JP6363676B2 - 血漿由来の富化ＩｇＧ組成物を調製する方法 - Google Patents

Description

発明の背景
ヒト血漿由来の免疫グロブリン製品は免疫不全を治療するために１９５２年に初めて使用された。当初は免疫グロブリンアイソタイプＧ（ＩｇＧ）の筋肉内投与もしくは皮下投与が選択法であった。しかしながら、様々な疾患の有効な治療に必要な大量のＩｇＧを注射するために、ＩｇＧ濃度の低い（５０ｍｇ／ｍＬ）静脈内投与可能な製品が開発された。通常、静脈注射用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は千人以上の血液提供者の血漿由来のプールされた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンを含む。一般的に、完全なＦｃ依存性のエフェクター機能を有する９５％以上の未修飾のＩｇＧとごく少量の免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）もしくは免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）を含むＩＶＩＧは、主として３つの主要な病状、（１）低抗体価を特徴とする、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン症候群および低ガンマグロブリン血症（原発性免疫不全）、後天性の免疫不全状態(続発性免疫不全)、（２）炎症性自己免疫疾患、（３）急性感染症、を治療する、無菌の精製されたＩｇＧ製品である。

特に、原発性免疫不全障害を持つ多くの人々は感染症に抵抗するのに必要な抗体が欠乏している。場合によっては、精製ＩｇＧを静脈内注射で投与（すなわちＩＶＩＧ治療）することで欠乏を補い得る。Ｘ連鎖無ガンマグロブリン症候群(ＸＬＡ)および分類不能型低ガンマグロブリン血症（ＣＶＩＤ）、高ＩｇＭ症候群（ＨＩＭ）、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、そしていくつかのＩｇＧサブクラス欠損といった原発性免疫不全障害は一般にその方法で治療される（Blaese and Winkelstein,J. Patient ＆ Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson, MD:Immune Deficiency Foundation;2007（非特許文献１））。

ＩＶＩＧ療法は原発性免疫不全の治療に非常に有効であるが、病気の治癒というよりも体内で産生されていない抗体への一時的な置換に過ぎない。従って、ＩＶＩＧ療法に依存している患者は、一般的に月約一度の反復投与を一生続ける必要がある。この必要性はＩＶＩＧ組成物の継続的な産生に要求を突きつける。しかしながら、組み換えＤＮＡベクターの生体外発現を用いて産生される他の生物製剤と異なり、ＩＶＩＧはヒト血液や血漿から分画される。それゆえ、ＩＶＩＧ製品は単純に生産量を増やすことでは増えない。むしろ商業利用可能なＩＶＩＧのレベルは利用できる血液や血漿の供給量によって制限される。

いくつかの要因がＩＶＩＧの需要を推進しており、それにはＩＶＩＧ療法の容認、ＩＶＩＧ療法が有効であるという追加適応の同定、患者診断やＩＶＩＧ製剤の増加が含まれる。とりわけ、ＩＶＩＧの世界的な需要は１９９０年から４倍より多く増加しており、今日でも年率約７％から１０％の間で増え続けている（Robert P.,Pharmaceutical Policy and Law, 11(2009)359-367（非特許文献２））。例えば、オーストラリア国立血液機関はオーストラリアにおけるＩＶＩＧの需要が２００８−２００９年度で１０．６％増加したと報告している（National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009（非特許文献３））。

増加する世界的な需要や免疫グロブリン製品の利用可能な供給量の変動により、オーストラリアや英国を含むいくつかの国では、製品不足のときに需要の高い患者への供給を守るための需要管理プログラムを実行してきた。

２００７年には、２６５０万リットルの血漿が分画され、７５．２トンのＩＶＩＧが作られ、その平均産生量は２．８ｇ／Ｌであったと報告されている（Robert P., 上記（非特許文献２））。この同じ報告書において、全体的なＩＶＩＧ収率は２０１２年までに約３．４３ｇ／Ｌへ増加することが期待されると予想されていた。しかしながら、世界的なＩＶＩＧ需要の継続増加によって、今後２０１５年までに約７％〜１３％の年間増加が見込まれており、世界的な需要を満たすためには全体的なＩＶＩＧ収率のさらなる改善が必要である。

多くのＩＶＩＧ調製法がＩＶＩＧ製品の市場供給者によって用いられている。今日のＩＶＩＧ産生法における１つの共通問題は精製過程におけるＩｇＧの多大な減少であり、出発物質中のＩｇＧ含有量の少なくとも３０％〜３５％になると見積もられる。ＩｇＧ収率を増強する一方で、１つの課題として副作用の原因となるウイルス不活化や不純物除去の品質を維持することがある。現在のＩＶＩＧ生産レベルでは、収率におけるわずかな増加であっても実際には非常に大きな影響を与えると考えられている。２００７年時点の生産レベルを例にとると、２％の効率上昇は５６ｍｇ／Ｌの追加に相当し、追加１．５トンのＩＶＩＧを産生することになる。

血清、血漿タンパク質の調製および特性に関して一連の影響力をもつ論文の第４の連載記事において、コーンら（J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3):459-475（非特許文献４））はヒト血漿から富化ＩｇＧ画分の単離を可能にする血漿タンパクのアルコール分画法について初めて記述した（方法６）。数年後、オンクレイら（J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2):541-550（非特許文献５））はコーン方法を拡張し、より純粋なＩｇＧ調製品の単離をもたらす方法（方法９）を発表した。

これらの方法は血液因子由来の血漿業界全体の基礎を作った一方、川崎病および血小板減少性紫斑病、原発性免疫不全といったいくつかの免疫系関連疾患の治療に十分に高い濃度のＩｇＧ調製品を与えることができなかった。それで、イオン交換クロマトグラフィーのような様々な技術を用いて、より純粋で濃度の高いＩｇＧ製剤を調製するためのさらなる方法論が開発された。ホッペら（Munch Med Wochenschr 1967(34):1749-1752（非特許文献６））やファルクスベーデン（スウェーデン特許第348942号（特許文献１））、ファルクスベーデンとルンドブラッド（Methods of Plasma Protein Fractionation 1980（非特許文献７））はこの目的でイオン交換クロマトグラフィーを先駆けて用いた。

沈殿の工程では、カプリル酸塩沈殿（Lebing et al., Vox Sang 2003(84):193-201（非特許文献８））やコーンフラクション（Ｉ＋）ＩＩ＋ＩＩＩエタノール沈殿法（Tanaka et al., Braz J Med Biol Res 2000(33)37-30（非特許文献９））とカラムクロマトグラフィーを組み合わせた様々な最新の方法が用いられている。ごく最近では、テシュナーら（Vox Sang, 2007(92):42-55（非特許文献１０））はプール血漿からクリオ沈殿物を最初に除き、それから改変コーン−オンクレイの冷エタノール分画、続いて中間イオン交換クロマトグラフィーのＳ／Ｄ処理、ナノ濾過、任意で限外濾過／透析濾過を行って１０％ＩＶＩＧ製品を産生する方法を記述した。

しかしながら、これらのＩｇＧ製造方法によって純度や安全性、収率が改善されたにもかかわらず、精製過程において相当量のＩｇＧが未だ失われている。例えば、テシュナーらは彼らの方法でＩｇＧ収率が６５％増加したと報告している（Teschner et al., 上記（非特許文献１０））。様々な血漿製品のミーティングで報告されているように、バクスターやＣＳＬベーリング、アップフロントテクノロジー、キャンジーン、プロメトリックバイオセラピューティックス、フィンランド赤十字社らのＩｇＧの大規模調製における平均収率は最終製品で約６１％から６５％である。これは製造工程中にプール血漿画分に存在するＩｇＧの少なくとも３分の１が失われていることを意味している。

そのため、ＩＶＩＧ製品を改良されたより効率の良い方法で製造する必要性がある。本発明はこのことや現在よりも少なくとも６から１０％高い収率を生み出すＩＶＩＧ製造方法を提供することにより、これらや他の必要性を満たすものであるとともに、ＩＶＩＧ組成物を提供するものである。

スウェーデン特許第348942号

Blaese and Winkelstein,J. Patient ＆ Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson, MD:Immune Deficiency Foundation;2007 Robert P.,Pharmaceutical Policy and Law, 11(2009)359-367 National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009 コーンら、J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3):459-475 オンクレイら、J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2):541-550 ホッペら、Munch Med Wochenschr 1967(34):1749-1752 ファルクスベーデンとルンドブラッド、Methods of Plasma Protein Fractionation 1980 Lebing et al., Vox Sang 2003(84):193-201 Tanaka et al., Braz J Med Biol Res 2000(33)37-30 テシュナーら、Vox Sang, 2007(92):42-55

１つの態様では、本発明は血漿由来の富化ＩｇＧ組成物（例えばＩＶＩＧ組成物）を調製する方法を提供するものである。有利な点として、ここに提供する方法はＩＶＩＧ組成物を調製する現在の最先端の方法に有意な改良を提供する。例えば、ここに提供する方法は静脈注射に必要な純度を失うことなく、最終バルク組成物におけるＩｇＧ収率を増加させることを可能にする。

１つの態様では、血漿由来の富化ＩｇＧ組成物を調製する方法として、（ａ）第１の沈殿工程として、ｐＨ約７．０から約７．５にて約６％から約１０％のアルコールを用いて脱クリオ血漿画分を沈殿させ、第１の沈殿物と第１の上清を得る工程、（ｂ）第２の沈殿工程として、ｐＨ約６．７から約７．３にて約２０％から約２５％のアルコールを用いて前記第１の上清からＩｇＧを沈殿させ、第２の沈殿物を形成させる工程、(ｃ)前記第２の沈殿物を再懸濁して懸濁液を形成させる工程、（ｄ）第３の沈殿工程として、ｐＨ約６．７から約７．３にて約２２％から約２８％のアルコールを用いて工程（ｃ）にて形成された前記懸濁液からＩｇＧを沈殿させ、第３の沈殿物を形成させる工程、（ｅ）前記第３の沈殿物を再懸濁して懸濁液を形成させる工程、および（ｆ）工程（ｅ）にて形成された前記懸濁液から可溶性画分を分離し、それによって富化ＩｇＧ組成物を形成させる工程を含み、少なくとも前記第１の沈殿工程、前記第２の沈殿工程、前記第３の沈殿工程の少なくとも一つが前記アルコールのスプレー添加を含む、方法を提供する。１つの実施形態では、前記第１の沈殿工程でアルコールがスプレー法にて添加される。別の実施形態では、前記第２の沈殿工程でアルコールがスプレー法にて添加される。さらに別の実施形態では、前記第３の沈殿工程でアルコールがスプレー法にて添加される。

ある実施形態では、一つ以上の溶液のｐＨはスプレー法によるｐＨ調整剤の添加によって調整され得る。関連する実施形態では、前記第１の沈殿工程、前記第２の沈殿工程、前記第３の沈殿工程の少なくとも１つ以上のｐＨは、アルコール添加後、またはアルコール添加前後、またはアルコール添加中および添加後、またはアルコール添加前、添加中および添加後にｐＨ調整溶液を添加することで達成される。さらに別の関連する実施形態では、ｐＨは、ｐＨの連続的な調整により全沈殿工程で維持される。

１つの特定の実施形態では、前記第１の沈殿工程のｐＨがｐＨ調整剤のスプレー添加によってアルコール添加後に調整される。別の実施形態では、前記第２の沈殿工程のｐＨがｐＨ調整剤のスプレー添加によってアルコール添加後に調整される。さらに別の実施形態では、前記第３の沈殿工程のｐＨがｐＨ調整剤のスプレー添加によってアルコール添加後に調整される。

さらに、ここで提供される予備の方法は、イオン交換クロマトグラフィー工程（例えば、陰イオン交換および／または陽イオン交換クロマトグラフィー）、ナノ濾過工程、限外濾過／透析濾過工程やＩＶＩＧ調製品の純度または品質をさらに高めるのに適した他の精製技術から成る。

別の態様では、脱クリオ血漿画分のｐＨを７．０または約７．０に調整する工程、（ｂ）温度−７℃または約−７℃から−９℃または約−９℃の間で工程（ａ）の前記脱クリオ血漿のエタノール濃度を２５％または約２５％（体積／体積）に調整することにより混合物を形成させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の前記混合物を液体と沈殿物に分離する工程、（ｄ）工程（ｃ)の前記沈殿物を、１０００Ｌあたり６００ｍＬまたは約６００ｍＬの氷酢酸にてｐＨを調整したリン酸塩および酢酸塩を含む緩衝液で再懸濁させることにより、懸濁液を形成する工程、（ｅ）微粉化した二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）と工程（ｄ）の前記懸濁液を少なくとも約３０分間混ぜる工程、（ｆ）加圧濾過器で前記懸濁液を濾過することにより濾過液を形成させる工程、（ｇ）少なくとも加圧濾過器のデッドボリュームの３容量の、１０００Ｌあたり１５０ｍＬまたは約１５０ｍＬの氷酢酸でｐＨ調整した、リン酸塩および酢酸塩を含む緩衝液を用いて、前記加圧濾過器を洗浄することにより、洗浄液を形成させる工程、（ｈ）工程（ｆ）の前記濾過液と工程（ｇ）の前記洗浄液を混合することにより溶液を形成し、前記溶液を界面活性剤で処理する工程、（ｉ）工程（ｈ）の前記溶液のｐＨを７．０または約７．０に調整して、終濃度が２５％または約２５％になるようにエタノールを加えることにより沈殿物を形成させる工程、（ｊ）工程（ｉ）の前記混合物を液体と沈殿物に分離する工程、（ｋ）前記沈殿物を溶媒または界面活性剤を含む水溶液に溶解し、少なくとも６０分間保持する工程、（ｌ）工程（ｋ）後の前記溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、前記カラムに吸着したタンパク質を溶出液に溶出する工程、（ｍ）工程（ｌ）からの前記溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、流出液を生成させる工程、（ｎ）工程（ｍ）からの前記流出液をナノフィルターに通しナノ濾過液を生成させる工程、（ｏ）工程（ｎ）からの前記ナノ濾過液を限外濾過膜に通し限外濾過液を生成させる工程、（ｐ）工程（ｏ）からの前記限外濾過液を透析濾過緩衝液にて透析濾過し約８％（重量／体積）から約１２％（重量／体積）のタンパク質濃度を有する透析濾過液を生成することにより富化ＩｇＧ組成物を得る工程を含む、血漿から富化ＩｇＧ組成物を調製する方法を提供する。

別の態様では、本発明はここに記述した方法で調製された水性ＩｇＧ組成物を提供する。一般的にそのＩｇＧ組成物は高純度で（例えば、少なくとも９５％、９８％、９９％またはそれ以上のＩｇＧ含有量）、約２０ｇ／Ｌから約２００ｇ／Ｌのタンパク質濃度を含み、ＩｇＧ、ＩｇＭ、フィブリノーゲン、トランスフェリン、ＡＣＡ、アミド分解活性、ＰＫＡ等の一般的なＩＶＩＧ混入物質を極めて低レベルに含んでいる。

さらに別の態様では、医薬ＩｇＧ組成物やＩＶＩＧ療法での使用に適した製剤を提供する。医薬製剤は高純度で（例えば、少なくとも９８％または９９％、それ以上のＩｇＧ含有量）、約２０ｇ／Ｌから約２００ｇ／Ｌのタンパク質濃度であり、ＩｇＧ、ＩｇＭ、フィブリノーゲン、トランスフェリン、ＡＣＡ、アミド分解活性、ＰＫＡ等の一般的なＩＶＩＧ混入物質を極めて低レベルに含んでいる。一般的に、医薬組成物は静脈内投与（つまり、ＩＶＩＧ療法）、皮下投与または筋肉内投与用に製剤化するのがふさわしい。

別の態様では、本発明はそれを必要とするヒトの免疫不全または自己免疫疾患、急性感染症を治療する方法を提供し、その方法というのはここに記述した医薬組成物の投与から成る。ここに提供される方法にて治療または処置され得る病気や容態は同種骨髄移植および慢性リンパ性白血病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、小児ＨＩＶ、原発性免疫不全、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、高抗体レシピエントまたはＡＢＯ不適合ドナーの腎臓移植、慢性疲労症候群、クロストリジウム・ディフィシル大腸炎、皮膚筋炎や多発性筋炎、グレーブス病眼症、ギラン・バレー症候群、筋ジストロフィー、封入体筋炎、イートン・ランバート症候群、エリテマトーデス、多巣性運動ニューロパシー、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、新生児アロ免疫血小板減少症、パルボウイルスＢ１９感染、天庖瘡、輸血後紫斑病、腎移植拒絶反応、自然流産、スティッフパーソン症候群、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、重症敗血症や重症成人の敗血性ショック、中毒性表皮剥離症、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、原発性免疫不全、ＲＲＭＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病に限定されない。
[本発明1001]
（ａ）第1の沈殿工程として、ｐＨ約7．0から約7．5にて約6％から約10％のアルコールを用いて脱クリオプラスミド画分を沈殿させ、第1の沈殿物と第1の上清を得る工程と、
（ｂ）第2の沈殿工程として、ｐＨ約6．7から約7．3にて約20％から約25％のアルコールを用いて前記第1の上清からＩｇＧを沈殿させ、第2の沈殿物を形成する工程と、
（ｃ）前記第2の沈殿物を再懸濁して懸濁液を形成する工程と、
（ｄ）第3の沈殿工程として、ｐＨ約6．7から約7．3にて約22％から約28％のアルコールを用いて工程（ｃ）にて形成された前記懸濁液からＩｇＧを沈殿させ、第3の沈殿物を形成する工程と、
（ｅ）前記第3の沈殿物を再懸濁して懸濁液を形成する工程と、
（ｆ）工程（ｅ）にて形成された前記懸濁液から可溶性画分を分離することにより富化ＩｇＧ組成物を形成する工程と
を含み、
前記第1の沈殿工程、前記第2の沈殿工程、または前記第3の沈殿工程の少なくとも1つが、アルコールのスプレー添加を含む、血漿由来の富化ＩｇＧ組成物を調製する方法。
[本発明1002]
前記第1の沈殿工程、前記第2の沈殿工程、および前記第3の沈殿工程の全てがアルコールのスプレー添加を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記第1の沈殿工程、前記第2の沈殿工程、または前記第3の沈殿工程の少なくとも1つの前記ｐＨは前記アルコール添加後、ｐＨ調整溶液の添加により達成される、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記第1の沈殿工程、前記第2の沈殿工程、および前記第3の沈殿工程の全ての前記ｐＨは前記アルコール添加後、ｐＨ調整溶液の添加により達成される、本発明1001〜本発明1003の何れかの方法。
[本発明1005]
前記ｐＨ調整溶液の添加が前記ｐＨ調整溶液のスプレー添加を含む、本発明1003または本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記沈殿工程のｐＨは、前記アルコール添加前および添加後、前記アルコール添加中および添加後、または前記アルコール添加前、添加中および添加後に調整される、本発明1003〜本発明1005の何れかの方法。
[本発明1007]
少なくとも1つの沈殿工程のｐＨは、前記ｐＨの連続的な調整により前記全沈殿工程で維持される、本発明1001〜本発明1006の何れかの方法。
[本発明1008]
イオン交換クロマトグラフィー精製工程をさらに含む、本発明1001〜本発明1007の何れかの方法。
[本発明1009]
陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程と陽イオン交換クロマトグラフィー工程の両方を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
ナノ濾過工程および／または限外濾過／透析濾過工程をさらに含む、本発明1001〜本発明1009の何れかの方法。
[本発明1011]
工程（ｆ）にて得られた前記富化ＩｇＧ組成物が、工程（ａ）にて用いられた脱クリオ血漿画分で見られるＩｇＧ含有量の少なくとも85％を含む、本発明1001〜本発明1010の何れかの方法。
[本発明1012]
工程（ｆ）にて得られた前記富化ＩｇＧ組成物が、工程（ａ）にて用いられた脱クリオ血漿画分で見られるＩｇＧ含有量の少なくとも90％を含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
最終ＩｇＧ組成物におけるγ−グロブリン純度が少なくとも約95％である、本発明1001〜本発明1012の何れかの方法。
[本発明1014]
最終ＩｇＧ組成物におけるγ−グロブリン純度が少なくとも約98％である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
最終ＩｇＧ組成物におけるγ−グロブリン純度が少なくとも約99％である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
（ａ）脱クリオ血漿画分の前記ｐＨを約7．0に調整する工程と、
（ｂ）約−7℃から約−9℃の温度で、工程（ａ）の前記脱クリオ血漿画分のエタノール濃度を約25％（体積／体積）に調整することにより、混合物を形成する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の前記混合物を液体と沈殿物に分離する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の前記沈殿物を、1000Ｌあたり300ｍＬから700ｍＬの氷酢酸でｐＨを調整したリン酸塩および酢酸塩を含む緩衝液で再懸濁させることにより、懸濁液を形成する工程と、
（ｅ）微粉化した二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）と工程（ｄ）の前記懸濁液を少なくとも約30分間混ぜる工程と、
（ｆ）加圧濾過器で前記懸濁液を濾過することにより濾過液を形成する工程と、
（ｇ）少なくとも加圧濾過器のデッドボリュームの3容量の、1000Ｌあたり50ｍＬから200ｍＬの氷酢酸でｐＨを調整した、リン酸塩および酢酸塩を含む緩衝液を用いて、前記加圧濾過器を洗浄することにより、洗浄液を形成する工程と、
（ｈ）工程（ｆ）の前記濾過液と工程（ｇ）の前記洗浄液を混合することにより溶液を形成し、前記溶液を界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）で処理する工程と、
（ｉ）工程（ｈ）の前記溶液の前記ｐＨを約7．0に調整し、終濃度が約25％になるようにエタノールを加えることにより、沈殿物を形成する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）の混合物を液体と沈殿物に分離する工程と、
（ｋ）前記沈殿物を溶媒または界面活性剤を含む水溶液に溶解し、前記溶液を少なくとも60分間保持する工程と、
（ｌ）工程（ｋ）後の前記溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、前記カラムに吸着したタンパク質を溶出液に溶出する工程と、
（ｍ）工程（ｌ）からの前記溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し流出液を生成する工程と、
（ｎ）工程（ｍ）からの前記流出液をナノフィルターに通しナノ濾過液を生成する工程と、
（ｏ）工程（ｎ）からの前記ナノ濾過液を限外濾過膜に通し限外濾過液を生成する工程と、
（ｐ）工程（ｏ）からの前記限外濾過液を透析濾過緩衝液に対して透析濾過し、約8％（重量／体積）から約12％（重量／体積）のタンパク質濃度を有する透析濾過液を生成することにより濃縮ＩｇＧ組成物を得る工程と、
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
工程（ｂ）および（ｉ）の少なくとも1つにおいて、エタノール濃度はエタノールを前記画分にスプレー法で導入することにより調製される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
工程（ｂ）および（ｉ）の少なくとも1つにおいて、エタノール添加後にｐＨを適切なｐＨに調整する、本発明1016または本発明1017の方法。
[本発明1019]
工程（ｂ）および（ｉ）の少なくとも1つにおいて、ｐＨはｐＨの連続的な調整により全沈殿反応で維持される、本発明1018の方法。
[本発明1020]
ｐＨの調整をすることができる溶液をスプレーすることにより、ｐＨが少なくとも1つの工程において調整される、本発明1016〜本発明1019の何れかの方法。
[本発明1021]
氷酢酸をスプレーすることによりｐＨが調整される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
0．22μｍ以下のフィルターを通して前記透析濾過液を濾過する工程をさらに含む、本発明1016〜本発明1021の何れかの方法。
[本発明1023]
前記血漿がヒト血漿である、本発明1016〜本発明1022の何れかの方法。
[本発明1024]
前記脱クリオ血漿画分が、
（ｉ）プール血漿供与物の混合物を約2℃から約10℃の温度に冷却する工程と、
（ｉｉ）遠心分離により工程（ｉ）の前記混合物を液体と沈殿物に分離する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で形成された前記液体上清に終濃度が約5％（体積／体積）から約10％（体積／体積）になるようにエタノールを混ぜることにより混合物を形成する工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で形成された前記混合物を約−4℃から約0℃に冷却する工程と、
（ｖ）遠心分離により工程（ｉｖ）の前記混合物を液体と沈殿物に分離し、上清を単離することにより、脱クリオ血漿画分を形成する工程と、
を含む方法により形成される、本発明1016〜本発明1023の何れかの方法。
[本発明1025]
工程（ｂ）の前記混合物の温度が約−7℃である、本発明1016〜本発明1024の何れかの方法。
[本発明1026]
工程（ｃ）で形成された前記沈殿物は沈殿物1ｋｇあたり約12Ｌから約18Ｌの緩衝液で再懸濁される、本発明1016〜本発明1025の何れかの方法。
[本発明1027]
前記沈殿物は沈殿物1ｋｇあたり約15Ｌの緩衝液で再懸濁される、本発明1026の方法。
[本発明1028]
工程（ｅ）において前記懸濁液に加えられた二酸化ケイ素の量が、工程（ｃ）で形成された沈殿物1ｇあたり約0．02ｇから約0．06ｇである、本発明1016〜本発明1027の何れかの方法。
[本発明1029]
工程（ｅ）において前記懸濁液に加えられた二酸化ケイ素の量が、工程（ｃ）で形成された沈殿物1ｇあたり約0．04ｇである、本発明1028の方法。
[本発明1030]
工程（ｆ）における濾過の前に濾過助剤を前記混合物に加える、本発明1016〜本発明1029の何れかの方法。
[本発明1031]
前記濾過助剤が珪藻土である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
工程（ｆ）で形成された前記濾過液におけるγ−グロブリン純度が少なくとも約85％である、本発明1016〜本発明1031の何れかの方法。
[本発明1033]
工程（ｆ）で形成された前記濾過液が全タンパク質1ｇあたり約10ｍｇ未満のフィブリノーゲンを含む、本発明1016〜本発明1032の何れかの方法。
[本発明1034]
工程（ｆ）で形成された前記濾過液が全タンパク質1ｇあたり約500 ＩＵ未満のＰＫＡ活性を含む、本発明1016〜本発明1033の何れかの方法。
[本発明1035]
工程（ｈ）で使用された前記界面活性剤が約0．1％（重量／体積）から約0．3％（重量／体積）のポリソルベート−80を含む、本発明1016〜本発明1034の何れかの方法。
[本発明1036]
工程（ｋ）で用いた前記水溶液がトリトン−Ｘ100、ポリソルベート−80、およびＴＮＢＰを含む、本発明1016〜本発明1035の何れかの方法。
[本発明1037]
工程（ｋ）において前記溶液が約18℃から約25℃の温度で保持される、本発明1016〜本発明1036の何れかの方法。
[本発明1038]
工程（ｎ）の前記ナノフィルターが約15ｎｍから約72ｎｍの平均ポアサイズを有する、本発明1016〜本発明1037の何れかの方法。
[本発明1039]
前記ナノフィルターが約19ｎｍから約35ｎｍの平均ポアサイズを有する、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記ナノフィルターが約35ｎｍの平均ポアサイズを有する、本発明1039の方法。
[本発明1041]
工程（ｏ）の前記限外濾過膜が約100ｋＤａ以下の公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）を有する、本発明1016〜本発明1040の何れかの方法。
[本発明1042]
前記組成物の前記タンパク質濃度が約10％（重量／体積）である、本発明1016〜本発明1041の何れかの方法。
[本発明1043]
工程（ｈ）で形成された前記溶液が、工程（ａ）の前記脱クリオ血漿画分に存在するＩｇＧを少なくとも約85％含む、本発明1016〜本発明1042の何れかの方法。
[本発明1044]
工程（ｈ）で形成された前記溶液が、工程（ａ）の前記脱クリオ血漿画分に存在するＩｇＧを少なくとも約90％含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
先行する本発明のいずれかの方法により調製される水性ＩｇＧ組成物。
[本発明1046]
組成物1Ｌあたり少なくとも約80ｇのタンパク質を含む、本発明1045の水性ＩｇＧ組成物。
[本発明1047]
タンパク質の少なくとも95％がＩｇＧである、本発明1045または本発明1046の水性ＩｇＧ組成物。
[本発明1048]
前記タンパク質の少なくとも98％がＩｇＧである、本発明1047の水性ＩｇＧ組成物。
[本発明1049]
約35μｇ／ｍＬ未満のＩｇＡを含む、本発明1045〜本発明1048の何れかの水性ＩｇＧ組成物。
[本発明1050]
本発明1001〜本発明1044のいずれかの方法により調製される水性ＩｇＧ組成物を含む、医薬組成物。
[本発明1051]
組成物1Ｌあたり約100ｇのタンパク質を含む、本発明1050の医薬組成物。
[本発明1052]
約200ｍＭから約300ｍＭの濃度でグリシンをさらに含む、本発明1050または本発明1051の医薬組成物。
[本発明1053]
前記組成物のｐＨが約4．6から約5．1である、本発明1050〜本発明1052の何れかの医薬組成物。
[本発明1054]
前記組成物の容量オスモル濃度が約240ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇから約300ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである、本発明1050〜本発明1053の何れかの医薬組成物。
[本発明1055]
室温で少なくとも約9か月間安定である、本発明1050〜本発明1054の何れかの医薬組成物。
[本発明1056]
約2℃から約8℃で少なくとも約36か月間安定である、本発明1050〜本発明1055の何れかの医薬組成物。
[本発明1057]
静脈内投与用に製剤化される、本発明1050〜本発明1056の何れかの医薬組成物。
[本発明1058]
本発明1050〜本発明1057のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、それを必要とするヒトの免疫不全、自己免疫疾患または急性感染症を治療する方法。

