CN103732236B - 用于生产痘苗病毒的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

某些实施方案涉及用于大规模生产痘苗病毒的病毒生产方法。

Description

用于生产痘苗病毒的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年8月5日提交的美国临时申请号61/515,724的权益，其整个内容通过引用并入本文。
发明背景
I.技术领域
本发明的实施方案一般地涉及病毒学、医学和病毒治疗剂。某些实施方案涉及病毒生产方法。
II.背景
溶瘤病毒(OV)是已经经过设计和选择而在肿瘤细胞中特异性地生长并杀死肿瘤细胞的复制治疗剂。基于临床前动物模型和在人类中的早期临床数据，几个组处于商业化的早期阶段。但是，本领域仍然面临的一个挑战是，生产大规模药用级病毒用于递送给患者。病毒是生物实体而不是合成的药物，因而生产方法包括在细胞内生产病毒和随后除去污染性的细胞碎片，同时维持感染效能。迄今为止，大部分（如果不是全部的话）的用于人用的痘苗病毒产品的商业生产已经成为在非人细胞培养物中的疫苗。一般而言，对于疫苗应用，患者在局部部位(经常肌肉内)接受低剂量的病毒，其中污染性的细胞蛋白可以实际上充当佐剂来增加制剂的免疫原性。相比而言，对于溶瘤病毒治疗剂，需要的病毒的剂量是多达疫苗应用的数百万倍，且可以静脉内地、颅内地、腹膜内地或通过直接肿瘤注射来施用。在OV的情况下，关键的是，能够生产大量不含污染性非人细胞碎片的病毒。此外，痘苗病毒是将宿主细胞蛋白掺入病毒膜中的有包膜病毒。将人蛋白掺入病毒包膜中会增加它的移动能力，而不被人宿主免疫系统检测到。
仍然需要用于大规模溶瘤病毒生产的额外方法和组合物。
发明内容
已经在以悬浮培养方式培养的HeLa细胞中生产痘苗病毒。但是，悬浮培养条件目前不适合用于病毒的大规模生产。因而，使用HeLa细胞大规模或商业规模生产痘苗病毒的尝试尚未成功。此外，预期附着性HeLa细胞系不会生产足够数目的细胞来确保使用附着性HeLa细胞生产大规模生产所需的数量的痘苗病毒。本申请描述了使用附着性HeLa细胞大规模生产痘苗病毒的方法。
某些实施方案涉及生产痘苗病毒的方法，所述方法包括一个或多个下述步骤。
在某些方面，所述方法包括：过使附着性HeLa细胞与痘苗病毒接触，用痘苗病毒感染附着于表面的HeLa细胞。优选地，所述痘苗病毒是重组痘苗病毒，诸如在美国专利申请公开号2009/0004723（通过引用整体并入本文）的段落中描述的那些。在某些实施方案中，从权利要求的范围中特别地排除附着于培养皿的HeLa细胞。在几个实施方案中，本发明提供了一种生产痘苗病毒的方法，其包括：(a)用痘苗病毒感染附着于表面的HeLa细胞，(b)在允许生产后代病毒的条件下，培养受感染的细胞，和(c)从培养物收获痘苗病毒。
在某些实施方案中，提供了生产痘苗病毒的方法，其包括：(a)通过使至少1x107个、1x108个、5x1081x109个、5x109个、1x1010个、5x1010个、1x1011个、5x1011个、1x1012个、5x1012个、1x1013个、5x1013个或更多个（包括其间的所有值和范围）附着性HeLa细胞与痘苗病毒组合物接触，用重组痘苗病毒感染附着于表面的HeLa细胞；和(b)在允许生产50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多个（包括其间的所有值和范围）重组痘苗病毒/细胞的条件下，培养受感染的细胞。优选地，根据所述方法生产至少50噬斑形成单位(pfu)痘苗病毒/HeLa细胞，更优选地生产至少75pfu痘苗病毒/HeLa细胞。
在其它实施方案中，以0.001至1.0、优选0.005至0.5、更优选0.01至0.1的感染复数(m.o.i.)，用痘苗病毒感染附着于表面的HeLa细胞。在一个特别优选的实施方案中，所述m.o.i.是0.01至0.05，包括其间的所有 值和范围。在其它优选的实施方案中，所述m.o.i.是0.015至0.03。术语“感染复数”或“m.o.i.”表示在感染过程中添加的病毒的噬斑形成单位(pfu)/HeLa细胞之比。
在有关的实施方案中，根据所述方法，以约104至约106个HeLa细胞/cm2、优选约105个HeLa细胞/cm2的密度，用痘苗病毒感染附着性HeLa细胞，其中所述痘苗病毒的浓度是103-105pfu/ml，优选约104pfu/ml。
附着性HeLa细胞的培养.通过任意合适的方法，可以培养根据所述方法用痘苗病毒感染的附着性HeLa细胞，所述方法包括(但不限于)在玻璃和塑料容器中培养，所述容器例如培养瓶、生物反应器，包括但不限于：细胞工厂诸如NunclonCell FactoriesTM，单元体诸如得自Corning Life Sciences的CELLCUBESystem，装有细胞支持基质的软塑料袋(如输液袋)诸如Gibco或Lampire细胞培养袋；滚瓶；旋转瓶诸如Magna-FlexSpinnerFlasks；发酵罐；或不同材料的中空纤维，诸如得自Cellex Biosciences的细胞培养系统(AcuSyst中空纤维反应器)、BioVest(Cell-PharmSystem100或System2500)或FibercellTM。在生物反应器中的培养是优选的，因为生物反应器允许精确监测和控制诸如温度和pH等变量。在某些方面，可以使用CellBindTM塑料制品(www.sigmaaldrich.com)。所述细胞培养物可以是细胞簇的形式，诸如在微载体珠子上的球状体、或在支架(例如，可生物降解的支架)上的细胞、组织或组织类器官。在某些方面，在微载体、单元体、细胞工厂、T-烧瓶或滚瓶容器中培养附着性HeLa细胞。在一个优选的实施方案中，在一个或多个滚瓶中培养附着性HeLa细胞，例如使用RollerCell40仪器(Cellon S.A.,Luxembourg)。使用的容器可以包含，但不限于，约、至少或至多1,700cm2、5,000cm2、10,000cm2、25,000cm2、50,000cm2、100,000cm2、150,000cm2、200,000cm2、500,000cm2（包括其间的所有范围和值）的累积培养面积。在某些方面，所述容器具有至少168,000cm2的累积培养面积。
