TWI579301B

TWI579301B - 多價免疫球蛋白之濃縮物之製造方法

Info

Publication number: TWI579301B
Application number: TW101124715A
Authority: TW
Inventors: 阿布迪莎特克托羅; 達米恩巴塔耶; 喬治斯米修
Original assignee: 法國分裂與生物技術實驗室
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2012-07-10
Publication date: 2017-04-21
Also published as: EP2731966B1; AU2012282566A1; CA2838930C; BR112014000278A2; CN103687874A; CN103687874B; FR2977893A1; WO2013007740A1; CA2838930A1; US20140141021A1; AU2012282566B2; EP2731966A1; JP6132839B2; ES2625030T3; US9718856B2; FR2977893B1; TW201307384A; JP2014520829A; KR20140062459A

Description

多價免疫球蛋白之濃縮物之製造方法

本發明係有關於一種用於治療使用之多價免疫球蛋白濃縮物的製造方法。

免疫球蛋白(Ig)由B淋巴球與漿球(plasmocytes)合成，其分佈於血漿、血管外液及分泌物中。根據其蛋白質結構，可被分為5個種類：IgG、IgA、IgM、IgE與IgD。其在人體內的自然分佈為：75%的IgG，20%的IgA，5%的IgM，以及<1%的IgE與IgD。一般來說，每公升的血漿中含有8至15 g的IgG。在血漿中，循環性IgG免疫球蛋白的半衰期為約21天，IgA、IgM、IgD與IgE則小於7天。

相對於針對各種傳染性病原之抗體具有高度多樣性，人源多價免疫球蛋白與所使用的藥學組成有97%為IgG。

富含多價免疫球蛋白之人類血漿分層已知可用於治療各種先天性感染或缺陷。可藉由給予多價或一般免疫球蛋白以改善主發性免疫缺陷和次發性缺陷(白血病、骨髓瘤或復發性感染)。其可分離自特定抗體(抗-恆河猴(Rhesus)或抗-D毒性抗體)。其可以非常高的劑量，大於2 g/kg/day，以緩和病情的發展，目前對病理生理所知甚少，但其中包含免疫形式的部分。給予多價免疫球已顯示至少可暫時治療免疫性之血小板減少，亦稱為免疫性血小板缺乏紫斑症。多價免疫球蛋白也可用於治療 Guillain-Barré’s症候群、脫髓鞘多發性神經炎、多發性硬化症、肌無力Lambert-Eaton’s症候群、皮肌炎。

多價免疫球蛋白含有多種分子，因此其作用機制複雜：作用發生於多個層次，其改變病患免疫系統的平衡，且因此達到治療效果。

目前已知許多多價免疫球蛋白的製造方法。最佳之製造方法包含多個乙醇沉澱步驟(Cohn et al.1946,J.Am.Chem.Soc.68,459)。

特別是專利EP 0703922(Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies,“Concentré d’immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré”(Immunoglobulin G concentrate for therapeutic use and method for producing said concentrate))揭示一種由人類血漿或冷凍沉澱血漿上清液製造免疫球蛋白G的方法。此方法不包含乙醇沉澱，且包括一系列的層析步驟與利用溶劑/界面活性劑之病毒去活化步驟。由於一系列的層析步驟，使得此方法的產率較低，此方法實質上包括2個陰離子及陽離子交換串聯循環，以及2個超過濾步驟。

專利EP 1385886(Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies,“Procédé de préparation de concentrés d’immunoglobulines humaines à usage thérapeutique”(Method for preparing human immunoglobulin concentrates for therapeutic use))揭示一種人類免疫球蛋白的製造方法，包括脂質及蛋白質沉澱污染物的前純化，以及陰離子交換樹脂與鹼性pH環境的層析步驟。此方法可獲得每公升起始處理血漿4 g以上的免疫球蛋白。

Tanaka K.等人2000(“High quality human immunoglobulin G purified from Cohn fractions by liquid chromatography”Braz J Med Bio Res 2000,33(1)：27-30)揭示一種由Cohn’s方法獲得之«I+II+II»與«II+III»部分來純化免疫球蛋白G的方法，其利用3種膠體的層析分離，2種離子交換膠體(Q-Sepharose FF與CM-Sepharose FF)以及1種過濾膠體(Sephacryl S-300 HR)。此方法可獲得每公升血漿4.3±0.2 g以上的免疫球蛋白G。

然而，可用免疫球蛋白治療之適應症大量增加，免疫球蛋白的需求量也顯著提升，且須確保最終產物具有高純度且無病毒無染。

因此，本發明之目的為提供一種人類多價免疫球蛋白濃縮物的製造方法，相較於已知的方法，其具有更高的產率。

本發明因此關於一種由一血漿或富含免疫球蛋白之血漿分層(plasma fraction)的初紿溶液來製造多價免疫球蛋白濃縮物的方法，其特徵在於： (a)利用辛酸移除蛋白污染物以獲得不含蛋白酶之溶液的步驟，(b)對此不含蛋白酶之溶液進行一流體化床層析步驟(fluidized bed chromatography step)，此方法可獲得人類多價免疫球蛋白的濃縮物，其產率大於4.5 g(免疫球蛋白)/L(血漿或富含免疫球蛋白之血漿分層)。

本發明方法中利用辛酸移除蛋白污染物之步驟(a)最後所獲得之溶液，其中蛋白酶的濃度符合歐洲藥典7.5版01/2012：0918之2.6.15標準，相較於含有30 g/L免疫球蛋白的稀釋液，最多為35 IU/mL。

本發明發現依據合併利用辛酸移除蛋白污染物之步驟與流體化床層析步驟可大幅增加免疫球蛋白的產量。

在一實施例中，本發明包括合併在酸性pH值下利用辛酸移除蛋白污染物之步驟，接著將經辛酸處理結束所獲得之上清液於酸性pH值下進行澄清(clarification)，使免疫球蛋白可在流體化管柱(一種陰離子交換型及/或親和性型及/或«偽親和性(pseudo-affinity)»型樹酯，較佳為«混合(mixed-mode)»型)中結合至層析膠體上，其可增加多價免疫球蛋白的產量。較佳地，若將多價免疫球蛋白由層析膠體沖提下來的條件可直接進行後續程序，不需經過任何透析或超過濾(ultrafiltration)技術的步驟，則可增加產率。特別是，本發明之方法可提升每公升血漿0.25%的多價免疫球蛋白產率及高純度(99%)之終產物。