濾過後の濾過装置の洗浄に用いた緩衝液のデッドボリュームの関数として表される、フラクションＩＩ＋ＩＩＩの濾過洗浄液中に存在するＥＬＩＳＡ（▲）および比濁分析法（●）により測定されたＩｇＧ濃度と全タンパク質濃度（■）。 アエロジル（二酸化ケイ素）処理の有無において酢酸添加による、ｐＨ３．８〜５．０の抽出および清澄化後の沈殿物Ｇ溶解画分における平均ＰＫＡ活性。 アエロジル（二酸化ケイ素）処理の有無において酢酸添加による、ｐＨ３．８〜５．０の抽出および清澄化後の沈殿物Ｇ溶解画分における平均フィブリノーゲン含有量。 アエロジル（二酸化ケイ素）処理の有無において酢酸添加による、ｐＨ３．８〜５．０の抽出および清澄化後の沈殿物Ｇ溶解画分におけるアミド分解活性。 ４℃で２週間（◆）または室温でさらに１週間インキュベートした後（■）のｐＨ３．８〜７．８にて抽出および清澄化した沈殿物Ｇ溶解画分におけるアミド分解活性。 ｐＨ３．８〜７．８にて抽出および清澄化した沈殿物Ｇ溶解画分におけるＰＫＡ活性。 ヒュームドシリカ処理の有無による改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ濾過液の純度の相違。（Ａ）濾過助剤のみで清澄化した改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ濾過液、および（Ｂ）ヒュームドシリカ処理後に清澄化した改変画分ＩＩ＋ＩＩＩ濾過液の酢酸セルロース電気泳動のクロマトグラフ。 ＩｇＧ大量製造における、沈殿用のアルコール添加後の６．９のフラクションＩＩ＋ＩＩＩ上清のｐＨ変動。 改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出用緩衝液における氷酢酸の量とｐＨの関係。 改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液のフィルター後洗浄緩衝液における氷酢酸の量とｐＨの関係。

定義
本明細書で用いられる場合、「抗体」は、分析物（抗原）と特異的に結合しかつ認識する免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされるポリペプチド、または、それらの断片を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子として、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに、ミリアド免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの順で、免疫グロブリン型を定義する。

典型的な免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは、２対のポリペプチド鎖で構成され、各々の対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各々の鎖のＮ末端は、抗原認識に寄与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を定める。用語、可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）および可変重鎖（Ｖ_Ｈ）は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。

本明細書で用いられる場合、「限外濾過（ＵＦ）」という用語は、水圧が液体を半浸透性膜に押し付ける、様々な膜濾過方法を包含する。懸濁された高分子量の固体および溶質は保持されるが、水および低分子量の溶質は膜を通過する。この分離プロセスは、マクロ分子（１０^３〜１０^６Ｄａ）の溶液、特に、タンパク質溶液を精製し、濃縮するのに利用されることが多い。数多くの限外薄膜は、それらの膜が保持する分子の大きさに応じて、入手することができる。限外濾過は、典型的には、１ｋＤａと１０００ｋＤａの間の膜ポアサイズおよび０．０１と１０ｂａｒの間の操作圧力を特徴とし、糖類および塩類のような小分子からタンパク質のようなコロイドを分離するのに特に有用である。

本明細書で用いられる場合、「透析濾過」という用語は、限外濾過と同じ膜を用いて実行され、接線流濾過である。透析濾過の間、緩衝液を再利用タンク内に導入するのに対し、濾過液はユニット操作から取り除く。生成物が残余物内にある（例えば、ＩｇＧ）プロセスでは、透析濾過は、成分を生成物プールから濾過液内へ洗い出し、それにより、緩衝液を交換し、望ましくない種の濃度を低減させる。

本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、特定値から正負１０％の近似範囲を表す。例えば、語句「約２０％」は、１８〜２２％の範囲を含む。

本明細書で用いられる場合、「混合」という用語は、いずれかの形式の撹拌により溶液または懸濁液中に２つ以上の別個の化合物または物質を等しく配分する行為を説明する。この用語が本願に利用される場合、「混合」の結果として、溶液または懸濁液中で全ての成分を完全に均等に配分する必要はない。

本明細書で用いられる場合、「溶媒」という用語は、１つ以上の他の物質を溶解または分散することを可能にする、任意の液体物質を包含する。溶媒は、本質的に、水等の無機質である可能性があり、エタノール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテル等のような有機液体である可能性がある。溶媒は、「溶媒界面活性剤処理」という用語で用いられる場合、溶液中の脂質エンベロープウイルスを不活性にするのに利用される溶媒界面活性剤混合物の一部である、有機溶媒（例えば、リン酸トリ−Ｎ−ブチル）を表す。

本明細書で用いられる場合、「界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）」という用語は、本出願で、用語「界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）」または「界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」と交換可能に利用される。界面活性剤は、典型的には、両媒性の、即ち、疎水基（「尾部」）と親水基（「頭部」）の両方を含む有機化合物であり、それらの官能基により、界面活性剤は、有機溶媒と水の両方に溶ける。界面活性剤は、その頭部が形式的に荷電基の存在により分類され得る。非イオン性界面活性剤は、その頭部に荷電基がないのに対し、イオン性界面活性剤は、その頭部が電荷を帯びている。双性イオン界面活性剤は、２つの反対に帯電された基を有する頭部を含む。通常の界面活性剤の幾つかの実例として、（硫酸塩陰イオン、スルホン酸塩陰イオンまたはカルボン酸塩陰イオンに基づく）陰イオン性では、ペルフルオロオクタン酸塩（ＰＦＯＡまたはＰＦＯ）、ペルフルオロオクタンスルホン酸塩（ＰＦＯＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、および他のアルキル硫酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、またはＳＬＥＳとしても知られている）、アルキルベンゼンスルホン酸塩と、（第四級アンモニウム陽イオンに基づく）陽イオン性では、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）、別名、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、および他のアルキルトリメチルアンモニウム塩類、セチルピリジニウム塩化物（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）と、カプリル酸塩、カプリル酸、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ナノ酸、デカン酸等を含む長鎖脂肪酸およびそれらの塩類と、双性イオン性（両性）では、ドデシルベタイン、ヤシ酸アミドプロピルベタイン、ココ両性グリシネートと、非イオン性では、アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）との共重合体（ポロキサマー類またはポロキサミン類として市場で知られている）、オクチルグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールおよびオレイルアルコール）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ポリソルベート類（ツイン２０、ツイン８０等）、トリトン界面活性剤、およびドデシルジメチルアミンオキシドを含むアルキルポリグルコシド類が挙げられる。

本明細書で用いられる場合、「静脈注射ＩｇＧ」または「ＩＶＩＧ」処置という用語は、一般に、ＩｇＧ免疫グロブリンの組成物を患者に静脈内投与、皮下投与または筋肉内投与して、免疫不全、炎症、および自己免疫疾患等の数多くの症状を治療する治療方法を指す。ＩｇＧ免疫グロブリンは、典型的には、プールされており、血漿から調製される。抗体全体または断片を利用することができる。ＩｇＧ免疫グロブリンは、皮下投与のために高濃度（例えば、１０％超過）に製剤化されるか、または筋肉内投与のために製剤化され得る。これは、特定の抗原（例えば、Ｒｈｏ Ｄ因子、百日咳毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、狂犬病等）に対する平均タイターよりも高いタイターで調製される、特化されたＩｇＧ製剤に特に共通のことである。議論し易くするために、そのような皮下投与または筋肉内投与用に製剤化されるＩｇＧ組成物も、本願では、用語「ＩＶＩＧ」に含まれる。

「治療上有効な量または投与量」または「十分な／有効な量または投与量」は、投与されて効果を作り出す投与量を意味する。正確な投与量は、治療目的に依存することになり、当業者により、公知の技術を利用して確認されるであろう（例えば、リバーマン、医薬適用法（第１〜３巻、１９９２年）、ロイド、医薬調合の技術、科学技術（１９９９年）、ピッカー、投与量計算法（１９９９年）、および、レミングトン、調剤科学および実践、第２０版（２００３年、ジェンナロ、リピンコット、ウィリアムズ＆ウィルキンス出版を参照のこと）。

本願において用いられる場合、用語「スプレー」は、例えば、改変コーン分画法ＩまたはＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程などのアルコール沈殿工程の間に液体の物質をその細かい水滴または霧の形状で系に送達する手段を意味する。スプレーヘッドまたはノズルを有し、手動で、または、自動で操作されて液体から微細な霧を発生させる容器（例えば、スプレーボトル）などのいかなる加圧装置によってもスプレーを達成することができる。典型的には、系内で液体の急速かつ均等な分配を確実にするために系を連続的に撹拌するかまたは混合しながらスプレーを実行する。

本発明の詳細な説明
Ｉ．概要
現代の医薬で通常実施されているように、濃縮された免疫グロブリン類（特に、ＩｇＧ類）の無菌製剤が、３つの主要な種類に分類される病状：免疫不全，炎症および自己免疫疾患、および急性感染症の治療に用いられる。一般に用いられているＩｇＧ製品の１つである静脈注射用免疫グロブリン、すなわちＩＶＩＧは、例えば、１０％または約１０％のＩｇＧ濃度で静脈内投与用に製剤化されている。濃縮免疫グロブリン類は、例えば、２０％または約２０％のＩｇＧ濃度で皮下投与用または筋肉内投与用に製剤化されることもできる。議論し易くするために、そのような皮下投与または筋肉内投与用に製剤化されたＩｇＧ組成物はまた、「ＩＶＩＧ」という言葉で本願に含まれる。

ある態様では、本発明は、生成物の最終収率を上昇させるＩＶＩＧ製造方法を提供し、さらに、同等の、または、より高い品質の、いくつかの場合ではさらに高い濃度のＩＶＩＧ組成物を提供する。１つの実施形態では、本発明は、１つ以上の沈殿工程でＩｇＧ損失を低減させる改変コーン分画法を提供する。

別の態様では、本発明は、本明細書において提供される改良された製造方法に従って調製されるＩｇＧ組成物を提供する。好都合なことに、これらの組成物は、本明細書において提供される方法により与えられた収率の向上のため、現在入手可能な市販品よりも製造費が少ない。さらに、これらの組成物は、商業ベースの方法を用いて製造された組成物と少なくとも同程度に純粋である。重要なことに、これらの組成物は、免疫不全、炎症および自己免疫疾患、および急性感染症のＩＶＩＧ療法での使用に適切である。１つの実施形態では、ＩｇＧ組成物は静脈内投与のために１０％または約１０％のＩｇＧである。別の実施形態では、ＩｇＧ組成物は皮下または筋肉内投与のために２０％または約２０％である。

別の態様では、本発明は、本明細書において提供される改良された製造方法論に従って調製されたＩｇＧ組成物の医薬組成物および製剤を提供する。ある実施形態では、これらの組成物および製剤は、現在市販されている他のＩＶＩＧ組成物と比較して向上した特性を提供する。例えば、ある実施形態では、本明細書において提供される組成物および製剤は長期間安定である。

さらに別の態様では、本発明 は、本明細書において提供される改良された方法を用いて調製されたＩｇＧ組成物の投与を含む、免疫不全、炎症および自己免疫疾患、および急性感染症の治療方法を提供する。

ＩＩ．ＩＶＩＧ製造方法
一般に、任意の適切な出発原料、例えば、回収血漿または原料血漿から本発明による免疫グロブリン製剤を調製することができる。典型的な例では、健康な提供者から血液または血漿が採取される。通常、血液は、免疫グロブリン製剤が投与されるであろう対象と同じ動物種から採取される（典型的には"相同"免疫グロブリン類と称される）。免疫グロブリン類は、例えば、沈殿（アルコール分画法またはポリエチレングリコール分画法）、クロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー等）、超遠心分離法および電気泳動調製法等のような適切な方法によって血液から単離される（例えば、Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); 米国特許第５，１２２，３７３号および米国特許第５，１７７，１９４号を参照のこと;これらの開示は、あらゆる目的のために、引用によりその全てがここに組み込まれる)。

多くの場合では、当業者に周知のアルコール分画法および／またはイオン交換クロマトグラフィー法およびアフィニティークロマトグラフィー法により作製されたγグロブリン含有産物から免疫グロブリン類が調製される。例えば、精製コーンフラクションＩＩは免疫グロブリン類の単離の出発点として一般に用いられる。出発コーンフラクションＩＩペーストは、典型的にはＩｇＧの濃度が約９５％であり、４つのＩｇＧサブタイプからなる。異なるサブタイプは、それらが得られたプールされたヒト血漿中に見いだされるのとほぼ同じ割合で、フラクションＩＩ中に存在する。フラクションＩＩは、投与可能な生成物への製剤の前にさらに精製される。例えば、フラクションＩＩペーストを冷精製アルコール水性溶液に溶解し、沈殿および濾過によって不純物を除去することができる。最後の濾過に続いて、アルコールを除去するために免疫グロブリン懸濁液を（例えば、１００，０００ダルトン以下の公称分画分子量を有する限外濾過膜を用いて）透析または透析濾過することができる。所望のタンパク質濃度を得るために溶液を濃縮または希釈することができ、当業者に周知の技術により前記溶液をさらに精製することができる。

さらに、免疫グロブリンの特定のアイソタイプまたはサブタイプを濃縮するために追加の調製工程を用いることができる。例えば、ＩｇＧまたは特定のＩｇＧサブタイプの免疫グロブリン類の混合物を濃縮するためにプロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＨセファロースクロマトグラフィーを用いることができる。Harlow and Lane, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)、Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988）、および、米国特許第５，１８０，８１０号を全体として参照のこと。これらの開示は、あらゆる目的のために、引用によりその全てがここに組み込まれる。

上記の方法と異なり、１つの態様では本発明は、脱クリオ出発原料を用いる濃縮ＩｇＧ組成物の調製方法を提供する。一般に、本明細書において提供される方法は、現在市販されているＩＶＩＧ製剤に見られる品質と少なくとも同じ品質を維持しつつ、優れたＩｇＧの収率をもたらすために改変コーン−オンクレイ（Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ）アルコール分画工程とイオン交換クロマトグラフィーの両方を利用する。例えば、ある実施形態では、原料血漿出発物質に見られるＩｇＧ含有量の７５％近くを含む最終バルクＩｇＧ組成物を産出する方法が提供される。これらの方法は、既存の最新式の精製方法よりも少なくとも１０％〜１２％の増産を全ＩｇＧ収量において意味する。例えば、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤの製造方法により、出発原料に見られるＩｇＧ含有量の約６０％と６５％の間の最終収量がもたらされると推定されている。したがって、本明細書において提供される方法により、既存のＩｇＧ精製技術に著しい改良がもたらされる。

１つの実施形態では、本発明は、原料血漿出発物質に見られるＩｇＧ含有量の少なくとも７０％を含む精製ＩｇＧ組成物を提供する。別の実施形態では、原料血漿出発物質に見られるＩｇＧ含有量の少なくとも７５％を含む精製ＩｇＧ組成物を提供する。他の実施形態では、本明細書において提供される精製ＩｇＧ組成物は、原料血漿出発物質に見られるＩｇＧ含有量の少なくとも約６５％を含み、または、原料血漿出発物質に見られるＩｇＧ含有量の少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％もしくはそれ以上を含むであろう。

Ａ．改変アルコール沈殿/イオン交換クロマトグラフィー分画法
１つの態様では、本発明は、ＩＶＩＧ療法での使用に適切なＩｇＧ組成物の改良された製造方法を提供する。一般的に、これらの方法は、市販のＩＶＩＧ製品の製造に用いられている現在の方法よりも高い収率を有し、そして、少なくともそれに比較し得る純度のＩｇＧ製剤を提供する。

１つの特定の態様では、本発明は、血漿から濃縮されたＩｇＧ組成物、例えば、１０％の濃度のＩＶＩＧを調製する方法であって、少なくとも１つのアルコール沈殿工程および少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー工程の実施を含む方法を提供する。特に、改良された上流処理におけるいくつかの工程、例えば、低温での２５％のエタノールの使用、スプレーによるエタノール添加、スプレーによるｐＨ調整およびシリカ微粒子の使用は以前の処理と異なる。

ある実施形態では、前記方法は、（ａ）第１沈殿工程において、約６．７と約７．３の間のｐＨで約６％と約１０％の間の濃度のアルコールを用いて脱クリオ血漿画分を沈殿させてＩｇＧが濃縮された上清を得る工程、（ｂ）約６．７と約７．３の間のｐＨで約２０％と約３０％の間の濃度のアルコールを低温で用いて上清からＩｇＧを沈殿させて第１の沈殿物を形成する工程、（ｃ）工程（ｂ）で形成された第１の沈殿物を再懸濁して懸濁液を形成する工程、（ｄ）工程（ｃ）で形成された懸濁液を界面活性剤で処理する工程、（ｅ）約６．７と約７．３の間のｐＨで約２０％と約３０％の間の濃度のアルコールを用いて懸濁液からＩｇＧを沈殿させて第２の沈殿物を形成する工程、（ｆ）工程（ｅ）で形成された第２の沈殿物を再懸濁して懸濁液を形成する工程、（ｇ）工程（ｆ）で形成された懸濁液を溶媒および／または界面活性剤で処理する工程、ならびに（ｈ）少なくとも１回のイオン交換クロマトグラフィー分画を実行し、それによって濃縮されたＩｇＧの組成物を調製する工程を含む。１つの実施形態では、前記方法は、工程（ｃ）で形成された懸濁液を微粉化した二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）で処理し、工程（ｄ）の前に溶液を濾過することをさらに含む。