可以在支持生长、维持和向细胞支持物表面附着的任意合适培养用培养基中培养要用痘苗病毒感染的附着性HeLa细胞，所述培养用培养基包括但不限于BME(基础伊格尔培养基)、MEM(最小伊格尔培养基)、199 培养基、DMEM(Dulbecco氏改良的伊格尔培养基)、GMEM(Glasgow改良的伊格尔培养基)、DMEM-HamF12和Ham-F10、Isocove氏改良的Dulbecco氏培养基、MacCoy氏5A培养基或RPMI1640。优选地，所述培养用培养基是成分确定的培养用培养基。在一个方面，所述培养用培养基基本上不含有血清。为与HeLa细胞一起使用而优化的无血清培养基的例子包括、但不限于，VP-SFM(Gibco BRL/Life Technologies)、无血清培养基(SFM)(Sigma Aldrich)和Quantum101(GE Healthcare)。在其它实施方案中，所述培养用培养基也可以包含动物血清诸如胎牛血清(FBS)。例如，所述培养用培养基可以包含5%至10%血清(例如FBS)，或者可以含有小于5%血清(例如FBS)，或其间的任意范围或值。在一个实施方案中，所述培养用培养基是补充了5%至10%FBS（诸如10%FBS）的DMEM。
术语“微载体”是指小离散颗粒，其用于培养细胞，且细胞可以附着于其上面。微载体可以是任意合适的形状，诸如杆、球等。在许多实施方案中，微载体包括微载体基质，后者被涂布以提供适合细胞培养的表面。多肽可以键合、移植或以其它方式连接至表面涂层上。已经将微载体用于细胞培养中，以便提供附着依赖性的细胞的高产量。通常在细胞培养用培养基中搅拌或搅动微载体，与更传统的培养设备相比，所述微载体会提供非常大的附着和生长表面积与体积比率。关于微载体的详细实施例，参见美国专利公开2011/0027889，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，所述痘苗病毒是痘苗病毒的IHD-J、Wyeth、Western Reserve或哥本哈根株。在某些方面，所述痘苗病毒是重组痘苗病毒。所述重组痘苗病毒可以包含异源编码区。本文中使用的异源编码区是在痘苗病毒基因组中非天然存在的编码区。在某些方面，所述异源编码区可以编码免疫刺激性多肽。免疫刺激性多肽可以是细胞因子，例如，但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在某些方面，所述重组痘苗病毒在肿瘤细胞中选择性地复制。所述重组痘苗病毒可以包含在内源基因中的突变。突变可以是，影响痘苗病毒的功能或表达的核酸序列的缺失、核酸残基的置换、或一个或多个核酸残基 的插入。所述突变可以导致肿瘤细胞的选择性生长、或非肿瘤细胞的减弱生长、或肿瘤细胞的增强生长、或它们的组合。包含内源基因突变的重组痘苗病毒可以是胸苷激酶缺陷型(TK-)痘苗病毒(即具有在编码胸苷激酶的基因中的突变的痘苗病毒，所述突变使得编码的多肽没有功能)。在某些方面，包含内源基因突变的重组痘苗病毒是痘苗病毒的IHD-J、Wyeth、Western Reserve或哥本哈根株；和/或包含异源编码区。在另一个实施方案中，包含内源基因突变的痘苗病毒也包含异源编码区，例如，但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多肽编码区。
培养受感染的HeLa细胞.在允许生产后代痘苗病毒的条件下，培养已经与痘苗病毒接触的附着性HeLa细胞。培养条件可以包括，但不限于：成分确定的感染培养基、确定的pH、确定的培养容器、确定的温度或温度范围、确定的细胞数目、确定的细胞汇合、确定的物理操作(例如，酶或化学处理、旋转频率、摇动速度等)、确定的气相条件、确定的培养时间、确定的细胞接种密度和确定的细胞传代数目。在一个方面，可以简单地将所述病毒加入用于制备附着性HeLa细胞的HeLa细胞培养用培养基中，在该情况下，所述培养用培养基和感染培养基是相同的。在其它方面，在感染步骤中除去用于制备附着性HeLa细胞的培养用培养基，并且用感染培养基（其可以包含血清或可以基本上不含血清）培养已经与痘苗病毒接触的HeLa细胞，直到在合适的感染培养基中产生后代病毒，所述感染培养基包括、但不限于，BME、MEM、199培养基、DMEM、GMEM、DMEM-HamF12和Ham-F10、Isocove氏改良的Dulbecco氏培养基、MacCoy氏5A培养基或RPMI1640，它们中的任一种可以任选地补充有血清。无血清培养基诸如VP-SFM、无血清培养基(SFM)和Quantum101也适合用作感染培养基。