在一具體實施例中，本發明之方法包括在利用辛酸移除蛋白污染物(a)與流體化床層析步驟(b)之間有一於酸性pH值下的澄清步驟，較佳使用深層過濾。

沖提步驟較佳係指選擇性萃取G型免疫球蛋白(IgG)。

本發明更有關於一種由一血漿或富含免疫球蛋白之血漿分層的初始溶液來製造多價免疫球蛋白濃縮物的方法，其特徵在於：(a)於酸性pH值下利用辛酸移除蛋白污染物以獲得不含蛋白酶之溶液的步驟，(b)於酸性pH值下之澄清步驟，(c)對此不含蛋白酶之溶液進行之流體化床層析步驟，(d)於免疫球蛋白之沖提緩衝液中的沖提步驟。

特別是，利用儘可能高孔隙(porosity)之深層過濾來進行步驟(b)之酸性pH值澄清，但此經澄清的上清液可通過一流體化床管柱。

本發明方法中利用辛酸移除蛋白污染物之步驟(a)中最後所獲得之溶液，其蛋白酶的濃度符合歐洲藥典7.5版01/2012：0918之2.6.15標準，相對於含30 g/L免疫球蛋白之稀釋液最多為35 IU/mL。

本發明有關於上述方法，且在酸性pH值後之澄清步驟(b)後，合併一提高pH值的步驟，使其可對應於多價免疫球蛋白在流體化床模式中結合至層析樹酯的條件。

令人驚訝的是，由本發明方法最終所獲得之人類多價免疫球蛋白濃縮物具有小於30%的抗-補體活性(anti-complementary activity)，其以歐洲藥典7.5版01/2012：0918，第2.6.17段所述之方法測定。

本發明中所述之«多價免疫球蛋白»係指所有的免疫球蛋白，或免疫球蛋白的片段，例如，F(ab’)2或F(ab)，與任何在生產過程中所獲得的中間產物(intermediate fraction)。

«血漿分層»係指任何經處理之血液溶液，其可為天然人類血漿的分離或分餾，尤其是任何在製備多價免疫球蛋白濃縮物之方法中所獲得的中間產物。

«富含免疫球蛋白的血漿分層»係指一含有免疫球蛋白的血漿分層，其免疫球蛋白的程度高於天然人類血漿。

«I+II+III»或«II+III»沉澱物(precipitate)係指由依據Cohn’s方法(Cohn et al.1946,J.Am.Chem.Soc.68,459)或Kistler與Nitschmann(1962,Vox Sang.7,14)方法經乙醇分離之血漿所獲得之沉澱物。

«蛋白污染物»係指除了G型免疫球蛋白之外所有的蛋白質，例如，但不限於，A、E或M型免疫球蛋白以及其化血漿蛋白，例如，但不限於：- 白蛋白、運鐵蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白原等，- 凝血因子，例如，但不限於，FX、FXI或FXII， - 蛋白酶，例如，但不限於，激肽釋放酶(kallikrein)、前激肽釋放酶或激肽釋放酶的活化劑，以及- 抗-A與抗-B血凝素。

«流體化床層析»係指一種技術，其使用與重力反方向的流體於高密度層析珠粒中，因而造成珠粒之間產生空間，使稍微澄清之溶液可通過層析管柱而不造成任何溶液流體的阻塞。流體化床層析可為離子交換型、親和型、«偽親和型»、«混合型»(例如，同時具有離子交換與偽親和性)層析。

特別是，流體化床層析為«混合型»的UpFront IVIG膠體，其包括結合靜電荷之化學配體與疏水基團，以對免疫球蛋白提供特定的偽-親和性。

本發明中所用之辛酸濃度須小心控制，例如，須以夠低最終濃度的辛酸以達成污染物的沉澱，在溶液其他成分的沉澱過程中不會捕捉多價免疫球蛋白。辛酸的濃度較佳為0.5至1.5%，較佳為0.8至1.2%，特別為0.9至1.1%，且最特別等於1%(辛酸百分比為每單位溶液體積之辛酸克重)。

在一實施例中，利用辛酸移除蛋白污染物的步驟是在pH值為4.3至4.9，較佳為4.6至4.8下進行。

申請人驚人地發現，當之後包括一後續之澄清步驟時，本發明之多價免疫球蛋白濃縮物之製造方法中所使用的辛酸濃度會對此方法的產量造成直接的影響。若辛酸的濃度過低，會導致沉澱情況不佳(特別是大部分的脂質會殘留於溶液中)，且選擇性的澄清步驟將難以進行。另一方面，若辛酸濃度過高，在經過選擇性澄清後，多價免疫球蛋白會形成沉澱，且不存在於上清液中。

在一實施例中，酸性pH值的澄清步驟可為移除蛋白污染物之步驟與流體化層析步驟之間。此酸性pH值澄清步驟是在pH 4.3至4.9下進行，較佳為pH 4.4至4.8，較佳為pH 4.6至4.8。

在一具體實施例中，此酸性pH的澄清步驟為利用深層過濾(depth filtration)的澄清步驟。此澄清步驟僅擋住可能會影響流體化床運作之較大顆粒。較佳使用滞留率為15至100 μm，較佳為25至70 μm或15至40 μm的濾膜。在一實施例中，在此步驟中使用SEITZ T5500之澄清濾膜，其滞留率為25-70 μm，且更特別為T2600濾膜，其滞留率為15-40 μm。任何種類的濾膜，不論帶電或不帶電，只要具有相同的澄清效果皆可使用。澄清較佳在濾土(filtration earths)的存在下進行，藉此可降低濾膜的表面。為了增加溶液過濾時的流動性，澄清較佳在4至30℃，更特別是10至25℃，例如為20至25℃下進行。本發明澄清步驟中所使用濾膜的特性較佳為至少40 L/m²，即8 kg沉澱物/m²，更特別是55 L/m²，即11 kg沉澱物/m²。

