结果进行四舍五入。

设备

●使用标准的实验室pH计。

●使用Mettler AT-100分析天平和Sartorius BP3100P实验室天平。

●用PVDF膜滤器(Millex-HV、或者等价物)进行0.45μm过滤。

●用实验室计时器测量工艺时间。

●使用生物安全II类柜。

●细胞被储存在控制湿度的Heraeus CO₂保温箱中。

●磁力搅拌器/搅拌棒被用于混合。

●通过Haake或Julabo低温恒温器和/或搅拌加热块来控制温度。

●使用与μR 1000YOKOGAWA记录仪相连接的Pt-100传感器测量温度。

研究设计

为了研究就病毒灭活而言Subcuvia NG制造步骤“在低pH和升高的温度下的储存”的稳定性，用于病毒灭活效力的关键参数按照如下讨论的方法被定义。在适合于研究通过低pH储存的病毒灭活的稳定性的条件下进行试验。大规模工艺状况与缩小规模试验状况的对比显示于表A中。

●蛋白质浓度：当Subcuvia NG是开发中的产品时，用于配制整体的蛋白质浓度范围被限定在较宽范围内，即大约14％至20％，并且该范围后来可以变窄。因此，为了研究低pH处理的稳定性，在两个可能的蛋白质浓度极值处进行两个试验(试验设计)。在13.5％蛋白质浓度下进行试验设计1；在20.9％蛋白质浓度下进行试验设计2。

定制材料的蛋白质浓度由PPD产品支持部提供。该定制材料的蛋白质浓度不被再次确定，因为数据已经可以从在生产定制的Subcuvia NG中间体之后进行的分析中获得。由于用于缩小规模的工艺的材料被无菌过滤、并且在2℃至8℃下储存直到开始缩小规模的工艺(即，不经受任何冷冻/解冻工序)，预期用于最后配制和无菌过滤的中间体的蛋白质浓度没有变化。

●pH值：在生产中，在整个低pH储存中对于Subcuvia NG最终容器，pH范围被限定为4.4-4.9(直接测量)。为了研究在不太有利于病毒灭活的条件下低pH处理的效力和稳定性，在更高的限定界限，即，pH 4.9±0.1下，进行两个试验。pH在掺料之后被测量，并且必要时被调节至更高的界限。在低pH储存27天±5小时后，通过直接pH测量法和欧洲药典推荐的方法，即，用0.9％NaCl溶液稀释至1％蛋白质，再次测量pH。

●温度：在生产工艺中，在低pH储存期间温度被设定为30-32℃。为了研究在不太有利于病毒灭活的条件下低pH储存的稳定性，所有缩小规模的试验在温度范围的下限，即，在30±1℃下进行。为了检验温度变化的潜在影响，将温度降低至25±1℃维持≥6小时，每个星期一次(即，在储存第0、7、14、20和27天期间，启动温度降低；天数指的是历法天数，即第0天是储存开始的那一天)。错误的是，在储存的第一个星期和第二个星期，每星期两次进行温度降低至25±1℃维持6小时，即，在低pH处理第一星期储存的第0和4天期间、以及在低pH处理第二星期储存的第7和10天期间进行。

●时间：储存时间典型地是在21天(BVDV有效灭活所要求的天数)至28天(因技术原因/逻辑原因的上限)之间的范围内。为了研究在不太有利于病毒灭活的条件下低pH处理的效力和稳定性，以低于上述所列储存时间范围的下限进行所有缩小规模的试验；即，短时间选项进行20天±4小时；对于长时间选项，储存进行27天±5小时。被掺料的中间体在低pH和升高的温度下储存27天±5小时，但是用于病毒滴定的样品在储存20天±4小时后被抽取，以便研究在储存3个星期后的病毒清除情况(参见表A)。

总的说来，总共进行4个掺加病毒的试验(2个掺加BVDV，另2个掺加MMV)来研究制造步骤“在低pH和升高的温度下的储存”的病毒灭活能力的稳定性。另外，进行两个未掺病毒的对照试验，以便产生用于测定生化参数的样品。另外，进行两个掺加模拟物的对照试验，并且取自这些试验的样品被用于研究工艺中间体对病毒滴定测定的可能的影响(即，细胞毒性和干扰)。