在某些方面，在包含5-10%血清(例如胎牛血清(FBS))的感染培养基中培养受感染的细胞，所述感染培养基是在约7、7.2、7.3、7.4、7.5.7.6、7.7、7.8、7.9或8的pH，优选地在高于7.1的pH，更优选地在高于7.2的pH，最优选地在约7.3的pH。在其它方面，在包含小于5%血清(例如FBS)诸如0%血清(例如FBS)的感染培养基中培养细胞，所述细胞是在约7、7.2、7.3、7.4、7.5.7.6、7.7、7.8、7.9或8的pH，优选地在高于7.1的pH，更优选地在高于7.2的pH，最优选地在约7.3的pH。在有关的方面，在包含0%至10%血清(例如FBS)的感染培养基中在约7.3的pH培养细胞。在其它实施方案中，在包含0%至10%血清(例如FBS)的感染培养基中在高于7.2且低于7.6的pH培养细胞。在一个优选的实施方案中，所述感染培养基包含DMEM和任选的100-300mM谷氨酰胺。可以在约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40℃的温度培养细胞。在一个优选的实施方案中，在36℃至37.5℃的温度、优选在37℃下培养细胞。在某些方面，所述感染培养基特别地排除硫酸葡聚糖、Pluronic F-68、吐温-80和/或大豆蛋白水解物中的一种或多种。在优选的实施方案中，所述感染培养基特别地排除硫酸葡聚糖和至少一种下述组分：Pluronic F-68、吐温-80和大豆蛋白水解物。在其它优选的实施方案中，所述感染培养基基本上不含有所有这些组分。
所述方法可以进一步包括：在感染之前、过程中或之后，扩增(expand)HeLa细胞培养物。可以在至少1、2、3、4、5个或更多个培养容器（例如，滚瓶培养容器）中传代HeLa细胞。在某些方面，通过用包含蛋白酶和/或溶胶原酶（例如，HyQtase）的脱离溶液处理，使细胞脱离表面。每个容器可以具有与以前的培养容器相比增加的培养面积。在某些方面，所述培养容器具有至少84,000cm2至1,000,000cm2的总培养面积。在某些方面，最终的传代是至具有至少168,000cm2的培养面积的培养容器。
在某些实施方案中，培养容器的接种和感染之间的时间间隔是12个、24个、48个、72个、96个、120个、144个或更多个小时，包括其间的所有值和范围。在某些方面，使附着性HeLa细胞与1x101pfu/mL、1x102pfu/mL、1x103pfu/mL、1x104pfu/mL、1x105pfu/mL、1x106pfu/mL、1x107pfu/mL、1x108pfu/mL、1x109pfu/mL（包括其间的所有值和范围）的痘苗病毒接触。在一个优选的实施方案中，使密度为约104至约106个HeLa细胞/cm2（优选约105个HeLa细胞/cm2）的附着性HeLa细胞与103-105pfu/ml的痘苗病毒、更优选约104pfu/ml的痘苗病毒接触。
在某些方面，所述方法包括：分离由附着性HeLa细胞生产的痘苗病毒。根据本领域技术人员已知的方法，可以浓缩和纯化收获的痘苗病毒。本发明的其它实施方案涉及通过本文所述的方法生产的痘苗病毒组合物，诸如在美国专利申请公开号2009/0004723（通过引用整体并入本文）的段落中描述的那些。
在本申请中讨论了本发明的其它实施方案。关于本发明的一个方面讨论的任何实施方案也可应用于本发明的其它方面，反之亦然。在实施例部分中的实施方案应当理解为可适用于本发明的所有方面的本发明的实施方案。
在权利要求书和/或说明书中，术语“一个”或”一种”当与术语“包含”结合使用时可以表示“一个/种”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”以及“一个/种或一个/种以上”的含义一致。
预见到，本文讨论的任何实施方案可以与本发明的任何方法或组合物一起实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明方法。
贯穿本申请，术语“约”用于指示，值包括用于确定某值的装置或方法的标准差。
在权利要求书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确表明仅仅表示替代物或替代物是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅表示替代物和“和/或”的定义。也预见到，使用术语“或”列出的任意对象也可以被特别地排除。
在本说明书和权利要求书中所用的词语“包含”(和包含的任意形式，诸如“包括”和“含有”)、“具有”(和具有的任意形式，诸如“有”和“带有”)、“包括”(和包括的任意形式，诸如“包含”和“含有”)或“含有”(和含有的任意形式，诸如“包含”和“包括”)是包含性的或开放式的，并且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
从下面的详细描述会明白本发明的其它目的、特征和优点。但是，应当理解，详细描述和具体实施例尽管指明了本发明的具体实施方案，但是仅通过举例说明来给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发 明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
下述附图形成本说明书的一部分，并且意图进一步证明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，并结合本文中呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1解释了在不同人细胞系中生产重组痘苗病毒株JX-594(pfu/细胞)。以0.1的感染复数感染细胞，并在感染后72小时，收集裂解物，并在U-2OS细胞上确定滴度。
图2解释了感染培养基的pH对重组痘苗病毒株JX-594在附着性HeLa细胞中的生产力的影响。在指定pH的培养基中以0.1的感染复数感染细胞，并在感染后72小时，收集裂解物，并在U-2OS细胞上确定病毒滴度。