１つの実施形態では、血漿から濃縮ＩｇＧ組成物を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：（ａ）脱クリオ血漿画分のｐＨを約７．０に調整する工程、（ｂ）約−５℃と約−９℃の間の温度で工程（ａ）の脱クリオ血漿画分のエタノール濃度を２５％（体積／体積）または約２５％（体積／体積）に調整し、それによって混合物を形成する工程であって、エタノール濃度をスプレーによって調整することができる工程、（ｃ）工程（ｂ）の混合物から液体と沈殿物を分離する工程、（ｄ）１０００Ｌの緩衝液あたり約４００ｍＬと約７００ｍＬの間の氷酢酸を用いてｐＨが調整されたリン酸塩および酢酸塩を含む緩衝液で工程（ｃ）の沈殿物を再懸濁し、それによって懸濁液を形成する工程、（ｅ）細かく分割した（ＳｉＯ_２）を工程（ｄ）の懸濁液と少なくとも約３０分間混合する工程、（ｆ）加圧濾過機を用いて懸濁液を濾過し、それによって濾過液を形成する工程、（ｇ）加圧濾過機のデッドボリュームの少なくとも３倍の、リン酸塩および酢酸塩を含む緩衝液であって、１０００Ｌの緩衝液あたり約１５０ｍＬの氷酢酸を用いてｐＨが調整された緩衝液を用いて、加圧濾過機を洗浄し、それによって洗浄溶液を形成する工程、（ｈ）工程（ｆ）の濾過液を工程（ｇ）の洗浄溶液と混合し、それによって溶液を形成し、そして、その溶液を界面活性剤で処理する工程、（ｉ）工程（ｈ）の溶液のｐＨを約７．０に調整し、そして、２５％または約２５％の終濃度にまでエタノールを添加し、それによって沈殿物を形成する工程であって、エタノール濃度および／またはｐＨはスプレーによって調整され得る工程、（ｊ）工程（ｉ）の混合物から液体と沈殿物を分離する工程、（ｋ）溶媒または界面活性剤を含む水性溶液に沈殿物を溶解し、そして、その溶液を少なくとも６０分間維持する工程、（ｌ）工程（ｋ）の後に溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、そして、カラムに吸着されたタンパク質を溶離液中に溶出する工程、（ｍ）工程（ｌ）からの溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通して流出液（すなわち、通過画分）を精製する工程、（ｎ）工程（ｍ）からの流出液をナノフィルターに通してナノ濾過液を生成する工程、（ｏ）工程（ｎ）からのナノ濾過液を限外濾過膜に通して限外濾過液を生成する工程、ならびに（ｐ）工程（ｏ）からの限外濾過液を透析濾過緩衝液に対して透析濾過して約８％（重量／体積）と約２２％（重量／体積）の間のタンパク質濃度を有する透析濾過液を生成し、それによって濃縮されたＩｇＧの組成物を得る工程。１つの実施形態では、工程（ｂ）の温度は−７℃または約−７℃である。１つの特定の実施形態では、工程（ｄ）の懸濁緩衝液は約６００ｍＬの氷酢酸を用いて調整される。

ある実施形態では、透析濾過液は、約８％と約１２％の間のタンパク質濃度、例えば、約８％または約９％、１０％、１１％または１２％のタンパク質濃度を有するであろう。好ましい実施形態では、透析濾過液は１０％または約１０％のタンパク質濃度を有するであろう。別の好ましい実施形態では、透析濾過液は１１％または約１１％のタンパク質濃度を有するであろう。さらに別の好ましい実施形態では、透析濾過液は１２％または約１２％のタンパク質濃度を有するであろう。他の実施形態では、透析濾過液は約１３％と約１７％の間のタンパク質濃度、例えば、約１３％または約１４％、１５％、１６％または１７％のタンパク質濃度を有するであろう。さらに他の実施形態では、透析濾過液は約１８％と約２２％の間のタンパク質濃度、例えば、約１８％または約１９％、２０％、２１％または２２％のタンパク質濃度を有するであろう。好ましい実施形態では、透析濾過液は２０％または約２０％のタンパク質濃度を有するであろう。別の好ましい実施形態では、透析濾過液は２１％また約２１％のタンパク質濃度を有するであろう。さらに別の好ましい実施形態では、透析濾過液は２２％または約２２％のタンパク質濃度を有するであろう。

本発明のある実施形態では、本明細書において提供される方法は２つ以上の上記の分画処理工程に改良を含むことができる。例えば、実施形態は、第１沈殿工程、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程および／または改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程に改良を含むことができる。

１つの実施形態では、第１沈殿工程になされる改良はスプレーによるアルコール添加である。別の実施形態では、第１沈殿工程になされる改良はスプレーによるｐＨ調整剤の添加である。さらなる実施形態では、第１沈殿工程になされる改良はアルコール添加後の溶液のｐＨ調整である。関連する実施形態では、第１沈殿工程になされる改良はアルコール添加中のｐＨの維持である。別の関連する実施形態では、第１沈殿工程になされる改良は、溶液の連続的なｐＨ調整による沈殿インキュベーション時間中のｐＨの維持である。ある実施形態では、第１沈殿工程はこれらの改良のうちの２つ以上を実施することによって改良され得る。本工程で実現され得るさらなる改良は、第１沈殿工程〜改変分画法Ｉについて論じる下記の節から明らかとなるだろう。１つ以上の上記の改良を実施することによって、第１沈殿工程の沈殿物画分で失われるＩｇＧの量が減少し、および／または、沈殿工程中に不可逆的に変性するＩｇＧの部分が減少する。

１つの実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程になされる改良はスプレーによるアルコール添加である。別の実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程になされる改良はスプレーによるｐＨ調整剤の添加である。さらなる実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程になされる改良はアルコール添加後の溶液のｐＨ調整である。関連する実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程になされる改良はアルコール添加中のｐＨの維持である。別の関連する実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程になされる改良は溶液の連続的なｐＨ調整による沈殿インキュベーション時間中のｐＨの維持である。別の態様では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程は、２５％または約２５％にアルコールの濃度を増加させることにより改良される。さらに別の実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程は、約−７℃と−９℃の間にインキュベーション温度を下げることにより改良される。ある実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程は、これらの改良の２つ以上を実施することによって改良され得る。本工程で実現され得るさらなる改良は、第２沈殿工程〜改変分画法ＩＩ＋ＩＩＩについて論じる下記の節から明らかとなるだろう。１つ以上の上記の改良を実施することによって、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程において失われる上清画分中のＩｇＧの量がより少なくなり、および／または、沈殿工程中に不可逆的に変性するＩｇＧの部分が減少する。

１つの実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程になされる改良は、溶解緩衝液の氷酢酸含有量を約０．０６％に増加することによって達成される。別の実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程になされる改良は、溶液の連続的なｐＨ調整により溶解インキュベーション中に溶液のｐＨを維持することによって達成される。別の実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程になされる改良は、濾過の前に微粉化した二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）をフラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液と混合することによって達成される。ある実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程は、これらの改良の２つ以上を実施することによって改良され得る。本工程で実現され得るさらなる改良は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程〜改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出について論じる下記の節から明らかとなるだろう。１つ以上の上記の改良を実施することによって、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液中に回収されるＩｇＧの量が増加し、および／または、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液において不純物の量が減少する。

改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程になされる改良の例は、１０００Ｌあたり１５０ｍＬまたは約１５０ｍＬの氷酢酸を含む、デッドボリュームの少なくとも約３．６倍の溶解緩衝液を用いてフィルターを後洗浄することにより実現される。本工程で実現され得るさらなる改良は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程〜改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液の前処理および濾過について論じる下記の節から明らかとなるだろう。１つ以上の上記の改良を実施することによって、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程中に失われるＩｇＧの量が減少する。

１つの実施形態では、前記方法は、第１沈殿工程と改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、第１沈殿工程と改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、第１沈殿工程と改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程と改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程と改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程と改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、第１沈殿工程、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程および改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、第１沈殿工程、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程および改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、第１沈殿工程、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程および改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程および改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程に改良を含み得る。

別の実施形態では、前記方法は、第１沈殿工程、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程および改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程に改良を含み得る。

ある実施形態では、本明細書において提供されるＩｇＧ精製方法における一つの処理方法の改良は、他の方法であれば流動添加によって血漿画分に添加されるであろう１つ以上の溶液をスプレーで添加することを含む。例えば、ある実施形態では、処理方法の改良は、１つ以上のタンパク質種の沈殿を目的とする、血漿画分へのスプレーによるアルコール（例えば、エタノール）添加を含む。他の実施形態では、スプレーにより血漿画分に添加され得る溶液は、これらに限定されないが、ｐＨ調整溶液，溶媒溶液、界面活性剤溶液、希釈緩衝液、伝導度調整溶液などを含む。好ましい実施形態では、１つ以上のアルコール沈殿工程は血漿画分へのスプレーによるアルコール添加によって実行される。第２の好ましい実施形態では、１つ以上のｐＨ調整工程は、血漿画分へのスプレーによるｐＨ調整溶液の添加によって実行される。

ある実施形態では、別の処理方法の改良はその他のどんな処理方法の改良とも組み合わせることができ、それは沈殿している血漿画分のｐＨを沈殿剤（例えば、アルコールまたはポリエチレングリコール）の添加の後に、および／または、添加と同時に調整することを含む。いくつかの実施形態では、沈殿インキュベーションまたは保持工程の全体を通じて、活発に沈殿している血漿画分のｐＨをｐＨの連続的なモニターと調整により維持する処理方法の改良が提供される。好ましい実施形態では、ｐＨの調整はｐＨ調整溶液のスプレー添加によって実行される。

他の実施形態では、別の処理方法の改良はその他のどんな処理方法の改良とも組み合わせることができ、それは不純物を除去するための微粉化したシリカで処理する工程の使用を含む。

１．脱クリオ血漿の調製
濃縮ＩｇＧ組成物の調製に用いられる出発原料は、一般的に、回収血漿（すなわち、体外で全血から分離された血漿）または原料血漿（すなわち、血漿交換法によって回収された血漿）のどちらかよりなる。典型的には、精製方法は、安全上および品質上の考慮すべき事項について既に評価されている前もって凍結されたプール血漿の解凍で始まる。典型的には、６℃以下の温度で解凍が実行される。低温での凍結血漿の解凍が完了した後、固形のクリオ沈殿物を液体の上清から分離するために、遠心分離が低温で（例えば、≦６℃）実行される。あるいは、分離工程は、遠心分離法よりはむしろ濾過によって実行することができる。その後、（新鮮な解凍血漿から遠心分離によって低温不溶性タンパク質が除去された後の「脱クリオ血漿」とも呼ばれる）液体の上清はその次の工程において処理される。この時点で、第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、第ＩＸ因子複合体、第ＶＩＩ因子濃縮物またはアンチトロンビンＩＩＩ複合体の単離のために様々な追加の工程をとることができる。

２．第１沈殿事象〜改変分画法Ｉ
この工程で、典型的には、脱クリオ血漿は約０±１℃に冷却され、そして、ｐＨは約７．０と約７．５の間に調整され、好ましくは約７．１と約７．３の間に調整され、最も好ましくは約７．２に調整される。１つの実施形態では、脱クリオ血漿のｐＨは７．２または約７．２のｐＨに調整される。次に血漿を撹拌しつつ８％（体積／体積）または約８％（体積／体積）の目的のエタノール濃度まで前もって冷却されたエタノールを添加する。同時に、温度を約−４℃と約０℃の間の温度にまでさらに低下させる。好ましい実施形態では、α_２−マクログロブリン、β_１Ａ−およびβ_１Ｃ−グロブリン、フィブリノーゲンおよび第ＶＩＩＩ因子などの夾雑物を沈殿させるために温度を−２℃または約−２℃まで低下させる。典型的には、前記沈殿事象は、より短い、または、より長い保持時間を用いることもできるけれども、少なくとも約１時間の保持時間を含むであろう。その後、理想的には脱クリオ血漿に存在するＩｇＧ含有量を完全に含む上清（上清Ｉ）が遠心分離法、濾過法または他の適切な方法によってさらに収集される。

本発明は、いくつかの実施形態では、脱クリオ血漿のための第１の分画工程として用いられる従来の方法(Cohn et al., 上記、 Oncley et al., 上記)と比較して、上清Ｉ画分におけるＩｇＧの収率を向上することになる方法を提供する。１つの実施形態では、ＩｇＧの収率の向上はスプレーによるアルコール添加により達成される。別の実施形態では、ＩｇＧの収率の向上はスプレーによるｐＨ調整剤添加により達成される。さらに別の実施形態では、ＩｇＧの収率の向上はアルコール添加後に溶液のｐＨを調整することによって達成される。関連する実施形態では、ＩｇＧの収率の向上はアルコール添加中に溶液のｐＨを調整することによって達成される。

１つの特定の態様では、前記改良は、第１沈殿工程の沈殿物画分において失われるＩｇＧの量が減少する方法に関連する。例えば、ある実施形態では、コーン法６のプロトコルの第１沈殿工程で失われるＩｇＧの量と比較して、前記の第１沈殿工程の沈殿物画分において失われるＩｇＧの量が減少する。

ある実施形態では、処理方法の改良は、沈殿用アルコールの添加後に、約７．０と約７．５の間に溶液のｐＨを調整することによって実現される。他の実施形態では、沈殿用アルコールの添加後に、約７．１と約７．３の間に溶液のｐＨを調整する。さらに他の実施形態では、沈殿用アルコールの添加後に、約７．０または約７．１、７．２、７．３、７．４または７．５に溶液のｐＨを調整する。特定の実施形態では、沈殿用アルコールの添加後に、約７．２に溶液のｐＨを調整する。したがって、ある実施形態では、沈殿用アルコールの添加後ではなく添加前に溶液のｐＨを調整する類似の沈殿工程と比較して、第１沈殿工程の沈殿物画分において失われるＩｇＧの量が減少する。１つの実施形態では、沈殿保持またはインキュベーション時間の間に溶液のｐＨを連続的に調整することによって、所望のｐＨにｐＨが維持される。１つの実施形態では、アルコールはエタノールである。

他のある実施形態では、処理方法の改良は、流動添加よりはむしろスプレーによる沈殿用アルコールおよび／またはｐＨ調整用溶液の添加によって実現される。したがって、ある実施形態では、アルコールおよび／またはｐＨ調整用溶液が流動添加によって導入される類似の沈殿工程と比較して、第１沈殿工程の沈殿物画分において失われるＩｇＧの量が減少する。１つの実施形態では、アルコールはエタノールである。

さらに他のある実施形態では、前記改良は、約７．０と約７．５の間に溶液のｐＨを調整することによって実現される。好ましい実施形態では、溶液のｐＨを約７．１および約７．３の間に調整する。他の実施形態では、沈殿用アルコールの添加の後に、流動添加よりはむしろスプレーによって沈殿用アルコールおよび／またはｐＨ調整用溶液を添加することにより、溶液のｐＨを７．０、７．１、７．２、７．３、７．４もしくは７．５または約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４もしくは７．５に調整する。特定の実施形態では、沈殿用アルコール添加の後に、流動添加よりはむしろスプレーによって沈殿用アルコールおよび／またはｐＨ調整用溶液を添加することにより、溶液のｐＨを７．２または約７．２に調整する。１つの実施形態では、アルコールはエタノールである。

３．第２沈殿事象〜改変分画法ＩＩ＋ＩＩＩ
さらに分画のＩｇＧ含量および純度を高めるために、改変コーン−オンクレイフラクションＩＩ＋ＩＩＩ分画法である第２沈殿工程に上清Ｉをかける。一般的に、溶液のｐＨを約６．６と約６．８の間のｐＨに調整する。好ましい実施形態では、溶液のｐＨを６．７または約６．７に調整する。次に、撹拌しながら約２０％と約２５％（体積／体積）の間の終濃度までアルコール、好ましくはエタノールを溶液に添加して画分中のＩｇＧを沈殿させる。好ましい実施形態では、２５％（体積／体積）または約２５％（体積／体積）の終濃度までアルコールを添加して画分中のＩｇＧを沈殿させる。一般的に、α_１−リポプロテイン、α_１−アンチトリプシン、Ｇｃ−グロブリン類、α_１Ｘ−グリコプロテイン、ハプトグロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、ヘモペキシン、クリスマス因子画分、チロキシン結合グロブリン、コリンエステラーゼ、ヒペルテンシノゲンおよびアルブミンなどの夾雑物はこれらの条件では沈殿しないであろう。

アルコール添加の前に、または、アルコール添加と同時に、約−７℃と約−９℃の間の温度まで溶液をさらに冷却する。好ましい実施形態では、−７℃または約−７℃の温度まで溶液を冷却する。アルコール添加の完了の後に、溶液のｐＨを直ちに約６．８と約７．０の間に調整する。好ましい実施形態では、溶液のｐＨを６．９または約６．９に調整する。典型的には、前記沈殿事象は、より短い、または、より長い保持時間を用いることもできるけれども、少なくとも約１０時間の保持時間を含むであろう。その後、理想的には脱クリオ血漿中に存在するＩｇＧ含有量の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％を含有する沈殿物（改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ）を遠心分離法、濾過法または他の適切な方法によって上清から分離し、回収する。本発明は、いくつかの実施形態では、脱クリオ血漿のための第２の分画工程として用いられる従来の方法(Cohn et al., 上記; Oncley et al., 上記)と比較して、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物におけるＩｇＧの収率を向上することになる方法を提供する。関連する実施形態では、本発明は、改変ＩＩ＋ＩＩＩ上清におけるＩｇＧの損失を低減することになる方法を提供する。

本発明は、いくつかの実施形態では、脱クリオ血漿のための第２の分画工程として使用される従来の方法(Cohn et al., 上記; Oncley et al., 上記)と比較して、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物におけるＩｇＧの収率を向上することになる方法を提供する。１つの実施形態では、前記改良はスプレーによるアルコール添加により実現される。別の実施形態では、前記改良はスプレーによるｐＨ調整剤添加により実現される。別の実施形態では、前記改良はアルコール添加後に溶液のｐＨを調整することによって実現される。関連する実施形態では、前記改良はアルコール添加中に溶液のｐＨを調整することによって実現される。別の実施形態では、前記改良は約２５％（体積／体積）までアルコール（例えば、エタノール）の濃度を増加することにより実現される。別の実施形態では、前記改良は沈殿工程の温度を約−７℃と−９℃の間の温度まで低下させることにより実現される。好ましい実施形態では、前記改良は約２５％（体積／体積）までアルコール（例えば、エタノール）の濃度を増加し、そして、温度を約−７℃と−９℃の間の温度まで低下させることにより実現される。それに対し、沈殿物中の夾雑物のレベルを低減するために、コーンらとオンクレイらの両方が−５℃で沈殿を実行し、そして、オンクレイらは２０％のアルコールを使用する。好都合なことに、本明細書において提供される方法は、最終産物中に高レベルの夾雑物が存在することなく最大のＩｇＧ収率を可能にする。

沈殿用アルコールの添加の前に溶液のｐＨを約６．９のｐＨに調整するとき、部分的にはタンパク質の沈殿のために溶液のｐＨが６．９から約７．４と約７．７の間に変わることが明らかになっている（図８を参照のこと）。溶液のｐＨが６．９から離れるので、ＩｇＧの沈殿はあまり順調でなくなり、ある夾雑物の沈殿がより順調になる。好都合なことに、発明者らは、沈殿用アルコールの添加の後に溶液のｐＨを調整することによってフラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物中により高いパーセンテージのＩｇＧが回収されることを発見している。

したがって、１つの態様では、前記改良は改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程の上清中において失われるＩｇＧの量が減少する方法に関連する。言い換えれば、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物中に出発ＩｇＧのパーセンテージが増加して存在する。ある実施形態では、処理方法の改良は、沈殿用アルコールの添加直後に、または、添加中に約６．７と約７．１の間に溶液のｐＨを調整することによって実現される。別の実施形態では、処理方法の改良は、沈殿インキュベーション期間中、溶液のｐＨを約６．７と約７．１の間に絶えず維持することにより実現される。他の実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿用アルコールの添加直後に、もしくは、添加中に約６．８と約７．０の間に調整される、または、沈殿用アルコールの添加直後に、もしくは、添加中に約６．７、６．８、６．９、７．０もしくは７．１のｐＨに調整される。特定の実施形態では、溶液のｐＨを、沈殿用アルコールの添加直後に、または、添加中に約６．９に調整する。ある実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿インキュベーション期間中、約６．８から約７．０の間に絶えず維持される、または、沈殿インキュベーション期間中、約６．９のｐＨに絶えず維持される。したがって、ある実施形態では、沈殿用アルコールの添加の後ではなく前にｐＨが調整される類似の沈殿工程と比較して、または、溶液のｐＨが沈殿インキュベーション期間の全体にわたって維持されない類似の沈殿工程と比較して、第２沈殿工程における上清画分において失われるＩｇＧの量が減少する。１つの実施形態では、溶液のｐＨを連続的に調整することにより沈殿保持またはインキュベーション時間の間に所望のｐＨにｐＨが維持される。１つの実施形態では、アルコールはエタノールである。

別の実施形態では、処理方法の改良は、流動添加よりはむしろスプレーによって沈殿用アルコールおよび／またはｐＨ調整用溶液を添加することによって実現される。したがって、ある実施形態では、アルコールおよび／またはｐＨ調整用溶液が流動添加によって導入される類似の沈殿工程と比較して、第２沈殿工程の上清画分において失われるＩｇＧの量が減少する。１つの実施形態では、アルコールはエタノールである。

別の実施形態では、処理方法の改良は、約−７℃と約−９℃の間の温度で沈殿工程を実行することにより実現される。１つの実施形態では、前記沈殿工程は−７℃または約−７℃で実行される。別の実施形態では、前記沈殿工程は−８℃または約−８℃で実行される。別の実施形態では、前記沈殿工程は−９℃または約−９℃で実行される。ある実施形態では、前記沈殿工程のアルコール濃度は約２３％と約２７％の間である。好ましい実施形態では、前記アルコール濃度は約２４％と約２６％の間である。別の好ましい実施形態では、前記アルコール濃度は２５％または約２５％である。他の実施形態では、前記アルコール濃度は２３％、２４％、２５％、２６％もしくは２７％、または、約２３％、２４％、２５％、２６％もしくは２７％であり得る。特定の実施形態では、第２沈殿工程は２５％または約２５％のアルコール濃度を用いて−７℃または約−７℃の温度で実行される。１つの実施形態では、アルコールはエタノールである。

第２の沈殿のアルコール濃度を、オンクレイら，上記，で用いられる２０％から２５％まで増加して、そして、インキュベーション温度を、コーン−オンクレイ法において用いられる−５℃から−７℃または約−７℃まで低下させることの効果は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のＩｇＧ含有量の５％〜６％の増加である。

別の実施形態では、処理方法の改良は、沈殿用アルコールの添加直後に、または、添加中に溶液のｐＨを約６．７と約７．１の間に、好ましくは６．９または約６．９に調整し、沈殿インキュベーション期間中、連続的にｐＨを調整することによって溶液のｐＨを約６．７と約７．１の間のｐＨに、好ましくは６．９または約６．９に維持し、ならびに、流動添加よりはむしろスプレーによって沈殿用アルコールおよび／またはｐＨ調整用溶液を添加することにより実現される。別の特定の実施形態では、処理方法の改良は、沈殿工程を約−７℃と約−９℃の間の温度で、好ましくは−７℃または約−７℃の温度で実行し、そして約２３％と約２７％の間のアルコール濃度、好ましくは２５％または約２５％のアルコール濃度を用いてＩｇＧを沈殿させることによって実現される。さらに別の特定の実施形態では、処理方法の改良は上記の改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ改良の全てを組み込むことにより実現される。好ましい実施形態では、処理方法の改良は−７℃または約−７℃の温度でスプレーにより添加された２５％または約２５％のエタノールを用いてＩｇＧを沈殿し、次に沈殿用アルコールの添加後に溶液のｐＨを６．９または約６．９に調整することにより実現される。さらに別の好ましい実施形態では、溶液のｐＨは、沈殿インキュベーションまたは保持時間の全体で６．９または約６．９に維持される。

４．改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出
改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のＩｇＧ内容物を可溶化するために、冷抽出緩衝液を用いて分画法ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を１部の沈殿物対１５部の抽出緩衝液という典型的な比率で再懸濁する。その他の適切な再懸濁比率、例えば、約１：８から約１：３０までの、または、約１：１０から約１：２０までの、または、約１：１２から約１：１８までの、または、約１：１３から約１：１７までの、または約１：１４から約１：１６までの比率が用いられ得る。ある実施形態では、再懸濁比率は、約１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０またはそれ以上であり得る。