在深層過濾結束後，依據此方法接續步驟的需要，較佳將濾液的pH值與滲透壓調整至不需透析或超過濾步驟。

在一具體實施例中，流體化床層析步驟可為一«混合型»層析，其包括： - 添加至一層析管柱，其已利用pH值為4.5至8；較佳為4.5至7.5；4.5至7.0；4.5至6.8；4.5至6.5；5.0至7.0；5.0至6.5；5.5至6.3；或為5.7至6.3的緩衝液進行事先平衡，事先將深層過濾中澄清步驟的溶液調整至相同的pH值，即pH值為4.5至8，更特別為4.5至7.5；4.5至7.0；4.5至6.8；4.5至6.5；5.0至7.0；5.0至6.5；5.5至6.3；或為5.7至6.3，- 以緩衝溶液清洗上述管柱直到移除管柱中所有的非吸附蛋白，- 利用pH值為8至10，較佳為8至9.8；8.3至9.8；8.5至9.8；8.8至9.8；9.0至9.8；9.5至9.8之沖提緩衝液沖提吸附於管柱上之多價免疫球蛋白，以及- 回收此富含人類多價免疫球蛋白之溶液。

本發明流體化床所之«混合型»層析使用具有不同尺寸之珠粒(beads)，其可保持流體化床的穩定。本發明流體化床之«混合型»層析中所使用之珠粒具有2.5至3.5kg/L的平均密度，直徑為20至400μm，以及在本發明條件下具與多價免疫球蛋白結合的能力，其較佳大於70g/L。

為了在簡單地調整pH與導電度後，即可直接進行下個步驟，流體化床層析所使用之沖提例如為一鹼性pH值與低離子強度的沖提。本發明中所使用之沖提緩衝液可例如為含有：5至500mM的甘胺酸，特別是20mM，以及5至500mM的NaCl，特別是20mM，pH值為7至10，特別是為9 至10，特別是為9.5至10，且更特別是為pH 9.5至9.8。

當接續流體化床層析的步驟無法接受高離子強度的條件，且流體化床層析步驟所獲得之沖提液需要事先大量稀釋或透析時，可使用具高pH值但低離子強度的沖提緩衝液。本發明所使用之沖提緩衝液可例如為含有：5 to 20 mM的甘胺酸，特別是10 mM，pH值為9.5至10.5，特別是為9.8至10.5，且更特別為pH 9.8至10.2。

在一具體實施例中，本發明之方法在流體化床層析步驟後更包括，一或複數個下列步驟：(i)病毒去活化步驟；(ii)對先前步驟所獲得之溶液進行陰離子交換的層析步驟，以移除病毒去活化步驟中化學物質並降低IgA與IgM的污染；(iii)移除先前步驟所獲得之溶液中抗-A與抗-B抗體的步驟；(iv)通過減小孔徑由100至15 nm之奈米濾膜進行的過濾步驟；(v)將先前步驟所獲得之溶液經超過濾之濃縮步驟與一配製步驟；(vi)傳統的消毒過濾步驟。

本發明方法所獲得之多價免疫球蛋白濃度物通常至少經過一移除或去活化至少一致病因子(infectious agent)的步驟。本發明之多價免疫球濃縮物一般具有至少經過一移除或去活化至少一致病因子的步驟。在致病因子之中，可為病毒與非傳統之傳染性因子(NCTAs)，例如，普恩(prions)。病毒去活性通常包括一化學處理，例如，一溶劑及/或界面活性劑及/或熱，例如UVC、伽瑪射線、及/或巴氏殺菌。奈米過濾也有助於移除致病因子，特別是病毒。此包括較佳包括至少一溶劑與界面活性劑的處理，以及奈米過濾。溶劑及/或界面活性劑(一般稱為溶劑/界面活性劑處理)的處理特別包括磷酸三丁酯(TnBP)及/或界面活性劑的處理，其擇自於Triton X-100、Tween(較佳為Tween 80)、膽酸鈉及2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧]乙醇(辛苯昔醇)。奈米過濾一般係指多價免疫球蛋白濃縮物透過一孔徑小於80 nm之濾膜的過濾。可使用之濾膜包括，例如BioEx,Planova^TM 75 nm、Planova^TM 35 nm、Planova^TM 20 nm或Planova^TM 15 nm(Asahi corporation)、Ultipor DV 50或DV 20(Pall corporation)、Virosart CPV(Sartorius)、Viresolve NFR或NFP(Millipore)濾膜。較佳奈米過濾在步驟(v)之濃縮多價免疫球蛋白之超過濾與配製步驟之前完成。在一具體實施例中，經純化之多價免疫球蛋白濃縮物經過一序列孔徑為15至50 nm，例如20或35 nm之濾膜的過濾。

本發明方法中所使用之陰離子交換層析在一鹼性pH與低離子強度下進行以結合多價免疫球蛋白。此步驟可參照例如專利EP1385886(Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies,“Procédé de préparation de concentrés d’immunoglobulines humaines à usage thérapeutique” (Method for preparing human immunoglobulin concentrates for therapeutic use))所述之方法。樹脂以任何低濃度、具緩衝特性、pH 8.5至9.5之緩衝液進行平衡，例如Tris緩衝液或特別是甘胺酸緩衝液。甘胺酸濃度可包括為5至50 mM，例如為5至20 mM，且特別為8至10 mM。pH值可調整為為8.5至9.5，且特別是為8.9至9.1。

較佳流體化床層析之沖提液經稀釋且調整pH值使多價免疫球可結合至陽離子交換層析的載體上。稀釋以水進行使導電率為1,500 μS/cm，且更佳為1,100 μS/cm。以平衡緩衝液清洗管柱，接著以20 mM Na/Na₂PO₄緩衝液(pH 6.2)沖提多價免疫球蛋白。最後，以150 mM NaCl溶液清洗管柱。