具体实施方式
痘苗病毒是有包膜病毒，其产生4种在它们的外膜方面存在差异的感染形式：细胞内的成熟的病毒粒子(IMV)，细胞内的有包膜的病毒粒子(IEV)、细胞相关的有包膜的病毒粒子(CEV)和细胞外的有包膜的病毒粒子(EEV)。由于补体活化的宿主调节剂向外EEV膜中的宿主细胞掺入，EEV形式是补体抗性的(Vanderplasschen等人,(1997)PNAS95:7544-7549)。逃避补体灭活的能力和逃避宿主免疫系统的识别的一般能力，是在患者中的全身性递送的效力的重要特征。
IMV的质膜在它的装配过程中掺入众多宿主细胞蛋白。由于IMV代表感染性后代的大多数，得自与溶瘤病毒疗法的靶患者相同的物种的生产细胞就在患者内的全身性扩散而言可以是有利的，因为所述病毒将具有更低的免疫原性。在IMV质膜上的这些宿主细胞蛋白也可以在感染过程中提供某些优点。
尽管IMV是感染性后代的大多数，尚未最终确定，在细胞培养物制品中不含有EEV形式的病毒。得自与靶患者相同物种的补体活化调节蛋 白可能在补体活化抑制中起重要作用，并因此逃避宿主免疫系统的免疫清除。因而，发明人开发了一种系统来生产大量具有人细胞组分的痘苗病毒。
历史上，从人结疤生产用作疫苗的痘苗病毒，但是，随后在小牛、绵羊和水牛的皮肤上，在鸡胚胎的绒毛尿囊膜中，或在初生牛胚胎成纤维细胞上培养它(Ellner,1998)。就全球范围内在天花根除中的协同工作而言，通过划破小牛的皮肤造成感染来生产储备物(Fenner,1977)。从小牛淋巴制备病毒储备物，并且该制剂是唯一被许可的且可得到的疫苗，被称作DRYVAX(Wyeth)。将该病毒制品浓缩和低压冻干，这有利于它的稳定性(Fenner,1977)。以至少108pfu/ml低压冻干物质的浓度生产它。将它在50%甘油和0.25%苯酚（在无菌注射用水中）中重构，并通过使用分叉针(Fenner,1977)真皮内地递送给多达400位疫苗接种者，剂量为大约2.5x105pfu——这比用作溶瘤病毒的痘苗病毒的标准109pfu(或更高)剂量低至少104倍。
溶瘤痘苗病毒的先导临床候选物是表达GM-CSF的、胸苷激酶灭活的痘苗病毒(Jennerex,JX-594)。但是，通过本文所述的方法，还可以生产其它痘苗病毒变体和株。例如，JX-963是重组痘苗病毒，其除了TK基因的除去以外，还具有在Western Reserve牛痘主链上构建的牛痘生长因子(VGF)基因的额外缺失。已经证实该双重缺失的痘苗病毒(vvDD)是肿瘤特异性的，且在动物模型中具有抗肿瘤活性(McCart等人,2001;Thorne等人,2007;Naik等人,2006)。第二种vvDD变体是JX-929，其携带并在受感染的细胞中表达人生长抑素受体(SSTR2)，这会促进使用111In-喷曲肽的全身性递送以后的分子成像(McCart等人,2004)。
I.细胞培养
已经检验了基于细胞的病毒生产，用于DRYVAX疫苗接种的替代方案中，并用于生产在病毒免疫疗法和基因治疗领域中使用的痘苗病毒。已经开发了在猴肾细胞系Vero（称作ACAM2000）中培养的第二代痘苗病毒疫苗株。在这些研究中，从细胞培养物有效地纯化病毒。另外，还已经在细胞中生产了采用与肿瘤特异性抗原(即，PSA、CEA)和免疫刺激性分子(即，B7.1、ICAM-1和LFA-1)相组合的痘苗病毒的癌症疫苗，并在I 期和II期临床试验中施用给患者(Li,等人,2005;Guo和Bartlett,2004)。但是，在上面这两种情况下，患者接受局部的、而不是全身性的病毒制品施用，且经常接受体内溶瘤效率所需要的总病毒剂量的一部分。
与已经被推荐为溶瘤病毒候选物的其它病毒相比，痘病毒诸如牛痘代表大规模生产和纯化中的一些独特挑战。作为在自然界中最大的病毒中的一些，痘病毒可通过光学显微术看到，并且具有200-400nm的测量长度(Moss,in Fields′virology B.N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howley,D.E.Griffin,编(Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,2001)第2849-2883页)。由于它的大尺寸，痘苗病毒不可通过过滤来除菌，因而通常关闭了任何生产方法。
由于它的整个生命周期发生在宿主细胞细胞质内，大部分感染性颗粒没有被释放进细胞的培养基中，而不被保留在受感染的细胞内，因而纯化需要裂解受感染的细胞和从细胞碎片中纯化病毒颗粒。
在痘病毒的形态发生中，它们在形态发生早期从新生膜合成获得膜，并在晚期从宿主高尔基体获得额外膜(Moss,in Fields′virology B.N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howley,D.E.Griffin,编(Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,2001)第2849-2883页)。
本方法涉及粘附细胞方法，其被开发生产用于癌症试验的GMP级病毒。所述粘附细胞方法可以在无血清条件下或在有血清存在下进行。本文中描述的生产平台的生产力目标是至少30、100、125、150、200或更多pfu/细胞，每剂的估测病毒浓度为约109pfu/ml。
本发明的一个实施方案涉及在细胞培养物中生产高滴度JX-594的操作。试验了多种人细胞系，并发现HeLa（一种人宫颈癌细胞系）会支持在附着性培养物中的稳健病毒复制。本方法不限于HeLa细胞，并且可以在生产方法中使用其它粘附细胞，但是目前，HeLa细胞会为痘苗病毒的生产提供最佳模式细胞系。