改変ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出に適切な溶液は、一般的に約４．０と約５．５の間のｐＨを有するであろう。ある実施形態では、前記溶液は約４．５と約５．０の間のｐＨを有し、他の実施形態では、前記抽出溶液は約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４または５．５のｐＨを有するであろう。好ましい実施形態では、抽出緩衝液のｐＨは４．５または約４．５であろう。別の好ましい実施形態では、抽出緩衝液のｐＨは４．７または約４．７であろう。別の好ましい実施形態では、抽出緩衝液のｐＨは４．９または約４．９であろう。一般的に、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、１塩基リン酸塩、２塩基リン酸塩、およびこれらの混合物等から選択される緩衝化剤を用いることでこれらのｐＨの必要性と合致することができる。適切な緩衝液の濃度は、典型的には、約５ｍＭから約１００ｍＭまでの範囲にあり、または、約１０ｍＭから約５０ｍＭまでの範囲にあり、または、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｍＭの濃度の緩衝化剤である。

抽出緩衝液は、好ましくは、約０．５ｍＳ・ｃｍ^−１から約２．０ｍＳ・ｃｍ^−１までの電気伝導度を有するであろう。例えば、ある実施形態では、抽出緩衝液の電気伝導度は約０．５ｍＳ・ｃｍ^−１または約０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または約２．０ｍＳ・ｃｍ^−１であろう。当業者は、適切な電気伝導度を有する抽出緩衝液の作成法がわかるであろう。

１つの特定の実施形態では、抽出緩衝液の例は、ｐＨ４．５±０．２または約４．５±０．２および０．７〜０．９ｍＳ／ｃｍまたは約０．７〜０．９ｍＳ／ｃｍの電気伝導度で５ｍＭまたは約５ｍＭのリン酸１ナトリウムおよび５ｍＭまたは約５ｍＭの酢酸塩を含むことができる。

一般的に、約０℃と約１０℃の間、または、約２℃と約８℃の間の温度で抽出を実行する。ある実施形態では、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃で抽出を実行することができる。特定の実施形態では、約２℃と約１０℃の間の温度で抽出を実行する．典型的には、懸濁液を絶えず撹拌しつつ、約６０分と約３００分の間または約１２０分と２４０分の間または約１５０分と２１０分の間の時間、抽出処理が進行するであろう。ある実施形態では、約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０，または約３００分の間、抽出処理が進行するであろう。好ましい実施形態では、少なくとも１６０分間、絶えず撹拌しつつ抽出処理が進行するであろう。

５ｍＭリン酸１ナトリウム、５ｍＭ酢酸塩および０．０５１％〜０．０６％氷酢酸（体積／体積）を含有する抽出緩衝液を使用すると、最終ＩｇＧ組成物の収率が、最終産物の純度を危うくすることなく、かなり増加することができることが明らかになっている。図９に酢酸の量と抽出緩衝液のｐＨの相関関係が示されている。好ましい実施形態では、４．５±０．２または約４．５±０．２のｐＨで１：１５または約１：１５のペーストの緩衝液に対する比率を用いてフラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を抽出する。

好都合なことに、５ｍＭリン酸１ナトリウム、５ｍＭ酢酸塩および０．０５１％氷酢酸（体積／体積）を含有する抽出緩衝液を用いる現在のＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ（ＢａｘｔｅｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）の製造方法と比較して、０．０６％（体積／体積）または約０．０６％（体積／体積）に氷酢酸の含有量を増やすことにより、最終ＩｇＧ組成物の収率がかなり増加することができることが明らかになっている。本発明は、いくつかの実施形態では、第２沈殿工程で形成された沈殿物の抽出のために以前に採用された方法（ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ）と比較して、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液におけるＩｇＧ収率を向上することになる方法を提供する。

１つの態様では、前記改良は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の非可溶化画分において失われるＩｇＧの量が減少する方法に関連する。１つの実施形態では、処理方法の改良は、５ｍＭリン酸１ナトリウム、５ｍＭ酢酸塩および０．０６％氷酢酸（体積／体積）を含有する溶液を用いて１：１５（沈殿物対緩衝液）の比率で改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を抽出することにより実現される。別の実施形態では、前記改良は、抽出処理の期間中、溶液のｐＨを維持することにより実現される。１つの実施形態では、抽出処理の期間中、約４．１と約４．９間に溶液のｐＨを維持する。好ましい実施形態では、抽出処理の期間中、約４．２と約４．８の間に溶液のｐＨを維持する。より好ましい実施形態では、抽出処理の期間中、約４．３と約４．７の間に溶液のｐＨを維持する。別の好ましい実施形態では、抽出処理の期間中、約４．４と約４．６の間に溶液のｐＨを維持する。さらに別の好ましい実施形態では、抽出処理の期間中、４．５または約４．５に溶液のｐＨを維持する。

別の態様では、前記改良は、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程においてフラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物から可溶化するＩｇＧの量が増加する方法に関連する。１つの実施形態では、処理方法の改良は、１０００Ｌあたり６００ｍＬの氷酢酸を含む溶解緩衝液中にフラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を可溶化することによって実現される。別の実施形態では、前記改良は、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物中のＩｇＧを可溶化した後に不純物を減少させる方法に関連する。１つの実施形態では、処理方法の改良は、少なくとも約３０分間、微粉化した二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）をフラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液と混合することにより実現される。

５．改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液の前処理および濾過
改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の非可溶化画分（すなわち、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩフィルターケーキ）を除去するために、典型的には深層濾過を用いて懸濁液を濾過する。本明細書において提供される方法に用いることができる深層フィルターには、金属深層フィルター、ガラス深層フィルター、セラミック深層フィルター、（珪藻土などの）有機深層フィルターなどが含まれる。適切なフィルターの例には、Ｃｕｎｏ５０ＳＡフィルター、Ｃｕｎｏ９０ＳＡフィルターおよびＣｕｎｏＶＲ０６フィルター（Ｃｕｎｏ）が含まれるがこれらに限定されない。あるいは、濾過よりはむしろ遠心分離によって分離工程を実行することができる。

上記の製造方法の改良は精製方法の初期の工程におけるＩｇＧの損失を最小化するけれども、ＰＫＡ活性、アミド分解活性およびフィブリノーゲン内容物を含む重要な不純物は、例えば、ＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ４．５または４．６で抽出されるとき、約４．９〜５．０のｐＨで抽出が行われるときと比較してずっと多い（実施例２〜５を参照のこと）。

本明細書において提供される方法において抽出される不純物に対処するために、濾過／遠心分離の前に前処理工程を加えることによりＩｇＧ組成物の純度が非常に高くなることが今では明らかになっている。１つの実施形態では、この前処理工程には、微粉化した二酸化ケイ素粒子（例えば、ヒュームドシリカ、アエロジル（登録商標））の添加とその後の懸濁液が絶え間なく混合される４０分〜８０分のインキュベーション期間が含まれる。ある実施形態では、インキュベーション期間は約５０分と約７０分の間、または、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０分またはそれ以上であろう。一般的に、約０℃と約１０℃の間、または、約２℃と約８℃の間の温度で処理が行われるであろう。ある実施形態では、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃で処理を行うことができる。特定の実施形態では、約２℃と約１０℃の間の温度で処理を行う。

ヒュームドシリカでの処理の効果は実施例１７に見られる結果によって例示される。この実施例では、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を懸濁し、そして、２つの試料に分け、そのうちの１つを濾過の前に濾過助剤のみで清澄化し（図７Ａ）、そして、そのうちの１つを濾過助剤の添加と濾過の前にヒュームドシリカで処理する（図７Ｂ）。クロマトグラフと定量化データに見ることができるように、ヒュームドシリカで前処理された濾過液試料は濾過助剤で処理されただけの試料よりもずっと高いＩｇＧの純度を有した（６８．８％対５５．７％；それぞれ、表１７と表１８を比較のこと）。

ある実施形態では、ＩＩ＋ＩＩＩペーストに対して約２０ｇ／ｋｇと約１００ｇ／ｋｇの間の濃度でヒュームドシリカを添加する（すなわち、１：１５の比率で抽出される改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物には、ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液に対して約２０ｇ／１６ｋｇから約１００ｇ／１６ｋｇまでの濃度で、または、約０．１２５％（重量／重量）〜約０．６２５％（重量／重量）の終濃度でヒュームドシリカが加えられるであろう。）。ある実施形態では、ＩＩ＋ＩＩＩペーストに対して約２０ｇ／ｋｇの濃度で、または、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｇ／ｋｇの濃度でヒュームドシリカを添加することができる。１つの特定の実施形態では、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液に対して約４０ｇ／１６ｋｇ ＩＩ＋ＩＩＩの終濃度でヒュームドシリカ（例えば、アエロジル３８０またはその同等物）を添加する。約２℃〜８℃で少なくとも５０〜７０分間混合を行う。

ある実施形態では、深層濾過を促進するために二酸化ケイ素での処理の後に濾過助剤、例えば、Ｃｅｌｐｕｒｅ Ｃ３００（Ｃｅｌｐｕｒｅ）またはＨｙｆｌｏ−Ｓｕｐｐｅｒ−Ｃｅｌ（Ｗｏｒｌｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ）が加えられるであろう。ＩＩ＋ＩＩＩペーストに対して約０．１ｋｇ／ｋｇから約０．０７ｋｇ／ｋｇまでの終濃度で、または、約０．２ｋｇ／ｋｇから約０．０６ｋｇ／ｋｇまでの終濃度で、または、約０．３ｋｇ／ｋｇから約０．０５ｋｇ／ｋｇまでの終濃度で濾過助剤を添加することができる。ある実施形態では、ＩＩ＋ＩＩＩペーストに対して約０．１ｋｇ／ｋｇの終濃度で、または、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６，または０．７ｋｇ／ｋｇの終濃度で濾過助剤が添加されるであろう。

ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤの製造方法の濾過工程中にかなりの画分のＩｇＧが失われているところであった。加圧濾過機の構成部とラインをパージするためにデッドボリュームの１．８倍の懸濁液緩衝液を用いる現在の濾過後洗浄方法は、この工程でＩｇＧの回収率を最大にするには不十分であることが明らかになった。驚くことに、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ清澄化懸濁液中の全ＩｇＧを効率よく回収するためにデッドボリュームの少なくとも３．０倍、好ましくはデッドボリュームの３．６倍の懸濁液緩衝液が必要であることが明らかになった（実施例１２および図１を参照のこと）。ある実施形態では、任意の適切な懸濁液緩衝液で加圧濾過機を洗浄することができる。特定の実施形態では、洗浄緩衝液は、例えば、５ｍＭリン酸１ナトリウム、５ｍＭ酢酸塩および０．０１５％氷酢酸（体積／体積）を含むであろう。

１つの態様では、前記改良は、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程中に失われるＩｇＧの量が減少する方法に関連する。１つの実施形態では、処理方法の改良は、デッドボリュームの少なくとも約３．６倍の、１０００Ｌあたり１５０ｍＬの氷酢酸を含む溶解緩衝液を用いてフィルターを後洗浄することによって実現される。図１０に氷酢酸の量と後洗浄緩衝液中のｐＨとの間の関係が示される。１つの実施形態では、後洗浄抽出緩衝液のｐＨは約４．６と約５．３の間である。好ましい実施形態では、後洗浄緩衝液のｐＨは約４．７と約５．２の間である。別の好ましい実施形態では、後洗浄緩衝液のｐＨは約４．８と約５．１の間である。さらに別の好ましい実施形態では、後洗浄緩衝液のｐＨは約４．９と約５．０の間である。

本発明は、いくつかの実施形態では、第２沈殿工程から形成された懸濁液の清澄化のために以前に採用された方法と比較して（ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ）、清澄化されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液におけるＩｇＧの収率と純度を向上することになる方法を提供する。１つの態様では、前記改良は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩフィルターケーキにおいて失われるＩｇＧの量が減少する方法に関連する。他の態様では、前記改良は、清澄化されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液において見られる不純物の量が減少する方法に関連する。

１つの実施形態では、処理方法の改良は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液の濾過または遠心清澄化の前にヒュームドシリカ処理を挿入することにより実現される。ある実施形態では、ヒュームドシリカ処理は、ＩＩ＋ＩＩＩペーストに対して約０．０１ｋｇ／ｋｇから約０．０７ｋｇ／ｋｇまで、または、約０．０２ｋｇ／ｋｇから約０．０６ｋｇ／ｋｇまで、または、約０．０３ｋｇ／ｋｇから約０．０５ｋｇ／ｋｇまでの添加、または、約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６または０．０７ｋｇ／ｋｇの添加を含むであろう。そして、その混合物は、約２℃と約８℃の間の温度で約５０分と約７０分の間の時間、または、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０分またはそれ以上の間保温されるであろう。別の実施形態では、処理方法の改良は、残存するフィブリノーゲン、アミド分解活性および／またはプレカリクレインアクチベーター活性のレベルを低減したフュームドシリカ処理の挿入によって実現される。

別の実施形態では、処理方法の改良は、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程の完了の後に深層フィルターのデッドボリュームの約３倍と約５倍の間の体積でそのフィルターを洗浄することによって実現される。ある実施形態では、フィルターのデッドボリュームの約３．５倍と約４．５倍の間の体積、または、少なくとも約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０倍の体積でフィルターが洗浄されるであろう。特定の実施形態では、デッドボリュームの少なくとも約３．６倍の懸濁液緩衝液を用いて加圧濾過機が洗浄されるであろう。

６．界面活性剤処理
改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ濾過液からその他の夾雑物を除去するために、試料を次に界面活性剤処理にかける。血漿由来画分の界面活性剤処理の方法は当技術分野において周知である。一般的に、本明細書において提供される方法と同時に任意の標準的な非イオン性界面活性剤処理を用いることができる。例えば、界面活性剤処理のプロトコルの例が以下に提供される。

簡単に述べると、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ濾過液に撹拌しながらポリソルベート−８０を約０．２％（重量／体積）の終濃度で添加し、試料を約２〜８℃の間の温度で少なくとも３０分間保温する。次にクエン酸ナトリウム無水物を約８ｇ／Ｌの終濃度で溶液に混合し、そして、約２〜８℃の間の温度で絶えず撹拌しながら、試料をさらに３０分間保温する。

ある実施形態では、任意の適切な非イオン性界面活性剤を用いることができる。適切な非イオン性界面活性剤の例には、オクチルグルコシド、ジギトニン、Ｃ１２Ｅ８、ルブロール、トリトンＸ−１００、ノニデットＰ−４０、ツイーン−２０（すなわち、ポリソルベート−２０）、ツイーン−８０（すなわち、ポリソルベート−８０）、アルキルポリ（エチレンオキシド）、ブリジ界面活性剤、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポロキサマー、オクチルグルコシド、デシルマルトシドなどが含まれるがこれらに限定されない。

１つの実施形態では、処理方法の改良は、流動添加よりはむしろスプレーによって洗浄性試薬（例えば、ポリソルベート−８０およびクエン酸ナトリウム無水物）を添加することにより実現される。他の実施形態では、添加物が急速に分布することを確実にするために試料を混合している間に改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ濾過液に固形の洗浄性試薬を添加することができる。ある実施形態では、流動添加のように局所的な過度の集中が起こらないように、濾過液の非局在化された表面領域に固形試薬を散布することによって添加することが好ましい。

７． 第３沈殿事象〜沈殿Ｇ
アルブミンおよびトランスフェリンなどの少量の残留部分を除去するために、２５％のアルコール濃度で第３の沈殿を実行する。簡単に述べると、適切なｐＨ調整溶液（例えば、１Ｍ水酸化ナトリウムまたは１Ｍ酢酸）を用いて界面活性剤で処理されたＩＩ＋ＩＩＩ濾過液のｐＨを約６．８と７．２の間、好ましくは約６．９と約７．１の間、最も好ましくは約７．０に調整する。次に、溶液に冷アルコールを約２５％（体積／体積）の終濃度まで添加し、そして、撹拌しつつ混合物を約−６℃〜約−１０℃の間の温度で少なくとも１時間保温して第３の沈殿物（すなわち、沈殿物Ｇ）を形成する。１つの実施形態では、混合物を少なくとも２時間、または、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間またはそれ以上の時間保温する。好ましい実施形態では、混合物を少なくとも２時間保温する。より好ましい実施形態では、混合物を少なくとも４時間保温する。さらにより好ましい実施形態では、混合物を少なくとも８時間保温する。

１つの態様では、処理方法の改良は、第３沈殿工程の上清画分において失われるＩｇＧの量が減少する方法に関連する。ある実施形態では、処理方法の改良は、沈殿用アルコールの添加直後に、または、添加中に約６．８と約７．２の間に溶液のｐＨを調整することによって実現される。別の実施形態では、処理方法の改良は、沈殿インキュベーション期間中、溶液のｐＨを約６．８と約７．２の間に絶えず維持することによって実現される。他の実施形態では、沈殿用アルコールの添加直後に、もしくは、添加中に約６．９と約７．１の間に溶液のｐＨを調整する、または、沈殿用アルコールの添加直後に、もしくは、添加中に約６．８、６．９、７．０、７．１もしくは７．２のｐＨに溶液のｐＨを調整する。特定の実施形態では、沈殿用アルコールの添加直後に、もしくは、添加中に約７．０に溶液のｐＨを調整する。ある実施形態では、沈殿インキュベーション期間中、約６．９〜約７．１の間に溶液のｐＨを絶えず維持する、または、沈殿インキュベーション期間中、約７．０のｐＨに溶液のｐＨを絶えず維持する。したがって、ある実施形態では、沈殿用アルコールの添加の後ではなく前にｐＨが調整される類似の沈殿工程、または、溶液のｐＨが沈殿インキュベーション工程の全体にわたって維持されない類似の沈殿工程と比較して、第３沈殿工程の上清画分において失われるＩｇＧの量が減少する。１つの実施形態では、沈殿保持またはインキュベーション時間の間に溶液のｐＨを連続的に調整することにより所望のｐＨにｐＨを維持する。１つの実施形態では、アルコールはエタノールである。

別の実施形態では、処理方法の改良は、流動添加よりはむしろスプレーによって沈殿用アルコールおよび／またはｐＨ調整用溶液を添加することにより実現される。したがって、ある実施形態では、流動添加によってアルコールおよび／またはｐＨ調整用溶液が導入される類似の沈殿工程と比較して、第３沈殿工程の上清画分中において失われるＩｇＧの量が減少する。１つの実施形態では、アルコールはエタノールである。

８．沈殿物Ｇ（ＰｐｔＧ）の懸濁および濾過
沈殿物ＧのＩｇＧ内容物を可溶化するために、冷抽出緩衝液を用いてＰｐｔＧを再懸濁する。簡単に述べると、ＡＵ_{２８０〜３２０}値が約４０〜９５に達するように約０℃と約８℃の間の温度で沈殿物Ｇを１〜３．５の注射用水（ＷＦＩ）に溶解する。次に、少なくとも２時間撹拌される溶液の最終ｐＨを５．２±０．２または約５．２±０．２に調整する。１つの実施形態では、１Ｍ酢酸を用いてこのｐＨ調整を実行する。ＩｇＧの溶解度を上昇させるために、懸濁液の電気伝導度を約２．５ｍＳ／ｃｍと約６．０ｍＳ／ｃｍの間の伝導度に上昇させる。１つの実施形態では、塩化ナトリウムを添加して電気伝導度を上昇させる。次に、溶解しなかったどんな粒子をも除去するために、約０．１μｍと約０．４μｍの間の公称ポアサイズを有する適切な深層フィルターを用いて懸濁ＰｐｔＧ溶液を濾過する。１つの実施形態では、深層フィルターの公称ポアサイズは、清澄化濾過液を得るために、約０．２μｍである（例えば、ＣｕｎｏＶＲ０６フィルターまたは同等物）。別の実施形態では、懸濁ＰｐｔＧ溶液を遠心分離して清澄化上清を回収する。約２．５ｍＳ／ｃｍと約６．０ｍＳ／ｃｍの間の電気伝導度を有する塩化ナトリウム溶液を用いてフィルターの後洗浄を実行する。典型的には、沈殿物Ｇの抽出に適切な溶液はＷＦＩおよび低電気泳動度緩衝液を含む。１つの実施形態では、低電気泳動度緩衝液は約１０ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有する。好ましい実施形態では、低電気泳動度緩衝液は約９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有する。好ましい実施形態では、低電気泳動度緩衝液は約６ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有する。別の好ましい実施形態では、低電気泳動度緩衝液は約４ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有する。別の好ましい実施形態では、低電気泳動度緩衝液は約２ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導度を有する。

９．溶媒界面活性剤処理
血漿由来産物中に存在し得る、様々なウイルス性夾雑物を不活化するために、次に清澄化ＰｐｔＧ濾過液を溶媒界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理にかける。血漿由来画分の界面活性剤処理の方法は、当技術分野において周知である（検討用に、Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42を参照のこと）。一般的に、本明細書において提供される方法と同時に任意の標準的なＳ／Ｄ処理を用いることができる。例えば、Ｓ／Ｄ処理のプロトコルの例が以下に提供される。

簡単に述べると、トリトンＸ−１００，ツイーン−２０およびリン酸トリ（ｎ−ブチル）（ＴＮＢＰ）を清澄化ＰｐｔＧ濾過液に、それぞれ、約１．０％、０．３％および０．３％の終濃度で添加する。次に、混合物を約１８℃と約２５℃の間の温度で少なくとも約１時間撹拌する。

１つの実施形態では、処理方法の改良は、流動添加よりはむしろスプレーによってＳ／Ｄ試薬（例えば、トリトンＸ−１００、ツイーン−２０およびＴＮＢＰ）を添加することにより実現される。他の実施形態では、Ｓ／Ｄ成分の急速な分布を確実にするために混合されている清澄化ＰｐｔＧ濾過液に固形の界面活性剤試薬を添加することができる。ある実施形態では、流動添加のように局所的な過度の集中が起こらないように、濾過液の非局在化された表面領域に固形試薬を散布することによって添加することが好ましい。

１０．イオン交換クロマトグラフィー
ＩｇＧをＳ／Ｄ処理したＰｐｔＧ濾過液からさらに精製し、そして、濃縮するために、陽イオン交換および／または陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることができる。イオン交換クロマトグラフィーを用いるＩｇＧの精製方法および濃縮方法は当技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，８８６，１５４号は、（約３．８と４．５の間の）低ｐＨでフラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を抽出し、次にカプリル酸を用いてＩｇＧを沈殿し、そして最後に２回の陰イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する方法について記載している。米国特許第ＷＯ６，０６９，２３６号は、アルコール沈殿に全く依らないクロマトグラフィーによるＩｇＧ精製スキームについて記載している。国際公開第ＷＯ２００５／０７３２５２号は、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の抽出、カプリル酸処理、ＰＥＧ処理および１回の陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含むＩｇＧ精製方法について記載している。米国特許第７，１８６，４１０号は、フラクションＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物またはフラクションＩＩ沈殿物のどちらかの抽出とそれに続くアルカリ性のｐＨで実行される１回の陰イオン交換工程を含むＩｇＧ精製方法について記載している。米国特許第７，５５３，９３８号は、フラクションＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物またはフラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物のどちらかの抽出、カプリル酸処理および１回か２回のどちらかの陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む方法について記載している。米国特許第６，０９３，３２４号は、約６．０と約６．６の間のｐＨで操作されるマクロポーラス陰イオン交換樹脂の使用を含む精製方法について記載している。米国特許第６，８３５，３７９号は、アルコール分画なしで陽イオン交換クロマトグラフィーに依る精製方法について記載している。上記の出版物の開示をこれにより、全ての目的のためにその全体を参照して組み込む。

本発明の方法の１つの実施形態では、Ｓ／Ｄ処理したＰｐｔＧ濾過液を陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーの両方にかけることができる。例えば、１つの実施形態では、Ｓ／Ｄ処理したＰｐｔＧ濾過液を、溶液中のＩｇＧを結合する陽イオン交換カラムに通す。次に、吸着されたＩｇＧからＳ／Ｄ試薬を洗い流すことができ、その後に約８．０と９．０の間のｐＨを有する高ｐＨ溶出緩衝液を用いてカラムからＩｇＧが溶出される。この方法で、調製物からＳ／Ｄ試薬を除去するために、ＩｇＧ含有溶液を濃縮するために、または、両方のために陽イオン交換クロマトグラフィー工程を用いることができる。ある実施形態では、ｐＨ溶出緩衝液は、約８．２と約８．８の間のｐＨ、または、約８．４と約８．６の間のｐＨ、または、約８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９または９．０のｐＨを有することができる。好ましい実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは約８．５±０．１である。