由陰離子層析所獲得溶液中之抗-A與抗-B抗體的移除可參照專利申請案WO 2007/077365(Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies,"Immunoglobulin G(IgG)concentrate depleted of anti-A and anti-B antibodies and of polyreactive IgGs")中所述之方法。先前步驟所獲得之溶液經過一移除抗-A與抗-B抗體的步驟，此步驟藉由過濾載體混合物上多價免疫球蛋白濃縮物之免疫親和性層析，且其基質上具有與A及B血型抗原類似的寡糖。

在本發明之具體實施例中，初始溶液為血漿或以習知方法所製備之富含免疫球蛋白的血漿分層，且特別以乙醇及/或層析分離之部分。

在一具體實施例中，初始溶液為一參照Cohn或Kistler與Nitschmann方法(1962,Vox Sang.7,414)由血漿乙醇分餾所獲得之«I+II+III»沉澱物或«II+III»沉澱物，並回溶成溶液。在本發明之範圍中，較佳此«I+II+III»沉澱物或«II+III»沉澱物回溶至經純化之注射用水(wfi)或含離子溶液中。本發明中的離子溶液可為濃度少於或等於20 mM，較佳為5至15 mM，較佳10 mM之NaCl溶液。

在另一實施例中，將«I+II+III»沉澱物或«II+III»沉澱物回溶至溶液是在可使污染性纖維蛋白原沉澱的條件下進行。將«I+II+III»沉澱物或«II+III»沉澱物以專一性針對纖維蛋白原之沉澱溶液處理後，可獲得污染性纖維蛋白原的沉澱，沉澱溶液例如為CaCl₂溶液，其濃度少於或等於20 mM，較佳為5至15 mM，較佳為含10 mM鹽類的溶液。在此實施例中，纖維蛋白原保持沉澱形式，但多價免疫球蛋白為溶解狀態。

本發明一特定實施例有關於一種多價免疫球蛋白濃縮物的製造方法，包括：(i)利用辛酸移除蛋白污染物之步驟；(ii)«混合型»之流體化床層析步驟；(iii)經溶劑/界面活性劑處理之病毒去活化步驟；(iv)離子交換層析步驟；(v)移除抗-A與抗-B抗體的步驟； (vi)經孔徑為100至15 nm之奈米濾膜的過濾步驟；(vii)將先前步驟所獲得之溶液經超過濾之濃縮步驟與配製步驟，以及接著傳統消毒過濾步驟。

在另一具體實施例中，本發明有關於一種多價免疫球蛋白濃縮物的製造方法，包括：(i)將血漿或富含免疫球蛋白之血漿分層的初紿溶液經乙醇處理，以獲得«I+II+III»or«II+III»沉澱物，此方法可參照Cohn’s方法(已揭示)或Kistler與Nitschmann方法(1962,Vox Sang.7,414)；(ii)將«I+II+III»或«II+III»沉澱物回溶至注射用中，於20℃(較佳為4至15℃)下攪拌。可給予各種離子以促使沉澱的多價免疫球蛋白回溶至溶液中，例如，陽離子，如Na+，陰離子，如Cl-，例如NaCl。鹽類的濃度小於或等於20 mM，較佳為為5至15 mM，且較佳等於10 mM，例如，10 mM的NaCl；(iii)以辛酸使«I+II+III»或«II+III»沉澱物回溶至溶液中的蛋白質污染物沉澱，辛酸的濃度為0.5至1.5%，特別是0.8至1.2%，特別是0.9至1.1%，以獲得不含蛋白酶的血漿溶液，且接著將pH值調整至4.3至4.9，較佳為4.4至4.8，且較佳為4.6至4.8。在一實施例中，以HCl進行pH的調整；(iv)將由步驟(iii)所獲得之不含蛋白酶之血漿溶液於酸性pH值以深層濾膜進行過濾，深層濾膜具有最大的孔徑，可容許濾液注入使用於流體化床模式的層析管柱中； (v)調整由步驟(iv)獲得之溶液的滲透壓與pH值；(vi)將上述步驟所獲得之溶液進行流體化床層析，以獲得富含人類多價免疫球蛋白的血液溶液。較佳此層析容許多價免疫球蛋白沖提液於一近似於後續步驟所需緩衝液之緩衝液中，以限制因透析、超過濾、或任何重新配製溶液所需步驟中造成多價免疫球蛋白的流失；(vii)以溶劑/界面活性劑處理，特別包括以三-n-丁基磷酸鹽(TnBP)及/或一界面活性劑的處理，其擇自於Triton X-100、Tween(較佳為Tween 80)、膽酸鈉及2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧]乙醇(辛苯昔醇)，以去活化上述步驟中所獲得之溶液中的病毒；(viii)利用交聯多醣或乙烯聚合物膠體、TMAE基團骨架對上述步驟中所獲得之溶液進行陰離子交換層析，以移除上述步驟中所使用之溶劑及界面活性劑，並移除IgA與IgM汙染物；(ix)如專利申請案WO 2007/077365(Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies,"Immunoglobulin G(IgG)concentrate depleted of anti-A and anti-B antibodies and of polyreactive IgGs".)所示之親和性層析，以移除上述步驟中所獲得溶液中之抗-A與抗-B抗體；(x)對上述步驟中所獲得溶液進行奈米過濾，利用孔徑50 nm(例如PALL DV20濾膜)或35 nm(例如PLANOVA 35 N濾膜)的前濾膜(pre-filter)，接著利用孔徑20 nm(例如PLANOVA 20 N濾膜)或15 nm(例如PLANOVA 20 N或BIOEX濾膜)的濾膜，以移除可抵抗步驟(ix)處理的普恩(prion)或病毒；(xi)對上述步驟中所獲得溶液進行濃縮或滲濾(diafiltration)，以獲得含至少50 g/L多價免疫球蛋白的溶液。

本發明方法中步驟(iii)利用辛酸移除汙染物所獲得溶液，其符合歐洲藥典6.7版01/2012：0918之2.6.15標準，含30 g/L免疫球蛋白之沉殿稀釋液最多為35 IU/mL。

本發明之目的更包括本發明方法所獲得之人類多價免疫球濃縮物，其特徵在於此濃縮物具有小於30%之抗補體活性。

本發明之目的更包括製備一種液體、冷凍或凍乾之多價免疫球蛋白藥學組成物，其特徵在於：a.添加一或複數種藥學上可接受之穩定劑至本發明方法所獲得之人類多價免疫球濃縮物中，以及b.選擇性地冷凍或凍乾上述步驟所獲得之藥劑；因此，此藥劑為液體、冷凍或凍乾形式。