为了进一步显示缩小规模的工艺与大规模工艺的等效性，在低pH储存之前和之后在最终产品上进行下述生化分析：分子大小分布和醋酸纤维素电泳。

表A：缩小规模的试验的工艺和生化参数，与大规模的工艺相比较。缩小规模的工艺中范围不同于大规模工艺的参数以粗体打印。

¹当Subcuvia NG是开发中的产品时，蛋白质浓度尚未限定为更窄的范围。因此，在可能的蛋白质浓度两个极值处进行两个缩小规模的试验。

²当取决于病毒清除研究的结果时，储存期尚未限定为更窄的范围。

³两个试验都进行27d±5h，并且在储存的第20天取样用于病毒滴定，以使得病毒灭活数据也可用于储存21至22天的大规模工艺选项。

⁴将温度降低至25±1℃维持6小时，每个星期一次(即，在储存第0、7、14、20和27天期间，启动温度降低；天数指的是历法天数，即第0天是储存开始的那一天)。如同在第4.1.1节(“温度分布”)讨论的那样，会在储存第一个星期和第二个星期每星期两次错误地进行温度降低至25±1℃保持6小时(参见DR10407)。

⁵根据欧洲药典的方法。

实验工序

由于其复杂度，掺加病毒、pH调节和0.45mm过滤步骤的顺序被显示在图3中所示的流程图中(箭头粗细指示相对体积)。

起始原料

对于试验1，取用具有13.5％蛋白质浓度的定制材料(批号IGSC64)。该材料被用于在可能的蛋白质浓度下限处、在pH范围的上限(即，对于BVDV为4.97，对于MMV为4.93)处和在温度范围的下限(即，29.4℃)处进行试验。

对于试验2，取用具有20.9％蛋白质浓度的定制材料(批号IGSC64)。该材料被用于在可能的蛋白质浓度上限处、在pH范围的上限(即，对于BVDV为4.92，对于MMV为4.86)处和在温度范围的下限(即29.4℃)处进行试验。

掺加的病毒：BVDV、MMV

储存

45.5mL的每个起始原料中掺加有4.5mL病毒保藏液悬浮液，并且在搅拌1至2分钟后抽取1mL样品。该样品立即以1∶3.16用各个细胞培养基(即，1体积样品加上2.16体积的细胞培养基)稀释并滴定。接着，抽取另一个3mL样品并且通过0.45μmPVDF滤膜进行过滤。1mL的过滤的材料立即用各个细胞培养基按1∶3.16稀释并滴定。

pH的调节

在搅拌下，使用0.5M HCl溶液将1等分的35mL掺加病毒的起始原料调节至pH为4.9±0.1(两个试验)。该材料然后被分成两个等分。1个等分的30mL被用于“低pH储存”，并且1个5mL等分被用于“温度保持对照”(参见“保持对照物”节)。

使用0.5M NaOH溶液，将另1个等分的10mL的掺加病毒的起始原料调节至pH为7.0±0.1，其中5mL的pH调节后的材料被用于“pH保持对照物”。

剩余5mL的pH调节后的材料被用于“组合pH和温度保持对照物”(参见“保持对照物”节)。

保持对照物

为了研究病毒灭活的机制，即，通过pH或者通过温度，将3个保持对照物在不同的条件下储存：

将每个5mL等分的掺加病毒并且调节pH(pH 7.0±0.1)的起始原料通过0.45μm PVDF膜滤器滤入冷冻小瓶中。将1个等分与掺加的工艺材料一起在30±1℃下储存，然后保持在该温度直至工艺结束(pH保持对照物，“pH HC”)。另一个等分立即在+2℃至+8℃下储存27天±5小时(组合pH和温度保持对照物，“c HC”)。

