CN107847541A - 克隆并进一步纯化以制备重组静脉注射免疫球蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本主题涉及克隆并纯化重组静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的方法，包括克隆人免疫球蛋白靶基因；体外筛选表达该人免疫球蛋白靶基因的酵母细胞以产生酵母细胞系；将酵母细胞系发酵并收集所得到的培养基；过滤该培养基；进行弱阴离子交换层析以收集流通溶液；超滤该流通溶液以达到所需的蛋白质浓度；无菌过滤该流通溶液；纳米过滤该流通溶液以去除病毒；填装并在低pH下温育该流通溶液进行病毒灭活以获得纯化的重组IVIG。本主题涉及用于液体和冻干形式的纯化的重组IVIG，其具有五种新发现的蛋白质，即KH 33、KH 34、KH 35、KH 36和KH 37。

Description

克隆并进一步纯化以制备重组静脉注射免疫球蛋白的方法
技术领域
本专利申请要求于2015年4月2日提交的美国临时专利申请No.62/142,237的优先权，其由本发明人提交，并且通过引用将其整体并入本文。
本主题涉及重组静脉注射免疫球蛋白(IVIG)和蛋白质序列。具体而言，本主题涉及克隆并纯化IVIG以产生液体和冻干形式的纯化的重组IVIG的方法，其含有五种新发现的蛋白质，即KH 33、KH 34、KH 35、KH 36和KH 37。
背景技术
免疫球蛋白G(IgG)是一种抗体并且是由四条肽链组成的蛋白质复合物，这四条肽链为两条相同的重链和两条相同的轻链，其排列成典型的抗体单体的Y形。每个IgG有两个抗原结合位点。代表人类约75％的血清抗体的IgG是循环系统中最常见的抗体类型。IgG分子通常由血浆B细胞产生并释放。抗体是体液免疫的主要成分。IgG是血液和细胞外液中发现的主要抗体类型，可以控制身体组织的感染。IgG通过结合多种病原体如病毒、细菌和真菌来保护身体免受感染。在血浆衍生工业中，IgG通常从人血浆的组分II纯化。然而，一定百分比的IgG可能会沉淀成组分III糊剂。
在相关申请中，申请人已经展示了，具有7种现有和新发现蛋白质的IVIG可体外和体内治疗和预防乙型肝炎病毒感染。由血浆产生的有限量的IVIG不足以为全球至少3.5亿HBV携带者提供治疗，更不用说仅在中国就至少有1.3亿HBV携带者。100万升IVIG仅可生产250,000个小瓶，可用于治疗25,000名患者。因此，少于0.00714％的患者可被治愈，导致对本主题的需求。
本主题涉及克隆总共7种现有和新发现的蛋白质，然后使用不同酵母菌株表达单个蛋白质以获得最大至少5,000,000,000(每毫升50亿个细胞)。通过加工培养基，可以纯化靶蛋白。从该方法，可以获得一个最终的靶蛋白，或者将七个单独的靶蛋白组合来制备重组IVIG。
发明内容
在本主题的一个实施方案中，使用重组DNA技术以克隆免疫球蛋白G中五种新发现的蛋白质或两种现有的轻链和重链，用于静脉注射。五种克隆的新发现的蛋白质在酵母细胞中表达。用这些新发现的蛋白质，免疫球蛋白的重组静脉注射液可以阻止乙型肝炎病毒的复制，也可以预防乙型肝炎病毒感染。具有新发现或现有蛋白质的重组IVIG具有与血浆来源的静脉注射免疫球蛋白相同的功能。
在一个实施方案中，本主题涉及一种克隆并纯化重组静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的方法，包括以下步骤：
a)克隆人免疫球蛋白靶基因；
b)体外筛选表达该人免疫球蛋白靶基因的酵母细胞以产生酵母细胞系；
c)将该酵母细胞系发酵并收集所得到的培养基；
d)用10CP+90SP过滤该培养基；
e)进行弱阴离子交换层析以收集流通溶液；
f)对该流通溶液进行超滤以达到所需的蛋白质浓度；
g)对该流通溶液进行无菌过滤；
h)用20nm过滤器对该流通溶液进行纳米过滤以去除病毒；和
i)填装并在低pH下温育该流通溶液进行病毒灭活以获得纯化的重组IVIG。
附图说明
图1是描绘了处理重组IVIG的方法的流程图。
图2是说明新发现的蛋白质KH 33、KH 34、KH 35、KH 36和KH 37的SDS-PAGE分析的照片。SDS-PAGE分析显示新发现的蛋白质单独表达，并且分子量接近IVIG中两种主要蛋白质，即IVIG的重链和轻链的分子量。