本發明中所使用之藥學上可接受的穩定劑為，例如，專利申請案FR 2853551、FR 2961107與FR 2962650中所述。專利申請案FR 2853551揭示一種包含醇糖(alcohol sugar)，例如甘露醇、甘氨酸與非離子性界面活性劑的穩定配方。較佳甘露醇的濃度為30 g/L至50 g/L，甘氨酸的濃度為7 g/L至10 g/L，且非離子性界面活性劑的濃度為20至50 ppm。專利申請案FR 2961107揭示一種包含甘氨酸與非離子界面活性劑，且pH值小於或等於4.8的穩定配方。甘氨酸的濃度為至少200 mM，較佳為250 mM±50 mM，且非離子性界面活性劑的濃度為20至100 mg/L，較佳為35 mg/L±15 mg/L，較佳為50 mg/L。專利申請案FR 2962650揭示人類免疫球蛋白G製劑的賦形劑，其擇自於胺基酸、醣類、醣類衍生物、鹽類與界面活性劑(surfactants)，其界面活性劑添加的濃度須小於此界面活性劑的臨界微胞濃度。

本發明之目的更包括此人類多價免疫球蛋白之液體、冷凍或凍乾藥學組成物的使用，特別是，用於治療病徵，例如，脫髓鞘性神經炎，蘭伯特-伊頓(Lambert-Eaton)肌無力症候群，皮肌炎，多發性硬化症，用於原發性免疫缺陷之替代治療，例如，先天性丙球蛋白缺乏症、先天性低丙球蛋白缺乏症、多樣性免疫缺乏症、嚴重複合型免疫缺乏症、Wiskott Aldrich症候群、嚴重性二次免疫球蛋白低下和反覆感染之多發性骨髓瘤或慢性淋巴白血病、HIV-感染病童之反覆感染、或治療免疫球蛋白低下或體液免疫功能障礙之原發性免疫缺陷。本發明更包括此人類多價免疫球蛋白之液體、冷凍或凍乾藥學組成物的使用，用於治療體液性免疫之二次性免疫缺陷，特別是，免疫球蛋白低下和反覆感染相關之慢性淋巴細胞白血病或多發性骨髓瘤、感染相關之免疫球蛋白低下的幹細胞移植、以及治療重大出血風險或改正血小板數量之醫療或手術前之成人和兒童特發性血小板減少性紫癜(ITP)、鳥槍彈樣網膜脈絡膜病變(Birdshot retinochorioditis)、Guillain-Barré症候群、多源性運動神經病變(MMN)、慢性脫髓鞘性神經炎(CIDP)、以及川崎症(Kawasaki’s disease)。

以下詳述本發明方法之實施例。下述之實施例僅用於說明本發明之目的及較佳實施例，但不可用於限制本發明之範圍。

【實施例】實施例1 1.1將«I+II+III»沉澱物回溶至溶液中

使用«I+II+III»沉澱物作為起始物，其可參照Cohn或Kistler與Nitschmann方法(1962,Vox Sang.7,414)由血漿分層經乙醇處理後獲得。將56.7 g的沉澱物回溶至228 mL的軟化水中，或使用其相同比例。將混合物於15℃±5℃下攪拌20分鐘。接著將溫度提高至22℃±2℃，且緩慢地將辛酸(1%重量/體積)加入回溶«I+II+III»沉澱物的溶液中。將加入辛酸後所獲得之溶液的pH值調整至4.8，且持續攪拌此溶液60分鐘。

1.2深層過濾

將所獲得之溶液以SEITZ^®T260濾膜(Pall Corporation)進行深層過濾。此過濾阻擋«I+II+III»沉澱物中的過濾佐劑，以及因加入辛酸所產生的蛋白質沉澱。

為了獲得最佳的過濾產量，可調整樣本的pH值。

過濾後，蛋白質溶液的pH值僅被調整為6.0。pH值由4.8調整至6.0會產生少量的沉澱(不可溶的多價免疫球蛋白)並被濾膜阻擋，因而降低多價免疫球蛋白的過濾產率。

濾膜的沖洗體積(apyrogenous purified water)與初始樣本的體積相同，以獲得最佳的最終產量。

1.3流體化床之«混合型»層析

操作條件如下所示：

˙平衡與清洗緩衝液：20 mM Na/Na₂PO₄，pH 6。

˙沖提緩衝液：20 mM甘胺酸/20 mM NaCl，pH 9.8。

利用Gly/NaCl緩衝液的pH影響進行選擇沖提，可藉由簡單地稀釋(導電度及pH值的調整)，以獲得可注入離子交換管柱(TMAE Fractogel)的樣本。

1.4溶劑/界面活性劑的處理

將由實施例1.3之流體化床«混合型»層析所獲得的沖提液以溶劑/界面活性劑進行病毒去活化處理，如Neurath與Horowitz(US4,764,369)所示。

10倍濃縮溶劑/界面活性劑混合物含有3%的TnBP(磷酸三丁酯)與10%的辛苯聚醇(Octoxinol)。沖提液中的最終濃度為0.3%的TnBP與1%的辛苯聚醇。

經1小時的去活化後，將沖提液的pH值調整至9.0，並以水稀釋，使導電度小於1,100 μS/cm。

1.5離子交換層析

所使用之離子交換樹酯為TMAE-Fractogel^®(Merck)。

˙前平衡緩衝液：甘胺酸80 mM/NaCl 80 mM，pH 9。

˙平衡緩衝液：甘胺酸9 mM/NaCl 9 mM，pH 9。

在注入樣本後，以平衡緩衝液清洗，並接著以pH 6.2之20 mM Na/Na₂PO₄緩衝液進行沖提。

1.6親和性層析

所使用之親和性樹酯為Iso A/Iso B Hypercel(Pall Corporation)