ある実施形態では、陽イオン交換カラムからの溶離液をより低いｐＨ、例えば、約５．５と約６．５の間のｐＨに調整し、そして、溶液の電気伝導度が減少するように適切な緩衝液で希釈することができる。ある実施形態では、陽イオン交換溶離液のｐＨを約５．７と約６．３の間のｐＨまたは約５．９と約６．１間のｐＨまたは約５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４または６．５のｐＨに調整することができる。好ましい実施形態では、溶離液のｐＨを約６．０±０．１のｐＨに調整する。次に、調製物中に見られるいくつかの夾雑物を結合する陰イオン交換カラムに溶離液を負荷する。カラムへの負荷と洗浄の間にＩｇＧ画分を含むカラムの通過画分を回収する。ある実施形態では、本発明のイオン交換クロマトグラフィー工程をカラムモード、バッチモードまたはその２つの組合せで実行することができる。

ある実施形態では、処理方法の改良は、流動添加よりはむしろスプレーによってｐＨ調整用溶液を添加することにより実現される。

１１．ナノ濾過および限外／透析濾過
本明細書において提供されるＩｇＧ組成物のウイルス負荷をさらに低減させるために、適切なナノ濾過装置を用いて陰イオン交換カラム溶出液をナノ濾過することができる。ある実施形態では、ナノ濾過装置は約１５ｎｍと約２００ｎｍの間の平均ポアサイズを有するであろう。この使用法に適切なナノフィルターの例には、ＤＶＤ、ＤＶ５０、ＤＶ２０（ポール）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲ（ミリポア）、プラノバ１５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎおよび７５Ｎ（プラノバ）が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ナノフィルターは、約１５ｎｍと約７２ｎｍの間、または、約１９ｎｍと約３５ｎｍの間、または、約１５ｎｍ、１９ｎｍ、３５ｎｍまたは７２ｎｍの平均ポアサイズを有することができる。好ましい実施形態では、ナノフィルターは、アサヒプラノバ３５Ｎフィルターまたはその同等物のように約３５ｎｍの平均ポアサイズを有するであろう。

所望により、ナノ濾過液をさらに濃縮するために限外濾過／透析濾過を実行することができる。１つの実施形態では、特別に計画された後洗浄と共にオープンチャンネル膜を使用し、そして、製造プロセスの終わり近くでの製剤化によって、収率と保存安定性に影響することなく、結果生じるＩｇＧ組成物のタンパク質濃度が最新式のＩＶＩＧ（例えば、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ）と比較して約２倍（２００ｍｇ／ｍＬ）になる。市販の限外濾過膜の大半では、大幅なタンパク質の損失なくＩｇＧの濃度を２００ｍｇ／ｍＬにすることはできない。これらの膜は早期に閉塞されるであろう。したがって、十分な後洗浄は達成するのが困難である。したがって、オープンチャンネル膜構造を用いなければならない。オープンチャンネル膜でも、タンパク質を著しく損失することなく（２％未満の損失）要求される濃度を得るためには特別に計画された後洗浄方法を用いなければならない。さらにずっと驚くべきことは、２００ｍｇ／ｍＬもの高いタンパク質濃度が低ｐＨ保存工程のウイルス不活化能力に影響を与えない事実である。

ナノ濾過の次に、濾過液は限外濾過／透析濾過によってさらに濃縮され得る。１つの実施形態では、限外濾過によってナノ濾過液を約２％と約１０％（重量／体積）の間のタンパク質濃度まで濃縮することができる。ある実施形態では、オープンチャンネルスクリーンを含むカセット中で限外濾過を実行し、そして、限外濾過膜は、約１００ｋＤａ未満または約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０ｋＤａ未満またはそれ以下の公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）を有する。好ましい実施形態では、限外濾過膜は５０ｋＤａ以下のＮＭＷＣＯを有する。

限外濾過工程が完了したら、静脈内または筋肉内投与に適切な溶液に対する透析濾過によって濃縮物をさらに濃縮することができる。ある実施形態では、透析濾過溶液は安定化剤および／または緩衝化剤を含むことができる。好ましい実施形態では、安定化剤および緩衝化剤は適切な濃度のグリシン、例えば、約０．２０Ｍと約０．３０Ｍの間の、または、約０．２２Ｍと約０．２８Ｍの間の、または、約０．２４Ｍと約０．２６ｍＭの間の、または約２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３．０の濃度のグリシンである。好ましい実施形態では、透析濾過緩衝液は０．２５Ｍまたは約０．２５Ｍの濃度のグリシンを含む。

典型的には、最小交換体積は元の濃縮物の体積の少なくとも約３倍、または、元の濃縮物の体積の少なくとも約４、５、６、７、８、９倍またはそれ以上である。約５％と約２５％（重量／体積）の間の、または、約６％と約１８％（重量／体積）の間の、または、約７％と約１６％（重量／体積）の間の、または、約８％と約１４％（重量／体積）の間の、または、約９％と約１２％の間の最終タンパク質濃度に、または、約５％または６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％またはそれ以上の終濃度にＩｇＧ溶液を濃縮することができる。１つの実施形態では、後洗浄画分を濃縮溶液に加えることなく少なくとも約２３％の最終タンパク質濃度が達成される。別の実施形態では、後洗浄画分を濃縮溶液に加えることなく少なくとも約２４％の最終タンパク質濃度が達成される。後洗浄画分を濃縮溶液に加えることなく少なくとも約２５％の最終タンパク質濃度が達成される。典型的には、濃縮処理の終わりに溶液のｐＨは約４．６〜５．１の間であろう。

例示的な実施形態では、限外濾過の前にＩｇＧ組成物のｐＨは約４．５に調整される。限外濾過によって５±２％（重量／体積）のタンパク質濃度に溶液を濃縮する。限外濾過膜は５０，０００ダルトン以下の公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）を有する（ミリポアペリコンポリエーテルスルホン膜）。濃縮物を１０倍の体積のｐＨ４．５±０．２の０．２５Ｍグリシン溶液に対して透析濾過する。限外濾過〜透析濾過の操作を通して、約２℃〜約８℃の間の温度に溶液を維持する。透析濾過の後に、少なくとも１１％（重量／体積）のタンパク質濃度に溶液が濃縮される。

１２．製剤化
透析濾過工程が完了したら、透析濾過緩衝液を用いて溶液のタンパク質濃度を約５％と約２０％（重量／体積）の間、または、約６％と約１８％（重量／体積）の間、または、約７％と約１６％（重量／体積）の間、または、約８％と約１４％（重量／体積）の間、または、約９％と約１２％の間の終濃度に、または、約５％または６％，７％，８％，９％，１０％，１１％，１２％，１３％，１４％，１５％，１６％，１７％，１８％，１９％または２０％の終濃度に調整する。好ましい実施形態では、溶液の最終タンパク質濃度は約９％と約１１％の間、より好ましくは約１０％である。

約０．２２μｍ以下の、例えば、約０．２μｍの絶対ポアサイズを有する膜フィルターに通して濾過することによって、製剤化されたバルク溶液をさらに無菌化する。次に、試験のために試料をとっておきつつ、適切な密封用の最終容器に溶液を無菌的に分配する。

１つの実施形態では、透析濾過緩衝液を用いてＩｇＧ組成物を約１０．２±０．２％（重量／体積）の濃度にさらに調整する。必要に応じて、ｐＨを約４．４〜約４．９に調整する。最後に、溶液を濾過滅菌し、そして、３０℃または約３０℃で３週間保温する。

１３．アルコール添加
好都合なことに、血漿からＩｇＧを分画するために、流動添加よりはむしろスプレーによるアルコールの添加がＩｇＧ収量の損失の減少をもたらすことが明らかになっている。理論に縛られるものではないが、血漿画分への流動添加中に、流体の進入位置でのアルコールの一時的で局所的な過度の集中が、上清中にＩｇＧが残っているであろう工程の間でのＩｇＧのタンパク質変性および不可逆的な損失および／または沈殿に至る可能性がある。さらに、少なくとも１００Ｌのプールされた血漿の分画を含む工業スケールの精製のように、大容量のアルコールが添加される必要があるとき、これらの効果は増幅される可能性がある。

スプレーによるアルコール添加の効果は、流動添加（１および２）またはスプレー添加（３および４）のどちらかにより８％エタノールを導入して脱クリオ血漿試料を沈殿する実施例１４で例示される。表１４に見ることができるように、スプレーによって試料にエタノールを添加すると脱クリオ血漿中に存在する１００％近くのＩｇＧが上清中に回収され、一方、流動添加によりアルコールを添加すると４〜５％のＩｇＧが失われる。これにより、この工程だけで約０．２０ｇ／Ｌと０．２５ｇ／Ｌの間のＩｇＧ喪失という結果になる。２００７年の製造レベルで言えば、これは約５３０万グラム（５，３００キログラム）のＩｇＧの損失ということを意味する。現在のＩＶＩＧ市場価格を前提とすると、グラムあたり＄５０と＄１００の間の範囲であるが、この工程での４〜５％の損失は年に５億ドルまでの世界的な経済的損失を意味する。

したがって、本明細書において提供される方法の１つの態様では、アルコールのスプレー添加によって１つ以上の沈殿工程を実行する。ある実施形態では、いかなる加圧装置、例えば、スプレーヘッドまたはノズルを有し、そして手動でまたは自動で操作されて液体から微細な霧を発生させる容器（例えば、スプレーボトル）でも使用することによってスプレー添加を実行することができる。ある実施形態では、系内で液体の急速かつ均等な分配を確実にするために、系を連続的に撹拌するかまたは混合しながら、スプレー添加を実行する。

１４．ｐＨの調整
血漿画分のタンパク質沈殿特性は、血漿タンパク質が沈殿させられている溶液のｐＨに大きく依存する。この事実は、それぞれ１９４６年および１９４９年にコーン法とオンクレイ法が導入されて以来、血漿タンパク質を分画する科学者に利用されてきた。伝統的には、目的の構成成分の最高の回収収率を促進するために、アルコール添加の前に血漿画分のｐＨが調整される。好都合なことに、アルコール添加直後またはアルコール添加と同時に溶液のｐＨを調整することによって、より確定的なかつ再現性のある沈殿がもたらされることが今では明らかになっている。血漿画分へのエタノール添加が、一般には溶液のｐＨを上昇させることによって、溶液のｐＨに変動をもたらすことが明らかになった。したがって、アルコール添加後ではなく添加前に血漿画分のｐＨを所定のｐＨに調整することによって、最適ではないｐＨで沈殿反応が起こるであろう。

同様に、血漿画分からのタンパク質の沈殿は、静電的環境をもたらし、そしてそれによって溶液のｐＨを変化させるであろう。したがって、沈殿事象を進めさせておくと、目的のタンパク質種の最大の回収率を可能にする所定のｐＨ値から溶液のｐＨが離れ始めるであろう。タンパク質の大きな分画が沈殿されつつある沈殿事象、高アルコール含量が用いられる沈殿事象、および、長いインキュベーション期間を必要とする沈殿事象にこれは特に当てはまる。

血漿画分のｐＨ調整の効果は、実施例１６に見られる結果によって例示される。この実施例では、アルコールのスプレー添加の後に上清Ｉ画分の２つの試料からＩｇＧを沈殿した。両方の試料のｐＨは、アルコール添加の前に６．７に調整され、アルコール添加の後であるが１０時間の沈殿インキュベーション工程の前に６．９に再調整された。第１の試料（基準試料）では１０時間のインキュベーション中にｐＨを調整しないが、一方、試料２（連続調整試料）では１０時間の沈殿インキュベーション中にｐＨ６．９にｐＨを絶えず調整した。表１６に見ることができるように、試料から改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物を除去した後に、第１の上清は１Ｌの血漿あたり０．２ｇのＩｇＧを含み、一方、沈殿インキュベーション中にｐＨが一定に保持された第２試料は１Ｌの血漿あたり０．１３ｇだけのＩｇＧを含んだ。第２試料での１Ｌの血漿あたり０．０７ｇのＩｇＧという減少した損失は、２００７年の製造レベルで言えば、約１９０万グラム（１，９００キログラム）のＩｇＧの損失を意味する。現在のＩＶＩＧ市場価格を前提とすると、グラムあたり＄５０と＄１００の間の範囲であるが、この工程での１．５％の損失は年に２億ドルまでの世界的な経済的損失を意味する。

したがって、本明細書において提供される方法の１つの態様では、アルコール添加の直後に血漿画分のｐＨを調整する。関連する実施形態では、アルコール添加の前後、または、アルコール添加中および添加後、または、アルコール添加前、添加中および添加後にｐＨを調整することができる。関連する実施形態では、１つ以上のアルコール沈殿事象またはインキュベーションの間に溶液のｐＨを連続的に調整する。ある実施形態では、系内でのｐＨ調整剤の急速かつ均等な分配を確実にするために系を連続的に撹拌するかまたは混合しながら溶液のｐＨを連続的に調整する、または、維持する。

流動アルコール添加の場合と同様に、大容量のｐＨ調整剤の流動添加が一時的で局所的なｐＨの変化を引き起こす可能性があり、望まないタンパク質変性または沈殿という結果になることが今では明らかになっている。したがって、本明細書において提供される方法の１つの実施形態では、１つ以上の血漿分画工程にスプレー添加によってｐＨ調整剤を導入することができる。本明細書において提供される方法の別の実施形態では、血漿画分または沈殿工程のｐＨはｐＨ調整剤のスプレー添加によって調整されることができる。ある実施形態では、いかなる加圧装置、例えば、スプレーヘッドまたはノズルを有し、そして手動でまたは自動で操作されて液体から微細な霧を発生させる容器（例えば、スプレーボトル）をも使用することによってスプレー添加を実行することができる。ある実施形態では、系内で液体の急速かつ均等な分配を確実にするために系を連続的に撹拌するかまたは混合しながらスプレー添加を実行する。

ＩＩＩ．濃縮ＩｇＧ組成物
ある自己免疫症状の治療について抗体全体を含むＩＶＩＧ組成物が記述されている。（例えば、米国特許公開第ＵＳ２００２／０１１４８０２号、第ＵＳ２００３／００９９６３５号および第ＵＳ２００２／００９８１８２号を参照のこと。）これらの引用文献において開示されるＩＶＩＧ組成物はポリクローナル抗体を含む。

１．水性ＩｇＧ組成物
１つの態様では、本発明は本明細書において提供される方法によって調製された水性ＩｇＧ組成物に関連する。一般に、本明細書において記載される新しい方法で調製されたＩｇＧ組成物は、高いＩｇＧ含量および純度を有するであろう。例えば、本明細書において提供されるＩｇＧ組成物は、少なくとも約３％（重量／体積）のタンパク質濃度および約９０％より高い純度のＩｇＧ内容物を有しうる。これらの高純度のＩｇＧ組成物は、治療的投与、例えば、ＩＶＩＧ療法、に好適である。１つの実施形態では、ＩｇＧ濃度は約１０％であり、静脈内投与に用いられる。別の実施形態では、濃度は約２０％であり、皮下または筋肉内投与に用いられる。

１つの実施形態では、本発明は、以下の各工程を含む方法によって調製された水性ＩｇＧ組成物を含む：（ａ）第１の沈殿工程において、約６．７と約７．３との間のｐＨで、約６％と約１０％との間のアルコールを用いて脱クリオ血漿分画を沈殿させて、ＩｇＧが富化された上清を得る工程、（ｂ）約６．７と約７．３との間のｐＨで、約２０％と約３０％との間のアルコールを用いて上清からＩｇＧを沈殿させて、第１の沈殿を形成する工程、（ｃ）工程（ｂ）で形成された第１の沈殿を再懸濁し懸濁液を形成する工程、（ｄ）工程（ｃ）で形成された懸濁液を界面活性剤で処理する工程、（ｅ）約６．７と約７．３との間のｐＨで、約２０％と約３０％との間のアルコールを用いて懸濁液からＩｇＧを沈殿させて、第２の沈殿を形成する工程、（ｆ）工程（ｅ）で形成された第２の沈殿を再懸濁し、懸濁液を形成する工程、（ｇ）工程（ｆ）で形成された懸濁液を溶媒および／または界面活性剤で処理する工程、および（ｈ）少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー分画法を実施し、それによって濃縮されたＩｇＧ組成物を調製する工程。

特定の実施形態では、以下の各工程を含む方法によって調製されたＩｇＧ組成物が提供される：（ａ）脱クリオ血漿分画のｐＨを約７．０に調整する工程、（ｂ）約−５℃と約−９℃との間の温度で、工程（ａ）の脱クリオ血漿分画のエタノール濃度を約２５％（体積／体積）に調整し、それによって混合物を形成する工程、（ｃ）工程（ｂ）の混合物から液体と沈殿とを分離する工程、（ｄ）工程（ｃ）の沈殿を、リン酸塩と酢酸塩とを含む緩衝液に再懸濁し、ここで緩衝液のｐＨは緩衝液１０００Ｌあたり６００ｍＬの氷酢酸を用いて調整され、それによって懸濁液を形成する工程、（ｅ）微粉化した二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を工程（ｄ）の懸濁液と少なくとも約３０分間混合する工程、（ｆ）懸濁液を加圧濾過機を用いて濾過し、それによって濾過液を形成する工程、（ｇ）加圧濾過機を、加圧濾過機デッドボリュームの少なくとも３倍量の、リン酸塩および酢酸塩を含む緩衝液を用いて洗浄し、ここで緩衝液のｐＨは緩衝液１０００Ｌあたり１５０ｍＬの氷酢酸を用いて調整されており、それによって洗浄液を形成する工程、（ｈ）工程（ｆ）の濾過液を工程（ｇ）の洗浄液と合わせ、それによって溶液を形成し、そしてその溶液を界面活性剤を用いて処理する工程、（ｉ）工程（ｈ）の溶液のｐＨを約７．０に調整し、そしてエタノールを最終濃度約２５％で添加し、それによって沈殿を形成する工程、（ｊ）工程（ｉ）の混合物から液体と沈殿とを分離する工程、（ｋ）沈殿を、溶媒または界面活性剤を含む水性溶液に溶解し、溶液を少なくとも６０分間保持する工程、（ｌ）工程（ｋ）の後の溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、そしてカラムに吸着されたタンパク質を溶離液中に溶出する工程、（ｍ）工程（ｌ）の溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通して溶出液を生成する工程、（ｎ）工程（ｍ）の溶出液をナノフィルターに通してナノ濾過液を生成する工程、（ｏ）工程（ｎ）のナノ濾過液を限外濾過膜に通して限外濾過液を生成する工程、および（ｐ）工程（ｏ）の限外濾過液を透析濾過緩衝液に対して透析濾過して、約８％（重量／体積）と約１２％（重量／体積）との間のタンパク質濃度の透析濾過液を生成し、それによって濃縮されたＩｇＧ組成物を得る工程。

ある実施形態では、水性ＩｇＧ組成物は、上記の２つまたはそれ以上の分画処理工程における改善を含む、本明細書において提供される方法を用いて調製される。例えば、ある実施形態では、改善は、第１の沈殿工程、改変されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程、改変されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程、および／または改変されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程、に見いだされ得る。

１つの実施形態では、水性ＩｇＧ組成物は、本明細書において記載される精製方法によって提供され、ここで、その方法は、他の方法では流動添加によって血漿分画に導入されるであろうが、１つ以上の溶液のスプレー添加を含む。例えば、ある実施形態では、方法は、スプレーによる血漿分画へのアルコール（例えば、エタノール）添加を含むであろう。他の実施形態では、スプレーによって血漿分画に添加され得る溶液は、これに限定されるものではないが、ｐＨ調整溶液、溶媒溶液、界面活性剤溶液、希釈緩衝液、伝導度調整溶液など、を含む。好ましい実施形態では、１つ以上のアルコール沈殿工程が、血漿分画へのスプレーによるアルコール添加によって実施される。第２の好ましい実施形態では、１つまたは複数のｐＨ調整工程が、血漿分画へのスプレーによるｐＨ調整溶液添加によって実施される。

ある実施形態では、水性ＩｇＧ組成物は、本明細書において記載される精製方法によって提供され、ここで、その方法は、沈殿剤（例えば、アルコールまたはポリエチレングリコール）添加の後または添加と同時に、沈殿させられる血漿分画のｐＨを調整することを含む。いくつかの実施形態では、プロセス改善がもたらされ、そこでは能動的に沈殿させられる血漿分画のｐＨが、ｐＨの継続的監視および調整によって、沈殿インキュベーションまたは保持工程全体にわたって維持される。好ましい実施形態では、ｐＨの調整は、ｐＨ調整溶液のスプレー添加によって実施される。

１つの実施形態では、本発明は、約３０ｇ／Ｌと約２５０ｇ／Ｌとの間の濃度のタンパク質を含む水性ＩｇＧ組成物を提供する。ある実施形態では、ＩｇＧ組成物のタンパク質濃度は、約５０ｇ／Ｌと約２００ｇ／Ｌとの間、または約７０ｇ／Ｌと約１５０ｇ／Ｌとの間、または約９０ｇ／Ｌと約１２０ｇ／Ｌとの間、またはこれらの範囲を含むあらゆる好適な濃度、例えば約３０ ｇ／Ｌ、または約３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１０５ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１１５ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１３５ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１４５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１５５ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１６５ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１８５ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、１９５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２０５ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２１５ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２３５ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２４５ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、またはより高い、である。好ましい実施形態では、水性ＩｇＧ組成物は、１０％または約１０％の濃度であろう。特に好ましい実施形態では、組成物は１０．２±０．２％（重量／体積）の濃度であろう。他の好ましい実施形態では、水性ＩｇＧ組成物は、２０％または約２０％の濃度であろう。

本明細書において提供される方法は、非常に高いレベルの純度を有するＩｇＧ組成物の調製を可能にさせる。１つの実施形態では、本明細書において提供される組成物中の全タンパク質の少なくとも約９５％がＩｇＧであろう。他の実施形態では、タンパク質の少なくとも約９６％がＩｇＧであり、または組成物中の全タンパク質の少なくとも約９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはより高い、がＩｇＧであろう。好ましい実施形態では、組成物中の全タンパク質の少なくとも９７％がＩｇＧであろう。別の好ましい実施形態では、組成物中の全タンパク質の少なくとも９８％がＩｇＧであろう。別の好ましい実施形態では、組成物中の全タンパク質の少なくとも９９％がＩｇＧであろう。

同様に、本明細書において提供される方法は、非常に低いレベルの混入物を含むＩｇＧ組成物の調製を可能にさせる。例えば、表１９は、本明細書において提供される改良された方法によって調製された３つのＩｇＧバルク溶液の純度試験結果を提供する。ある実施形態では、約１４０ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＡを含むＩｇＧ組成物が提供される。他の実施形態では、ＩｇＧ組成物は、約６０ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＡ、好ましくは約４０ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＡ、最も好ましくは約３０ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＡを含むであろう。

別の実施形態では、約５０ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＭを含むＩｇＧ組成物が提供される。他の実施形態では、ＩｇＧ組成物は、約２５ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＭ、好ましくは約１０ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＭ、より好ましくは約５ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＭ、より好ましくは約４ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＭ、より好ましくは約３ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＭ、最も好ましくは約２．５ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＭを含むであろう。

別の実施形態では、毎分約１００ ＰＬ−１ ｎｍｏｌ／ｍＬより少ないアミド分解活性を含むＩｇＧ組成物が提供される。他の実施形態では、ＩｇＧ組成物は毎分約５０ ＰＬ−１ ｎｍｏｌ／ｍＬより少ないアミド分解活性、好ましくは毎分約２５ ＰＬ−１ ｎｍｏｌ／ｍＬより少ないアミド分解活性、より好ましくは毎分約２０ ＰＬ−１ ｎｍｏｌ／ｍＬより少ないアミド分解活性、より好ましくは毎分約１５ ＰＬ−１ ｎｍｏｌ／ｍＬより少ないアミド分解活性、最も好ましくは毎分約１０ ＰＬ−１ ｎｍｏｌ／ｍＬより少ないアミド分解活性を含むであろう。