图3是说明通过使用双重DNA表达系统，在一个酵母细胞中表达KH 33和KH 37的照片。KH 33代表IVIG的轻链，而KH 37代表IVIG的重链。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与目前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在提供数值范围(例如，浓度范围、百分比范围或比率范围)的情况下，应当理解，除非上下文另外明确指出，在所述范围的上限和下限之间的以下限单位的十分之一为基准的每个中间值，以及在所述范围内的任何其他已说明的值或中间值均被涵盖在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且这样的实施方案也涵盖在所述主题内，受到所述范围中的任何明确排除的端值的限制。在所述范围包括一个或两个端值的情况下，排除了所包括端值中任一者或两者的范围也包括在所述主题中。
在整个申请中，各种实施方案的描述使用措辞“包含”；然而，本领域技术人员将会理解，在某些特定情况下，可以替代地使用措辞“基本上由……组成”或“由……组成”来描述实施方案。
为了更好地理解本教导且绝不限制本教导的范围，除非另有说明，表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和权利要求书中使用的其他数值应被理解为在所有情况下均由术语“约”来修饰。因此，除非有相反指示，在下面的说明书和所附权利要求书中提出的数字参数都是近似值，其可以根据所希望获得的性质而变化。最低限度，每个数字参数至少应该根据所报告的有效数字的数目并通过使用普通的四舍五入技术来解释。
本主题的一个实施方案涉及一种克隆并纯化重组静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的方法，包括以下步骤：
a)克隆人免疫球蛋白靶基因；
b)体外筛选表达该人免疫球蛋白靶基因的酵母细胞以产生酵母细胞系；
c)将该酵母细胞系发酵并收集所得到的培养基；
d)用10CP+90SP过滤该培养基；
e)进行弱阴离子交换层析以收集流通溶液；
f)对该流通溶液进行超滤以达到所需的蛋白质浓度；
g)对该流通溶液进行无菌过滤；
h)用20nm过滤器对该流通溶液进行纳米过滤以去除病毒；和
i)填装并在低pH下温育该流通溶液进行病毒灭活以获得纯化的重组IVIG。
在一个实施方案中，纯化的重组IVIG包含蛋白KH 33、KH 34、KH 35、KH 36和KH37。纯化的重组体可以是液体或冻干形式。此外，本主题的一个实施方案涉及根据克隆并纯化重组IVIG的方法生产的纯化的重组IVIG。
在一个实施方案中，人源免疫球蛋白靶基因在血浆来源的IVIG中被发现和测序。该方法可进一步包括将IVIG基因序列转染到酵母细胞系中以获得表达IVIG的酵母细胞系，并用双重抗生素标记筛选表达IVIG的酵母细胞系。该方法可进一步包括将表达IVIG的酵母细胞系在生物反应器中扩增和培养以使细胞数目最大化至每毫升至少50亿个细胞。
在一个实施方案中，弱阴离子交换层析是使用DEAE琼脂糖凝胶Fast Flow(DEAE琼脂糖凝胶FF)(一种层析介质)进行的。在一个实施方案中，流通溶液用10K截止膜进行超滤。该方法可以进一步包括调节流通溶液的蛋白质浓度和pH。在一个实施方案中，无菌过滤是0.22μm无菌过滤。在一个实施方案中，将流通溶液填装并在25℃下以pH 4进行低pH孵育21天作为病毒灭活。
本主题的一个实施方案涉及一种阻止乙型肝炎病毒在患者体内复制的方法，包括用由克隆并纯化重组IVIG的方法获得的纯化的重组IVIG对有此需要的患者进行给药。本主题的一个实施方案涉及一种杀死患者体内的乙型肝炎病毒的方法，包括用由克隆并纯化重组IVIG的方法获得的纯化的重组IVIG对有此需要的患者进行给药。本主题的一个实施方案涉及一种预防患者体内感染乙型肝炎病毒的方法，包括用由克隆并纯化重组IVIG的方法获得的纯化的重组IVIG对有此需要的患者进行给药。