将5mL等分的掺加病毒的、调节pH(pH 4.9±0.1)的、并且0.45μm过滤的起始原料(参见上面的“pH的调节”)立即在+2℃到+8℃下储存，直至工艺结束(温度保持对照物，“t HC”)。

在过滤之后所有保持对照物的最小体积始终多于3mL，因而，在储存期之后可利用适当的体积用于病毒滴定。

低pH储存

将30mL等分的掺加病毒并且调节pH的Subcuvia NG中间体通过0.45μmPVDF膜滤器滤入50mL的无菌玻璃瓶中。在过滤后最小体积的Subcuvia NG中间体始终多于24mL。因此，在储存期之后可利用足够的体积用于病毒滴定。接着，在使用水浴以慢动作来回摇动下，温度被平衡至30±1℃，该水浴经由外部温度传感器而受到控温低温恒温器的调节。外部温度传感器和附加的Pt 100电极被放入一个相当于用于低pH储存的玻璃瓶的50mL玻璃瓶中，它们中每一个灌装有30mL水，这是在过滤之后最大可能含量的被掺加的工艺材料。连续地记录温度。一旦材料达到29℃的温度，就启动取样。每个样品立即用各个冷(在+2℃至+8℃下存放)的细胞培养基按1∶3.16(即1体积的样品加2.16体积的细胞培养基)稀释以防止病毒被低pH进一步灭活，并且进行滴定。在所有试验中，在27天±5小时的整个完整工艺期间，Subcuvia NG中间体在(以慢动作来回)搅拌下30±1℃存放，储存中每个星期一次地将温度下降至25±1℃保持至少六个小时(≥6h)。错误的是，在第一个星期和在储存第二个星期，每星期两次地将温度降低至25±1℃保持6小时，即，在低pH处理第一个星期储存的第0和4天期间、和在低pH处理第二个星期储存的第7和10天期间进行。对于论述，请参阅第4.1.1节(“温度分布”)。其他样品根据抽样方案(参见第3.2节)抽取，立即按如上所述方法稀释，并且滴定。在完成30℃±1℃下低pH储存后，通过直接测量和欧洲药典推荐的方法(用0.9％NaCl溶液稀释至1％蛋白质)测定pH。

没有病毒的对照试验

按照对于掺加病毒的试验所描述的方法，进行两个对照试验，其中未掺病毒并且0.45μm过滤的Subcuvia NG中间体被加工。分别按照对于掺加病毒的试验1和试验2的限定，实施相同的工艺参数，不同的是材料不进行pH调节。根据抽样方案(参见第3.2节)，取样用于测定生化参数。

测定在0.45μm过滤之后掺加模拟物(按0.9∶10掺加用于感染细胞的BT-培养基^*；在滴定前，样品按如上所述方法过滤)的和掺加模拟物的以及调节pH的SubcuviaNG中间体的细胞毒性。根据抽样方案(参见第3.2节)，取样用于测定细胞毒性。

^*用于感染细胞的BT培养基的组成如下所述：DMEM(含有4.5g/L右旋葡萄糖)+1％(v/v)L-谷氨酰胺(200mM)+1％(v/v)硫酸庆大霉素(10mg/ml)+1％(v/v)丙酮酸钠+2％(v/v)碳酸氢钠(7.5％)+1％(v/v)非必需氨基酸+5％(v/v)马血清。

可能的干扰

对于每个指示剂细胞系，按如下所述方法一式两份地研究在pH调节后(pH4.9±0.1)用于含有Subcuvia NG中间体的样品的样品基质对于病毒检测的干扰：从掺加模拟物的调节pH的并且0.45μm过滤的Subcuvia NG中间体中抽取1mL的样品，被用各个冷(在+2℃至+8℃下存放)的细胞培养基按1∶3.16(v/v)稀释。接着，向1.8mL稀释的材料中按1∶10掺加0.2mL预稀释^*的病毒保藏液悬浮液，至计算的滴度为2.0和3.0log₁₀[TCID₅₀/ml]。在混合后，抽取样品，并且立即滴定。作为对照，在滴定之前，以极为相同的方式用预稀释的病毒保藏液悬浮液掺加1.8mL各个冷(在+2℃至+8℃下存放)的细胞培养基中。