用于评估病毒生产力的典型方案是，执行标准噬斑测定，这包括：系列稀释，然后是2-3天的等待噬斑形成的时段，随后计算滴度。作为一个替代方案，已经将定量PCR方案(Q-PCR)标准化，其允许确定感染以后生 产的病毒基因组的数目。已经优化扩增引物，其允许我们定量受感染的细胞中的病毒E9L基因的拷贝数，并已经将这些结果与我们的标准噬斑测定数据相关联。该方案的优点是，它可以适用于96孔形式，并且在数小时（而不是数天）内得到数据。因而，可以在96孔板中快速地进行培养基和补充物、到收获的时间、和输入病毒的浓度的影响的标准初步筛选，并进行分析。在该初步筛选以后，用经典噬斑测定确认所有阳性的“命中”。
试验了在市售无血清培养基中存在的组分对病毒生产力的影响。HeLaS3细胞系已经适合悬浮生长，并且在我们的手中，这些细胞在EX-CELLTMHeLa无血清悬浮培养基(SAFCBiosciences)中生长得象粘附细胞在含血清的培养基中一样好。但是，如上所述，尽管具有优良的细胞生长特征，发明人在该培养基中观察到非常差的病毒生长(每个受感染的细胞小于1个病毒颗粒)。尽管EX-CELLTMHeLa无血清培养基的精确制剂是专有的，该无血清培养基的一种已知组分是硫酸多糖（硫酸葡聚糖），显然加入它是为了帮助防止细胞团聚。但是，也已知硫酸葡聚糖会抑制多种有包膜病毒的复制，所述有包膜病毒包括逆转录病毒、疱疹病毒、弹状病毒和沙粒病毒(De Clercq,1993)。在EX-CELL培养基中存在大约20mg/L的硫酸葡聚糖。在上述的快速测定中使用和评估了多种硫酸葡聚糖浓度。发现了硫酸葡聚糖确实对病毒生产力具有剂量依赖性的负面影响，该发现随后使用经典的滴度测定进行了证实。尽管硫酸葡聚糖的除去确实会提高病毒生产力，它仍然低于用附着性HeLa细胞在含血清的培养基中常规地实现的生产力。影响病毒生产力的其它培养基组分包括：Pluornic F-68，即一种通常对细胞无毒的双功能嵌段共聚物表面活性剂；吐温-80，即一种常用的去污剂；和大豆水解物。在本发明的某些方面，所述培养基缺少硫酸葡聚糖、Pluronic F-68、吐温-80和大豆蛋白水解物中的一种或多种。这些培养基制剂和血清补充物中的一些的例子描绘在表1中。
表1.培养基制剂和补充物
培养基的名称 供应商
ExCell HeLa SFM SAFC
ExCell 293 SFM SAFC
OPTIPRO SFM Invitrogen
UltraCulture Cambrex
CHO-S-SFM II Invitrogen
293 SFM II Invitrogen
VP-SFM Invitrogen
IS-293-V Irvine Scientific
BD Nu Serum补充物 BD Biosciences
由于痘苗病毒喜欢细胞与细胞接触以实现有效扩散，病毒的较差细胞至细胞传递可能限制悬浮细胞培养物。在某些方面，可以促进细胞的团聚，或者可以在微载体上培养细胞，或者贴壁培养对于病毒生产而言可以是足够的。
在一个非限制性实施例中，将下述条件用于JX-594的生长，其一致地导致超过100pfu/细胞的滴度。以4x104个细胞/cm2，将细胞接种在滚瓶中，并在培养物中生长2天。在此时，除去生长培养基，并加入含有104pfu/ml JX-594的新鲜培养基。将细胞维持另外60-70小时，在此时，收集细胞，并收获病毒。该方案可以生产大约170剂(109pfu/剂)的JX-594。在该过程中，发明人发现了没有预见到对病毒产量具有惊人影响的因素。例如，培养基的pH可以对JX-594复制产生影响。在pH7.3的良好缓冲培养基中优化病毒生产。得自附着性培养物的生产力显著优于在悬浮培养时的所有尝试。
为了确保基本上不含有污染性产物的高质量病毒制品的生产，可以将许多测定用于分析病毒纯度和/或质量。这些测定将确保病毒制品与其它经证实的病毒制品批次相当，并确保该方法是成功的。
特征 方法
传染性滴度 噬斑测定
效能:细胞毒性 在U2OS细胞上的ED50
基因组滴度 E9L的qPCR
总DNA pico green
宿主细胞DNA量 qDNA-PCR
总蛋白(ug/mL) BCA
宿主细胞蛋白(总体) ELISA(Cygnus)
在某些实施方案中，可以分离和纯化痘苗病毒。纯化痘苗病毒的方法可以包括：a.给固相基质加载被包含在液相中的痘苗病毒；b.洗涤所述基质；和c.洗脱痘苗病毒。
在某些方面，所述基质可以包含结合牛痘的配体。所述配体可以通过与所述基质结合或偶联而附着于固相基质。配体和病毒之间的相互作用形成可逆的复合物，因而，基质可逆地保留病毒。在某些方面，使用葡糖胺聚糖(GAG)（尤其是硫酸类肝素或肝素）或GAG-样物质作为配体。本文中使用的“糖胺聚糖”(GAG)是由重复二糖单元组成的无支链长多糖。
所述配体可以是生物分子，例如，肽和/或凝集素和/或抗体和/或优选的碳水化合物。所述配体也可以包含硫酸酯或由硫酸酯组成。在另一个实施方案中，所述配体包含一个或多个带负电荷的硫酸酯基团。
在某些方面，所述配体是疏水分子，例如，芳族苯基、PPG基团、丁基或己基。
在一个方面，所述方法包括：用疏水相互作用色谱法(HIC)纯化痘苗病毒。在另一个实施方案中，所述方法包括：用HIC以及亲和色谱法纯化痘苗病毒。HIC的使用可以提供高病毒产率，并大幅减少DNA和蛋白污染物。DNA污染水平可以降低至最初起始原料的0.01%，且蛋白污染水平可以降低至低于0.1%。
在某些方面，可以与HIC苯基柱色谱法一起使用硫酸化纤维素，从而以高产率和纯度水平生产病毒颗粒。