將TMAE層析的沖提液以親和性層析處理，以移除抗-A與抗-B抗體。

所欲之多價免疫球蛋白會通過管柱，不會被阻擋下來。

˙於去離子水中平衡樹酯

˙不清洗管柱，回收未吸附附的部分。

1.7過濾

由親和性層析所獲得的蛋白質溶液以深層濾膜90LACUNO(3M)過濾，接著以孔隙0.2 μm的濾膜過濾。以水沖洗濾膜，並合併沖洗液與濾液。

1.8奈米過濾

前述pH 4.5的濾液先以孔徑0.1 μm之Fluorodyne II濾膜(Pall Corporation)進行前過濾，並以DV5濾膜(Pall Corporation)進行奈米過濾，接著以Planova 20N濾膜(Asahi)進行過濾。

1.9配製

以30 kDa閥值進行超過濾，將產物前-濃縮至約80 g/L，接著以相同體積進行濾析(diafiltered)直到導電度<600 μS/cm。接著，製備此產物並將蛋白質濃度調整至50 g/L。

實施例2：以本發明方法獲得試產規模之多價免疫球蛋白濃縮物 2.1將«I+II+III»沉澱物回溶至溶液中

使用«I+II+III»沉澱物作為起始物，其可參照Cohn或Kistler與Nitschmann方法(1962,Vox Sang.7,414)，由血漿分層經乙醇處理後獲得。將3 kg的沉澱物回溶至12 L的軟化水中。將此混合物於10℃±3℃下攪拌20分鐘。接著，將溫度上升至22℃±2℃，並將辛酸(1%重量/體積)緩慢地加至回溶«I+II+III»沉澱物的溶液中。將加入辛酸後所獲得之溶液的pH值調整至4.8，且持續攪拌此溶液60分鐘。

2.2深層過濾

將所獲之溶液以SEITZ^®T260濾膜(PallCorporation)進行深層過濾。此過濾會阻擋«I+II+III»沉澱物中的過濾佐劑以及因加入辛酸所產生的蛋白質沉澱。對此測試，所使用之表面積為8.7 kg沉澱物/m²過濾介質。

濾膜的沖洗體積(apyrogenous purified water)與初始樣本的體積相同，即1.5 L，以獲得最佳的最終產率。

2.3流體化床之«混合型»層析

所使用之層析樹酯為Rhobust IGIV gel(Upfront)。

直徑10 cm的管柱中具有4.3 L的樹酯。

操作條件如下所示：

˙平衡與清洗緩衝液：20 mM Na/Na₂PO₄，pH 6。

˙沖提緩衝液：20 mM甘胺酸/20 mM NaCl，pH 9.8。

2.4溶劑/界面活性劑的處理

將由流體化床«混合型»層析所獲得的沖提液以溶劑/界面活性劑進行病毒去活化處理，如Neurath與Horowitz(US 4,764,369)所示。

10倍濃縮之溶劑/界面活性劑混合物含有3%的TnBP(磷酸三丁酯)與10%的辛苯聚醇(Octoxinol)。沖提液中的最終濃度為0.3%的TnBP與1%的辛苯聚醇。

2.5離子交換層析

所使用之離子交換樹酯為EMD-TMAE Fractogel^®(Merck)

直徑12.7 cm的管柱中具有4 L的樹酯。

˙前平衡緩衝液：甘胺酸80 mM/NaCl 80 mM，pH 9。

˙平衡緩衝液：甘胺酸9 mM/NaCl 9 mM，pH 9。

在注入樣本後，以平衡緩衝液清洗。

接著，以pH 6.2之20 mM Na/Na2 PO4緩衝液進行沖提。

2.6親和性層析

所使用之親和性樹酯為Iso A/Iso B Hypercel(Pall Corporation)。

直徑7 cm的的管柱中具有154 mL的樹酯。

將TMAE層析的沖提液以親和性層析處理，以移除抗-A與抗-B抗體。所欲之多價免疫球蛋白會通過管柱，不會被阻擋下來。

˙於去離子水中平衡樹酯。

˙不清洗管柱，將非吸附附的部分回收。

2.7過濾

將由Iso A/Iso B Hypercel親和性層析所獲得的蛋白質溶液以深層濾膜90LA CUNO(3M)過濾，接著以孔隙0.2 μm的濾膜過濾。以水沖洗濾膜，並合併沖洗液與濾液。

2.8奈米過濾

2.9配製

以30 kDa閥值進行超過濾，將產物前濃縮(pre-concentrated)至約80 g/L，接著以相同體積進行濾析(diafiltered)直到導電度<600 μS/cm。接著，製備此產物並將蛋白質濃度調整至50 g/L。

實施例3：產量的方法

依照本發明實施例1且特別是實施例3之方法，以三個不同的«I+II+III»沉澱物進行個3個生產批次。以1%的辛酸移除蛋白酶。利用SEITZ T2600板式壓濾機進行過濾。

對照組批次依專利申請案EP 1385886所示之方法進行處理。

此新方法的產量如下表所示：

在配製濃縮步驟階段的累積產量(g)/蛋白質或血漿Ig(L)

相較於對照方法(EP 1385886)，本發明之方法可增加每公升經處理之血漿中的多價免疫球蛋白產量(g)。

上述實施例獲得0.26 g IgG/血漿(L)，為由相同沉澱物所製備之本發明與對照組批次兩者之間。

實施例4：抗-補體活性

以本發明方法由3個不同«I+II+III»沉澱物所製備之試產規模批次進行研究。此批次將與以工業方法所生產之相同規模(試產規模)免疫球蛋白，經專利EP 1385886所述之靜脈注射，以及由相同沉澱物依照專利申請案EP 1385886所述方法製備之3個工業批次進行比較。

試產規模批次對應於工業批次至少10%的批次規模。

根據歐洲藥典7.5版01/2012：0918之第2.6.17段的內容進行偵測，本發明批次所具有之抗-補體活性(ACA)，始終小於以專利申請案EP1385886所述方法製備之批次的抗-補體活性。在此標準下，本發明方法所製備之批次在18個月內的進展很小。

抗-補體活性(ACA)的結果如下表：

因此，本發明方法提供獲得抗-補體活性小於30%之多價免疫球蛋白濃縮物的可能性。

實施例5：本發明方法製備之免疫球蛋白的純度

實施例2之試產批次的純度分析數據如下表所示。

différentsanalyseurs”.Ann Biol Clin 1995；53：273-81.