^*适当的细胞培养基[用于BT细胞(BVDV)的BT-培养基、用于A9细胞(MMV)的A9-培养基]被用于病毒保藏液悬浮液的预稀释。

抽样方案

病毒滴定

下述可接受范围适用于抽样：在储存第1天(±1小时)之后、在储存第2至6天(±2小时)之后、在储存第7至13天(±3小时)之后、在储存第14至20天(±4小时)之后、以及在储存第21至27天(±5小时)之后。对于样品编码，参见第1.1节(工艺流程图)。

不经额外的储存，立即滴定样品。

^§在滴定之前，样品立即用各个冷的细胞培养基按1∶3.16进行稀释。

细胞毒性的测定

不经额外的储存，立即滴定样品。

^§在滴定以前，样品立即用各个冷的细胞培养基按1∶3.16进行稀释。

干扰的测定

不经额外的储存，立即滴定样品。

^§在滴定以前，样品立即用各个冷的细胞培养基按1∶3.16稀释。

生化参数的测定

仅从每个未掺病毒的对照试验中抽取样品，并且在+2至8℃下储存直至分析。

¹在2个“放大规模”批次以及定制材料(批号IGSC64)的生产期间产生的数据也被考虑用于评估缩小规模的工艺。

²在2个“放大规模”批次的生产期间产生的数据也被考虑用于评估缩小规模的工艺。

³对于产品的开发阶段而言，在28天储存期之后的生化参数数据似乎不太可能有用。

结果和讨论

通过使用这些步骤的缩小规模的实验室模型，用BVDV和MMV研究了Subcuvia NG在低pH和升高的温度下储存的效力和稳定性，其中低pH储存和升温储存是专门用于脂质包膜病毒和非脂质包膜病毒的灭活步骤。在缩小规模的工艺中限定并测量的验证参数和生化参数，并且通过制造工艺条件的结果对比，建立两个工艺的等效性。

验证参数和生化参数的结果

验证参数

通过测定对于病毒灭活而言的关键参数，即，工艺材料的pH、在低pH储存期间的温度和储存时间，验证缩小规模的工艺的有效性。

在低pH和升高的温度下储存之前的pH值

在所有的试验中，根据需要测量被掺料的工艺材料的pH，并调节至4.9±0.1，并且因此在研究计划中将pH调节在限定的界限内。在储存之后测定的pH值在第4.1.2节(其他工艺参数和生化参数)中有讨论。

温度分布

为了研究在低pH和升高的温度下储存步骤相对于温度变化的稳定性，储存中每星期一次将温度从30℃±1℃降低至25±1℃并保持6小时。在研究计划中，该温度始终被限定在该范围内。然而，在储存的第一个星期和在第二个星期，每星期两次，即，在第一个星期第0和4天期间和在第二个星期第7和10天期间，错误地进行温度降低至25±1℃并维持6小时。就病毒灭活而言，由于这一事故将试验分布变为更差的方案，对病毒灭活的稳定性进行比最初打算更广泛的研究。

储存时间

对于Subcuvia NG的制造工艺，在低pH下和在升高的温度下储存的持续时间并不作限定。取决于当前研究的结果，有几个选项：对于储存持续时间的一个选项是21至22天；第二个选项可以是大约28天。为了研究在不太有利于病毒灭活的条件下低pH处理的效力和稳定性，在低于可能的储存时间下限进行所有缩小规模的试验；即对于第一个选项进行20天±4小时，并且对于第二个选项储存27天±5小时。被掺料的中间体在低pH和升高的温度下储存26天+22小时(MMV，两个试验)和储存27天+1小时(BVDV，两个试验)。为了研究在3个星期储存后的病毒清除情况，对于MMV在储存20天+1小时后以及对于BVDV在储存20天+2小时之后抽样用于病毒滴定。