在某些方面，在纯化痘苗病毒之前或之后，降解或除去DNA。通过核酸酶处理，诸如Benzonase处理，可以除去DNA。核酸酶处理会降低含有完整癌基因或其它功能性DNA序列的疫苗或病毒载体的可能性。
在有关的方面，在纯化痘苗病毒之前或之后，降解或除去蛋白。通过蛋白酶处理，诸如TrypLETMSelect处理，可以除去蛋白。优选地，采用核酸酶和蛋白酶处理的组合来减少或消除污染性HeLa DNA和蛋白。
所述基质可以是凝胶、珠子、孔、膜、柱等。在本发明的一个优选实施方案中，所述固相是膜，尤其是纤维素膜。可以使用宽范围的能够结合病毒的经改性的聚合物。这样的聚合物的例子是：纤维素衍生物(纤维素酯、纤维素水合物、醋酸纤维素、硝酸纤维素)；琼脂糖及其衍生物；多糖诸如甲壳质或壳聚糖；聚烯烃(聚丙烯)；聚砜；聚醚砜；聚苯乙烯；芳族和脂族聚酰胺；聚磺酰胺；卤代的聚合物(聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚偏二氟乙烯)；聚酯；丙烯腈的同聚物和共聚物。
可以在无菌条件下纯化痘苗病毒以得到有活性的、稳定的且高纯的病毒制品。所述痘苗病毒可以是天然的或重组的。
本文中使用的“污染物”涵盖任何不希望的物质，其可以源自用于病毒培养的宿主细胞(例如宿主细胞DNA或蛋白)，或者源自在包括上游(例如庆大霉素)和下游(例如Benzonase)在内的生产过程中使用的任何添加剂。
本文中使用的痘苗病毒或重组痘苗病毒的“工业级”或“大规模”生产包括，能够提供每批(生产运行)最少50,000剂的1.0x108病毒颗粒(总共最少5.0x1012个病毒颗粒)的方法。
关于杂质DNA、蛋白、Benzonase和庆大霉素的含量，研究了本文中使用的痘苗病毒制品或疫苗的“纯度”。将纯度表示为特定杂质，其为每剂中每种杂质的量(例如ng DNA/剂)。
本文中使用的“稳定性”是指，在多种环境因素（诸如温度、湿度和光）的影响下，病毒制品(散装药用物质(BDS)或最终的药物产品(FDP))的质量如何随时间而变化的量度，并建立在推荐的贮存条件下的再检验阶段（对于BDS）或贮存期限（对于FDP）。
所述配体使得在痘苗病毒完全保留它们的生物活性的温和条件下洗脱结合的痘苗病毒成为可能。这意味着，病毒是感染性的。在纯化过程中可以保留痘苗病毒的感染性，使得在纯化过程中保留最初TCID50(半数组织培养物感染剂量)的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80%或90%。优选地，在纯化过程中保留最初TCID50的至少30%。
在一个实施方案中，所述固相基质是具有0.25μm、优选超过0.25μm、更优选1.0-3.0μm的孔径的凝胶或膜，从而在实际纯化条件下表现出10cm/min至20cm/min的线性流动速率。所述基质的孔径可以是0.25-0.5μm、0.5-0.75μm、0.75-1.0μm、1.0-2.0μm、2.0-3.0μm、或大于3.0μm。
给固相加载配体可以通过分配方案、柱方案或膜方案来实现。
就大病毒（如痘苗病毒）的纯化而言，膜方案可以具有一些益处。大孔径和配体在膜表面上的可用性允许甚至大病毒颗粒的高结合能力。
在一个实施方案中，所述病毒在硫酸铵（例如，在0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1.0M、1.2M、l.4M、1.6M、1.8M或2.0M）中结合至配体。
当痘苗病毒或重组病毒与配体或基质的结合已经充分进行时，通过用适当的洗涤介质洗涤痘苗病毒所结合的基质，可以除去保留在液相中的宿主细胞污染物(尤其是宿主细胞DNA和蛋白)。在一个方面，用0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1.0M、1.2M、l.4M、1.6M、1.8M或2.0M的硫酸铵洗涤基质。
可以从基质洗脱结合的痘苗病毒或重组病毒。用特异性地破坏配体或基质和痘苗病毒之间的特异性相互作用的试剂，或者用非特异性地破坏配体或基质和表面蛋白之间的静电相互作用的试剂，可以实现捕获的痘苗病毒的洗脱。在一个方面，所述试剂是硫酸铵。在另一个方面，可以用GAG或GAG类配体洗脱痘苗病毒。在另一个方面，所述试剂是氯化钠，更优选在0.15M至2.0M范围内递增的NaCl浓度梯度。
在加载到基质上之前，可以预处理病毒悬浮液，具体地，以便从液相培养物的痘苗病毒中除去污染物。预处理可以是下述步骤中的一种或多种（单独或组合）：将宿主细胞匀浆化，超声处理，冷冻/融化，低渗裂解，高压处理，离心，过滤，核酸酶处理，蛋白酶处理，阳离子交换，选择性沉淀。
取决于洗脱痘苗病毒或重组病毒所用的试剂，可以进行后处理以提高病毒制品的纯度。所述后处理可以是超滤/渗滤，以进一步除去杂质和/或用于洗脱的特异性的或非特异性的试剂。
通常，在洗脱病毒以后，增加pH值，尤其是增加至高达9或更高的pH值，尤其是增加至pH7.5、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.5、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.5、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4或10.5。
本发明的实践采用分子生物学、蛋白分析和微生物学的技术，这些技术属于本领域的熟练从业人员的技能。在例如Ausubel等人.1995,编,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York中，充分地解释了这样的技术。
II.实施例