***R.A.Goldsby,T.J.Kindt,B.A.Osborne etJ.Kuby,“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”in Immunology,5e édition,pages 148-150,W.H.Freeman,New York,2003

本發明方法所獲得之免疫球蛋白的“單體+二聚體”、子類(sub-classes)的分佈、污染物程度及抗-補體活性與EP 1385886方法所獲之免疫球蛋白相同。這些結果皆符合歐洲藥典的規定。

實施例6：本發明方法製備之免疫球蛋白的安定性

將由實施例2之試產批次所製備成的產物保持在4℃下，且將以相同起始沉澱物所製備之工業批次於相同的階段置於相同的條件下。每6個月取樣，觀察本發明批次(試產批次1、2與3)與以工業方法EP 1385886之批次(工業批次1、2與3)的3個指標。此3個偵測指標如下所述：- 免疫球蛋白G(IgG)濃度與抗-Hbs免疫球蛋白濃度的偵測，其參照歐洲藥典6.7版(Pharmeuropa,volume 21,number 2,April 2009)2.7.1段所述之方法，以及- 分子大小(聚合物、二聚物、單體及片段)的偵測，其參照歐洲藥典6.7版(Pharmeuropa,Volume 21,Number 2,Abril 2009)2.2.29.段所述之方法。

下表顯示各差異：

數據的分析：-超過18個月之IgG濃度的穩定性以及7個批次的同質性(homogeneity)，-超過18個月之抗-Hbs Igs濃度的穩定性：每批次以此標準進行，- «單體+二聚體»總合常數大於藥典所要求的85%，且每批次超過18個月。

實施例7：包括辛酸沉澱、澄清步驟與流體化床之«混合型»層析步驟的方法

辛酸處理可達到移除含血漿蛋白質沉澱物(免疫球蛋白存留於溶液中)部分以及大部分蛋白酶的目的。依據所使用辛酸的百分比及分離上清液與沉澱物的方法，多少會流失免疫球蛋白的重要蛋白。測試實驗的條件以獲得可容許流體化床層析之最大的粗澄清(coarse clarification)，以及最少的免疫球蛋白流失。對此，在第一階段，比較增加濾膜孔隙與無辛酸沉澱，並確認在不同情況下的辛酸處理。

測試-直徑90濾膜，50 cm ² ，(沖洗)，無辛酸沉澱

這些結果顯示可使用10-20 μm最小孔隙來造成阻塞以限制IgG的流失。在相同的IgG產量，相對於濾膜T5500，可選擇較小的孔隙之濾膜T2600。

分析可影響蛋白酶沉澱之辛酸百分比與溶液過濾，辛酸為0.5至1%，不添加任何過濾佐劑。將所獲得的結果與簡單離心之對照組澄清液進行比較。

測試-重新懸浮(RES)1%辛酸-直徑90之濾膜，50 cm ² ，充填210 Ml

離心對照組顯示若無後續沖洗，則有一部分的免疫球蛋白會流失於沉澱物中，此技術未被使用。最感興趣的測試條件為1%的辛酸：蛋白酶污染物很少，且免疫球蛋白的流失小於30%。因此，在過濾、產率與蛋白酶移除上，1%辛酸為最佳之妥協條件。

為增加產率，下述測試將使用較小的充填量(以180 mL取代210 mL)，且可增加沖洗緩衝液之沉澱物清洗體積，如下表所示。

測試09AXTO440 126-RES 1%辛酸-濾膜直徑90，50 cm ² ，充填180 mL.

藉由減少濾膜的充填體積以及以與澄清產物相同體積(180 mL)之清洗體積沖洗沉澱物，未發現阻塞，且可回收所有的免疫球蛋白。所有的免疫球蛋白可進行後續純化方法中的親和性層析步驟。

實施例8：IgG回溶至溶液中的改善

實施例2新方法所製備之試產批次與專利申請案EP 1385886方法所製備之相同規模批次(10AXTO1064015)比較發現，可改善«I+II+III»沉澱物至溶液的回溶。在此步驟中(相同體積)可發現至少1 g/IgG(L)的差異，如下表所示。

補體試驗顯示可將沉澱物中存在之免疫球蛋白回溶至含離子之溶液中，而非經純化之水。特別是，使用10 mM 的NaCl溶液。

經辛酸處理之蛋白污染物沉澱也可在pHs小於4.8的條件下被改善。特別是，在pH 4.6時可達到改善的目的。

以這些改進條件製備一試產批次(«新批次»)，且與本發明方法製備之«穩健層析沖提液(Robust Chromatography Eluate)»階段的3批次(批次1、2及3)進行比較。

下表顯示各差異：

新方法在«流體化床層析洗湜»階段的產率

回溶至含10 mM NaCl溶液，經辛酸處裡，且將pH調整至4.6以製備新批次具有：-較佳之每公升血漿的免疫球蛋白產率，-較佳之純度，即免疫球蛋白-總蛋白比。

實施例9：本發明«II+III»沉澱物的應用

"II+III"沉澱物可代替“I+II+III”沉澱物，作為多株IgGs的純化原料。

在此基礎上，以不同的«II+III»沉澱物製備本發明之2批次產物。比較由這些原料於“流體化床層析洗湜”所獲得之評價結果。

下表顯示各結果：

此結果顯示在相同的方式下，本發明方法之第1步驟可適用於這二種形式的沉澱物：-萃取產率：澄清及穩健親和性層析步驟(robust affinity chromatography steps)的累積產率彼此相似，即使其中一個批次較差。

然而，相較於«I+II+III»沉澱物，«II+III»沉澱物在經過一額外的乙醇分離步驟(fractionation step)後每公升血漿的IgG(g)產率比«I+II+III»沉澱物少15%。此缺陷為在額外的乙醇分離步驟中會造成IgGs蛋白的流失。