对于缩小规模，在所有的试验中，储存时间是在规定的界限内，即20天±4小时、以及27天±5小时，其低于当前考虑的制造中储存时间下限。

其他工艺参数和生化参数

低pH储存之后的pH

在低pH储存后，直接地、以及根据欧洲药典(EP)推荐的方法(即，用0.9％NaCl溶液稀释至1％蛋白质)再次测量pH值。在处理之后，通过直接测量法测量的pH接近在低pH储存之前的pH值；即，差异范围(储存后pH减去储存前pH)是-0.07至+0.04。根据EP方法测量的pH始终比直接测量方法测量的pH高0.2至0.3。在pH测定中，对于这两个不同的方法，当使用EP方法时pH值的这一略微提高是典型的。这一事实也被考虑在制造规模下规定的限定中，而在低pH处理之后对于pH的限定如下：当通过直接测量法测定时为4.4至4.9，并且当通过EP方法测定时是4.6至5.1。

分子大小分布(MSD)

对于两个未掺料的对照试验，研究储存之前和之后(通过高效液体色谱分析测量)的分子大小分布。将试验结果与3个在Subcuvia NG开发阶段期间生产的“放大规模”批次相比较，并且与定制的材料IGSC64(14％和20％蛋白质浓度)相比较。批次IGSC64，其也称为“放大规模”批次，在制造中不经受在低pH和升高的温度下的储存，因为没有足够的材料可用于该步骤。将所有结果彼此相比较。分子大小分布的数值，尤其是IgG单体的百分率，接近于在“放大规模”试验中观察到的数值。对于第二个对照试验，其中在储存之后IgG单体的浓度要低几个百分点，应注意该材料在储存以前已经具有相对低浓度的IgG单体，这也适用于在“放大规模”工艺内测试的材料。因此，分子大小分布数据支持缩小规模的工艺与大规模工艺的等效性。

γ球蛋白的纯度

测定来自两个未掺料的对照试验的样品中γ球蛋白的纯度(通过CA电泳)，并且与从“放大规模”批次获得的结果和从定制的材料IGSC64(14％和20％蛋白质浓度，仅在低pH处理之前的数值，详细说明参见上文)获得的结果相比较。将在缩小规模的工艺期间测定的所有γ球蛋白纯度的数值与从“放大规模”批次获得的结果相比较，并且在测定精确度之内(相对标准偏差是1.5％)。这些结果显示了缩小规模的工艺与制造工艺的可比性。

病毒滴定结果

细胞毒性

在对照试验中研究在低pH和升高的温度下储存之前获得的中间体的细胞毒性，所述对照试验使用对于被掺加病毒的试验所描述的掺加模拟物且调节至各个pH的材料。在所有两个试验中，在pH调节之前和之后的掺加模拟物的工艺中间体对于所使用的细胞都仅显示出非常弱的细胞毒效果，除在试验2中对BT细胞没有显示细胞毒效果之外。而调节pH的中间体从1.0 log₁₀以上稀释度起都没有显示出细胞毒效果。对于掺加病毒的试验，注意到细胞毒性没有显著差异。

干扰测试

来自干扰测试的结果显示，样品基质对于低滴度的BVDV和MMV的检测没有显著的干扰：在被掺料的细胞培养基对照和被掺料的Subcuvia NG中间体之间的病毒滴度差异是在-1.0log₁₀到0.1log₁₀之间，这在病毒滴定测定的精确度范围之内。因此，在病毒灭活试验期间获得的滴度没有因干涉效应而失真，并且代表样品的实际滴度。

病毒灭活

用病毒BVDV和MMV中的每一个进行两个试验，即，试验1为13.5％蛋白质浓度，而试验2为20.9％蛋白质浓度。两个试验都是在pH 4.9±0.1和30±1℃下进行，其中每星期一次将温度降低至25±1℃并保持至少6小时。两个试验的结果对比显示，在Subcuvia NG可能的蛋白质浓度上限和下限处进行的两个试验之间的病毒灭活动力学没有显著差异。