下述实施例为了解释本发明的不同实施方案的目的而给出，且无意以任何方式限制本发明。本领域技术人员会容易地明白，本发明非常适合实现所述目的和得到提及的目标和优点、以及在本文中固有的那些目的、目标和优点。本发明的实施例与本文所述的方法一起在目前代表优选的实施方案，是示例性的，且无意作为对本发明的范围的限制。本领域技术人员会做出在其中的变化和其它用途，它们被包括在由权利要求的范围限定的本发明的精神内。
试验了多种人细胞系的JX-594生产。简而言之，以0.1的感染复数，用JX-594感染附着性HeLa细胞、A549细胞、MCF-7细胞、M14细胞、U-2OS细胞、悬浮的HeLa S3细胞和附着性HeLa S3细胞，并在感染后72小时收集裂解物，并在U-2OS细胞上确定病毒的滴度。结果显示在图1中。在附着性HeLa细胞中得到惊人的好结果。
在优化附着性HeLa细胞中的病毒生产的努力中，检验了不同的参数。发现感染培养基的pH对病毒生产具有意外的惊人影响(参见图2)。在其它方面相同的条件下，JX-594的生产从感染培养基pH为7.1时的约12pfu/细胞增加至感染培养基pH为7.3时的约60pfu/细胞。当感染培养基的pH低于7.1时，病毒生产几乎不存在。当感染复数是在0.005至0.05的范围内时（特别是0.01至0.03），且当在感染过程中和以后将温度维持在36℃至37.5℃时，观察到病毒生产的进一步提高。塑料滚瓶作为附着表面的应用，也会促进高病毒产率。
还确定了在感染之前用于培养附着性HeLa细胞的培养基中的血清的 存在和量会影响病毒产率。当培养基含有10%FBS时，得到最佳产率：降低培养基中的血清的量会导致病毒产率的相应损失。尽管如此，其它参数(例如pH、感染复数、附着表面)的优化会在一定程度上抵消由降低的血清浓度引起的产率损失。
但是，感染培养基中的血清的存在和量不会显著影响病毒产率。因而，为了根据本发明在附着性HeLa细胞中得到痘苗病毒的惊人的好产率，感染培养基可以包含血清，或可以基本上不含血清。
描述经过优化的上游过程的非限制性实施例的流程图如下：
JX-594上游过程
病毒融化和接种物扩增。通过融化足够数目的得自细胞库的管形瓶，开始上游过程。在聚苯乙烯细胞培养容器(636cm2)(Nunc Nalgene)中温育得到的细胞悬浮液。使用通常使用的细胞培养方案，将细胞培养至通过视觉评价确定的某种汇合(约80-95%)。
在传代1，除去培养基，用PBS冲洗细胞，并使细胞脱离培养容器。使用Vi-Cell XR(Beckman Coulter)或血球计数器计数活细胞，然后以1x104-6x104个细胞/cm2的密度接种进4个聚苯乙烯培养容器(总面积2544 cm2)，每个容器含有200mL培养基-100。在37℃温育培养物。
如果以2x104接种培养物，那么下一次传代的目标日期是接种后4天。如果以4x104接种培养物，那么下一次传代的目标日期是接种后3天。定义该过程以在每次传代时提供大约1x105个细胞/cm2。
滚瓶细胞培养扩增.在传代2的目标日期，除去培养基，用PBS冲洗细胞，并使细胞脱离聚苯乙烯培养容器。
以1x104-6x104个细胞/cm2的密度，将细胞接种进在RC-40滚瓶仪器(Synthecon,总表面积8400cm2)中的2个Extended Surface(ES)聚苯乙烯滚瓶(RB,Cellon)中。培养每个含有900mL培养基100的瓶子，并在RC-40培养箱(Sanyo)中在37℃温育细胞培养物。
在传代3的目标日期，除去细胞培养用培养基，用PBS冲洗细胞，并使细胞脱离。从ES瓶子收集细胞悬浮液，与培养基100进行1:1混合，并计数活细胞。然后以1x104-6x104个细胞/cm2，将适当量的细胞悬浮液接种进4个ES RB(总表面积16800cm2)中。在每个瓶子中，用900mL培养基在37℃温育细胞培养物。
在传代4过程中，将细胞培养物转移至10个RB(总表面积42000cm2)，且在传代5过程中，将细胞培养物扩增至20个RB(总表面积84000cm2)。传代6是JX-594生产方法的第一关键步骤，因为将细胞培养物扩增至40个RB(总表面积168000cm2)。40个RB的接种密度对于JX-594生产而言是关键性的，且具有4x104个细胞/cm2的确定靶标。在传代6过程中，收集细胞悬浮液和条件培养基的样品用于DNA指纹法和偶然性试剂试验。在生产种子阶段中，将细胞培养物的温度控制在37℃。
感染和JX-594生产.从接种40个RB至用数个管形瓶的JX-594（得自主病毒库或工作病毒库）感染的间隔是72小时的靶标。在感染当天，从细胞培养物除去培养基，并用含有1x104pfu/mL的JX-594病毒的新鲜培养基-100替代。感染培养基的滴度是一个关键的过程参数，且具有1x104pfu/mL的确定靶标。在感染时不计数细胞密度，但是基于传代史预期为1x105个细胞/cm2。将感染的持续时间控制在40-80小时的范围内，且优选为约44小时。细胞培养物在感染过程中的温度是一个关键的过程参数，且 控制在37℃。
根据该方法经常得到高达和甚至大于100pfu/细胞的病毒滴度