別の実施形態では、約２０ｍｇ／Ｌより少ないフィブリノーゲンを含むＩｇＧ組成物が提供される。他の実施形態では、ＩｇＧ組成物は約１０ｍｇ／Ｌより少ないフィブリノーゲン、好ましくは約５ｍｇ／Ｌより少ないフィブリノーゲン、より好ましくは約２．５ｍｇ／Ｌより少ないフィブリノーゲン、より好ましくは約１ｍｇ／Ｌより少ないフィブリノーゲン、より好ましくは約０．５ｍｇ／Ｌより少ないフィブリノーゲン、最も好ましくは約０．２５ｍｇ／Ｌより少ないフィブリノーゲン、を含むであろう。

さらに別の実施形態では、主としてＩｇＧ単量体／二量体からなるＩｇＧ組成物が提供される。１つの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％のＩｇＧが単量体または二量体であるＩｇＧ組成物が提供される。好ましい実施形態では、少なくとも９７％のＩｇＧが単量体または二量体であるＩｇＧ組成物が提供される。より好ましい実施形態では、少なくとも９９％のＩｇＧが単量体または二量体である。より好ましい実施形態では、少なくとも９９．５％のＩｇＧが単量体または二量体である。より好ましい実施形態では、少なくとも９９．７％のＩｇＧが単量体または二量体である。

２．医薬組成物
別の態様では、本発明は、本明細書において提供される方法によって調製された、精製されたＩｇＧを含む医薬組成物および製剤を提供する。一般的に、本明細書において記載される新しい方法によって調製されたＩｇＧ医薬組成物および製剤は、高いＩｇＧ含量および純度を有するであろう。例えば、本明細書において提供されるＩｇＧ医薬組成物および製剤は、少なくとも約７％（重量／体積）のタンパク質濃度および約９５％より高い純度のＩｇＧ含量を有する。これらの高純度ＩｇＧ医薬組成物および製剤は、治療的投与、例えば、ＩＶＩＧ療法のために適している。好ましい実施形態では、医薬ＩｇＧ組成物は、静脈内投与（例えば、ＩＶＩＧ療法）のために製剤化される。

１つの実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供される方法を用いて単離された水性ＩｇＧ組成物を製剤化することによって調製される。一般的に、製剤化された組成物は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つのウイルス不活化または除去工程を受ける。本明細書において提供される方法で使用され得るウイルス不活化または除去工程の非限定的な例は、溶媒界面活性剤処理(Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 and Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028, いずれも、あらゆる目的のために、引用によりその全てが明示的に本明細書に組み入れられるものとする)、ナノ濾過(Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 and Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, いずれも、あらゆる目的のために、引用によりその全てが明示的に本明細書に組み入れられるものとする)、および高温下での低ｐＨインキュベーション(Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 and Louie et al., Biologicals 1994 (22):13-19)を含む。

ある実施形態では、約８０ｇ／Ｌ ＩｇＧと約１２０ｇ／Ｌ ＩｇＧとの間のＩｇＧ含量を有する医薬製剤が提供される。一般的には、これらのＩＶＩＧ製剤は、本明細書において記載される方法を使用して、血漿からＩｇＧ組成物を単離すること、組成物を濃縮すること、および静脈内投与に適した溶液中に濃縮された組成物を製剤化することによって調製される。ＩｇＧ組成物は、当業者に知られている適切な方法を使用して濃縮され得る。１つの実施形態では、組成物は、限外濾過法／透析濾過法によって濃縮される。いくつかの実施形態では、組成物を濃縮するために使用される限外濾過装置は、約１００ｋＤａより小さいまたは約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０より小さい、またはより小さいｋＤａの公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）を有する限外濾過膜を用いるであろう。好ましい実施形態では、限外濾過膜は５０ｋＤａ以下のＮＭＷＣＯを有する。緩衝液交換は、当業者に知られている適切な方法によって達成され得る。特定の実施形態では、緩衝液交換は、透析濾過によって達成される。

１つの特定の実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供され、ここで、ＩｇＧ組成物は、以下の各工程を含む方法を使用して血漿から精製される：（ａ）第１の沈殿工程において、約６．７と約７．３との間のｐＨで、約６％と約１０％との間のアルコールを用いて脱クリオ血漿分画を沈殿させて、ＩｇＧが富化された上清を得る工程、（ｂ）約６．７と約７．３との間のｐＨで、約２０％と約３０％との間のアルコールを用いて上清からＩｇＧを沈殿させて、第１の沈殿を形成する工程、（ｃ）工程（ｂ）で形成された第１の沈殿を再懸濁して、懸濁液を形成する工程、（ｄ）工程（ｃ）で形成された懸濁液を界面活性剤で処理する工程、（ｅ）約６．７と約７．３との間のｐＨで、約２０％と約３０％との間のアルコールを用いて懸濁液からＩｇＧを沈殿させて、第２の沈殿を形成する工程、（ｆ）工程（ｅ）で形成された第２の沈殿を再懸濁して、懸濁液を形成する工程、（ｇ）工程（ｆ）で形成された懸濁液を溶媒および／または界面活性剤で処理する工程、（ｈ）少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー分画法を実施する工程；（ｉ）溶媒界面活性剤処理を実施する工程；および（ｊ）組成物をナノ濾過法にかけ、それによってＩｇＧ組成物を調製する工程。

特定の実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供され、ここでＩｇＧ組成物は、以下の各工程を含む方法を用いて血漿から精製される：（ａ）脱クリオ血漿分画のｐＨを約７．０に調整する工程、（ｂ）工程（ａ）の脱クリオ血漿分画のエタノール濃度を、約−５℃と約−９℃との間の温度で、約２５％（体積／体積）に調整し、それによって混合物を形成する工程、（ｃ）工程（ｂ）の混合物から液体と沈殿とを分離する工程、（ｄ）工程（ｃ）の沈殿を、リン酸塩と酢酸塩とを含む緩衝液を用いて再懸濁し、ここで緩衝液のｐＨは緩衝液１０００Ｌあたり６００ｍＬの氷酢酸を用いて調整する、それによって懸濁液を形成する工程、（ｅ）微粉化した二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を工程（ｄ）の懸濁液と、少なくとも約３０分間混合する工程、（ｆ）懸濁液を加圧濾過機によって濾過し、それによって濾過液を形成する工程、（ｇ）加圧濾過機を、加圧濾過機デッドボリュームの少なくとも３倍量の、リン酸塩および酢酸塩を含む緩衝液を用いて洗浄し、ここで緩衝液のｐＨは緩衝液１０００Ｌあたり１５０ｍＬの氷酢酸を用いて調整されており、それによって洗浄液を形成する工程、（ｈ）工程（ｆ）の濾過液を工程（ｇ）の洗浄液と合わせ、それによって溶液を形成し、そしてその溶液を界面活性剤を用いて処理する工程、（ｉ）工程（ｈ）の溶液のｐＨを約７．０に調整し、そしてエタノールを最終濃度約２５％で添加し、それによって沈殿を形成する工程、（ｊ）工程（ｉ）の混合物から液体と沈殿とを分離する工程、（ｋ）沈殿を、溶媒または界面活性剤を含む水性溶液に溶解し、溶液を少なくとも６０分間保持する工程、（ｌ）工程（ｋ）の後の溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、そしてカラムに吸着されたタンパク質を溶離液中に溶出する工程、（ｍ）工程（ｌ）の溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通して溶出液を生成する工程、（ｎ）工程（ｍ）の溶出液をナノフィルターに通してナノ濾過液を生成する工程、（ｏ）工程（ｎ）のナノ濾過液を限外濾過膜に通して限外濾過液を生成する工程、および（ｐ）工程（ｏ）の限外濾過液を透析濾過緩衝液に対して透析濾過して、約８％（重量／体積）と約１２％（重量／体積）との間のタンパク質濃度の透析濾過液を生成し、それによって濃縮されたＩｇＧの組成物を得る工程。

ある実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供される、ここでＩｇＧ組成物は、上記の２またはそれ以上の分画処理工程における改善を含む、本明細書において提供される方法を用いて調製される。例えば、ある実施形態では、改善は、第１の沈殿工程、改変されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程、改変されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ溶解工程、および／または改変されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過工程、に見いだされ得る。

ある実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供される、ここでＩｇＧ組成物は本明細書において記載される精製方法を用いて調製され、その方法は、他の方法では流動添加によって血漿分画に導入されるであろうが、１つ以上の溶液のスプレー添加を含む。例えば、ある実施形態では、方法は、スプレーによる血漿分画へのアルコール（例えば、エタノール）添加を含むであろう。他の実施形態では、スプレーによって血漿分画に添加され得る溶液は、これに限定されるものではないが、ｐＨ調整溶液、溶媒溶液、界面活性剤溶液、希釈緩衝液、伝導度調整溶液など、を含む。好ましい実施形態では、１つ以上のアルコール沈殿工程が、血漿分画へのスプレーによるアルコール添加によって実施される。第２の好ましい実施形態では、１または複数のｐＨ調整工程が、血漿分画へのスプレーによるｐＨ調整溶液添加によって実施される。

ある実施形態では、ＩｇＧの医薬組成物が提供される、ここで、ＩｇＧ組成物は本明細書において記載される精製方法によって調製され、その方法は、沈殿剤(例えば、アルコールまたはポリエチレングリコール)添加の後または添加と同時の、沈殿させられる血漿分画のｐＨの調整を含む。いくつかの実施形態では、プロセス改善がもたらされ、そこでは能動的に沈殿させられる血漿分画のｐＨが、ｐＨの継続的監視および調整によって、沈殿インキュベーションまたは保持工程全体にわたって維持される。好ましい実施形態では、ｐＨの調整は、ｐＨ調整溶液のスプレー添加によって実施される。

１つの実施形態では、本発明は、約７０ｇ／Ｌと約１３０ｇ／Ｌとの間の濃度のタンパク質を含むＩｇＧの医薬組成物を提供する。ある実施形態では、ＩｇＧ組成物のタンパク質濃度は約８０ｇ／Ｌと約１２０ｇ／Ｌとの間、好ましくは約９０ｇ／Ｌと約１１０ｇ／Ｌとの間、最も好ましくは約１００ｇ／Ｌ、またはこれらの範囲中のあらゆる適切な濃度、例えば約７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１０５ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１１５ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、または１３０ｇ／Ｌである。好ましい実施形態では、タンパク質濃度が１００ｇ／Ｌまたは約１００ｇ／Ｌの医薬組成物が提供される。特に好ましい実施形態では、医薬組成物は、１０２ｇ／Ｌまたは約１０２ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有するであろう。

別の実施形態では、本発明は、約１７０ｇ／Ｌと約２３０ｇ／Ｌとの間の濃度のタンパク質を含むＩｇＧ医薬組成物を提供する。ある実施形態では、ＩｇＧ組成物のタンパク質濃度は約１８０ｇ／Ｌと約２２０ｇ／Ｌとの間、好ましくは約１９０ｇ／Ｌと約２１０ｇ／Ｌとの間、最も好ましくは約２００ｇ／Ｌ、またはこれらの範囲中のあらゆる適切な濃度、例えば約１７０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１８５ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、１９５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２０５ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２１５ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、または２３０ｇ／Ｌである。好ましい実施形態では、２００ｇ／Ｌまたは約２００ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する医薬組成物が提供される。

本明細書において提供される方法は、非常に高いレベルの純度を有するＩｇＧ医薬組成物の調製を可能にさせる。例えば、１つの実施形態では、本明細書において提供される組成物中の全タンパク質の少なくとも約９５％がＩｇＧであろう。他の実施形態では、タンパク質の少なくとも約９６％がＩｇＧであり、または組成物中の全タンパク質の少なくとも約９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはより高い、がＩｇＧであろう。好ましい実施形態では、組成物中の全タンパク質の少なくとも約９７％がＩｇＧであろう。別の好ましい実施形態では、組成物中の全タンパク質の少なくとも約９８％がＩｇＧであろう。別の好ましい実施形態では、組成物中の全タンパク質の少なくとも約９９％がＩｇＧであろう。

同様に、本明細書において提供される方法は、非常に低いレベルの混入物を含むＩｇＧ医薬組成物の調製を可能にさせる。例えば、ある実施形態では、約１００ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＡを含むＩｇＧ組成物が提供される。他の実施形態では、ＩｇＧ組成物は、約５０ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＡ、好ましくは約３５ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＡ、最も好ましくは約２０ｍｇ／Ｌより少ないＩｇＡを含むであろう。

本明細書において提供される医薬組成物は、典型的には、静脈内、皮下、および／または筋肉内投与に適した１つ以上の緩衝剤またはｐＨ安定剤を含むであろう。本明細書において提供されるＩｇＧ組成物の製剤化に適した緩衝剤の非限定的な例は、適切なｐＨに調整されたグリシン、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、ヒスチジンまたはその他のアミノ酸、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、炭酸塩、またはこれらの任意の組み合わせ、を含む。一般的に、緩衝剤は、製剤中で長期間にわたって適切なｐＨに維持するのに十分であろう。好ましい実施形態では、緩衝剤はグリシンである。

いくつかの実施形態では、製剤中の緩衝剤の濃度は、約１００ｍＭと約４００ｍＭとの間、好ましくは約１５０ｍＭと約３５０ｍＭとの間、より好ましくは約２００ｍＭと約３００ｍＭとの間、最も好ましくは約２５０ｍＭである。特に好ましい実施形態では、ＩＶＩＧ組成物は約２００ｍＭと約３００ｍＭとの間のグリシン、最も好ましくは、約２５０ｍＭのグリシンを含むであろう。

ある実施形態では、製剤のｐＨは約４．１と約５．６との間、好ましくは約４．４と約５．３との間、最も好ましくは約４．６と約５．１との間であろう。特定の実施形態では、製剤のｐＨは約４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、または５．６であり得る。好ましい実施形態では、製剤のｐＨは約４．６と約５．１との間であろう。

いくつかの実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、任意でさらに組成物の浸透圧を調節するための薬剤を含んでもよい。浸透圧調節剤の非限定的な例は、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、ショ糖、ブドウ糖、デキストロース、レブロース、果糖、乳糖、ポリエチレングリコール類、リン酸塩類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、グルコノグルコヘプトン酸カルシウム、ジメチルスルホンなど、を含む。

典型的には、本明細書において提供される製剤は、生理的な浸透圧と同程度の浸透圧、約２８５から２９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇを有するであろう(Lacy et al., Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999:1254。ある実施形態では、製剤の浸透圧は約２００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇと約３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇとの間、好ましくは約２４０と約３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇとの間であろう。特定の実施形態では、製剤の浸透圧は約２００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、または２１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２４５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２５５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２６０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２６５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２７０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２７５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２８５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、または３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであろう。

本明細書において提供されるＩｇＧ製剤は、通常液体形態で長期間安定である。ある実施形態では、製剤は、室温で少なくとも約３か月間、または室温で少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４か月間安定である。製剤はまた、冷蔵状態（典型的には約２℃と約８℃との間）で通常６または少なくとも約１８ヶ月間、または冷蔵状態で少なくとも約２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、または４５か月間安定であろう。

ＩＶ．治療方法
現代の医薬で通常実施されているように、濃縮された免疫グロブリン類（特にＩｇＧ類）の滅菌製剤は、３つの主要な種類に分類される疾患：免疫不全、炎症性および自己免疫疾患、ならびに急性感染症の治療に用いられる。これらのＩｇＧ製剤は、多発性硬化症（特に再発寛解型多発性硬化症またはＲＲＭＳ）、アルツハイマー病、およびパーキンソン病の治療にもまた有用である。本発明の精製されたＩｇＧ製剤はこれらの目的の他に、治療的に認められているＩｇＧ製剤のその他の用途のためにも適している。

ＦＤＡはＩＶＩＧの使用を、同種異系骨髄移植、慢性リンパ性白血病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、小児ＨＩＶ、原発性免疫不全症、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、および高抗体レシピエントまたはＡＢＯ型不適合ドナーにおける腎臓移植を含む様々な適応症について認可している。ある実施形態では、本明細書において提供されるＩＶＩＧ組成物はこれらの疾患および状態の治療または管理のために有用である。

さらにまた、ＩＶＩＧの承認適応症外使用が、様々な適応症、例えば、慢性疲労症候群、クロストリジウム・ディフィシル大腸炎、皮膚筋炎および多発性筋炎、グレーブス眼症、ギラン・バレー症候群、筋ジストロフィー、封入体筋炎、ランバート-イートン症候群、エリテマトーデス、多巣性運動ニューロパシー、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、新生児同種免疫性血小板減少症、パルボウイルスＢ１９感染症、天疱瘡、輸血後紫斑病、腎移植拒絶反応、自然流産／流産、全身硬直症候群、眼球クローヌスミオクローヌス、危篤状態の成人患者における重症敗血症および敗血症性ショック、中毒性表皮壊死症、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、の治療または管理のために、一般的に患者に提供されている。ある実施形態では、本明細書において提供されるＩＶＩＧ組成物は、これらの疾患および状態の治療または管理のために有用である。

最後に、原発性免疫不全症、ＲＲＭＳ、アルツハイマー病、およびパーキンソン病を含む疾患の治療または管理のための、ＩＶＩＧの試験的な使用が提案されている(米国特許出願公開第2009/0148463号、ここで、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)。ある実施形態では、本明細書において提供されるＩＶＩＧ組成物は原発性免疫不全症、ＲＲＭＳ、アルツハイマー病、またはパーキンソン病の治療または管理のために有用である。連日投与を含むある実施形態では、患者に投与すべき有効量は、年齢、体重、疾患の重症度、投与経路（例えば、静脈内、対、皮下）および治療に対する反応性の個人差を考慮して医師により決定され得る。ある実施形態では、本発明の免疫グロブリン製剤は、対象者に対して１日あたり約５ｍｇ／ｋｇから約２０００ｍｇ／ｋｇ投与し得る。追加の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇの量を投与し得る。追加の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、対象者に対して、１日あたり最大で約１００ｍｇ／ｋｇまで、約１５０ｍｇ／ｋｇまで、約２００ｍｇ／ｋｇまで、約２５０ｍｇ／ｋｇまで、約３００ｍｇ／ｋｇまで、約４００ｍｇ／ｋｇまでの用量で投与し得る。他の実施形態では、免疫グロブリン製剤の用量は、より多くまたは少なくでき得る。さらに、免疫グロブリン製剤は、１日あたり１つ以上の用量で投与し得る。ＩｇＧ製剤で治療される疾患に精通した臨床医は、この分野で知られている基準に従って、患者のための適切な用量を決定し得る。

本発明に従って、一連の治療を完了するために必要な時間は、医師により決定することができ、１日ほどの短期間から１か月を超える期間であり得る。ある実施形態では、一連の治療は１から６か月間であり得る。

有効量のＩＶＩＧ製剤は、静脈内的な手段で患者に投与される。「有効量」という語は、対象者の疾患または状態の改善または修正をもたらすＩＶＩＧ製剤の量を意味する。対象者に投与されるべき有効量は、年齢、体重、治療される疾患または状態、疾患の重症度および治療に対する反応性の個人差を考慮して医師により決定され得る。ある実施形態では、ＩＶＩＧ製剤は、投与あたり約５ｍｇ／ｋｇから約２０００ｍｇ／ｋｇの用量で対象者に投与し得る。ある実施形態では、用量は、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１１００ｍｇ／ｋｇ、１２００ｍｇ／ｋｇ、１３００ｍｇ／ｋｇ、１４００ｍｇ／ｋｇ、１５００ｍｇ／ｋｇ、１６００ｍｇ／ｋｇ、１７００ｍｇ／ｋｇ、１８００ｍｇ／ｋｇ、１９００ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２０００ｍｇ／ｋｇであり得る。

ＩＶＩＧ治療の投与量および頻度は、他の要因の中で、治療される疾患または状態および患者の疾患または状態の重症度に依存するであろう。一般に、原発性免疫不全症のためには、約１００ｍｇ／ｋｇと約４００ｍｇ／ｋｇ体重との間の用量が、およそ３から４週間ごとに投与されるであろう。神経系および自己免疫性疾患のためには、最大で２ｇ／ｋｇ体重が、３から６か月間、１か月あたり５日の期間にわたって実施される。これには、一般的に約１００ｍｇ／ｋｇと約４００ｍｇ／ｋｇ体重との間の、３から４週間ごとに約１回の投与を含む維持療法が追加される。一般に、患者は、およそ１４から３５日ごとに、またはおよそ２１から２８日ごとに約１回の用量または治療を受けるであろう。治療の頻度は、他の要因の中で、治療される疾患または状態および患者の疾患または状態の重症度に依存するであろう。

好ましい実施形態では、その治療が必要なヒトにおける免疫不全、自己免疫疾患、または急性感染症を治療する方法が提供され、その方法は本発明のＩＶＩＧ医薬組成物の投与を含む。関連する実施形態では、本発明は、免疫不全、自己免疫疾患、または急性感染症の治療が必要なヒトの治療のための、本明細書において提供される方法に従って製造されたＩＶＩＧ組成物を提供する。

ある実施形態では、免疫不全、自己免疫疾患、または急性感染症は、同種異系骨髄移植、慢性リンパ性白血病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、小児ＨＩＶ、原発性免疫不全症、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、高抗体レシピエントまたはＡＢＯ型不適合ドナーにおける腎臓移植、慢性疲労症候群、クロストリジウム・ディフィシル大腸炎、皮膚筋炎および多発性筋炎、グレーブス眼症、ギラン・バレー症候群、筋ジストロフィー、封入体筋炎、ランバート-イートン症候群、エリテマトーデス、多巣性運動ニューロパシー、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、新生児同種免疫性血小板減少症、パルボウイルスＢ１９感染症、天疱瘡、輸血後紫斑病、腎移植拒絶反応、自然流産／流産、全身硬直症候群、眼球クローヌスミオクローヌス、危篤状態の成人患者における重症敗血症および敗血症性ショック、中毒性表皮壊死症、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、原発性免疫不全症、ＲＲＭＳ、アルツハイマー病、およびパーキンソン病、から選択される。

以下の実施例は、限定ではなく例示として提供するものである。本質的に同様の結果を得るために変更または改変することができる種々の非重要なパラメータは、当業者であれば容易に認識するだろう。

実施例１
本実施例は、濾過の前にアエロジルで処理することにより、多量のフィブリノーゲン、アミド分解活性、プレカリクレイン活性、およびリポタンパク質が抽出改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩペースト懸濁液から除去できることを明らかにする。

現在のところ、ヒュームドシリカ（アエロジル３８０）は、フィブリノーゲン、アミド分解活性、プレカリクレイン活性、およびリポタンパク質の吸着に使用されている。より詳細にアエロジルの効果を調べるため、濾過の前に様々な量のアエロジルで６種の改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液を処理した。簡単に言うと、改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストを再懸濁させるために５ｍＭ酢酸ナトリウム／５ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５を含む溶解緩衝液を使用した。ここに説明するように、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり溶解緩衝液１５ｇの割合で調合した。ペースト添加後、ｐＨ制御環境下（ｐＨ ＩＰＣ限界：４．９〜５．３）、２℃〜８℃で１時間、懸濁液を撹拌した。我々は、この懸濁液のｐＨが通常約ｐＨ５．１にシフトすることを発見したため、さらなるｐＨ調整は不要であるとした。少なくとも１２０分間の追加の抽出を行った後、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり０〜１００ｍｇのアエロジル３８０を容器に加え、懸濁液を１時間インキュベートした。Ｃｕｎｏ５０ＳＡフィルターを用いた深層濾過の前に珪藻土を加えた。濾過後、フィルターを８ｇＬ^−１クエン酸塩および０．２％ポリソルベート８０（ｐＨ５．０）を含む抽出緩衝液で洗浄し、その洗浄液を濾過液に加えた。その後、混合した濾過液と洗浄液をポリソルベート８０で処理して、例えばリポタンパク質等の疎水性不純物を可溶化し、−８℃〜−１０℃で２５％エタノール（ｐＨ７）によりＩｇＧを沈殿させた。その結果得られたＰｐｔ Ｇ沈殿物はほぼ白色であり、より高いＩｇＧ純度を持っていた。その後、沈殿物を純水でＰｐｔ Ｇ沈殿物２ｇあたり純水７ｇの割合で溶解した。