使用最少有利于病毒灭活的条件，即储存时间和温度下限、以及pH上限，对于BVDV而言，显示出在20天±4小时储存之后，BVDV显著灭活；并且在储存27天±5小时之后，所有能够被掺加至各个Subcuvia NG中间体中的病毒完全灭活，无论研究条件如何。在两个试验中，在第20天，仍然能够检测到来自BVDV的残留传染性。然而，在第27天储存结束时，所有的BVDV被灭活至低于检测极限。对于MMV，减少因数显示，该工艺步骤对产品的病毒安全性有实质性贡献，就非脂质包膜病毒而言也是如此。对于使用的病毒，在下文还将更详细地讨论单个的病毒滴度和减少因数。另外，对于每个病毒，在各个结果表格后给出了病毒灭活动力学的图解说明。

BVDV

在储存第20天之前，BVDV被灭活至接近检测极限(试验1)或者至检测极限(试验2)，在试验1和试验2中分别给出了5.3log₁₀和5.5log₁₀的减少因数。对于两个试验，在储存27天后，所有被掺加Subcuvia NG中间体的BVDV被灭活至低于检测极限，在试验1和试验2中减少因数分别为＞6.6log₁₀和＞6.5log₁₀。在两个试验的灭活动力学中，没有显著的差异能够被观察到。在试验1(具有13.5％蛋白质浓度)和试验2(具有20.9％蛋白质浓度)中，两个中间体显示出类似的灭活动力学。

在储存20天±4小时后，在升高的温度下低pH处理显示出BVDV的灭活效果，计算的平均减少因数为5.4log₁₀。在低pH和升高的温度下储存27天后，实现了完全灭活BVDV至低于检测极限，计算出平均减少因数为＞6.6log₁₀。

MMV

对于MMV，在低pH和升高的温度下储存20天后，计算出试验1和试验2的减少因数分别为2.9log₁₀和3.1log₁₀。计算的平均减少因数是3.0log₁₀。在低pH处理27天之后，得到了3.4log₁₀和3.7log₁₀的减少因数，计算的平均减少因数是3.6log₁₀。这些减少因数显示，就细小病毒而言，该工艺步骤对于制造工艺的病毒性安全分布有实质性贡献，其中细小病毒对于物理化学灭活有极高耐抗性。在两个试验中的病毒灭活动力学是二相性的，在第一个7天期间灭活较快，在后三个星期期间灭活稍慢。

保持对照物

为了研究病毒灭活机制，即，是否被pH或者温度或者两者的组合所介导，将3个保持对照物保持在各个条件下。

在2℃至8℃下保持27天±5小时的“组合保持对照物”(pH 7.0±0.1)的滴定结果是，研究的两种病毒的病毒滴度与被掺加病毒的起始原料的病毒滴度相当，但在试验2中MMV除外，其中观察到滴度有较小损失(1.6log₁₀)。

在30±1℃和pH 7.0±0.1(“pH保持对照物”)下储存显示，脂质包膜病毒BVDV对于在升高的温度储存下很敏感。在两个试验中，BVDV被灭活4.6log₁₀。而且，非脂质包膜病毒MMV在试验1和试验2中分别被灭活3.3log₁₀和3.8log₁₀。

“温度保持对照物”(t HC)在低pH和2℃至8℃下储存27天±5小时的滴定结果是，研究的两种病毒的病毒滴度与被掺加病毒的起始原料相当。这些结果表明，BVDV和MMV对在低温下在4.4至4.9范围内的低pH储存具有耐抗性。