此外，本主题的一个实施方案涉及一种预防患者体内感染H1N1和其他禽流感病毒中的一种或多种的方法，包括用由克隆并纯化重组IVIG的方法获得的纯化的重组IVIG对有此需要的患者进行给药。
在一个实施方案中，本主题涉及一种治疗有此需要的患者的方法，包括用由克隆并纯化重组IVIG的方法获得的纯化的重组IVIG对有此需要的患者进行给药，其中纯化的重组IVIG将受损的和有病的细胞转化或修复成健康的细胞，其中纯化的重组IVIG保护细胞改变，并且其中纯化的重组IVIG向身体发送信号以产生健康的新细胞，从而防止新细胞受细胞内和细胞外损伤信号的影响。
实施例
根据本主题的一个实施方案，…
致谢
一个实施方案…
利用本文所包含的信息，在不脱离所附权利要求的主旨和范围的情况下，对本主题所属领域的技术人员而言，对本主题精确描述的各种偏离将是显而易见的。由于优选实施方案和其他描述仅旨在说明当前提供的主题的特定方面，因此本主题不被认为在范围上局限于所定义的过程、特性或成分。实际上，对于化学、生物化学或相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本主题的所描述模式的各种修改均旨在落入以下权利要求的范围内。

Claims (18)

1.一种克隆并纯化重组静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的方法，包括以下步骤：
a)克隆人免疫球蛋白靶基因；
b)体外筛选表达该人免疫球蛋白靶基因的酵母细胞以产生酵母细胞系；
c)将该酵母细胞系发酵并收集所得到的培养基；
d)用10CP+90SP过滤该培养基；
e)进行弱阴离子交换层析以收集流通溶液；
f)对该流通溶液进行超滤以达到所需的蛋白质浓度；
g)对该流通溶液进行无菌过滤；
h)用20nm过滤器对该流通溶液进行纳米过滤以去除病毒；和
i)填装并在低pH下温育该流通溶液进行病毒灭活以获得纯化的重组IVIG。
2.权利要求1的方法，其中所得的纯化的重组IVIG包含蛋白质KH 33、KH 34、KH 35、KH36和KH 37。
3.权利要求1的方法，其中该人免疫球蛋白靶基因在血浆来源的IVIG中被发现并测序。
4.权利要求1的方法，还包括将IVIG基因序列转染到酵母细胞系中以获得表达IVIG的酵母细胞系，并用双重抗生素标记筛选表达IVIG的酵母细胞系。
5.权利要求4的方法，其中表达IVIG的酵母细胞系在生物反应器中扩增和培养以使细胞数目最大化至每毫升至少50亿个细胞。
6.权利要求1的方法，其中该弱阴离子交换层析是DEAE琼脂糖凝胶FF。
7.权利要求1的方法，其中对该流通溶液用10K截止膜进行超滤。
8.权利要求1的方法，还包括调节该流通溶液的蛋白质浓度和pH。
9.权利要求1的方法，其中该无菌过滤是0.22μm无菌过滤。
10.权利要求1的方法，其中将该流通溶液填装并在25℃下以pH 4进行低pH孵育21天作为病毒灭活。
11.一种阻止乙型肝炎病毒在患者体内复制的方法，包括用权利要求1的方法获得的纯化的重组IVIG对有此需要的患者进行给药。
12.一种杀死患者体内的乙型肝炎病毒的方法，包括用权利要求1的方法获得的纯化的重组IVIG对有此需要的患者进行给药。
13.一种预防患者体内感染乙型肝炎病毒的方法，包括用权利要求1的方法获得的纯化的重组IVIG对有此需要的患者进行给药。
14.一种预防患者体内感染H1N1和其他禽流感病毒中的一种或多种的方法，包括用权利要求1的方法获得的纯化的重组IVIG对有此需要的患者进行给药。
15.根据权利要求1的方法生产的纯化的重组IVIG。
16.一种治疗有此需要的患者的方法，包括用权利要求1的方法获得的纯化的重组IVIG对患者进行给药，
其中纯化的重组IVIG将受损的和有病的细胞转化或修复成健康的细胞，
其中纯化的重组IVIG保护细胞改变，
其中纯化的重组IVIG向身体发送信号以产生健康的新细胞，从而防止新细胞受细胞内和细胞外损伤信号的影响。
17.权利要求1的纯化的重组IVIG，其中该纯化的重组IVIG为液体形式。
18.权利要求1的纯化的重组IVIG，其中该纯化的重组IVIG为冻干形式。
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