ＩｇＧ溶液はＣｕｎｏ濾過工程後にＩｇＧ回収および不純物を分析した。具体的には、アミド分解活性（ＰＬ−１）、ＰＫＡ活性、およびフィブリノーゲンのレベルを測定した（表３）。表３に示すように、明らかに、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり４０〜６０ｍｇのアエロジル３８０を使用した抽出手順では、濾過液中のフィブリノーゲンのレベルにおける著しい減少とともに、アミド分解およびＰＫＡ活性の著しく減少した許容レベルのＩｇＧを回収できた。アエロジル処理なしで行う抽出と比較すると、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり４０ｍｇのアエロジル３８０を添加することにより、同様のＩｇＧ回収（７３％）を保ちつつも、ＰＫＡ活性およびフィブリノーゲン含有量はほぼ９０％の減少、アミド分解活性は６０％の減少となった。

（表１）ＩＩ＋ＩＩＩ Ｃｕｎｏ濾過工程におけるアエロジル３８０の量の効果（ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤでの抽出条件）

実施例２
本実施例は、濾過の前にアエロジルで処理することにより、多量のフィブリノーゲンが抽出された改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩペースト懸濁液から除去できることを明らかにする。本実験の目的の１つは、ＩｇＧの著しい減少を負うことなく効率良くフィブリノーゲンを除去できる適切な条件を見つけることであった。

ここで提供される方法により調合した改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストを５ｍＭ酢酸ナトリウム／５ｍＭリン酸一ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５で溶かした。溶解比は、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｋｇあたり１５ｋｇの緩衝液とした。緩衝液に加える酢酸の量は６０分間撹拌した後のｐＨが４．９になるように設定した。懸濁液を十分に均質化するために、表２に示すようにそれぞれ異なる量のアエロジル３８０がすでに入った１００ｍｌビーカーのそれぞれに５０ｍｌずつ６つに分ける前に、懸濁液を２０時間まで、２℃〜８℃で撹拌した。その後、処理と分析の前に、ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁溶液をアエロジル存在下で８０分間撹拌した。撹拌後、全てのサンプルを３０分間、４℃、５０ｍｌファルコンチューブ内、４６００ＲＰＭで、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｃｒｙｏｆｕｇｅ ８５００ｉにより遠心分離した。

本実験において、ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液に見られる高濃度のＩｇＧ測定は、ＥＬＩＳＡテストに比べてより正確な値が得られることから選択された比濁分析テストを用いた。非特異的濁りによる刺激を最小限にするため、テスト前に０．４５μｍフィルターでサンプルを濾過した。ＩｇＭ、ＩｇＡおよびフィブリノーゲンに対し、ＥＬＩＳＡテストは懸濁液中のそれら不純物が低濃度であることが好ましかった。本実験の結果は以下の表２に示す。

実施例１で述べたように、フィブリノーゲンの除去およびＩｇＧの減少に関するアエロジル処理の効果をより特徴づけるため、アエロジル濃度を改変ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり０ｍｇ〜４０ｍｇの間で設定した。表２に示す結果は、大容量のアエロジルがこの画分におけるフィブリノーゲンを減少させることを裏付ける。とりわけ、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり４０ｍｇ使用すると、濾過ケーキ中のＩｇＧ回収が１０％しか減少しなかった一方で、フィブリノーゲンがほぼ９０％減少した。

（表２）遠心分離後にＩＩ＋ＩＩＩを５ｍＭ ＮａＡｃ／５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ ４．５によりＩＩ＋ＩＩＩ１ｋｇ＋緩衝液１５ｋｇの溶解比で抽出した後の溶解条件の変化による結果

実施例３
本実施例は、弊害をもたらす不純物レベルを制限しつつ、改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩペーストからのＩｇＧの高効率抽出を可能にする適切な条件を明らかにする。具体的に言うと、ＩＩ＋ＩＩＩ溶解緩衝液に使用される酢酸濃度および濾過前の抽出溶液のアエロジル処理を含むパラメータを調べた。

ＩＩ＋ＩＩＩペーストは、表１に示すように、５ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭリン酸二水素ナトリウムおよび様々な量の濃縮酢酸で１８０分間、２℃〜８℃で抽出した。続いて、表１に示すようにアエロジル３８０を添加した。１時間の撹拌後、珪藻土の存在下、Ｃｕｎｏ５０ＳＡによる濾過により懸濁液を清澄化した。表１に記載のように、フィルターの後洗浄は、濾過前の懸濁液の４０％の容量を使用して、酢酸の量が異なることを除いて抽出用と同じ緩衝液を用いて行った。２５％エチルアルコール、８ｇＬ^−１クエン酸ナトリウムおよび０．２％ツイーン８０（ｐＨ７）の存在下、−８℃で沈殿物Ｇを沈殿させ、８時間の待機時間の後に、３０分間、−１０℃、４６００ＲＰＭで、ステンレスビーカーの中で、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｃｒｙｏｆｕｇｅ ８５００ｉにより遠心分離した。沈殿物は純水中で１：２の割合で溶解した。

（表３）抽出緩衝液のｐＨ調整の酢酸量と、ＩｇＧ収率、Ｐｐｔ Ｇの純度および濾過ケーキ中のＩｇＧの減少への清澄化におけるアエロジル量の影響

表１から分かるように、ＩＩ＋ＩＩＩペースト懸濁液にアエロジルを添加すると、Ｐｐｔ Ｇ画分におけるγ−グロブリン純度に著しい影響がある。アエロジル無しではγ−グロブリン純度は８３．５％にとどまるが、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり４０ｍｇのアエロジルをＩＩ＋ＩＩＩペースト懸濁液に添加すると、γ−グロブリン純度は８７．２％に上昇する。アエロジル処理がフィブリノーゲン、ＰＫＡおよびアミド分解活性の著しい減少を導くことから明らかである。アエロジルへの不純物吸着の欠点の１つは、アエロジルの量が増えるにつれ濾過ケーキ中のＩｇＧ減少が増す点である。しかしながら、表１に示すように、抽出緩衝液において酢酸の濃度が高いことが、濾過ケーキ中のＩｇＧ減少におけるアエロジルの効果、さらには減少した上清Ｐｐｔ Ｇ画分中のＩｇＧ減少と部分的に釣り合いをとる。表１から分かるように、溶解緩衝液中の酢酸濃度がペースト１Ｌあたり４００μＬから５１０μＬに増加すると、濾過ケーキ中のＩｇＧ減少の量がほぼ５０％まで減少する。有利なことに、酢酸濃度が高いことはＰｐｔ Ｇ画分におけるγ-グロブリン純度に影響を及ぼさない（ペースト１Ｌあたり４００μＬで８７．２％純度に対し、ペースト１Ｌあたり５１０μＬで８６．７％純度）。さらに、ｐｋａ値が４．７５付近である酢酸の高い緩衝能により（Ｍｅｒｃｋ）、異なる酢酸量により生じたｐＨの差は無視できることを結果が示している。これは、より精度のよい大規模製造のためには、酢酸を重量で加えるべきであることを示唆する。したがって、ＣＡＥにより測定されたγ−グロブリン含有量に示されるように、調べた範囲においては、純度に対しアエロジルの影響が酢酸の影響よりもはるかに高い。

実施例４
実施例３での結果は、濾過ケーキ中のＩｇＧ減少量が抽出緩衝液のｐＨ調整のために所定のアエロジル濃度で使用された酢酸の量に強く依存することを示している。この効果をさらに特徴づけるため、改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストを約１２０分間純水中で抽出し均質な懸濁液を得、４つのパートに分けた。これらのパートは１Ｍ酢酸でそれぞれｐＨ３．８、４．２、４．６、５．０に調整され、その後にさらに１２０分間の第２の抽出時間を続けた。その後、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり４０ｍｇのアエロジル３８０でアエロジル処理を行った。１時間の撹拌後、珪藻土の存在下、Ｃｕｎｏ５０ＳＡによる濾過により懸濁液を清澄化した。ｐＨを上述のように調整した抽出緩衝液を用いた濾過の前に、１００％容量の懸濁液でフィルターの後洗浄を行った。濾過液は、８ｇＬ^−１クエン酸ナトリウムおよびｐＨ７．０に調整された０．２％ツイーン８０で処理し、２５％アルコール、−８℃でＩｇＧを沈殿させた。Ｐｐｔ Ｇ沈殿物は、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｃｒｙｏｆｕｇｅ ８５００ｉにおいて、４６００ＲＰＭ、３０分間、−１０℃でステンレスビーカーを用い遠心分離することにより回収した。その後、沈殿物を純水でＰｐｔ Ｇ沈殿物２ｇあたり純水７ｇの割合で溶解した。その後、関連の画分にＩｇＧ回収、ＰＫＡ活性、フィブリノーゲン含有量およびアミド分解活性の分析を行い、回収のｐＨ依存性を求めた（表４）。

（表４）アエロジル処理での抽出および清澄化によるフィブリノーゲン、ＰＫＡおよびアミド分解活性のｐＨ依存性の除去

表４は、アエロジルを用いたＰＫＡ、アミド分解活性（ＰＬ−１）、およびフィブリノーゲンの除去が、清澄化の間低いｐＨでは効果が少ないことを示している。ここで得られた結果から、Ｐｐｔ Ｇ画分において効率的なＩｇＧ回収を維持しつつも、ＰＫＡ、アミド分解活性（ＰＬ−１）およびフィブリノーゲンの効果的な除去に対し最も効果的なｐＨが約ｐＨ５であることが分かる。濾過ケーキ中のＩｇＧ減少が最小化される一方で、高濃度の酢酸はＰｐｔ Ｇ上清における著しいＩｇＧ減少につながる（７５ｍＭ酢酸の存在下で０．８５ｇＬ^−１）。

実施例５
実施例４で分かった結果におけるアエロジル処理の依存性を求めるため、実験を繰り返したが、アエロジル処理工程を省略した。簡単に言うと、ＩＩ＋ＩＩＩペーストを約１２０分間純水中で抽出し均質な懸濁液を得、４つのパートに分けた。これらのパートは１Ｍ酢酸でそれぞれｐＨ３．８、４．２、４．６、５．０に調整され、その後にさらに１２０分間の第２の抽出時間を続けた。その後、珪藻土の存在下、Ｃｕｎｏ５０ＳＡによる濾過により懸濁液を清澄化した。ｐＨを上述のように調整した抽出緩衝液を用いた濾過の前に、１００％容量の懸濁液でフィルターの後洗浄を行った。濾過液は、８ｇＬ^−１クエン酸ナトリウムおよびｐＨ７．０に調整された０．２％ツイーン８０で処理し、２５％アルコール、−８℃でＩｇＧを沈殿させた。Ｐｐｔ Ｇ沈殿物は、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｃｒｙｏｆｕｇｅ ８５００ｉにおいて、４６００ＲＰＭ、３０分間、−１０℃でステンレスビーカーを用い遠心分離することにより回収した。その後、沈殿物を純水でＰｐｔ Ｇ沈殿物２ｇあたり純水７ｇの割合で溶解した。その後、関連の画分にＩｇＧ回収、ＰＫＡ活性、フィブリノーゲン含有量およびアミド分解活性の分析を行い、回収のｐＨ依存性を求めた（表５）。

（表５）アエロジル処理なしでの抽出および清澄化によるフィブリノーゲン、ＰＫＡおよびアミド分解活性のｐＨ依存性の除去

実施例４で見られた結果と一致して、抽出および溶解緩衝液のｐＨが５．０に上昇しても、濾過ケーキ中のＩｇＧ減少は少ししか上昇しなかった。しかしながら、この減少はＰｐｔ Ｇ上清におけるＩｇＧ減少の大きな減少を補って余りあるものである。

実施例４と実施例５の結果を比較すると、アエロジル処理が、ＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ５．０ではなく、より低いｐＨ（３．８、４．２および４．６）で抽出される時の溶解Ｐｐｔ Ｇ画分中に見られる残留ＰＫＡ活性の量を減少させることが分かる（図２）。反対に、アエロジル処理は、ＩＩ＋ＩＩＩペーストがより高いｐＨで抽出される時の溶解Ｐｐｔ Ｇ画分のフィブリノーゲン含有量を著しく減少させる（図３：ｐＨ４．６および５．０とｐＨ３．８および４．２を比較のこと）。アエロジル処理は、溶解Ｐｐｔ Ｇ画分中に見られる残留アミド分解活性のレベルに影響しないと思われる（図４）。特に、ｐＨ３．８、４．２および４．６と比較して、ＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ５．０で抽出される時に溶解Ｐｐｔ Ｇ画分中の３種の混入物質全てのレベルが著しく減少する。

実施例６
上記実施例に見られるように、濾過ケーキおよびＰｐｔ Ｇ上清におけるＩｇＧ減少はＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ４．５から４．６付近で抽出されるときに最小化する。しかしながら、前の実施例においても明らかなように、ＰＫＡ活性、アミド分解活性およびフィブリノーゲン含有量を含む重篤な不純物がＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ４．９から５．０付近にて抽出されるときと比較して、ｐＨ４．５から４．６にて抽出されるときの方が非常に多い。それに基づき、ＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ４．５で抽出されるときに見られる非常に高い不純物レベルを、濾過ケーキおよびＰｐｔ Ｇ上清におけるＩｇＧ減少のレベルを低く維持しつつ、混入物質を吸着するのに用いるアエロジルの量を増やすことで相殺できるかどうかを確認するために本実施例を行った。

この線に沿って、改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストの抽出は以前と同じように、ｐＨ４．５の抽出緩衝液を用いて行った。その後、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり２００ｍｇまでアエロジル３８０の量を増やして添加し、懸濁液を１時間撹拌した。サンプルのさらなる処理は上記のとおり行った。

表６に見られるように、フィブリノーゲンおよびＰＫＡ活性の除去は大量のアエロジルによる清澄化によって著しく改善する。アエロジルへの結合による濾過ケーキ中のＩｇＧ減少は大量のアエロジルを用いると増加するが、この影響はＰｐｔ Ｇ上清におけるＩｇＧ減少が減ることによっていくぶん相殺される。しかしながら、重要なのは、ＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ４．５で抽出されたときには大量のアエロジルでもアミド分解活性が減少しないことである。そのうえ、γ‐グロブリン純度は大量のアエロジルにて改善されるが、全ての場合においてＰｐｔ Ｇにおける＞８６％という規格限界をまだ下回っている。おそらく抽出および清澄化における低いｐＨが理由であろう。

（表６）表６はｐＨ４．５の抽出および清澄化におけるアエロジル濃度の変化の結果を提示する

実施例７
本実施例では、ＩＩ＋ＩＩＩペースト再懸濁および清澄化に続く不純物の除去における抽出緩衝液のｐＨの影響について明らかにする。

改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストの低いｐＨでの抽出はＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり１５ｇの緩衝液の比率を用いてｐＨ４．２で行った。その後懸濁液を３つのパートに分け、３Ｍトリスを用いてそれぞれｐＨ４．５、４．７、５．０に調整した。その後、各溶液をさらに２つのパートに分け、４℃または２５℃で１時間インキュベートした。Ｃｕｎｏ５０（９０）ＳＡによる濾過をそれぞれの清澄化緩衝液と同じｐＨを持つ１０ｍＭ酢酸ナトリウム後洗浄緩衝液を用いて行った。濾過液は８ｇＬ^−１クエン酸塩および０．２％ツイーン８０で処理し、それからＩｇＧを２５％エチルアルコール添加により−１０℃で少なくとも８時間沈殿させた。沈殿物は前述のように遠心分離によって回収し、２倍量の純水に溶解した。結果として得られた懸濁液をＣｕｎｏＶＲ０６濾過装置を用いて濾過し、約１．３ｍＳｃｍ^−１の伝導率を有する最終液となった。

様々な条件を評価するためにＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、トランスフェリン、フィブリノーゲン、およびその他の不純物のレベルについて確認した。ＩＩ＋ＩＩＩペースト懸濁液の清澄化のｐＨ依存性について示した分析結果を表７に示す。ｐＨ４．５から５．０の範囲内では、ＩｇＡおよびＩｇＭ、トランスフェリン、およびフィブリノーゲン量は広範囲での変化はしなかったが、低ｐＨの緩衝液を用いた場合には、他の不要なタンパク質が高いレベルで存在する。これらの他の不純物はｐＨ５では全タンパク質の１％未満だが、ｐＨ４．５では１０％と算出された。ＩｇＧ含有量はｐＨ５．０で最も高くなる一方、４℃〜２５℃におけるＩｇＧ含有量と不純物レベルの温度依存性はごくわずかである。

（表７）表７は、ＩＩ＋ＩＩＩペーストの再懸濁後の１時間のインキュベーションおよびそれに続く添加剤なしの低ｐＨ抽出後の濾過の間におけるＩＩ＋ＩＩＩの溶解からＶＲ０６濾過までの不純物の減少をｐＨおよび温度を変化させることにより比較する

表８から分かるように、溶解Ｐｐｔ Ｇ画分およびＶＲ０６濾過のさらなる分析は、ｐＨ４．５の緩衝液をＩＩ＋ＩＩＩ清澄化およびＩＩ＋ＩＩＩ濾過処理工程に用いることにより、凝集体および低分子量成分のレベルが上昇することを示している。これらの工程は４℃よりも２５℃で行うと、この効果がより高められる。反対に、サンプルをより高いｐＨ（ｐＨ５．０）で処理すると、ｐＨ４．５での処理に比べ、得られるＰｐｔ Ｇ懸濁液および濾過液は〜３５０ｋＤａの物質を高いレベルで（二量体ＩｇＧまたはＩｇＡ）を含む（表８）。さらに、より低いｐＨで処理すると、ｐＨ５．０での処理に比べ、より高いアミド分解活性レベルとなった。

（表８）溶解した沈殿物ＧのＰＫＡおよびアミド分解活性、ＶＲ０６濾過における分子サイズ分布におけるＩＩ＋ＩＩＩペースト懸濁液のインキュベーションおよび濾過の間のｐＨおよび温度の影響

実施例８
表７および８に示された結果は、ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の再懸濁は冷蔵温度（２℃〜８℃）で行う必要があること、またアミド分解活性を有する成分と同様に、高（＞４５０ｋＤａ）および低（＞７０ｋＤａ）分子量成分の溶解を最小限に抑えるためにｐＨをｐＨ５．０に保つ必要があることを示している。ＩＩ＋ＩＩＩペースト懸濁後の効果的な清澄化は、Ｐｐｔ Ｇの下流工程のクロマトグラフィーにおける不純物の負荷を減少させるため、ＩＶＩＧ最終容器の仕様書に再現性良く適合する鍵となる。この成果をより有効にするため、改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストは上記のように溶解、処理し、改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストをｐＨ４．２で溶解し、その後ｐＨ４．５、４．７、５．０に調整した。表９に示すように、ＩＩ＋ＩＩＩペーストの懸濁および清澄化において、ｐＨ４．５よりもｐＨ５．０の方がＩｇＭはより効率良く除去される。この実験において、ＩｇＧ収率はｐＨ５．０と４．５ではよく似た結果となった。

（表９）ＩＩ＋ＩＩＩペースト再懸濁、濾過、およびＰｐｔ Ｇ沈殿の種々の工程におけるＩｇＧ，ＩｇＡ、ＩｇＭ，トランスフェリン、およびフィブリノーゲンの収率

実施例９
ＩＩ＋ＩＩＩペースト抽出工程におけるｐＨの最適条件を求めるため、濾過液中のタンパク質分解活性を最小限に抑える目的で、抽出および濾過におけるｐＨをｐＨ３．８〜７．８の広い範囲にわたって変化を持たせた。この目的のため、改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストを１＋８の比率で低いｐＨで抽出した。短時間撹拌した後、均一化した分散液を得るため、懸濁液を８つのパートに分け、ｐＨを酢酸またはトリス緩衝液を用いてそれぞれｐＨ３．８、４．２、４．６、５．０、６．６、７．０、７．４，７．８に調整し、追加で１２０分間抽出した。その後、ｐＨを５．１に調整し、清澄化を５０ｍＬのファルコンチューブ内での遠心分離により行った。Ｐｐｔ Ｇ沈殿は標準条件下で行った。図５および６に示されるように、アミド分解活性およびＰＫＡはＰｐｔ Ｇ溶解画分中で測定した。

図５の４℃で保管したサンプルにおいて見られるように、ＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ５．０で抽出される時にアミド分解活性は最小限に抑えられる。さらに強調したい点は、Ｐｐｔ Ｇ溶解画分を室温で１週間保管した後、アミド分解活性が上昇したことから、サンプルは長時間高温（室温）で保存するべきではないということである。同様に、図６から分かるように、ＩＩ＋ＩＩＩペーストがｐＨ５．０以上で抽出される時にＰＫＡ活性は最小限に抑えられる。

実施例１０
本実施例では、抽出および清澄化においてＩｇＧ収率減少のｐＨ依存性を評価する。簡単に言うと、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり１５ｇの純水の比率で１１０ｇの改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストを再懸濁させ、続いて１２０分間の抽出を行った。その後サンプルを４つのパートに分け、ｐＨを酢酸でそれぞれｐＨ３．８、４．２、４．６、５．０に調整した。４つの同一性を確保するために、４つのパートに分ける前にもとのｐＨで前抽出を行い、上述のｐＨに調整し、さらに追加で１時間抽出を行った。その後、サンプルをそれぞれの抽出およびＰｐｔ Ｇ沈殿に用いたものと同じｐＨでＣｕｎｏ５０ＳＡ濾過により清澄化した。Ｃｕｎｏ濾過の後、全てのパートを同じように処理した、つまり、全てのパートをｐＨ７．０の標準的な沈殿物Ｇの沈殿処理をした。そのような実験の２つの結果は以下の表１０および１１に要約される。

（表１０）濾過液中のタンパク質およびＩｇＧ回収、および再溶解沈殿物Ｇ'ｓのＭＳＤおよびＣＡＥの結果

（表１１）抽出および清澄化におけるＩｇＧ減少、および再溶解沈殿物Ｇにおけるタンパク質分解活性およびフィブリノーゲン

上記のデータは低いｐＨでの抽出によるタンパク分解酵素の活性化に関する図５および６に示した結果を裏付けている。まとめると、そのデータは低ｐＨ抽出が全てのタンパク質の溶解性が増加することによってＩｇＧ減少がより少なくなることをもたらすということを明らかにしている。さらに、表１１に見られるＩｇＧ減少は、より低いｐＨをもたらす高濃度の酢酸により、濾過ケーキ中のＩｇＧ減少はより低くなるが、沈殿物Ｇ上清においてはＩｇＧ減少はより高くなるということを示唆している。この現象は低いｐＨでの抽出後の沈殿工程における高濃度の酢酸によって説明できるかもしれない。

実施例１１
適切なＩＩ＋ＩＩＩ抽出条件を確認するために、酢酸でｐＨ４．３に調整した純水で低いｐＨでの抽出を行い、濾過前にｐＨ４．９に再調整する手順と、抽出緩衝液１０００Ｌあたり６００ｇの酢酸を用い、溶解液のｐＨが４．８〜４．９となる５ｍＭ酢酸ナトリウム／５ｍＭリン酸二水素ナトリウムによる抽出を比較した。この実験はパイロットスケールで行われ、３．８〜５ｋｇの改変ＩＩ＋ＩＩＩペーストを用いて開始した。全ての実験はＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｋｇあたり４０ｇのアエロジルを用いたアエロジル処理を含めた。清澄化には、Ｃｕｎｏ５０ＳＡフィルターシートを備えたフィルター枠３０ｃｍ^＊３０ｃｍのストラスバーガー加圧濾過器を用いた。後洗浄は、緩衝液１０００Ｌあたり１５０ｇの酢酸を用いた５ｍＭ酢酸ナトリウム／５ｍＭリン酸二水素ナトリウムを用い、加圧濾過器の４デッドボリューム容量で行った。沈殿物Ｇの遠心分離はＣｅｐａ（登録商標）Ｚ６１Ｈ遠心分離機を用いて１７０００ＲＰＭ（ローター直径１０．５ｃｍ）、１時間あたり４０Ｌの流量で行った。３回実施されたその試験の結果は表１２に示される。