合在一起，3个保持对照物的结果建议：

●对于BVDV的灭活，温度将是最重要的因素，同时低pH有一定的贡献(基于如下事实：在27天后，在30±1℃下和中性pH的对照被基本上灭活、但不完全灭活)。

●对于MMV的灭活，温度似乎是唯一的相关因素，因为在27天后，低pH动力学样品的病毒滴度实质上与在中性pH和30℃下的对照相同。

总结和结论

在本研究的过程中，建立了在Subcuvia NG制造中在低pH和升高的温度下储存的缩小规模的模型，并且其与制造工序的等效性通过几个工艺参数的测定被显示出来。另外，来自缩小规模的模型和制造工艺的中间体的生化参数对比进一步支持了两种工艺的等效性，表明在缩小规模期间获得的减少因数对于大规模也是有效的。为了研究就病毒灭活而言的稳定性，研究了Subcuvia NG中不同蛋白质浓度的影响、将被掺料的起始原料的pH调节至与制造工艺相当的上限，并且研究了温度周期性下降的影响。在研究中获得的病毒减少因数和灭活动力学表明，脂质包膜病毒BVDV通过在27天内在低pH和升高的温度下储存而被有效地强力灭活。而且，在低pH和升高的温度下储存20天后，对于BVDV，取得了显著的BVDV灭活，计算的平均减少因数是5.4log₁₀。对于细小病毒模型MMV，计算的平均减少因数，即，在储存20天后为3.0log₁₀，并且在储存20天后为3.6log₁₀，表明对于20天以及27天的储存时间，就小的非脂质包膜DNA病毒对于较高物理化学的抗性而言，该工艺步骤进一步对制造工艺的病毒安全性做出了贡献[2]。

对于MMV和BVDV，研究的两个蛋白质浓度都显示出相同的灭活动力学，这建议对于浓缩的免疫球蛋白溶液和病毒BVDV及MMV而言，蛋白质浓度对病毒灭活能力的影响并不显著。

应理解，在此描述的实施例和实施方式是仅用于示例性目的，并且对其进行的各种改进或者变化属于本领域的技术人员的常识，并且在不违背本申请的精神和范围的情况下应被包括在附后的权利要求的范围内。因此将在此引用的所有公开、专利、以及专利申请的全部内容并入本文以供参考以用于所有目的。

Claims (10)

1.一种制备浓缩免疫球蛋白G(IgG)组合物的方法，其包括下述步骤： 

(A)使用包含第一超滤膜的第一超滤/渗滤体系，将包含IgG的第一溶液浓缩至蛋白质浓度为至少22％(w/v)，借此形成第一IgG浓缩物； 

(B)收集来自第一超滤/渗滤体系的第一IgG浓缩物； 

(C)通过使后洗涤缓冲液再循环经过第一超滤/渗滤体系，后洗涤第一超滤/渗滤体系，其中洗涤第一超滤/渗滤体系所用的后洗涤缓冲液的体积等于第一超滤/渗滤体系的死体积的两倍以上，借此形成第一IgG后洗涤溶液； 

(D)将第一IgG后洗涤溶液从第一超滤/渗滤体系转移进入包含与第一超滤/渗滤膜类型相同的第二超滤膜的第二超滤/渗滤体系，其中第二超滤体系小于第一超滤/渗滤体系； 

(E)使用包含第二超滤/渗滤膜的第二超滤/渗滤体系，通过超滤将第一IgG后洗涤溶液浓缩至蛋白质浓度为至少22％(w/v)，借此形成第二IgG浓缩物；以及 

(F)合并来自第二超滤/渗滤体系的第二IgG浓缩物和所述第一IgG浓缩物，借此形成浓缩IgG组合物；

(G)后洗涤第二超滤/渗滤体系，借此形成第二IgG后洗涤溶液；以及 

(H)使用第二后洗涤溶液调节整体溶液的最终蛋白质浓度。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(A)中的浓缩包括： 

(i)通过超滤将包含IgG的第一溶液浓缩至蛋白质浓度为2％-10％(w/v)； 

(ii)对步骤(i)形成的浓缩物相对于低pH的0.25M的甘氨酸溶液进行渗滤；以及 

(iii)进一步浓缩溶液。 

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在具有开放通道筛的盒中进行步骤(A)中的浓缩，以及超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)为100kDa以下。 

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)为90kDa以下。 

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)为80kDa以下。 

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)为70kDa以下。 

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)为60kDa以下。 

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)不超过50kDa。 

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第二超滤/渗滤膜的表面积是第一超滤/渗滤膜表面积的十分之一以下。 

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IgG是人IgG。