JX-594下游方法.从细胞小规模制备痘病毒的经典方法已经包括低渗裂解，随后进行数轮冻融和声处理。本发明的发明人已经发现，冷冻/融化和声处理在很大程度上是不必要的步骤，其经常导致降低的病毒滴度。因此，JX-594的下游处理采用核酸酶(Benzonase)处理来消化HeLa DNA，并采用蛋白酶(TrypLETMSelect)处理来消化HeLa蛋白，随后进行切向流过滤(TFF)。用Benzonase处理粗制培养物(含有在低渗裂解缓冲液中的病毒和细胞碎片)，会造成在制品中显著更少的污染性宿主(HeLa)DNA。因而，与TFF组合的核酸酶处理会提供显著更纯的病毒制品，在制品中含有显著更少的污染性宿主DNA和蛋白，同时保留病毒的感染性滴度。具体地，使用核酸酶/蛋白酶处理和TFF的组合，已经使DNA污染从40μg DNA/剂降低至3μg DNA/剂，并使蛋白污染从12mg蛋白/剂降低至4mg蛋白/剂(剂量＝1x 109pfu的JX-594)。通过采用一个或多个色谱步骤，可以实现进一步降低。在一个方面，所述一个或多个色谱步骤包括离子交换色谱法。在另一个方面，所述一个或多个色谱步骤包括假亲和色谱法，优选地基于肝素(或肝素-样分子)或硫酸化纤维素，利用痘苗病毒A27L蛋白的肝素-结合能力。在另一个方面，所述一个或多个色谱步骤包括膜吸附色谱法，例如膜亲和色谱法。优选的膜具有孔径为至少3μM的多微孔结构。
参考文献
就它们提供示例性操作细节或其它细节来补充本文所述的那些而言，下述参考文献具体地通过引用并入本文。
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Claims (20)

1.一种用于生产痘苗病毒的方法，所述方法包括：
(a)通过使HeLa细胞与痘苗病毒以0.01-0.05噬斑形成单位(pfu)/细胞的感染复数(m.o.i.)接触，用痘苗病毒感染附着于表面的所述HeLa细胞；
(b)在具有7.2-7.4的pH的感染培养基中，在36℃至37.5℃的温度下，培养受感染的细胞，持续40-80小时的时段；和
(c)从培养物收获痘苗病毒，
由此生产以计算的至少50pfu痘苗病毒/HeLa细胞，其中所述HeLa细胞附着于包含至少168,000cm2的累积培养面积的多个塑料滚瓶容器。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)过程中附着性HeLa细胞的密度是104-106个HeLa细胞/cm2。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)过程中附着性HeLa细胞的密度是105个HeLa细胞/cm2。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中在步骤(a)过程中的痘苗病毒的浓度是103-105pfu/ml。
5.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中在37℃的温度下进行步骤(a)和(b)。
6.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中生产至少75pfu痘苗病毒/HeLa细胞。
7.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述培养基不包含下述的一种或多种：硫酸葡聚糖、F-68、聚山梨酯80和大豆水解物。
8.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述培养基包含胎牛血清。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述培养基包含小于10％的胎牛血清。
10.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述培养基不包含血清。
11.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中使收获的病毒进行一个或多个纯化步骤，所述纯化步骤任选地包括下述的一种或多种：(a)用核酸酶处理所述收获的病毒以除去HeLa细胞核酸，和/或用蛋白酶处理所述收获的病毒以除去HeLa细胞蛋白；(b)切向流过滤；(c)肝素亲和色谱法；和(d)膜吸收色谱法。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述痘苗病毒：
-是痘苗病毒的IHD-J、Wyeth、Western Reserve或哥本哈根株；
-包含编码免疫刺激性多肽的异源编码区；和/或
-缺少功能性胸苷激酶基因。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫刺激性多肽是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
14.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：在感染之前扩增HeLa培养物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中通过至少一个滚瓶培养容器传代所述HeLa细胞，所述至少一个滚瓶培养容器具有与以前的培养容器相比增加的培养面积。
16.根据权利要求15所述的方法，其中接种所述滚瓶培养容器和感染之间的间隔是48-96小时。
17.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤(a)过程中的痘苗病毒的浓度是104pfu/ml。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述感染培养基的pH为7.3。
19.根据权利要求1所述的方法，其中进行步骤(b)，持续44小时的时段。
20.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的所述m.o.i.为0.02pfu/细胞。
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