（表１２）ｐＨ４．３での低いｐＨでの抽出およびアエロジル処理前にｐＨ４．９にシフトしたものと抽出緩衝液１０００Ｌあたり氷酢酸６００ｇを用いた改良されたＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤによる抽出との比較

表１２に見られるように、両抽出手順では同様のＩｇＧ回収であった。ｐＨ５．０でのＩＩ＋ＩＩＩペーストの抽出によって様々な不純物が最小化された実施例３から１０の結果を考えると、表１２に与えられた結果は、抽出緩衝液１０００Ｌあたり６００ｇの氷酢酸を用いたｐＨ４．８〜４．９での抽出が低ｐＨでの抽出とその後のｐＨ４．８〜５．０への調整よりも優れていることを示している。

実施例１２
製造の間、加圧濾過器の枠や、タンクへおよびタンクから結合している導管はかなりの空隙ボリュームを持っており、後洗浄が開始される前には懸濁液または濾過液でまだ満たされている。後洗浄が終了すると、この空隙ボリュームは加圧濾過器内に残ったままになる。標準手順は加圧濾過器の１と２デッドボリュームの間で洗浄することによって、この空隙ボリュームを占有する。標準的なフィルターの後洗浄が全ＩｇＧの効率的な回収に効果があるかどうか確認するために、大規模製造のＩｇＧ精製における様々な量の洗浄緩衝液を用いた実験を行った。図１に、残存するＩｇＧおよび全タンパク質のレベルについて、後洗浄容量（デッドまたは空隙ボリュームとして測定された）の依存性を示す。

特に、図１に見られるように、加圧濾過器のデッドボリュームの約２倍量を用いた濾過後洗浄はＩｇＧ回収がかなり減少する結果となり、洗浄液１Ｌあたり１．５ｇのＩｇＧを含んでいる。驚くべきことに、ＩｇＧの効率的な回収には、加圧濾過器のデッドボリュームの３．６倍量の後洗浄緩衝液が必要となる（図１に矢印で表示した）。加圧濾過器のデッドボリュームの３．６倍量を超えるさらなる後洗浄は得策ではなく、追加のＩｇＧ回収なしの濾過液の希釈につながる。

実施例１３
ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿工程の間、アルコール濃度は２０から２５％に上げられ、温度は−５℃から−７℃に下げられた。ＩＩ＋ＩＩＩペーストを溶解する際、以前は５１０ｍＬ氷酢酸／１０００Ｌ緩衝液の比で用いたのに対し、ＩＩ＋ＩＩＩペースト再懸濁緩衝液のｐＨを調整するために少なくとも１０００Ｌ容量あたり６００ｍＬの氷酢酸を使用した。その抽出比は酢酸緩衝液を用いて１＋１５であった。清澄化には、ＩＩ＋ＩＩＩペースト１ｇあたり０．０４〜０．０６ｇのアエロジル（通常この範囲で一番低い、例えば０．０４ｇ）が添加された。後洗浄には、加圧濾過器のデッドボリュームの約４倍量（４×）の後洗浄緩衝液を用いた。例えば、ある特定の試験ではデッドボリュームの４．３倍量が用いられた一方、別の試験ではデッドボリュームの３．６倍量が用いられた。４倍またはそれ以上のデッドボリュームでの後洗浄は以前に使用されていた１．８倍量のデッドボリュームから増やされた。その緩衝液は１０００Ｌ緩衝液あたり１５０ｍＬの氷酢酸を用いて調整され、以前の１２０ｍＬ氷酢酸／１０００Ｌ緩衝液から増加している。これらの変化は８％のＩｇＧ収率向上および少なくとも純度８６％のγ‐グロブリンをもたらした。０．１Ｍリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４、伝導率２５．５ｍＳ／ｃｍ）抽出時には、濾過ケーキ抽出物中に極低量のＩｇＧが見られた。

実施例１４
Ａ．分画Ｉの最適化：スプレー法対変量的（ｆｌｕｅｎｔ−ｗｉｓｅ）添加によるエタノール添加；エタノール添加後のｐＨ７．０または７．５へのｐＨの調整
表１３は現在使用している製造方法によるＩｇＧ収率を示しており、後述する実験における比較の参考を提供する。１５〜２０％のＩｇＧがコーンプールから濾過液にかけて失われる。ＩＩ＋ＩＩＩ上清において、血漿１Ｌあたり約０．４ｇのＩｇＧが失われる。

（表１３）

^*ＬＡ Ｂ５回収血漿コーンプール：ｓａｌｉｎｅ ｃｈａｓｅによる低ＩｇＧ濃度．平均ＬＡ Ｂ１回収血漿コーンプール：８．５２ｇ／Ｌ．

方法
１４リットルのバケット中、２４〜２７℃で６〜７時間、コーンプールをとかした。その後、材料を２〜８℃で一晩混ぜ合わせた。プールをその後４つのパートに分けた（それぞれ８００ｇ）。
１：変量的エタノール添加、続いて７．０にｐＨ調整
２：変量的エタノール添加、続いて７．５にｐＨ調整
３：スプレー法によるエタノール添加、続いて７．０にｐＨ調整
４：スプレー法によるエタノール添加、続いて７．５にｐＨ調整

まず、全てのパートを０℃に冷却した。その後、８％エタノールをパート１およびパート２に変量的に加え、パート３およびパート４にスプレーヘッドを用いてスプレー法により加えた。いずれの方法においてもエタノールはほぼ同じ速度で加えた。エタノール添加中、クライオスタットを−５℃に調整し、７５ｍｌのエタノールをそれぞれのパートにかき混ぜながら加えた。ｐＨを１Ｍ酢酸により７．０または７．５に調整した。その後、溶液を１時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液をビーカー遠心分離機で遠心分離した（４６００ｒｐｍ、３０分間、−２℃）。

結果
ＩｇＧ収率を比濁分析法で測定し、その結果を表１４に示す。従来のエタノール添加では０．２〜０．２５ｇ／Ｌ血漿が失われた一方で、改良された方法（エタノールスプレー法）では、分画Ｉ上清においてほぼ１００％のＩｇＧ収率が得られた。これらの結果は、製造において、改良された方法がＩｇＧ収率を０．２ｇ／Ｌ血漿まで上昇させることを示している。

（表１４）

Ｂ．パイロットスケール：分画Ｉ（スプレー法対変量的；エタノール添加後７．４にｐＨ調整）および分画ＩＩ＋ＩＩＩ（エタノール添加前６．７にｐＨ調整、エタノール添加後６．９に再調整）

実施例１５
方法
２℃でかき混ぜながら、２．８ｋｇの血漿をとかした。フラクションＩ：８％エタノールを加え、５Ｍ酢酸を用いてｐＨを７．４に調整した。かき混ぜながら、懸濁液を−２℃の温度まで冷却した。スプレーの条件はスプレーヘッドを用いることで得られた。いずれの方法においても、エタノールおよび５Ｍ酢酸の添加はほぼ同じ速度で行った。１時間のインキュベーション後、溶液を−４℃の温度でＣＥＰＡ遠心分離機を用いて遠心分離した。

フラクションＩＩ＋ＩＩＩ：ｐＨ４緩衝液を用いてｐＨを６．７に調整し、従来行っていたように（１）スプレー法または（２）変量的に２５％エタノールを添加した。その後、ｐＨを６．９に再調整した。−７℃で１０時間インキュベーションを行った。

結果
２５％エタノールを用いたフラクションＩＩ＋ＩＩＩでのＩｇＧ減少を比濁分析法で測定し、その結果を表１５に示す。ＩｇＧ測定にはある程度の変動があるため、最適な方法での平均値を取り上げた。

（表１５）

フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物に至るまで、１Ｌの血漿あたり０．３５ｇのＩｇＧしか失わなかった。変量的２５％エタノール添加と比べて、スプレー法を用いた分画ＩＩ＋ＩＩＩにおいて１Ｌの血漿あたり０．０４ｇのＩｇＧの収率増加が得られ、現在製造に使用している変量的２０％エタノール添加と比べて、１Ｌの血漿あたり０．３ｇのＩｇＧの収率増加が得られた（０．４から０．０６ｇ／Ｌの範囲から平均化）。濾過液中のＩｇＧ収率は参考に比べて著しく高く、ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿における変量的２０％エタノール添加での製造において現在得られている８０〜８６％をはるかに超えている。

Ｃ．分画ＩＩ＋ＩＩＩ（２０％エタノール）：分画ＩＩ＋ＩＩＩ全体にわたって初期のｐＨを維持

実施例１６
方法
１７〜２０℃で２７時間かき混ぜながら、５０Ｌの血漿をとかした。分画Ｉは上のセクションで述べたように最適な工程として行った。上清Ｉは以下の２つのパートに分けた。
（１）最悪なｐＨ調整：インキュベーション期間ではなくエタノール添加前後のｐＨ調整
（２）最適なｐＨ調整：エタノール添加前後のｐＨ調整およびさらに待機時間におけるｐＨ再調整。待機時間中は溶液を絶えず撹拌した。

Ｉの上清のｐＨは、どちらのパートにおいても、エタノール添加前にｐＨ４緩衝液を用い６．７に調整した。エタノールはスプレー法で添加し、エタノール添加後にｐＨを６．９に再調整した。

パート（１）において、最悪の事態を想定することなくｐＨ調整を行った。エタノール添加後に、溶液のｐＨを直接調整し、インキュベーション期間は調整しなかった。パート（２）において、ｐＨを１０時間のインキュベーション期間に一定値６．８〜７．０となるように再調整した。

結果
ＩｇＧを再び比濁分析法で測定し、その結果を表１６に示す。待機時間中に約６．９の一定値へｐＨを一定に再調整することにより、大規模製造における平均である０．４ｇ／Ｌ血漿と比較して、血漿１Ｌあたり０．１３ｇのＩｇＧしか失われなかった。参考（スプレー法は用いず、待機時間中絶えず撹拌）と比べて、血漿１Ｌあたり０．０７ｇのＩｇＧの収率増加を得た。現在使用されている従来法（１Ｌ血漿あたり０．３８ｇのＩｇＧ減少、表１３）と比べて、血漿１Ｌあたり約０．２０ｇから約０．３０ｇへのＩｇＧの収率増加を得た。

（表１６）

結論
ＩＩ＋ＩＩＩ上清におけるＩｇＧ減少は、製造バッチにおける０．４ｇ ＩｇＧ／Ｌ血漿の現在のレベルから２０％エタノールによる沈殿での０．１３ｇ／Ｌ血漿のレベルへ、およびエタノールをスプレー法で添加し沈殿の間ｐＨが持続して６．９±０．１に維持されている場合、２５％エタノールによる沈殿での０．０８ｇ／Ｌ血漿未満のレベルへ減少する。

沈殿Ｉで、スプレー法によるｐＨ調整前のエタノール添加は分画Ｉ上清中における０．１から０．２ｇ／Ｌ血漿のＩｇＧ収率増加をもたらす。

考察
ＩｇＧは全ての実験で比濁分析法にて測定し、少なくとも−／＋５．０％の分散を有する（ネフェロメーター製造業者によって示された、ジーメンスＡＧ）。それゆえ、製造において改良された方法で得られる実際の収率増加は、実施例中に示したものよりわずかに低い、または高いものとなるだろう。

新しく改良された方法による収率増加のさらなる裏づけとして、沈殿物ＩｇＧ重量を、製造における同じ血漿ソースから得られた平均の沈殿物ＩｇＧ重量と比較した。製造において現在用いる方法により、１０００ＬのＵＳソースコーンプールあたり１８ｋｇの沈殿物ＩｇＧが得られたのに対し、パイロットスケール研究（上述のセクションＢ）では、２０．８ｋｇの沈殿物ＩｇＧが得られた（２０％エタノールおよび分画ＩＩ＋ＩＩＩの最適化されたｐＨ調整、全ての緩衝液とエタノールのスプレー法による添加）。これが１０００Ｌのコーンプールあたり２ｋｇ以上の沈殿物ＩｇＧの増加となる。

実施例１７
この実施例では、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁物の濾過前のフュームドシリカ処理工程の追加が、より高い純度のＩｇＧ濾過液をもたらすことを明らかにする。簡単に言うと、脱クリオ血漿は上述の方法でフラクションＩＩ＋ＩＩＩ段階に分画化され、その時点で２つのサンプルに分けられた。第１のサンプルは標準フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過前に、濾過助剤の添加によってのみ清澄化される（図７Ａ）。第２のサンプルは、ここに記述したように、濾過助剤の添加および標準フラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液濾過前にフュームドシリカ前処理を受けた（図７Ｂ）。

濾過液のタンパク質成分は、酢酸セルロース電気泳動によりその後分離され、個々のピーク面積が標準法を用いて計算された。クロマトグラフおよび定量されたデータに見られるように、濾過前にフュームドシリカを用いて処理した第２のサンプルは、フュームドシリカで処理していないサンプルよりも非常に高いＩｇＧ純度を有する濾過液となった（６８．８％対５５．７γ‐グロブリン；表１８と表１６を比較のこと）。

（表１７）図７Ａに示した、濾過前に濾過助剤のみの添加によって清澄化された画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液由来の酢酸セルロース電気泳動により分離されたタンパク質ピークの定量

（表１８）図７Ｂに示した、フュームドシリカを用いた前処理および濾過前に濾過助剤の添加によって清澄化されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液由来の酢酸セルロース電気泳動により分離されたタンパク質ピークの定量

実施例１８
本実施例では、限外濾過および２０％ＩｇＧ調製の処方が皮下注射に適していることを示す。この情報は生産スケールアップおよび非臨床の２０％ＩｇＧ調製の間に蓄積された。ナノ濾過工程前の２０％ロットの製造に用いるプロセスは上述のとおりであった。限外／透析濾過は溶液を２０％に濃縮するよう改良された。収率減少を最小にするため、透析濾過に用いる限外濾過装置の後洗浄液は、同じ膜を備えた第２のより小さな装置によって濃縮され、その後バルク溶液に加えられた。

驚くべきことに、低いｐＨでの保管の間のウイルス不活性化は溶液のタンパク質濃度による影響を受けないことが示された。同様のウイルス減少が１０％溶液（ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ）および２０％溶液でも得られた。それゆえ、ウイルス減少工程としての低ｐＨでの保管は２０％生成物において維持された。

ナノ濾過の前に、ＩｇＧ溶液のグリシン濃度は目標の０．２５Ｍに調整される。その後にその溶液を限外濾過（ＵＦ）でタンパク質濃度６±２％（重量／体積）に濃縮する。ｐＨは５．２±０．２に調整する。使用したＵＦ膜は公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）が５０，０００ダルトン以下であり、高粘性の生成物のために特別に設計されている(例えば、ミリポアのＶスクリーン)。

その後、その濃縮物をｐＨ４．２±０．２の０．２５Ｍグリシン溶液に対して透析濾過する。最小交換容量は元の濃縮物容量の１０倍である。限外濾過／透析濾過操作の間中、溶液は約４℃〜２０℃の間に保たれる。

透析濾過後、その溶液は少なくともタンパク質濃度２２％（重量／体積）にまで濃縮される。その溶液の温度は２℃〜８℃に調整される。

システム中の完全な残存タンパク質を回収するために、第１のより大きな限外濾過システムの後洗浄が、全てのタンパクが洗い落とされることを保証するために少なくとも再循環モードにおける２倍のデッドボリュームで行われる。それから、第１の限外濾過システムの後洗浄液は、第１のものの１０分の１もしくはそれ未満の寸法の同じタイプの膜を備える第２の限外／透析濾過システムで、少なくともタンパク質濃度２２％（重量／体積）まで濃縮される。後洗浄液の濃縮物はバルク溶液に加えられる。第２の限外濾過システムはその後、後洗浄される。この後洗浄液は、最終処方のタンパク質濃度の調整に用いられる。その溶液の温度は約２℃〜８℃に維持される。

最終溶液を製剤化するために、そのタンパク質濃度は、第２のより小さな限外濾過システムの後洗浄液および／または透析濾過緩衝液を用いて、約２０．４±０．４％（重量／体積）に調整される。必要であれば、ｐＨは約４．４〜４．９に調整される。

実施例１９
現在のＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ製造プロセスにおけるフラクションＩＩ＋ＩＩＩの濾過液中に回収されたＩｇＧの画分を比較するために、ここに提供する改良されたフラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿と溶解法を用いて、ＩｇＧの５つの製造スケール精製を行った。簡単に言うと、−７℃でｆｌｕｅｎｔ添加によって合わせられた２５％エタノールを用い、現在の製造プロセスで採用されている−５℃および２０％エタノールと比較して、ＩｇＧ初期濃度約６．１４ｇ／ＬであるＩｇＧのコーンプール沈殿を行った。改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物はそれから、ｐＨ４．３の溶解緩衝液または０．０６％氷酢酸を用いて調整された緩衝液を用いて１〜１５を抽出し、その後溶解緩衝液の４．３倍のフィルターデッドボリュームの最終洗浄液を用いて深層フィルターを通して濾過した。表１８に見られるように、ここに提供する改良された方法による改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ濾過液は、現在の製造プロセスにより調製された改変フラクションＩＩ＋ＩＩＩ濾過液よりも、初期のコーンプール中に存在するＩｇＧを顕著に高い割合（少なくとも８．０％の増加）で含んでいた（それぞれ、９１．１％対９１．６％、８３．１％対８３．８％）。

（表１８）ここに提供する改良された方法により製造されたロットにおけるＩｇＧ回収と比較した、２００８年および２００９年の一部の間にウィーンにて行われたバクスターの全ての製造稼働のフラクションＩＩ＋ＩＩＩ濾過液におけるＩｇＧの平均回収

実施例２０
ここに提供するＩｇＧ組成物の純度を求めるために、ＩｇＧの３つのロットをここに提供する改良された方法により調製した。これらの精製の最終ＩｇＧ生成物は、最終組成物におけるＩｇＧ単量体／二量体の割合を求めるとともに、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アミド分解活性、Ｃ３およびフィブリノーゲンを含むいくつかの混入物質について検査された。表１９の下部に見られるように、ここに提供する改良された方法の製造により、初期物質の７３．６％〜７８．５％と、現在採用されている方法における６０％〜７０％と比較して、最終バルク組成物におけるＩｇＧ回収の増加をもたらす一方、不純物プロファイルが現在のＩｇＧ製造基準とはいわないまでも同じくらい良く維持された。

（表１９）ここに提供する改良された製造方法により調製されたＩｇＧ組成物中の不純物およびＩｇＧ単量体／二量体組成物のレベル

本明細書に記載される実施例および実施形態は、単に説明目的のためのものであり、それらに照らし合わせて様々な修正または変更が、当業者に暗示されることになり、本出願の趣旨および権限ならびに付属の請求項の範囲内に含まれるべきであると理解される。本明細書で引用される全ての公報、特許、および特許出願は、全ての目的のために、参考としてそのまま本明細書に組み込まれている。

Claims (23)

1. （ａ）第１の沈殿工程として、ｐＨ約７．０から約７．５にて約６％から約１０％のアルコールを用いて脱クリオ血漿画分を沈殿させ、第１の沈殿物と第１の上清を得る工程と、
   （ｂ）第２の沈殿工程として、ｐＨ約６．７から約７．３および−７℃〜−９℃の温度にて約２３％から約２７％のアルコールを用いて第１の上清からＩｇＧを沈殿させ、第２の沈殿物を形成する工程と、
   （ｃ）第２の沈殿物１部に対して抽出緩衝液１３〜１７部の比率で、第２の沈殿物を懸濁して、懸濁液を形成する工程であって、前記抽出緩衝液がｐＨ４．５±０．２を有する、前記工程と、
   （ｄ）前記懸濁液を、工程（ｂ）において形成された沈殿物１ｇあたり０．０２ｇ〜０．１ｇのヒュームドシリカの添加によって処理する工程と、
   （ｅ）深層フィルターによって、ヒュームドシリカで処理された懸濁液から、ＩｇＧを含む可溶性画分を分離する工程と、
   （ｆ）デッドボリュームの少なくとも２．５倍の緩衝液を用いて深層濾過に使用されるフィルターを洗浄し、それにより、可溶性画分中で富化ＩｇＧ組成物を形成する工程
   を含む、血漿由来の富化ＩｇＧ組成物を調製する方法。
2. ＩｇＧが、２４％〜２６％のアルコールを用いる工程（ｂ）において第１の上清から沈殿される、請求項１に記載の方法。
3. ＩｇＧが、２５％のアルコールを用いる工程（ｂ）において第１の上清から沈殿される、請求項１に記載の方法。
4. ＩｇＧが、約−７℃の温度の工程（ｂ）において第１の上清から沈殿される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＩｇＧが、−７℃の温度の工程（ｂ）において第１の上清から沈殿される、請求項４に記載の方法。
6. ＩｇＧが、ｐＨ６．９の工程（ｂ）において第１の上清から沈殿される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 第２の沈殿物が、沈殿物１部に対して抽出緩衝液１５部の比率で抽出緩衝液を用いる工程（ｃ）において懸濁される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 抽出緩衝液が、リン酸１ナトリウムおよび酢酸塩を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 抽出緩衝液が、５ｍＭのリン酸１ナトリウムおよび５ｍＭの酢酸塩を含む、請求項８に記載の方法。
10. 工程（ｄ）における懸濁液の処理が、工程（ｂ）において形成された沈殿物１ｇあたり０．０２ｇ〜０．０６ｇのヒュームドシリカの添加を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 工程（ｄ）における懸濁液の処理が、工程（ｂ）において形成された沈殿物１ｇあたり０．０４ｇのヒュームドシリカの添加を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 工程（ｄ）における懸濁液の処理が、ヒュームドシリカの存在下で少なくとも３０分間、懸濁液をインキュベートすることを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 懸濁液が、２℃〜１０℃の温度の工程（ｄ）において処理される、請求項１２に記載の方法。
14. 深層濾過に使用されるフィルターが、デッドボリュームの少なくとも３．６倍の緩衝液を用いて洗浄される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. （ｇ）第３の沈殿工程として、ｐＨ６．７から７．３にて２２％から２８％のアルコールを用いて富化ＩｇＧ組成物中に存在するＩｇＧを沈殿させ、第３の沈殿物を形成する工程
    をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第１の沈殿工程、前記第２の沈殿工程、および前記第３の沈殿工程のうち少なくとも１つの工程が、アルコールのスプレー添加を含み、前記スプレー添加が、細かい水滴または霧の形状のアルコールの添加である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記第１の沈殿工程、前記第２の沈殿工程、または前記第３の沈殿工程のうち少なくとも１つの工程のｐＨは、前記アルコール添加後、ｐＨ調整溶液の添加により達成される、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 少なくとも１つの沈殿工程のｐＨは、前記ｐＨの連続的な調整により前記全沈殿工程で維持される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. イオン交換クロマトグラフィー精製工程をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程と陽イオン交換クロマトグラフィー工程の両方を含む、請求項１９に記載の方法。
21. ナノ濾過工程ならびに／または限外濾過および透析濾過工程をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 工程（ｆ）において得られた富化ＩｇＧ組成物が、工程（ａ）において用いられた脱クリオ血漿画分で見られるＩｇＧ含有量の少なくとも８５％を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 工程（ｆ）において得られた富化ＩｇＧ組成物が、工程（ａ）において用いられた脱クリオ血漿画分で見られるＩｇＧ含有量の少なくとも９０％を含む、請求項２１に記載の方法。

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