-純度：比較由«II+III»沉澱物回溶至溶液中，經辛酸處理，以及將pH調整至4.6所獲得之IgG/總蛋白比例與由«I+II+III»沉澱物回溶至溶液中，經辛酸處理，以及將pH調整至4.8所獲得之IgG/總蛋白比例。

Claims

一種製造人類多價免疫球蛋白濃縮物的方法，該多價免疫球蛋白來自血漿初始溶液或富含免疫球蛋白之血漿分層，其特徵在於包括：(a)一利用辛酸移除蛋白污染物以獲得一不含蛋白酶的溶液之步驟，其中該辛酸的濃度為0.5至1.5%，(b)於酸性pH值下藉由深層過濾實行的澄清步驟(clarification step)，(c)之後對該不含蛋白酶之溶液進行一流體化床層析步驟，該方法獲得產率大於每公升血漿4.5g免疫球蛋白的人類多價免疫球蛋白濃縮物。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該辛酸的使用濃度為0.8至1.2%。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該辛酸的使用濃度為0.9至1.1%。
如申請專利範圍第1至3項任一項所述之方法，其中該利用辛酸移除蛋白污染物之步驟(a)於pH 4.3至4.9下進行。
如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該利用辛酸移除蛋白污染物之步驟(a)於pH4.6至4.8下進行。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該不含蛋白酶之溶液的流體化床層析步驟(c)係以離子交換型、親和型、«偽親和型»或«混合型»之層析載體進行。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該«混合型»之流體化床層析步驟包括：- 添加至一已事先利用pH值為4.5至8的緩衝液平衡之層析管柱，該溶液經過深層過濾之澄清步驟，且事先調整至相同的pH值，- 以緩衝溶液清洗該管柱直到管柱中所有未吸附的蛋白皆被移除，- 以pH值為8至10之沖提緩衝液沖提吸附於該管柱上之多價免疫球蛋白，以及- 回收該富含人類多價免疫球蛋白之溶液。
如申請專利範圍第1項所述之方法，更包括在步驟(c)後有一或複數個下列步驟：(i)病毒去活化步驟，(ii)對該先前步驟所獲得之溶液進行的陰離子交換層析步驟，(iii)移除該先前步驟所獲得之溶液中抗-A與抗-B抗體的步驟，(iv)通過孔徑由100減少至15nm之奈米濾膜進行的過濾步驟，(v)將該先前步驟所獲得之溶液經超過濾之濃縮步驟與一配製步驟，以及(vi)傳統的消毒過濾步驟。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該起始溶液為經乙醇分離或層析分離之富含免疫球蛋白之血漿分層。
如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該起始溶液為由乙醇分離之血漿分層所獲得之«I+II+III»沉澱物或«II+III»沉澱物，且回溶至溶液中。
如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該«I+II+III»沉澱物或«II+III»沉澱物回溶至經純化之注射用水或一含離子之溶液中。
如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該含離子之溶液為包含NaCl濃度小於或等於20mM的溶液。
如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該含離子之溶液為包含NaCl濃度為5至15mM的溶液。
如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該含離子之溶液為包含NaCl濃度等於10mM的溶液。
如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該«I+II+III»沉澱物或«II+III»沉澱物以CaCl2溶液處理，該CaCl2濃度小於或等於20mM。
如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該«I+II+III»沉澱物或«II+III»沉澱物以CaCl2溶液處理，該CaCl2濃度為5至15mM。
如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該«I+II+III»沉澱物或«II+III»沉澱物以CaCl2溶液處理，該CaCl2濃度為10mM。
如申請專利範圍第1項所述之方法，包括：(i)一利用辛酸移除蛋白污染物之步驟， (ii)一深層過濾之澄清步驟，(iii)一“混合型”流體化床層析步驟，(iv)一經溶劑/界面活性劑處理之病毒去活化步驟，(v)一陰離子交換層析步驟，(vi)一移除抗-A與抗-B抗體之步驟，(vii)一通過孔徑由100減少至15nm之奈米濾膜的過濾，(viii)一將該先前步驟所獲得之溶液經超過濾之濃縮步驟與一配製步驟，以及接著傳統的消毒過濾步驟。
如申請專利範圍第18項所述之方法，更包括下列步驟：(a)將一或複數個藥學上可接受之穩定劑添加至由申請專利範圍第1項之方法所獲得之人類多價免疫球蛋白濃縮物中，以及(b)選擇性地冷凍或凍乾該由前述步驟所獲得之藥學組成物；使該藥學組成物為一液體、冷凍或凍乾形式。
一種由申請專利範圍第1項所述之方法所獲得之人類多價免疫球蛋白濃縮物，其特徵在於該濃縮物的抗-補體活性小於30%。
一種使用包括如申請專利範圍第20項所述之人類多價免疫球蛋白濃縮物之液體、冷凍或凍乾的藥物組成物用以製備治療下列病理之藥物之用途，該病理係擇自於下列所組成之族群：脫髓鞘性神經炎、多發性硬化症、蘭伯特-伊頓肌無力症候群、皮肌炎，用於原發性免疫缺陷之替代治療、先天性丙球蛋白缺乏症、先天性低丙球蛋白缺乏症、多樣性免疫缺乏症、嚴重複合型免疫缺乏症、Wiskott Aldrich症候群、嚴重性二次免疫球蛋白低下和反覆感染之多發性骨髓瘤或慢性淋巴白血病、HIV-感染病童之反覆感染、或治療免疫球蛋白低下或體液免疫功能障礙之原發性免疫缺陷、用於治療體液性免疫之二次性免疫缺陷、免疫球蛋白低下和反覆感染相關之慢性淋巴細胞白血病或多發性骨髓瘤、感染相關之免疫球蛋白低下的幹細胞移植、以及治療重大出血風險或改正血小板數量之醫療或手術前之成人和兒童特發性血小板減少性紫癜(ITP)、鳥彈樣網膜脈絡膜病變(Birdshot retinochorioditis)、Guillain-Barré症候群、多源性運動神經病變(MMN)、慢性脫髓鞘性神經炎(CIDP)及川崎症(Kawasaki’s disease)。
如申請專利範圍第21項所述之用途，其中該多價免疫球蛋白之藥學組成物為以申請專利範圍第1項所述方法所獲得的組成物。